CN111164205B - 包含视网膜组织的细胞聚集体及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体是具备包含神经视网膜的核部和连续地或断续地覆盖所述核部的表面的至少一部分的被覆部的球体状细胞聚集体，其特征在于，(1)在所述神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，所述视细胞层至少包含选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞，所述视细胞层中包含的细胞在所述核部的表面的切线方向上连续地存在，(2)所述被覆部包含相互接触的视网膜色素上皮细胞，(3)所述细胞聚集体不包含晶状体、玻璃体、角膜和血管，并且(4)所述视网膜色素上皮细胞没有与所述神经视网膜层一起形成连续的上皮结构。
Description
技术领域
本发明涉及包含神经视网膜的球体状细胞聚集体及其制造方法，特别是涉及具备包含神经视网膜的核部和连续地或断续地覆盖该核部的表面的至少一部分且包含视网膜色素上皮细胞的被覆部的球体状细胞聚集体及其制造方法。
背景技术
在恶化的老年性黄斑变性症等视细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞同时受损的情况下，神经视网膜(NR)和视网膜色素上皮(RPE)细胞的同时移植被认为是最理想的。
另一方面，与针对视网膜色素变性等基于视网膜组织的损害的疾病的视网膜的移植治疗相关联，正活跃地进行由多能干细胞制造神经视网膜、视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法的研究。作为由多能干细胞制造神经视网膜的方法，已知例如通过将多能干细胞的聚集体在包含BMP信号转导通路激动剂的培养基中进行悬浮培养来得到神经视网膜的方法(专利文献1、2和非专利文献1)。另外，作为由多能干细胞制造RPE细胞的方法，已知例如由在包含视黄酸受体拮抗剂的培养基中诱导出的视网膜前体细胞得到RPE细胞的方法(专利文献3)。但是，尚不知晓在NR与RPE细胞这两者以与活体视网膜中的视网膜组织同样的方式具有取向性而正确地局部存在的状态下制造包含两者的视网膜组织的方法。
到目前为止，已报道了视网膜前体细胞与RPE细胞的细胞混合物的移植(非专利文献2)、和使视网膜前体细胞粘附于RPE细胞片上的RPE细胞-视网膜前体细胞粘附体的移植(专利文献4)。
但是，非专利文献2中，使用了未相互粘附的细胞的混合物，专利文献1中，粘附于RPE细胞片上的视网膜前体细胞彼此没有紧密地粘附，并非能够作为视网膜组织发挥作用的状态。因此预料，在任一情况下，移植后的长期成活性都不好。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/025967号
专利文献2：国际公开第2016/063986号
专利文献3：国际公开第2012/173207号
专利文献4：美国专利申请公开第2016/0331867号说明书
非专利文献
非专利文献1：Atsushi Kuwahara等,Nature Communications,6,6286(2015)
非专利文献2：Seiler等,Curr Eye Res.1995Mar；14(3):199-207
发明的概要
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供适于移植的包含视网膜组织、特别是神经视网膜和视网膜色素上皮细胞的细胞聚集体及其制造方法。
用于解决问题的方法
本发明人发现，通过使RPE细胞与包含神经视网膜的球体状细胞聚集体接触，能够得到该细胞聚集体上粘附有RPE细胞的本发明的球体状细胞聚集体，将由该聚集体物理切出的细胞片移植到视网膜变性裸大鼠中，结果确认到良好的成活，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的发明。
[1]一种球体状细胞聚集体，其具备包含神经视网膜的核部和连续地或断续地覆盖上述核部的表面的至少一部分的被覆部，所述球体状细胞聚集体的特征在于，
(1)在上述神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，上述视细胞层至少包含选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞，上述视细胞层中包含的细胞在上述核部的表面的切线方向上连续地存在，
(2)上述被覆部包含相互接触的视网膜色素上皮细胞，
(3)上述细胞聚集体不包含晶状体、玻璃体、角膜和血管，并且
(4)上述视网膜色素上皮细胞没有与上述神经视网膜层一起构成连续的上皮结构。
[2]如[1]所述的球体状细胞聚集体，其中，在(1)中的视细胞层与覆盖该视细胞层的至少一部分的视网膜色素上皮细胞之间还存在细胞外基质。
[3]如[2]所述的球体状细胞聚集体，其中，细胞外基质为选自由透明质酸、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白组成的组中的一种或两种以上的细胞外基质。
[4][1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体的制造方法，其包括：
制备神经视网膜的细胞聚集体的步骤，所述神经视网膜的细胞聚集体为包含神经视网膜的球体状细胞聚集体，
(I)上述神经视网膜的细胞聚集体中，上述神经视网膜存在于上述细胞聚集体的表面，并且
(II)在上述神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，在上述视细胞层中存在有选自由视网膜前体细胞、视细胞前体细胞和视细胞组成的组中的一种以上的细胞；
制备视网膜色素上皮细胞的步骤；和
使上述神经视网膜的细胞聚集体和上述视网膜色素上皮细胞接触的步骤。
[5]如[4]所述的制造方法，其中，上述神经视网膜的细胞聚集体中的上述神经视网膜中的Chx10阳性细胞的存在比例为20％以上。
[6]如[4]或[5]所述的制造方法，其中，在接触步骤中，在粘附因子存在下进行接触。
[7]如[6]所述的制造方法，其中，粘附因子为细胞外基质。
[8]如[7]所述的制造方法，其中，细胞外基质为选自由透明质酸、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白组成的组中的一种或两种以上的细胞外基质。
[9]如[4]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，神经视网膜的细胞聚集体和视网膜色素上皮细胞中的至少一者来源于多能干细胞。
[10]如[4]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，在制备视网膜色素上皮细胞的步骤中，视网膜色素上皮细胞以细胞片或细胞悬液的形式制备。
[11]如[4]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，在接触步骤后，进一步培养至视网膜色素上皮细胞具有多边形或铺路石状的细胞形态。
[12]一种被测物质的毒性或药效评价用试剂，其含有[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体而成。
[13]一种被测物质的毒性或药效评价方法，其包括：
使被测物质与[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分接触，对被测物质给该球体状细胞聚集体或该球体状细胞聚集体中包含的细胞带来的影响进行检验。
[14]一种基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病的治疗药，其含有[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分而成。
[15]一种基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病的治疗方法，其包括：
对需要移植的对象移植有效量的[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分。
[16][1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分在治疗基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病中的应用。
[17]一种药物组合物，其含有[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分作为有效成分。
[18]一种球体状细胞聚集体的一部分，其是从[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体物理切出而成的。
[19]如[18]的球体状细胞聚集体的一部分，其为包含视网膜色素上皮细胞和神经视网膜的细胞片。
[20]一种球体状细胞聚集体的一部分的制造方法，其包括物理切出[1]～[3]中任一项所述的球体状细胞聚集体的一部分的步骤。
[21]如[20]所述的制造方法，其中，上述球体状细胞聚集体的一部分为包含视网膜色素上皮细胞和神经视网膜的细胞片。
发明效果
根据本发明，能够提供适于移植的包含视网膜组织、特别是神经视网膜和视网膜色素上皮细胞的细胞聚集体及其制造方法，该细胞聚集体能够在生物体内应当存在各视网膜系细胞的适当位置长期成活。
附图说明
图1是示出由人ES细胞分化诱导、并分别形成视网膜色素上皮(RPE)细胞和神经视网膜(NR)的显微镜观察结果(A、B、C、D)和荧光显微镜观察结果(A’、B’、C’、D’)的图。
图2是示出实施例2的使NR与RPE细胞粘附的方法(A)、以及粘附1小时后和粘附的第二天的显微镜观察结果(B、C、D)和荧光显微镜观察结果(B’、C’、D’)的图。
图3是示出实施例2中利用显微镜对使NR与RPE细胞粘附后第1天、第6天和第45天的经时变化进行观察的结果(E、F、G)、以及利用显微镜对第45天的粘附于NR表面的RPE细胞的形态进行观察的结果(H)和利用荧光显微镜进行观察的结果(H’)的图。
图4是示出实施例2中对使NR与RPE细胞粘附后第50天的NR-RPE细胞的聚集块进行免疫染色、并利用共聚焦荧光显微镜进行观察的结果(I、J)的图。
图5是示出实施例3的使NR与RPE细胞粘附的方法(A)、以及刚粘附后和粘附10分钟后的显微镜观察结果(B)的图。
图6是示出实施例3中利用显微镜对使NR与RPE细胞刚粘附后和粘附第13天的经时变化进行观察的结果(C、D)和利用荧光显微镜进行观察的结果(C’、D’)的图。
图7是示出实施例4中使制作的NR-RPE细胞片粘附后培养5天和50天并利用荧光显微镜进行观察的结果(A、B、C、D、E、F)、以及将培养的NR-RPE细胞片切出并利用荧光显微镜进行观察的结果(A’、B’、C’、D’、E’、F’)的图。
图8是示出实施例4中将移植所制作的NR-RPE细胞片5个月以上后的眼组织切片在显微镜下进行观察的结果(G)和利用荧光显微镜进行观察的结果(G’)的图。
图9是示出实施例4中对移植所制作的NR-RPE细胞片5个月以上后的移植物进行免疫染色并利用共聚焦荧光显微镜进行观察的结果(H)的图。
图10是示出实施例4中对移植所制作的NR-RPE细胞片5个月以上后的移植物进行免疫染色并利用共聚焦荧光显微镜进行观察的结果(I)的图。
具体实施方式
[球体状细胞聚集体]
本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体具备包含神经视网膜的核部和连续地或断续地覆盖上述核部的表面的至少一部分的被覆部，具有以下的(1)～(4)的特征：
(1)在上述神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，上述视细胞层至少包含选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞，上述视细胞层中包含的细胞在上述核部的表面的切线方向上连续地存在，
(2)上述被覆部包含相互接触的视网膜色素上皮细胞，
(3)上述细胞聚集体不包含晶状体、玻璃体、角膜和血管，并且
(4)上述视网膜色素上皮细胞没有与上述神经视网膜层一起构成连续的上皮结构。
“球体(sphere)状细胞聚集体”是指具有接近球状的立体形状的细胞聚集体。接近球状的立体形状是具有三维结构的形状，可以列举投影于二维面时显示例如圆形或椭圆形的球形、和多个球形融合而形成的形状(例如，二维投影时显示2～4个圆形或椭圆形重合而形成的形状)。一个方式中，聚集体的核部具有小泡性层状结构，具有在亮视野显微镜下中央部较暗且外边缘部分较亮地被观察到这样的特征。
“细胞聚集体(Cell Aggregate)”只要是多个细胞彼此粘附而形成立体结构的聚集体则没有特别限定，例如是指分散在培养基等介质中的细胞集合而形成的块、或经过细胞分裂而形成的细胞的块等。细胞聚集体也包含形成特定组织的情况。
上述细胞聚集体的核部包含神经视网膜。“视网膜组织(Retinal tissue或Retinal organoid)”是指以层状立体地包含一种或多种在活体视网膜中构成各视网膜层的视网膜系细胞的组织，“神经视网膜(Neural Retina)”是视网膜组织，是指不包含后述的视网膜层中的视网膜色素上皮层、包含视网膜色素上皮层的内侧的神经视网膜层的组织。各个细胞是构成哪一个视网膜层的细胞这一点可以通过公知的方法、例如细胞标志物的表达的有无或表达的程度等来确认。
上述“细胞聚集体的核部”的一部分区域中可以包含视网膜色素上皮细胞和/或睫状缘部用结构体。作为一个方式，针对细胞聚集体的外环境形成的连续的边界面(由神经视网膜构成)的一部分由视网膜色素上皮细胞构成，并且在神经视网膜与视网膜色素上皮细胞的边界区域存在睫状缘部用结构体。作为这样的“细胞聚集体的核部”，具体而言，可以列举WO2013/183774中公开的细胞聚集体(图12A)。
“视网膜系细胞(Retinal cell)”是指活体视网膜中构成各视网膜层的细胞或其前体细胞。具体而言，包括视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、无长突细胞、中间神经元、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、双极细胞(视杆双极细胞、视锥双极细胞)、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、睫状缘部细胞、这些细胞的前体细胞(例：视细胞前体细胞、双极细胞前体细胞等)、视网膜前体细胞等细胞，但不限于这些。上述视网膜系细胞中，作为构成神经视网膜层的细胞，具体而言，可以列举视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、无长突细胞、中间神经元、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、双极细胞(视杆双极细胞、视锥双极细胞)、米勒胶质细胞和这些细胞的前体细胞(例：视细胞前体细胞、双极细胞前体细胞等)等细胞。
“成熟的视网膜系细胞”是指人成人的视网膜组织中可包含的细胞，具体而言，是指视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、无长突细胞、中间神经元、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、双极细胞(视杆双极细胞、视锥双极细胞)、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、睫状缘部细胞等分化了的细胞。“未成熟的视网膜系细胞”是指确定向成熟的视网膜系细胞分化的前体细胞(例：视细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、视网膜前体细胞等)。
视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜神经节细胞前体细胞、米勒胶质前体细胞、视网膜色素上皮前体细胞分别是指确定向视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮细胞分化的前体细胞。
“视网膜前体细胞”是指可能分化为视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜神经节细胞前体细胞、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮前体细胞等中的任意一种未成熟的视网膜系细胞、并最终可能分化为视细胞、视杆细胞、视锥细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞等中的任意一种成熟的视网膜系细胞的前体细胞。
“视细胞(photoreceptor cell)”存在于视网膜的视细胞层，具有吸收光刺激而转换为电信号的作用。视细胞有在明处发挥作用的椎体(cone)和在暗处发挥作用的杆体(rod)这两种。视细胞从视细胞前体细胞分化并成熟。细胞是否是视细胞或视细胞前体细胞可以由本领域技术人员通过例如后述的细胞标志物(视细胞前体细胞中表达的Crx和Blimp1、视细胞中表达的恢复蛋白、成熟视细胞中表达的视紫红质、S-视蛋白(Opsin)和M/L-视蛋白等)的表达、外节结构的形成等来容易地确认。一个方式中，视细胞前体细胞为Crx阳性细胞，视细胞为视紫红质、S-视蛋白和M/L-视蛋白阳性细胞。
“视网膜色素上皮细胞”是指活体视网膜中存在于神经视网膜的外侧的上皮细胞。细胞是否是视网膜色素上皮细胞可以由本领域技术人员通过例如后述的细胞标志物(RPE65、Mitf、CRALBP、MERTK、BEST1等)的表达、黑素颗粒的存在(黑褐色)、细胞间的紧密连接、多边形/铺路石状的特征性细胞形态等来容易地确认。细胞是否具有视网膜色素上皮细胞的功能可以通过VEGF和PEDF等细胞因子的分泌能力等来容易地确认。一个方式中，视网膜色素上皮细胞为RPE65阳性细胞、Mitf阳性细胞、或RPE65阳性且Mitf阳性细胞。
视网膜系细胞的存在可以通过视网膜系细胞的标志物(以下，有时称为“视网膜系细胞标志物”)的表达的有无来确认。视网膜系细胞标志物的表达的有无、或者细胞群体或组织中的视网膜系细胞标志物阳性细胞的比例可以由本领域技术人员容易地确认。例如，可以利用使用市售的抗体的流式细胞术、免疫染色等方法，通过用特定的视网膜系细胞标志物阳性细胞的数量除以总细胞数来确认。
作为视网膜系细胞标志物，可以列举视网膜前体细胞中表达的Rx(也称为“Rax”)、PAX6和Chx10、视细胞前体细胞中表达的Crx和Blimp1、视细胞中表达的恢复蛋白、双极细胞中表达的Chx10、PKCα和L7、视网膜神经节细胞中表达的TuJ1和Brn3、无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白、水平细胞中表达的钙结合蛋白、成熟视细胞中表达的视紫红质、视杆细胞中表达的Nrl和视紫红质、视锥细胞中表达的Rxr-gamma、S-视蛋白和M/L-视蛋白、米勒胶质细胞中表达的GS和GFAP、视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65和Mitf、睫状缘部细胞中表达的Rdh10和SSEA1等。
“阳性细胞”是指在细胞表面上或细胞内表达特定的标志物的细胞。例如，“Chx10阳性细胞”是指在核内表达Chx10蛋白质的细胞。
(1)在球体状细胞聚集体的核部的神经视网膜中，形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层。“视网膜层”是指构成视网膜的各层，具体而言，可以列举视网膜色素上皮层、视细胞层、外界膜、外颗粒层、外网层、内颗粒层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜。“神经视网膜层”是指构成神经视网膜的各层，具体而言，可以列举视细胞层、外界膜、外颗粒层、外网层、内颗粒层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜。“视细胞层”是视网膜层或神经视网膜层的一种，是指形成于神经视网膜的最外侧、包含大量视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞的视网膜层。
核部的神经视网膜中的视细胞层至少包含选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞(以下，有时称为“视细胞等”)，在此，视细胞包含视杆细胞和视锥细胞，相对于存在于视细胞层的全部细胞，以核的数量为基准，视细胞等占70％以上、优选80％以上、更优选90％以上。核部的神经视网膜中的视细胞层至少形成于聚集体核部的最外侧，另外，在内侧也可以形成有视细胞层。上述视细胞等在核部表面的切线方向上连续地、即相互粘附地存在，通过使视细胞等在核部表面的切线方向上连续地存在，形成包含视细胞等的视细胞层。需要说明的是，切线方向是指相对于球体状细胞聚集体的核部(神经视网膜)表面的切线方向、即视细胞层中的视细胞等排列的方向，相对于该神经视网膜为平行方向或横向。
作为核部的神经视网膜的一个方式，有时也可以为在同一聚集体内还具有视网膜色素上皮细胞的块、并在上述的神经视网膜与视网膜色素上皮细胞的边界区域具有睫状缘部样结构体的、所谓芜菁型(カブラ型)聚集体(非专利文献1)。
睫状缘部样结构体是指与睫状缘部类似的结构体。作为“睫状缘部(ciliarymarginal zone；CMZ)”，可以列举例如作为活体视网膜中存在于神经视网膜与视网膜色素上皮的边界区域的组织、并且包含视网膜的组织干细胞(视网膜干细胞)的区域。睫状缘部也被称为睫状缘(ciliary margin)或视网膜缘(retinal margin)，睫状缘部、睫状缘和视网膜缘是同等的组织。已知睫状缘部对于视网膜前体细胞、分化细胞向视网膜组织的供给、视网膜组织结构的维持等发挥着重要的作用。作为睫状缘部的标志物基因，可以列举例如Rdh10基因(阳性)、Otx1基因(阳性)和Zic1(阳性)。
(2)球体状细胞聚集体的被覆部连续地或断续地覆盖细胞聚集体的核部的表面的至少一部分，在此，球体状细胞聚集体的核部的表面是指核部的神经视网膜的表面所存在的最外侧的视细胞层的表面。被覆部优选覆盖核部的表面积的30％以上、更优选50％以上。连续地覆盖核部的表面是指，被覆部在核部的表面以连续的1个块的形式存在，断续地覆盖核部的表面是指，被覆部在核部的表面以2个以上的连续的块或层的形式存在，且各个连续的块相互不连接。在被覆部断续地覆盖核部的表面的情况下，优选各个连续的块连续地覆盖核部的表面积的10％以上或20％以上。
被覆部包含相互接触的视网膜色素上皮(RPE)细胞，在此，RPE细胞也包含视网膜色素上皮前体细胞。RPE细胞“相互接触”是指在被覆部中1个RPE细胞与其他RPE细胞接触的状态，不与其他RPE细胞接触的独立的单个RPE细胞不构成被覆部。
存在于上述核部的表面的视细胞层与覆盖该视细胞层的至少一部分的视网膜色素上皮细胞之间，可以还存在一种或两种以上的细胞外基质作为被覆部的一部分。细胞外基质是指构成细胞的外侧的空间的生物高分子，可以列举纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白等细胞粘附性蛋白质、胶原蛋白、弹性蛋白等纤维性蛋白质、这些蛋白质的片段、透明质酸、硫酸软骨素等糖胺聚糖或蛋白聚糖等。优选为选自由透明质酸、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白组成的组中的一种或两种以上的细胞外基质。作为优选的细胞外基质，可以列举层粘连蛋白的片段(例：层粘连蛋白511-E8片段、层粘连蛋白521-E8片段)。
(3)包含胎儿视网膜的活体视网膜包含晶状体、玻璃体、角膜和血管，与此相对，本发明的球体状细胞聚集体具有不包含晶状体、玻璃体、角膜和血管这样的特征。
“晶状体”是发挥使从外部入射到眼球的光发生折射、在视网膜上对焦的透镜的作用的组织。作为晶状体的部分结构，可以列举晶状体上皮、晶状体核、晶状体嚢等。作为晶状体的前体组织，可以列举晶状体板、晶状体泡等。晶状体板是指由肥厚的表皮外胚层细胞层构成的晶状体前体组织。在胚发生中，通过眼泡向表皮外胚层的接触而使该接触区域肥厚，由此形成。晶状体泡是指通过晶状体板的陷入而形成的小泡。存在晶状体、其部分结构或其前体组织这一点可以通过标志物的表达来确认。作为晶状体、其部分结构或其前体组织的标志物，可以列举L-Maf(晶状体前体组织)、α、β和γ-晶状体蛋白(晶状体)等，但不限于这些。
“玻璃体”是指位于晶状体的后方且充满内腔的透明的胶状的组织，具有在保持眼球的形状的同时使外力分散的作用。玻璃体由水分和蛋白质(胶原蛋白)形成。存在玻璃体这一点可以通过其胶状的形状来确认。
“角膜”是指占眼球壁的外层的前方约1/6的透明的表面玻璃状的组织。作为角膜的部分结构，可以列举角膜上皮、鲍曼氏膜(Bowman’s membrane)、角膜实质、德斯密氏膜(Descemet’s membrane)、角膜内皮等。角膜通常由从体表侧起依次由角膜上皮、鲍曼氏膜、角膜实质、德斯密氏膜和角膜内皮构成的五层构成。存在角膜、其部分结构或其前体组织这一点可以通过标志物的表达来确认。作为角膜、其部分结构或其前体组织的标志物，可以列举广谱细胞角蛋白(角膜上皮前体组织)、E-钙粘蛋白(角膜上皮前体组织)、细胞角蛋白3(角膜上皮)、细胞角蛋白12(角膜上皮)、细胞角蛋白14(角膜上皮)、p63(角膜上皮)、ZO-1(角膜上皮)、PDGFR-α(角膜实质、角膜内皮或其前体组织)、Pitx2(角膜实质和角膜内皮的前体组织)、ABCG2(角膜实质和角膜内皮的前体组织)等。
从胎儿视网膜摘除晶状体等时，在该部分形成孔，组织被空隙分割开。另外，与活体视网膜相比，在构成球体状细胞聚集体的核部的神经视网膜层的内层(除最外侧的视细胞层以外的部分)存在的细胞(例：水平细胞、无长突细胞、双极细胞)和神经节细胞的数量少。具体而言，例如，与在人胎儿视网膜的内层存在的细胞数相比为80％以下、70％以下、60％以下、50％以下。另外，在切取胎儿视网膜的一部分来进行培养的情况下，成为具有二维的厚度的片结构，但不可能成为立体的球体状细胞聚集体。
另一方面，已知通过对多能干细胞进行分化诱导而人为地制作的视杯(Opticcup)(例：Nature.2011Apr 7；472(7341):51-6)，但该视杯在细胞聚集体的一部分形成有孔，组织被空隙分割开。
(4)被覆部中的视网膜色素上皮细胞不与神经视网膜层一起形成连续的上皮结构。“上皮结构”是指形成了上皮组织的层结构，上皮结构连续是指，上皮结构由1个连续的上皮组织形成。即，球体状细胞聚集体的被覆部中的视网膜色素上皮细胞与构成核部中的神经视网膜的神经视网膜层不具有作为上皮组织的连续性。是否是连续的上皮结构可以由本领域技术人员在显微镜下对组织的状态、细胞的排列状态进行观察来确认。
活体视网膜具有由内侧的神经视网膜、外侧的视网膜色素上皮细胞构成的、内外2个上皮组织大幅重叠而成的上皮结构。该上皮结构通过使1个连续的上皮组织叠起来而形成。作为具体例，胎儿视网膜是以一张上皮片的形式神经视网膜-睫状体-RPE连续而成的上皮。另外，人为地制造的视杯也以一张上皮片的形式神经视网膜与RPE连续而成。
一个方式中，本发明的球体状细胞聚集体包含哺乳动物的细胞。本发明球体状细胞聚集体优选包含啮齿类(例：小鼠、大鼠)或灵长类(例：人、猴)的细胞，更优选包含人的细胞。
一个方式中，本发明的球体状细胞聚集体是用于在基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病(特别是视细胞视网膜色素上皮细胞同时发生了损害或损伤的重症例)的治疗中应用的球体状细胞聚集体。
一个方式中，本发明的球体状细胞聚集体可以移植到需要移植的对象(例：哺乳动物)，可以通过该移植改善视觉功能。作为成为对象的哺乳动物，可以列举例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴等。
移植时，可以将球体状细胞聚集体在用于维持该球体状细胞聚集体的生存能力所需的介质中进行保存。作为“用于维持生存能力所需的介质”，可以列举培养基、生理学缓冲溶液等，但只要包含视网膜前体细胞等视网膜系细胞的细胞群体可生存，则没有特别限定，本领域技术人员可以适当选择。作为一例，可以列举以动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基而制备的培养基。作为基础培养基，可以列举例如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、改良的MEM锌选择培养基、Neurobasal培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham’s培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基或这些培养基的混合培养基等动物细胞的培养中可以使用的培养基。
一个方式中，也可以将本发明的球体状细胞聚集体使用镊子、小刀、剪刀等细切成适当的大小后进行移植。切出后的形状没有限制，可以列举包含神经视网膜和视网膜色素上皮细胞的片剂(也称为细胞片、NR-RPE细胞片)。可以列举例如：将一片从一个细胞聚集块切出的细胞片(例如，直径300μm高度50μm)根据视细胞、视网膜色素上皮细胞发生了变性的区域的面积以一张至多张进行移植。本领域技术人员可以根据该发生了变性坏死的区域来选择细胞片的片数。
移植可以通过例如使用注射针移植到视网膜下的方法、将眼球的一部分切开并从切开部位移植到损伤部位或病变部位的方法来实施。
移植后成活的未成熟的视网膜系细胞的至少一部分在对象生物体内(眼内)的环境下被分化诱导为成熟的视网膜系细胞。在此，“移植后被诱导的视细胞”是指在对象的眼内由移植后成活的视网膜前体细胞或视细胞前体细胞分化诱导的视细胞。
在此，本说明书中的“成活”是指，被移植的细胞在生物体内长期(例：30日以上、60日以上、90日以上)生存，并粘附地停留于脏器内。
本说明书中的“接触率”是指移植的视网膜组织的视细胞层与宿主侧的包含双极细胞的视网膜层接触的长度相对于移植的视网膜组织的长径的比例。
本说明书中的“功能性成活”是指被移植的细胞成活、并在生物体内发挥着本来的功能的状态。
本说明书中的“功能性成活率”是指移植的细胞中发挥了功能性成活的细胞的比例。被移植的视细胞的功能性成活率例如可以由上述接触率求出。
通过移植上述球体状细胞聚集体，被移植的视细胞(包含移植后被诱导的视细胞)的功能性成活率为10％以上、优选为20％以上、更优选为40％以上、进一步优选为50％以上、进一步优选为60％以上。
活体视网膜具有非常复杂的层结构，只有通过存在于视网膜层中的细胞秩序井然地存在才能发挥功能。上述球体状细胞聚集体具有至少包含视细胞层的神经视网膜层，在该视网膜层中，视细胞等粘附地连续存在，并且在其被覆部存在有视网膜色素上皮细胞，因此具有与活体视网膜的结构非常类似的结构。因此，通过移植本球体状细胞聚集体，作为生物体中受到损害的视网膜、视网膜色素上皮细胞的替代来发挥基于视细胞的光接收功能和视网膜色素上皮细胞的视细胞保护功能等这两者，由此，可期待长期在生物体中成活。因此，球体状细胞聚集体为适于移植的细胞聚集体。另外，本球体状细胞聚集体可以通过后述的制造方法来制造，在能够对需要移植的患者适时地提供所需量这方面而言，可以说比活体视网膜更优良。
[球体状细胞聚集体的制造方法]
本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体的制造方法包括制备包含神经视网膜的球体状细胞聚集体(神经视网膜的细胞聚集体)的步骤、制备视网膜色素上皮细胞的步骤、以及使神经视网膜的细胞聚集体和视网膜色素上皮细胞接触的步骤。
(神经视网膜的细胞聚集体)
以下，对神经视网膜的细胞聚集体及其制造方法进行说明。需要说明的是，“神经视网膜的细胞聚集体”是指包含神经视网膜的球体状细胞聚集体。
(I)包含神经视网膜的球体状细胞聚集体(神经视网膜的细胞聚集体)中，神经视网膜存在于细胞聚集体的表面。例如，神经视网膜在神经视网膜的细胞聚集体的表面具有厚度地存在，对于外环境以连续的面形成边界。面向外环境的边界面中，视细胞占多数，在其内侧存在有内层的细胞、视网膜前体细胞。这些构成视网膜层的细胞相互粘附地连续存在。在其内部具有空洞、或者未形成整齐地排列的层结构的空间，因此，在其交界线处观察到清楚的阴影，确认到形成了上皮结构。包含神经视网膜的球体状细胞聚集体相当于上述的具有核部和被覆部的球体状细胞聚集体的核部。
(II)在神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，在视细胞层中存在有选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞。神经视网膜中的Chx10阳性细胞的存在比例为20％以上、优选为30％以上、进一步优选为40％以上。作为Chx10阳性细胞，可以列举视网膜前体细胞和视细胞前体细胞。
神经视网膜的细胞聚集体优选来源于多能干细胞。“多能干细胞”是指能够在试管内培养、并且具有能够分化为除胎盘以外的构成生物体的全部细胞(来源于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的组织)的能力(分化多能性(pluripotency))的干细胞，胚胎干细胞也包含在其中。
多能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织内干细胞、体细胞等诱导。作为多能干细胞，可以列举胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)、EG细胞(胚胎生殖细胞；Embryonic germ cell)、诱导多能干细胞(iPS细胞；induced pluripotent stemcell)等。由间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(多系分化持续应激细胞；Multi-lineage differentiating stress enduring cell)和由生殖细胞(例如睾丸)制作的GS细胞也包含在多能干细胞中。胚胎干细胞在1981年开始建立，在1989年以后也被应用于敲除小鼠制作。在1998年建立了人胚胎干细胞，也逐渐被用于再生医学。胚胎干细胞可以通过将内部细胞块在饲养细胞上或包含LIF(白血病抑制因子)的培养基中进行培养来制造。胚胎干细胞的制造方法记载于例如WO96/22362、WO02/101057、US5843780、US6200806、US6280718等中。胚胎干细胞可以从规定的机构获得，另外也可以购入市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1、KhES-2和KhES-3可以从京都大学再生医科学研究所获得。作为人胚胎干细胞的Rx::GFP株(KhES-1株来源)可以从国立研究开发法人理化学研究所获得。作为小鼠胚胎干细胞的EB5细胞株和D3细胞株分别可以从国立研究开发法人理化学研究所和ATCC获得。
作为胚胎干细胞之一的核移植胚胎干细胞(ntES细胞)可以由将体细胞的核移植到除去核后的卵子中而制作的克隆胚胎来建立。
EG细胞可以通过将原始生殖细胞在包含mSCF、LIF和bFGF的培养基中进行培养来制造(Cell,70:841-847,1992)。
本发明中的“诱导多能干细胞”是指通过将体细胞利用公知的方法等进行重编程(reprogramming)而诱导出多能性的细胞。具体而言，可以列举通过选自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等的重编程基因群中的多个基因的组合中的任意一者的表达使成纤维细胞、外周血单核细胞等分化的体细胞重编程而诱导出多分化能力的细胞。作为优选的重编程因子的组合，可以列举(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、和Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28和L-Myc(Stem Cells,2013；31:458-466)。
诱导多能干细胞是在2006年由山中等人利用小鼠细胞建立的(Cell,2006,126(4),pp.663-676)。在2007年，诱导多能干细胞也在人成纤维细胞中建立，与胚胎干细胞同样地具有多能性和自我复制能力(Cell,2007,131(5),pp.861-872；Science,2007,318(5858),pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.,2008,26(1),pp.101-106)。
作为诱导多能干细胞，除了通过基于基因表达的直接重编程来制造的方法以外，也可以通过化合物的添加等由体细胞诱导出诱导多能干细胞(Science,2013,341,pp.651-654)。
另外，也可以获得建立了细胞株的诱导多能干细胞，例如，由京都大学建立的201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞等人诱导多能性细胞株可以从京都大学获得。作为建立了细胞株的诱导多能干细胞，例如，由京都大学建立的Ff-I01细胞和Ff-I14细胞可以从京都大学获得。
作为制造诱导多能干细胞时使用的体细胞，没有特别限定，可以列举组织来源的成纤维细胞、造血细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC)、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。
制造诱导多能干细胞时，在通过多种基因的表达进行重编程的情况下，用于使基因表达的方法没有特别限定。作为上述方法，可以列举使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体)的感染法、使用质粒载体(例如，质粒载体、附加体型载体)的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质体转染法、RetroNectin法、电穿孔法)、使用RNA载体的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法)、蛋白质的直接注入法(例如，使用针的方法、脂质体转染法、电穿孔法)等。
制造诱导多能干细胞时，可以在饲养细胞存在下或饲养细胞不存在下(无饲养层)进行制造。在饲养细胞存在下制造诱导多能干细胞时，可以通过公知的方法在未分化维持因子存在下制造诱导多能干细胞。作为在饲养细胞不存在下制造诱导多能干细胞时使用的培养基，没有特别限定，可以使用公知的胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞的维持培养基、或用于在无饲养层条件下建立诱导多能干细胞的培养基。作为用于在无饲养层条件下建立诱导多能干细胞的培养基，可以列举例如Essential 8培养基(E8培养基)、Essential 6培养基、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基、Stabilized Essential 8培养基、StemFit培养基等无饲养层培养基。在制造诱导多能干细胞时，例如，可以使用仙台病毒载体在无饲养层条件下向体细胞中基因导入Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc这四个因子，由此制作诱导多能干细胞。
本发明中使用的多能干细胞优选为胚胎干细胞或诱导多能干细胞，更优选为诱导多能干细胞。
本发明中使用的多能干细胞为哺乳动物的多能干细胞，优选为啮齿类(例：小鼠、大鼠)或灵长类(例：人、猴)的多能干细胞，更优选为人或小鼠多能干细胞，进一步优选为人诱导多能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)。
作为专能干细胞，可以列举造血干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、间充质干细胞等组织干细胞(也被称为组织性干细胞、组织特异性干细胞或体性干细胞)。
神经视网膜的细胞聚集体可以通过对多能干细胞进行分化诱导而得到。分化诱导可以列举WO2011/055855、WO2013/077425、WO2015/025967、WO2016/063985、WO2016/063986、WO2017/183732、PLoS One.2010Jan 20；5(1):e8763.、Stem Cells.2011Aug；29(8):1206-18.、Proc Natl Acad Sci USA.2014Jun 10；111(23):8518-23、NatCommun.2014 Jun 10；5:4047中公开的方法，但没有特别限定。
作为具体的一个方式，可以通过包括下述步骤(A)、(B)和(C)的方法来制备神经视网膜的细胞聚集体。
(A)将多能干细胞在饲养细胞不存在下、在包含1)TGFβ家族信号转导通路抑制剂和/或音猬因子信号转导通路激动剂、以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养的步骤；
(B)通过在无血清培养基中进行悬浮培养而形成细胞聚集体的步骤；
(C)将步骤(B)中得到的细胞聚集体在包含BMP信号转导通路激动剂的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。
本方法例如也公开于WO2016/063985、WO2017/183732中，更详细而言，可以参考WO2016/063985、WO2017/183732。
TGFβ家族信号转导通路抑制剂是指抑制TGFβ家族信号转导通路、即由Smad家族转导的信号转导通路的物质，具体而言，可以列举TGFβ信号转导通路抑制剂(例：SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等)、Nodal/Activin信号转导通路抑制剂(例：SB431542、A-83-01等)和BMP信号转导通路抑制剂(例：LDN193189、Dorsomorphin等)。这些物质已市售，可以获得。
音猬因子(以下有时记为“Shh”)信号转导通路激动剂是指可增强经由Shh介导的信号转导的物质。作为Shh信号转导通路激动剂，可以列举例如PMA(Purmorphamine)、SAG(Smoothened激动剂)等。
TGFβ家族信号转导通路抑制剂和音猬因子信号转导通路激动剂的浓度为可诱导向视网膜系细胞的分化的浓度即可。例如，SB431542通常以0.1～200μM、优选2～50μM的浓度使用。A-83-01通常以0.05～50μM、优选0.5～5μM的浓度使用。LDN193189通常以1～2000nM、优选10～300nM的浓度使用。SAG通常以1～2000nM、优选10～700nM的浓度使用。PMA通常以0.002～20μM、优选0.02～2μM的浓度使用。
步骤(A)中的无饲养层条件下的多能干细胞的培养中，优选使用包含未分化维持因子的上述无饲养层培养基作为培养基。
步骤(A)中的无饲养层条件下的多能干细胞的培养中，为了将代替饲养细胞的基底供于多能干细胞，可以使用适当的基质作为基底。作为可以作为基底使用的基质，可以列举层粘连蛋白(Nat Biotechnol 28,611-615,(2010))、层粘连蛋白片段(Nat Commun 3,1236,(2012))、基底膜标准品(Nat Biotechnol 19,971-974,(2001))、明胶、胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白、玻连蛋白(Vitronectin)等。
关于步骤(A)中的多能干细胞的培养时间，在能够实现提高步骤(B)中形成的细胞聚集体的质量的效果的范围内没有特别限定，通常为0.5～144小时。一个方式中，优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，更进一步优选为18～28小时(例如24小时)。
无血清培养基的准备和细胞聚集体的形成可以与上述同样地实施。
一个方式中，步骤(B)中使用的培养基包含音猬因子信号转导通路激动剂。作为音猬因子信号转导通路激动剂，可以以上述的浓度使用上述的物质。音猬因子信号转导通路激动剂优选从悬浮培养开始时包含在培养基中。培养基中可以添加ROCK抑制剂(例如Y-27632)。培养时间例如为12小时～6天。
BMP信号转导通路激动剂是指可增强由BMP介导的信号转导通路的物质。作为BMP信号转导通路激动剂，可以列举例如BMP2、BMP4或BMP7等BMP蛋白质、GDF7等GDF蛋白质、抗BMP受体抗体、或BMP部分肽等。BMP2蛋白质、BMP4蛋白质和BMP7蛋白质可以从例如R&DSystems公司获得，GDF7蛋白质可以从例如和光纯药获得。
所使用的培养基可以列举例如添加有BMP信号转导通路激动剂的无血清培养基或血清培养基(优选无血清培养基)。无血清培养基、血清培养基可以如上所述进行准备。
BMP信号转导通路激动剂的浓度为可诱导向视网膜系细胞的分化的浓度即可。例如，在人BMP4蛋白质的情况下，以达到约0.01nM～约1μM、优选约0.1nM～约100nM、更优选约1nM～约10nM、进一步优选约1.5nM(55ng/mL)的浓度的方式添加到培养基中。
BMP信号转导通路激动剂在从步骤(A)的悬浮培养开始起约24小时后以后进行添加即可，可以在悬浮培养开始后几天以内(例如，15天以内)添加到培养基中。优选将BMP信号转导通路激动剂在悬浮培养开始后第1天至第15天的期间、更优选第1天至第9天的期间、最优选第3天添加到培养基中。
作为具体的方式，例如，可以在步骤(B)的悬浮培养开始后第1～9天、优选第1～3天将培养基的一部分或全部更换为包含BMP4的培养基，将BMP4的终浓度调整至约1nM～约10nM，在BMP4存在下培养例如1～12天、优选2～9天、进一步优选2～5天。在此，为了将BMP4的浓度维持同一浓度，可以以1次或2次的程度将培养基的一部分或全部更换为包含BMP4的培养基。或者，也可以阶段性地减少BMP4的浓度。
上述步骤(A)～步骤(C)中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
通过改变上述步骤(C)中的培养期间，可以制造各种分化阶段的视网膜系细胞作为神经视网膜的细胞聚集体中包含的视网膜系细胞。即，可以制造以各种比例包含未成熟的视网膜系细胞(例：视网膜前体细胞、视细胞前体细胞)和成熟的视网膜系细胞(例：视细胞)的、神经视网膜的细胞聚集体中的视网膜系细胞。通过延长步骤(C)的培养期间，可以增加成熟的视网膜系细胞的比例。
上述步骤(B)和/或步骤(C)也可以使用WO2017/183732中公开的方法。即，步骤(B)和/或步骤(C)中，可以在进一步包含Wnt信号转导通路抑制剂的培养基进行悬浮培养，形成神经视网膜的细胞聚集体。
作为步骤(B)和/或步骤(C)中使用的Wnt信号转导通路抑制剂，只要是可抑制由Wnt介导的信号转导的物质则没有特别限定，可以为蛋白质、核酸、低分子化合物等中的任意一种。由Wnt介导的信号经由以Frizzled(Fz)和LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6，low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)的杂二聚体形式存在的Wnt受体来进行转导。作为Wnt信号转导通路抑制剂，可以列举例如与Wnt或Wnt受体直接作用的物质(抗Wnt中和抗体、抗Wnt受体中和抗体等)、抑制编码Wnt或Wnt受体的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制Wnt受体与Wnt的结合的物质(可溶型Wnt受体、显性失活Wnt受体等、Wnt拮抗剂、Dkk1、Cerberus蛋白质等)、抑制因基于Wnt受体的信号转导引起的生理活性的物质[CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺)、D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-桥亚甲基-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)、以及IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺)等低分子化合物等]等，但不限于这些。作为Wnt信号转导通路抑制剂，可以含有一种或两种以上的上述物质。CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2等是公知的Wnt信号转导通路抑制剂，可以适当获得市售品等。作为Wnt信号转导通路抑制剂，优选使用IWR1e。
步骤(B)中的Wnt信号转导通路抑制剂的浓度为可诱导良好的细胞聚集体的形成的浓度即可。例如，在IWR-1-endo的情况下，以达到约0.1μM～约100μM、优选约0.3μM～约30μM、更优选约1μM～约10μM、进一步优选约3μM的浓度的方式添加到培养基中。在使用IWR-1-endo以外的Wnt信号转导通路抑制剂的情况下，优选以显示与上述IWR-1-endo的浓度同等的Wnt信号转导通路抑制活性的浓度使用。
步骤(B)中，将Wnt信号转导通路抑制剂添加到培养基中的时机越早越优选。Wnt信号转导通路抑制剂在从步骤(B)中的悬浮培养开始起通常6天以内、优选3天以内、更优选1天以内、更优选12小时以内、进一步优选步骤(B)中的悬浮培养开始时添加到培养基中。具体而言，例如，可以进行添加有Wnt信号转导通路抑制剂的基础培养基的添加、一部分或全部的培养基更换为该基础培养基的操作。使步骤(A)中得到的细胞在步骤(B)中与Wnt信号转导通路抑制剂作用的期间没有特别限定，优选在步骤(B)中的悬浮培养开始时添加到培养基中后，使其作用至步骤(B)结束时(临添加BMP信号转导通路激动剂之前)为止。更优选如后所述在步骤(B)结束后(即步骤(C)的期间内)也继续暴露于Wnt信号转导通路抑制剂。作为一个方式，如后所述，可以在步骤(B)结束后(即步骤(C)的期间内)也继续与Wnt信号转导通路抑制剂作用，使其作用至形成视网膜组织。
步骤(C)中，作为Wnt信号转导通路抑制剂，可以使用前述的Wnt信号转导通路抑制剂中的任意一种，但优选在步骤(C)中使用与步骤(B)中使用的Wnt信号转导通路抑制剂相同种类的物质。
步骤(C)中的Wnt信号转导通路抑制剂的浓度为可诱导视网膜前体细胞和视网膜组织的浓度即可。例如，在IWR-1-endo的情况下，以达到约0.1μM～约100μM、优选约0.3μM～约30μM、更优选约1μM～约10μM、进一步优选约3μM的浓度的方式添加到培养基中。在使用IWR-1-endo以外的Wnt信号转导通路抑制剂的情况下，优选以显示与上述IWR-1-endo的浓度同等的Wnt信号转导通路抑制活性的浓度使用。将步骤(B)的培养基中的Wnt信号转导通路抑制剂的浓度设为100时，步骤(C)的培养基中的Wnt信号转导通路抑制剂的浓度优选为50～150、更优选为80～120、进一步优选为90～110，更优选与第二步骤的培养基中的Wnt信号转导通路抑制剂的浓度同等。
向培养基中添加Wnt信号转导通路抑制剂的培养基的时期在能够实现包含视网膜系细胞或视网膜组织的聚集体形成的范围内没有特别限定，越早越优选。优选在步骤(C)开始时将Wnt信号转导通路抑制剂添加到培养基中。更优选在步骤(B)中添加Wnt信号转导通路抑制剂后，在步骤(C)中也继续(即，从步骤(B)的开始时起)包含在培养基中。进一步优选在步骤(B)的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导通路抑制剂后，在步骤(C)中也继续包含在培养基中。例如，可以向步骤(B)中得到的培养物(包含Wnt信号转导通路抑制剂的培养基中的聚集体的悬浮液)中添加BMP信号转导激动剂(例：BMP4)。
与Wnt信号转导通路抑制剂作用的期间没有特别限定，在步骤(B)中的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导通路抑制剂的情况下，以步骤(B)中的悬浮培养开始时作为起算点，优选为2天～30天、更优选为6天～20天、8天～18天、10天～18天或10天～17天(例如10天)。在另一个方式中，关于与Wnt信号转导通路抑制剂作用的期间，在步骤(B)中的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导通路抑制剂的情况下，以步骤(B)中的悬浮培养开始时作为起算点，优选为3天～15天(例如5天、6天、7天)，更优选为6天～10天(例如6天)。
将通过上述方法得到的神经视网膜的细胞聚集体在包含Wnt信号转导通路激动剂和/或FGF信号转导通路抑制剂的无血清培养基或血清培养基中进行约3天～约6天期间的培养(步骤(D))后，在不包含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导通路抑制剂的无血清培养基或血清培养基中进行约30天～约60天的培养(步骤(E))，由此，也可以制造包含睫状缘部样结构体的神经视网膜。
作为一个方式，可以由作为步骤(A)～(C)中得到的神经视网膜的细胞聚集体的、步骤(B)的悬浮培养开始后第6～30天、第10～20天(第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天)的神经视网膜的细胞聚集体，通过上述步骤(D)和步骤(E)来制造包含睫状缘部样结构体的神经视网膜。
作为Wnt信号转导通路激动剂，只要是可增强由Wnt介导的信号转导的物质则没有特别限定。作为具体的Wnt信号转导通路激动剂，可以列举例如GSK3β抑制剂(例如6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)、CHIR99021、肯帕罗酮(Kenpaullone))。例如，在CHIR99021的情况下，可以列举约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约30μM的范围。
作为FGF信号转导通路抑制剂，只要是能够抑制由FGF介导的信号转导的物质则没有特别限定。作为FGF信号转导通路抑制剂，可以列举例如SU-5402、AZD4547、BGJ398等。例如，在SU-5402的情况下，以约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约30μM、更优选约5μM的浓度进行添加。
通过上述的方法，可以制造神经视网膜的细胞聚集体，但不限于此。
(视网膜色素上皮细胞)
视网膜色素上皮细胞优选来源于多能干细胞。由多能干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法可以列举WO2012/173207号、WO2015/053375号、WO2015/053376号、WO2015/068505号、WO2017/043605、Stem Cell Reports,2(2),205-218(2014)和Cell Stem Cell,10(6),771-785(2012)中公开的方法，但没有特别限定。另外，通过对上述的WO2016/063985中记载的方法进行改良，也可以制备视网膜色素上皮细胞的聚集体。视网膜色素上皮细胞可以以细胞片或细胞悬液的形式制备。
作为WO2016/063985中记载的方法的改良法，在上述方法中，将多能干细胞在饲养细胞不存在下，1)在分化诱导一天前利用TGFβ家族信号转导通路抑制剂和音猬因子信号转导通路激动剂进行处理，2)在分化诱导开始时不对音猬因子信号转导通路激动剂进行处理的条件下进行培养。然后，进行上述的步骤(B)和(C)。进一步优选将上述步骤(D)的开始时期提前。具体而言，在步骤(B)的悬浮培养开始9天前后(例：7天、8天、9天、10天、11天后)开始步骤(D)。然后，实施上述的步骤(E)即可。
视网膜色素上皮细胞可以在与神经视网膜的细胞聚集体接触之前进一步培养至具有多边形或铺路石状的细胞形态为止。此时的培养基没有特别限定，也可以更换为视网膜色素上皮细胞的维持培养基(以下，也有时记载为RPE维持培养基)并进一步进行培养。由此，能够更清楚地对黑素色素沉着细胞群、粘附于基底膜上的具有多边扁平状的形态的细胞群进行观察。利用RPE维持培养基的培养只要可形成视网膜色素上皮细胞的群体则没有限定，例如，在以3天1次以上的频率进行全量培养基更换的同时进行约5天～约20天的培养。本领域技术人员可以在确认该形态的同时容易地设定培养期间。视网膜色素上皮细胞的维持培养基可以使用例如IOVS,March 2004,Vol.45,No.3、MasatoshiHaruta等,IOVS,November 2011,Vol.52,No.12、Okamoto等,Cell Science 122(17)、Fumitaka Osakadar等,ebruary 2008,Vol.49,No.2、Gamm等中记载的培养基。
本领域技术人员也可以由通过上述的方法得到的视网膜色素上皮细胞的聚集体或细胞片通过吹吸等常规方法制备视网膜色素上皮细胞的细胞悬液。例如，可以利用PBS(Thermo fisher公司制造)等对聚集体或细胞片进行洗涤后，利用Tryple select(Thermofisher公司制造)等细胞解离酶进行约15分钟～约30分钟的处理，进行吹吸，由此制备细胞悬液。也可以从细胞过滤网(Cell strainer)等网状物通过。
“细胞片”是指由至少在二维方向上具有生物学结合的单个或多个细胞构成的单层或多层的结构体。细胞片可以通过使用镊子、小刀、剪刀等从粘附培养后的细胞或细胞聚集体切出来制作。
“细胞悬液”是指以悬浮状态包含相同种类或不同种类的多个细胞的溶液。优选是指介质中存在的细胞的大多数(例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上)相互解离而不进行持续的物理接触地存在的状态。其他的一部分细胞可以以细胞聚集体等的形式存在。
视网膜色素上皮细胞的细胞悬液可以通过例如将以细胞片、细胞聚集体的形式制造的视网膜色素上皮细胞分散为单个细胞来制备。分散方法没有特别限定，可以通过本领域技术人员公知的方法、例如利用细胞解离酶(例：Tryple(商标)select、Thermo fisher公司)等的化学处理、使用细胞刮刀等的物理处理进行分散。
(接触步骤)
使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞接触的方法只要可以使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞粘附则没有特别限定，可以列举例如：将神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞的悬浮液一起进行培养，使视网膜色素上皮细胞粘附于沉到板底的神经视网膜的细胞聚集体上的方法；或者使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞片接触的方法；以及利用渗透压差的方法等。
作为将神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞的细胞悬液一起进行培养、使视网膜色素上皮细胞粘附于沉到板等培养容器的底的神经视网膜的细胞聚集体上的方法，优选使视网膜色素上皮细胞粘附于上述培养容器，由此以不抑制与细胞聚集体的粘附的方式在低粘附性的容器中进行。作为所使用的容器，可以列举孔小的板(例如，孔的底面积以平底换算计为约0.1cm2～约2.0cm2的板)、使用微孔等将细胞封入微小空间的方法、小的离心管等。作为孔小的板，可以列举例如24孔板(面积以平底换算计为约1.88cm2)、48孔板(面积以平底换算计为约1.0cm2)、96孔板(面积以平底换算计为约0.35cm2)、384孔板。作为孔小的板的形状，作为从横向观察孔时的底面的形状，可以为平底结构，也可以为外周部高、内凸部凹陷的结构。作为底面的形状，可以列举例如U底、V底、M底、平底。孔小的板的底面优选为细胞非粘附面的底面、优选Prime surface(住友电木公司制造)等。作为细胞非粘附性的培养容器，可以使用出于降低与细胞的粘附性的目的对培养器的表面人为地进行处理(例如，MPC聚合物等的超亲水性处理、蛋白质低吸附处理等)而得到的培养容器等。
另外，还可以列举使用生物反应器等、利用搅拌培养使其粘附的方法。
另外，为了使视网膜色素上皮细胞粘附于神经视网膜的细胞聚集体表面的整体，优选通过使神经视网膜的细胞聚集体沉淀至孔的底而使其粘附的方法进行培养。
关于视网膜色素上皮细胞的细胞悬液的浓度和用于粘附的培养的期间，本领域技术人员可以通过确认RPE细胞的粘附、增殖而容易地设定。视网膜色素上皮细胞粘附于神经视网膜的细胞聚集体的表面这一点可以通过例如显微镜观察、免疫染色来确认。另外，粘附于神经视网膜的细胞聚集体的表面的视网膜色素上皮细胞发生了增殖这一点可以通过例如显微镜观察、免疫染色来确认。视网膜色素上皮细胞的细胞悬液的浓度具体而言为每一孔1×104个细胞以上、优选为1×105个细胞以上。用于粘附的培养的期间为1天～60天、优选为3天～30天。
在使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞接触之前，优选将神经视网膜的细胞聚集体利用后述的粘附因子(例：细胞外基质)预先进行包被。也可以在粘附因子存在下进行神经视网膜的细胞聚集体和视网膜色素上皮细胞的培养。
作为使神经视网膜的细胞聚集体或作为其一部分的细胞片与视网膜色素上皮细胞片接触的方法，可以列举如下方法：使神经视网膜的细胞聚集体或切出神经视网膜的细胞聚集体而得到的神经视网膜的细胞片利用自重或使用重叠网状物的方法等沉降，从而粘贴于粘附培养中的视网膜色素上皮细胞片上。
在使神经视网膜的细胞片接触之前，优选在视网膜色素上皮细胞片上包被后述的粘附因子(例：细胞外基质)。
利用渗透压差的方法中，例如，在包含甲基纤维素的介质中，使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞接触，进行培养，由此使其粘附。具体而言，使包含神经视网膜的神经视网膜的细胞聚集体漂浮在包含0.1％～20％(例：3％)的甲基纤维素的培养基中，将以达到1000个细胞/μL～1000000个细胞/μL的方式悬浮在培养基中的视网膜色素上皮细胞以少量(1μL～10μL、例：3μL)慢慢地向包含甲基纤维素的培养基中的神经视网膜的细胞聚集体中吐出。通过本操作，在神经视网膜的细胞聚集体的周围形成包含视网膜色素上皮细胞的培养基的液滴，进行一定时间(例：约1小时)培养，由此，利用与包含甲基纤维素的培养基的渗透压的差异，仅使液滴中的培养基扩散至外部的液体，使视网膜色素上皮细胞聚集于神经视网膜的细胞聚集体的周围，由此促进粘附。也可以使用水凝胶等来代替甲基纤维素。
另外，作为上述的3个接触方法中使用的介质，没有特别限定，可以列举例如视网膜系细胞、视网膜色素上皮细胞或神经视网膜的培养中使用的培养基(例：DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、这些培养基的混合培养基、RPE维持培养基等)。另外，更优选包含后述的粘附因子。
在接触步骤中，优选在粘附因子存在下进行接触。粘附因子是指具有使细胞彼此粘附的作用的物质，没有特别限定，可以列举例如上述的细胞外基质、人工水凝胶等。粘附因子不需要是分离开的单个物质，还包含例如Matrigel、视细胞间基质、血清等来自生物体和细胞的制备物。Matrigel是来源于Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基底膜制备物。Matrigel可以通过例如US patent No.4829000中公开的方法制备，也可以购入市售品。Matrigel的主要成分为层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。视细胞间基质是在活体视网膜中的视细胞等视网膜系细胞之间存在的细胞外基质的总称，例如包含透明质酸。视细胞间基质可以由本领域技术人员通过例如将视网膜放置在蒸馏水中使其膨胀、并进行分离这样的方法从活体视网膜采集，也可以购入市售品。作为粘附因子，优选为细胞外基质，进一步优选细胞外基质为选自由透明质酸、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白组成的组中的一种或两种以上的细胞外基质。另外，也可以与细胞外基质一起在EGF等生长因子等其他成分存在下进行接触。作为市售的细胞外基质，可以列举Matrigel(注册商标)、iMatrix511(注册商标)等。
接触步骤中的细胞外基质的浓度根据神经视网膜的细胞聚集体的大小、视网膜色素上皮细胞的细胞数而有所不同，可以由本领域技术人员通过确认RPE细胞的粘附、增殖而容易地设定。例如，若是Matrigel，优选以将已有制品(贝克顿-迪金森(BD)公司)进行200～10000倍稀释后的浓度进行添加，若是iMatrix511，优选以0.1～5ug/ml的浓度进行添加。
具体而言，在包含粘附因子的上述介质中进行用于使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞粘附的培养即可。在上述的用于使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞粘附的培养期间内，可以继续在包含粘附因子的上述介质中进行培养，也可以在包含粘附因子的上述介质中培养一定期间(例：1天～10天)后，更换为不含粘附因子的介质来继续培养。
在进行用于使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞粘附的培养之前，可以将神经视网膜的细胞聚集体或视网膜色素上皮细胞片利用粘附因子进行包被。具体而言，在包含粘附因子的上述介质中对神经视网膜的细胞聚集体或视网膜色素上皮细胞片进行培养即可。本领域技术人员可以适当设定培养时间，进行约10分钟～约5小时(例如10分钟～60分钟)培养即可。培养后，可以利用PBS等介质进行洗涤。
对于进行接触的包含神经视网膜的神经视网膜的细胞聚集体和视网膜色素上皮细胞，在使用上述的制造方法中的不同培养天数的神经视网膜的细胞聚集体和视网膜色素上皮细胞的情况下，错开开始制造的日期即可。在视网膜色素上皮细胞为聚集体或细胞片的情况下，可以在与神经视网膜的细胞聚集体接触之前，对该聚集体或细胞片进行细胞解离酶处理和/或吹吸操作，使细胞解离，形成视网膜色素上皮细胞的细胞悬液后进行接触。
通过使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞接触，两者粘附而形成具备核部和被覆部的球体状细胞聚集体。在使神经视网膜的细胞聚集体与视网膜色素上皮细胞接触后，为了使两者进一步粘附，优选进一步进行培养，以使视网膜色素上皮细胞覆盖神经视网膜的细胞聚集体的表面整体，和/或使视网膜色素上皮细胞具有多边形或铺路石状的细胞形态。所使用的培养基在能够实现上述目的的范围内没有特别限定，可以列举视网膜系细胞、视网膜色素上皮细胞或神经视网膜的培养中使用的培养基(例：DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、这些培养基的混合培养基、RPE维持培养基等)。另外，本领域技术人员可以在显微镜下对细胞的粘附的状态和神经视网膜的细胞聚集体表面中的视网膜色素上皮细胞的存在比例进行确认，另外，可以确认视网膜色素上皮细胞显示出多边形或铺路石状的细胞形态，可以通过确认该形状来设定培养天数。实施上述的接触步骤后，可以在例如约1天～约100天(约5天～约50天)的范围内进行培养。
[毒性或药效评价用试剂和被测物质的毒性或药效评价方法]
本发明的一个实施方式的被测物质的毒性或药效评价用试剂含有本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分而成，本发明的一个实施方式的被测物质的毒性或药效评价方法包括：使被测物质与本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分接触，对被测物质给该球体状细胞聚集体或该球体状细胞聚集体中包含的细胞带来的影响进行检验。
例如，从基于视网膜组织的损害的疾病、特别是基于遗传性损害的疾病的人患者制作iPS细胞，使用该iPS细胞，通过本发明的方法制造球体状细胞聚集体。球体状细胞聚集体可以在体外重现成为该患者所罹患的疾病的原因的视网膜组织的损害。因此，本发明提供一种被测物质的毒性或药效评价方法，其包括：使被测物质与通过本发明的制造方法制造的球体状细胞聚集体接触，对被测物质给该球体状细胞聚集体或该球体状细胞聚集体中包含的细胞带来的影响进行研究。
[治疗药、治疗方法和药物组合物]
本发明的一个实施方式的治疗药为含有球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分而成的、基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病(特别是视细胞和视网膜色素上皮细胞同时发生了损害或损伤的重症例)的治疗药。本发明的一个实施方式的治疗方法为一种基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病(特别是视细胞和视网膜色素上皮细胞同时发生了损害或损伤的重症例)的治疗方法，其包括：对需要移植的对象移植有效量的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分。本发明的一个实施方式的药物组合物含有本发明的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分作为有效成分。本发明的一个实施方式的药物组合物作为基于视网膜色素上皮细胞、视网膜系细胞或视网膜组织的损害或者视网膜组织的损伤的疾病(特别是视细胞和视网膜色素上皮细胞同时发生了损害或损伤的重症例)的治疗药有用。
作为基于视网膜组织的损害的疾病，可以列举例如作为眼科疾病的黄斑变性症、老年性黄斑变性、视网膜色素变性、青光眼、角膜疾病、视网膜脱离、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视锥营养不良、视锥视杆营养不良等。作为视网膜组织的损伤状态，可以列举例如视细胞发生了变性坏死的状态等。
本发明的一个实施方式的治疗药或药物组合物可以包含有效量的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分、和作为药物可接受的载体。移植用球体状细胞聚集体的有效量根据给药目的、给药方法、给药对象的状況(性别、年龄、体重、病情等)而有所不同，例如，作为细胞数，可以设定为1×105个、1×106个或1×107个。
作为作为药物可接受的载体，可以使用生理性水性溶剂(生理盐水、缓冲液、无血清培养基等)。根据需要，在移植医疗中，也可以在包含要移植的组织或细胞的药物中配合通常使用的保存剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。
本发明的一个实施方式的治疗药或药物组合物可以通过将本发明的球体状细胞聚集体或该细胞聚集体的一部分利用适当的生理性水性溶剂进行悬浮而以细胞悬液的形式制造。若有需要，也可以添加冷冻保存剂进行冷冻保存，在使用时解冻，利用缓冲液洗涤后用于移植医疗。
一个方式中，可以将本发明的球体状细胞聚集体使用镊子、小刀、剪刀等细切为适当的大小，为了移植聚集体的一部分而切出后利用。切出后的形状没有特别限定，可以列举细胞片。
[球体状细胞聚集体的一部分及其制造方法]
本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体的一部分为本发明的球体状细胞聚集体的一部分，例如可以通过从本发明的球体状细胞聚集体物理切出来得到。球体状细胞聚集体的一部分的形状没有限制，可以不为球体状。球体状细胞聚集体的一部分为具备神经视网膜以及连续地或断续地覆盖其表面的至少一部分的、包含相互接触的视网膜色素上皮细胞的被覆部的细胞聚集体，例如，可以为包含视网膜色素上皮细胞和神经视网膜的细胞片。
本发明的一个实施方式的球体状细胞聚集体的一部分的制造方法包括物理切出本发明的球体状细胞聚集体的一部分的步骤。切出步骤可以通过通常的方法、例如使用镊子、小刀、剪刀等细切为适当的大小的方法来实施。
实施例
以下，列举实施例对本发明详细地进行说明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
<实施例1视网膜色素上皮(RPE)细胞与神经视网膜(NR)的分别形成>
将以具有Crx::Venus报告基因的方式进行了基因改造的人ES细胞(Kh-ES1株、Cell Stem Cell,10(6),771-785,(2012)依据“Scientific Reports,4,3594(2014)”中记载的方法在无饲养层条件下进行培养。作为无饲养层培养基，使用StemFit培养基(商品名：AK03N、味之素公司制造)，作为代替饲养细胞的基底，使用层粘连蛋白(Laminin)511-E8(商品名、Nippi公司制造)。
具体的人ES细胞的维持培养操作如下进行。首先，将达到亚汇合(培养面积的6成被细胞覆盖的程度)的人ES细胞(KhES-1株)用PBS洗涤后，使用TrypLE Select(商品名、Life Technologies公司制造)分散为单个细胞。然后，将分散为单个细胞的人ES细胞接种至用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿中，在Y27632(ROCK抑制剂、10μM)存在下在StemFit培养基中，在无饲养层条件下进行培养。在使用6孔板(IWAKI公司制造、细胞培养用、培养面积9.4cm2)作为上述塑料培养皿的情况下，上述分散为单个细胞的人ES细胞的接种细胞数设定为每一孔1.2×104个细胞。在接种的1天后，更换为不含Y27632的StemFit培养基。之后，每1天～2天一次用不含Y27632的StemFit培养基进行培养基更换。然后，在接种的6天后培养至达到亚汇合的1天前。
将该亚汇合1天前的人ES细胞在下述两个条件、(1)在SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM)存在下、或(2)在SAG和SB431542(TGFβ信号转导通路抑制剂、5μM)存在下，在无饲养层条件下培养1天(以下也有时记载为预处理)。
将预处理后的人ES细胞用PBS洗涤后，使用TrypLE Select进行细胞分散液处理，进一步通过吹吸操作分散为单个细胞，然后，将分散为单个细胞的人ES细胞以达到非细胞粘附性的96孔培养板(商品名：PrimeSurface 96孔V底板、住友电木公司制造)的每一孔1.2×104个细胞的方式悬浮于100μL的无血清培养基中，在37℃、5％CO2下进行悬浮培养。此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)使用在F-12培养基与IMDM培养基的1：1混合液中添加有10％KSR、450μM 1-单硫代甘油、1×化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically defined lipidconcentrate)的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天)向上述无血清培养基中添加Y27632(ROCK抑制剂、终浓度20μM)。另外，在同时添加或不添加SAG(Shh信号转导通路激动剂、30nM)的条件下进行研究。在悬浮培养开始后第3天，使用不含Y27632和SAG而含有人重组BMP4(商品名：Recombinant Human BMP-4、R&D公司制造)的培养基，添加50μL的以终浓度1.5nM包含外源性的人重组BMP4的培养基。
将这样制备的细胞在悬浮培养开始后第3、6、9、15和18天用无血清培养基(gfCDM+KSR)进行半量更换。将该悬浮培养开始后第15或18天的聚集体转移至90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制造)中，利用包含Wnt信号转导通路激动剂(CHIR99021、3μM)和FGF信号转导通路抑制剂(SU5402、5μM)的无血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加有1％N2补充剂的培养基)在37℃、5％CO2下培养3～4天。然后，在90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制造)中，利用不包含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导通路抑制剂的血清培养基(在DMEM/F12培养基(Thermo fisher公司制造)中添加有10％胎牛血清、1％N2补充剂(Thermofisher公司制造)、牛磺酸的培养基；以下有时记载为NucT0培养基)进行长期培养。2～4天一次用上述血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第38天使用显微镜和荧光显微镜进行观察(图1)。
其结果是，在进行基于SAG和SB添加的预处理、在分化诱导开始时未添加SAG的情况下，RPE的制作效率良好(图1B、B’)。在上述以外的条件下，包含具有CRX阳性的视细胞前体细胞的神经视网膜的细胞聚集体的制作效率良好(图1A、A’、C、C’、D、D’)。
<实施例2NR与RPE细胞的粘附1>
将如实施例1那样制成的RPE细胞和NR分别在悬浮培养开始后第40天以后用不包含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导抑制剂的血清培养基(将NucT0培养基与NucT2培养基以1：3进行混合而成的培养基；以下有时记载为NucT1培养基。需要说明的是，NucT2培养基是指在Neurobasal Medium(Thermo fisher公司制造)中添加有10％FBS、B27补充剂w/o V.A.(Thermo fisher公司制造)、L-谷氨酰胺、牛磺酸、T3的培养基。)长期培养至第59天。该悬浮培养开始后第60天以后，用不包含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导抑制剂的血清培养基(NucT2培养基)进行长期培养。
分别准备悬浮培养开始后第80～90天的RPE细胞和第50～120天的NR，分别如下所述进行处理(图2A)。
RPE细胞：用PBS(Thermo fisher公司制造)洗涤后，利用Tryple select(Thermofisher公司制造)进行15～30分钟的酶处理，进行吹吸，由此形成单细胞，从40μm的细胞过滤网(Cell strainer)通过后，悬浮于Nuc培养基中。
NR：将NR回收至管中，利用iMatrix511(Nippi公司制造)或Matrigel(BD公司制造)实施15～60分钟包被，用PBS洗涤。
将以上述方式制备的NR和RPE细胞接种至低粘附的PrimeSurface(注册商标)96V板(住友电木公司制造)。接种1小时后，使用显微镜和荧光显微镜进行观察。其结果确认到，在NR的周围单细胞化的RPE细胞沉到孔的底部并聚集(图2B、B’)。另外，在第二天用PBS洗涤，利用显微镜和荧光显微镜进行观察，结果确认到，在NR的表面粘附有RPE细胞(图2C、C’、D、D’)。
对粘附后第1天、第6天、第45天的经时变化进行观察。其结果是，利用荧光显微镜确认到，在第1天粘附的RPE细胞在第6天慢慢增殖而开始覆盖NR表面，在第45天覆盖住NR表面(图3E、F、G)。另外，利用荧光显微镜还确认到，在第45天粘附于NR表面的RPE细胞形成六边形结构(图3H、H’)。
在粘附后第50天，将NR-RPE细胞的聚集块用4％PFA固定，制作冷冻切片。对于这些冷冻切片，使用抗MITF抗体(商品名：Anti MITF Antibody、EX alpha公司制造)对MITF蛋白质进行免疫染色。使用共聚焦荧光显微镜对这些免疫染色后的切片进行观察。其结果确认到，在使NR和RPE细胞粘附后的聚集体中，在CRX阳性的视细胞前体细胞的表面局部存在有MITF阳性的RPE细胞(图4I、J)。
由这些结果可知，使各自分别形成的RPE细胞与NR粘附，可以制作在NR上局部存在有RPE细胞的NR-RPE细胞片。
<实施例3NR与RPE细胞的粘附2>
将如实施例1那样制作的RPE细胞和NR分别在悬浮培养开始后第40天以后用不包含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导抑制剂的血清培养基(在将NucT0培养基与NucT2培养基以1：3进行混合而成的NucT1培养基中培养。NucT2培养基：在Neurobasal Medium中添加有10％FBS、B27补充剂w/o V.A.、L-谷氨酰胺、牛磺酸、T3的培养基)长期培养第59天。该悬浮培养开始后第60天以后，用不包含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导抑制剂的血清培养基(NucT2培养基)进行长期培养。
使用移液管，向添加有3％甲基纤维素(Sigma aldrich公司制造)的血清培养基中添加悬浮培养开始后第50～120天的NR，使其悬浮。另外，回收悬浮培养开始后第80～90天的RPE细胞的聚集体约10个，用PBS洗涤，利用Tryple select(Thermo fisher公司制造)进行15～60分钟酶处理，进行吹吸，由此进行单细胞化。使单细胞化的RPE细胞从40μm的Cellstrainer(Falcon公司制造)通过后，以800rpm进行离心，除去上清。添加10μL的培养基，然后回收3μl，在添加有3％甲基纤维素(Sigma aldrich公司制造)的血清培养基中向NR吐出(图5A、B)。在1小时以内利用显微镜和荧光显微镜进行观察，结果确认到，单细胞化的RPE细胞附着于NR(图6C、C’)。在粘附13天后，利用显微镜和荧光显微镜进行观察，结果确认到，粘附于NR上(图6D、D’)。
由这些结果可知，通过将各自分别形成的RPE细胞和NR添加到添加有甲基纤维素的培养基中，能够使RPE细胞粘附于NR上。
<实施例4：NR-RPE细胞片的移植和成活确认>
使实施例2中制作的NR-RPE细胞片在Nuc T2培养基中接合后培养5天和50天(图7A、A’、D、D’)。对于上述培养后的NR-RPE细胞片，同时切出NR和RPE细胞(图7B、B’、C、C’、E、E’、F、F’)。利用显微镜和荧光显微镜进行观察，结果，从外侧观察时，观察到RPE细胞发生了粘附，从内侧观察时，几乎没有观察到RPE细胞，能够良好地确认到CRX::Venus的荧光。因此，能够在NR-RPE细胞片中具有极性地进行切出。
将以上述方式切出的NR-RPE细胞片使用注射器移植到作为视细胞变性模型的视网膜变性大鼠的视网膜下。在移植5个月以上后，将眼组织进行多聚甲醛固定(PFA固定)，进行蔗糖置换。使用冷冻切片机(Cryostat)，制作组织切片(图8G、G’)。将切片在显微镜和荧光显微镜下进行观察，结果，在宿主(Host)的RPE上具有RPE层，在其上确认到CRX::Venus阳性的视细胞玫瑰花结(Rosette)(图8G、G’)。
通过免疫染色，使用视紫红质抗体(商品名：抗RetP1抗体、Sigma公司制造)对移植后的移植物进行评价。另外，使用人细胞质标志物特异性的小鼠单克隆抗体(商品名：Stem121、TaKaRa公司制造)、抗RPE65抗体(商品名：RPE65抗体、Millipore公司制造)，分别对组织切片中的人细胞、RPE细胞进行染色，对移植后的移植物进行评价。
将染色后的组织使用共聚焦显微镜(商品名：TCS SP8、Leica公司制造)进行荧光观察。结果可知，视细胞为视紫红质阳性，可知在与RPE细胞同时移植后的视细胞中也没有问题地成熟(图9H)。另外，对利用Stem121和RPE65染色后的切片进行观察，结果可知，下侧的RPE65阳性的RPE层为Stem121阴性，因此为宿主的RPE细胞；另一方面，位于其上侧的RPE65阳性的RPE层为Stem121阳性，因此为移植物来源的RPE层(图10I)。另外，在紧挨移植物来源的RPE层的上侧观察到CRX::Venus阳性的视细胞玫瑰花结。
由上述结果表明，在NR-RPE细胞片的同时移植中视细胞成熟，并且NR和RPE细胞能够具有取向性地同时移植、成活。
Claims (13)
1.一种球体状细胞聚集体，其具备包含神经视网膜的核部和连续地或断续地覆盖所述核部的表面的至少一部分的被覆部，所述球体状细胞聚集体的特征在于，
(1)在所述神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，所述视细胞层至少包含选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞，所述视细胞层中包含的细胞在所述核部的表面的切线方向上连续地存在，
(2)所述被覆部包含相互接触的视网膜色素上皮细胞，
(3)所述细胞聚集体不包含晶状体、玻璃体、角膜和血管，并且
(4)所述视网膜色素上皮细胞没有与所述神经视网膜层一起构成连续的上皮结构。
2.如权利要求1所述的球体状细胞聚集体，其中，在(1)中的视细胞层与覆盖该视细胞层的至少一部分的视网膜色素上皮细胞之间还存在细胞外基质。
3.如权利要求2所述的球体状细胞聚集体，其中，细胞外基质为选自由透明质酸、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白组成的组中的一种或两种以上的细胞外基质。
4.权利要求1～3中任一项所述的球体状细胞聚集体的制造方法，其包括：
制备神经视网膜的细胞聚集体的步骤，所述神经视网膜的细胞聚集体为包含神经视网膜的球体状细胞聚集体，
(I)所述神经视网膜的细胞聚集体中，所述神经视网膜存在于所述细胞聚集体的表面，并且
(II)在所述神经视网膜中形成有至少包含视细胞层的神经视网膜层，在所述视细胞层中存在有选自由视细胞、视细胞前体细胞和视网膜前体细胞组成的组中的一种以上的细胞；
制备视网膜色素上皮细胞的步骤；和
使所述神经视网膜的细胞聚集体和所述视网膜色素上皮细胞接触的步骤。
5.如权利要求4所述的制造方法，其中，所述神经视网膜的细胞聚集体中的所述神经视网膜中的Chx10阳性细胞的存在比例为20％以上。
6.如权利要求4或5所述的制造方法，其中，在接触步骤中，在粘附因子存在下进行接触。
7.如权利要求6所述的制造方法，其中，粘附因子为细胞外基质。
8.如权利要求7所述的制造方法，其中，细胞外基质为选自由透明质酸、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白组成的组中的一种或两种以上的细胞外基质。
9.如权利要求4或5所述的制造方法，其中，神经视网膜的细胞聚集体和视网膜色素上皮细胞中的至少一者来源于多能干细胞。
10.如权利要求4或5所述的制造方法，其中，在制备视网膜色素上皮细胞的步骤中，视网膜色素上皮细胞以细胞片或细胞悬液的形式制备。
11.如权利要求4或5所述的制造方法，其中，在接触步骤后，进一步培养至视网膜色素上皮细胞具有多边形或铺路石状的细胞形态。
12.一种球体状细胞聚集体的一部分，其是从权利要求1～3中任一项所述的球体状细胞聚集体物理切出而成的，
所述球体状细胞聚集体的一部分为包含视网膜色素上皮细胞和神经视网膜的细胞片。
13.一种球体状细胞聚集体的一部分的制造方法，其包括物理切出权利要求1～3中任一项所述的球体状细胞聚集体的一部分的步骤，
所述球体状细胞聚集体的一部分为包含视网膜色素上皮细胞和神经视网膜的细胞片。
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