CN106754636A - 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用 - Google Patents

体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用。本发明提供一种由化学成分确定的肝细胞胆管化培养基和/或肝细胞成熟培养基组成的原代肝细胞长期稳定培养、扩增和分化体系；本发明还提供了一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法，可诱导原代肝细胞在体外转化为胆管样肝细胞，具有胆管上皮细胞和肝脏前体细胞特征，并可长期稳定培养和扩增。本发明制备得到的可增殖的胆管样肝细胞和分化成熟的肝细胞，可应用于化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、制备生物人工肝等方面。

Description

体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法 及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用。
背景技术
肝脏具有强大的再生能力，在正常情况下的肝脏稳态维持和肝切除术后，肝再生主要由成熟肝细胞完成，在慢性肝损伤时，肝再生表现为胆管样增生。胆管样细胞的来源有胆管来源与肝细胞来源两种，肝细胞来源的胆管样肝细胞被证明在肝再生中发挥主要作用(Tarlow,B.D.et al.Bipotential adult liver progenitors are derived fromchronically injured mature hepatocytes.Cell stem cell 15,605-618,2014)。以上表明肝再生主要由肝细胞完成，再生以两种形式进行，一种是肝切除后的肝细胞直接增殖，一种是慢性损伤时的肝细胞胆管化增殖。
肝细胞有巨大的应用前景，但无法在体外长期大量扩增。肝细胞在体外培养时表现出典型的胆管样改变，并可具有一定前体细胞特性，提示肝细胞在体外可以胆管化的方式进行增殖。
在生物工程技术领域的研究中，较多集中在诱导胚胎干细胞、人脐带间充质干细胞定向分化为肝细胞；或者将成纤维细胞通过谱系重编程转化为肝细胞；也有文献报道通过活化肝星状细胞可促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞(Yu Y.,et al.Cell therapiesfor liver diseases.Liver Transpl.18(1):9-21，2012)肝前体细胞可向肝细胞和胆管上皮细胞分化(Miyajima A.,et al.Stem/progenitor cells in liver development,homeostasis,regeneration,and reprogramming.Cell Stem Cell.14(5):561-74，2014)。
目前尚无文献报导体外诱导原代肝细胞胆管化，并长期培养、扩增和分化的方法。而胆管样的细胞不仅可用于化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、生物人工肝的制备等等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系和方法，本发明的另一目的在于通过上述体系和方法获得的胆管化肝细胞的应用。
在早期的肝细胞培养体系中，原代肝细胞可表现出一些胆管化特征，比如形态变化和表达CK9等胆管上皮细胞标志物等，但细胞不能长期存活，一般在2-3周细胞发生衰老和死亡。
本发明的第一方面，提供一种由化学成分确定的肝细胞胆管化培养基和/或肝细胞成熟培养基组成的原代肝细胞长期稳定培养、扩增和分化体系。在肝细胞胆管化培养基中，成熟肝实质细胞被诱导转化为胆管样肝细胞，其具有胆管上皮细胞和肝脏前体细胞的特征，可长期稳定培养和扩增。在肝细胞成熟培养基中，增殖的胆管样肝细胞可分化并表现出成熟肝细胞的功能和特征。
一种原代肝细胞长期培养和扩增体系，即一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，该体系包括一种肝细胞胆管化培养基和/或一种肝细胞成熟培养基；
所述的肝细胞胆管化培养基包括：
液体基础培养基、
细胞培养营养添加物、
生长因子、
Hedgehog信号通路活化剂、
Notch信号通路活化剂和
Wnt信号通路活化剂；
更优的，所述的肝细胞胆管化培养基还包括：
Rho相关蛋白激酶抑制剂、
G蛋白偶联受体激动剂，和
转化生长因子-β通路抑制剂。
所述的液体基础培养基，选自DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基，或F12细胞培养基等中的一种或两种以上。
所述的细胞培养营养添加物，选自胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液细胞培养添加物、N2细胞培养营养添加物、B27细胞培养营养添加物等中的一种或两种以上。
所述的N2其成分为本领域公知常识，可参见文献Bottenstein JE,SatoGH.Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplementedmedium.Proc Natl Acad Sci U S A.1979Jan；76(1):514-7.
所述的B27细胞培养添加物为Thermo Scientific公司商品化产品。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-20％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-20％的N2。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-20％的B27。
所述的生长因子，选自表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、白介素-6、抑瘤素等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的表皮生长因子。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的成纤维细胞生长因子2。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的血管内皮生长因子。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的血小板衍生生长因子。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的肝细胞生长因子。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的白介素-6。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100ng/ml的抑瘤素M。
所述的Hedgehog通路活化剂，选自重组Hh或Shh蛋白、SAG、purmorphamine等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有10ng/ml-10μg/ml的Shh蛋白。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的SAG。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的purmorphamine。
所述的Notch通路活化剂，选自重组DLL-1蛋白、Jagged-1蛋白中的一种或两种。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.5-50μg/ml的DLL-1蛋白。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.5-50μg/ml的Jagged-1蛋白。
所述的Wnt通路活化剂，选自重组Wnt蛋白、重组R-spondin(Rspo)蛋白、糖原合成酶激酶3β抑制剂如BIO、CHIR99021、TWS119等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有5-500ng/ml的重组Wnt3a蛋白。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有5-2000ng/ml的重组R-spondin蛋白。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基0.01-50μM的糖原合成酶激酶3β抑制剂BIO。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基0.01-50μM的糖原合成酶激酶3β抑制剂CHIRP99021。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基0.01-50μM的糖原合成酶激酶3β抑制剂TWS119。
所述的Rho相关蛋白激酶抑制剂，选自Fasudil、Y-27632、Thiazovivin、SB-772077-B等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂Fasudil。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632。
优选的，所述的所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂Thiazovivin。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂SB-772077-B。
所述的G蛋白偶联受体激动剂，选自溶血磷脂酸、1-磷酸神经鞘氨醇中的一种或两种。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的溶血磷脂酸。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的1-磷酸神经鞘氨醇。
所述的转化生长因子-β通路抑制剂，选自RepSox、SB431542、A83-01等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-50μM的RepSox。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100μM的SB431542。
优选的，所述的肝细胞胆管化培养基含有0.1-100μM的A83-01。
所述的糖原合成酶激酶3β抑制剂可以是BIO、CHIR99021、TWS119，或者是其它糖原合成酶抑制剂。
所述的Rho相关蛋白激酶抑制剂可以是Fasudil、Y-27632、Thiazovivin、SB-772077-B，或者是Rho相关蛋白激酶抑制剂。
所述的G蛋白偶联受体激动剂可以是溶血磷脂酸、1-磷酸神经鞘氨醇，或者是其它G蛋白偶联受体激动剂。
所述的转化生长因子-β通路抑制剂可以是RepSox、SB431542、A83-01，也可以是其它转化生长因子-β通路抑制剂。
所述的肝细胞成熟培养基包括：
液体基础培养基、
细胞培养营养添加物、
抑瘤素M、
糖皮质激素、
转化生长因子-β通路抑制剂，和
Notch信号通路抑制剂。
更优的，所述的肝细胞成熟培养基还包括：
组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
所述的液体基础培养基，选自DMEM/F12细胞培养基，William E细胞培养基，Neurobasal Medium细胞培养基，MEM细胞培养基，DMEM细胞培养基，1640RPMI细胞培养基，F12细胞培养基等中的一种或两种以上。
所述的细胞培养营养添加物，选自胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液细胞培养添加物、N2细胞培养营养添加物、B27细胞培养营养添加物等中的一种或两种以上。
所述的N2其成分为本领域公知常识，可参见文献Bottenstein JE,SatoGH.Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplementedmedium.Proc Natl Acad Sci U S A.1979Jan；76(1):514-7.0.1-20％
所述的B27细胞培养添加物为Thermo Scientific公司商品化产品。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-20％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-20％的N2。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-20％的B27。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-100ng/ml的抑瘤素M。
所述的糖皮质激素，选自地塞米松、氢化可的松等一种或两种。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.01-100μM的地塞米松。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.01-100μM的氢化可的松。
所述的转化生长因子-β通路抑制剂，选自RepSox、SB431542、A83-01等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-50μM的RepSox。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-100μM的SB431542。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-100μM的A83-01。
所述的Notch信号通路抑制剂，选自γ-分泌酶抑制剂包括但不限于LY-411575、Compound E、DAPT等中的一种或两种以上。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.01-50μM的LY-411575。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.01-50μM的Compound E。
优选的，所述的肝细胞成熟培养基含有0.1-100μM的DAPT。
所述的糖皮质激素可以是地塞米松、氢化可的松，或者是其它糖皮质激素。
所述的转化生长因子-β通路抑制剂可以是RepSox、SB431542、A83-01，或者是其它转化生长因子-β通路抑制剂。
所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以是丙戊酸(VPA)、伏立诺他(SAHA)、曲古柳菌素(TSA)，或者是其它组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
所述的γ-分泌酶抑制剂可以是LY-411575、Compound E、DAPT，或者是其它γ-分泌酶抑制剂。
在本发明的一个优选实施例中，提供了一种原代肝细胞长期培养和扩增体系，包括一种肝细胞胆管化培养基和/或一种肝细胞成熟培养基；
所述的肝细胞胆管化培养基包括：
液体基础培养基为DMEM/F12，1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，50ng/ml表皮生长因子，20ng/ml肝细胞生长因子，20ng/ml成纤维细胞生长因子-2，20ng/ml白介素-6，20ng/ml抑瘤素M，200ng/ml的Shh蛋白，1μM的SAG或1μM的purmorphamine，5μg/ml的Jagged-1或5μg/ml的DLL-1，200ng/ml的Wnt3a或500ng/ml的Rspo，5μM的BIO或1μM的CHIR99021 或5μM的TWS119。10μM的Y-27632或2μM的Thiazovivin或3μM的Fasudil。5μM的溶血磷脂酸。1μM的1-磷酸神经鞘氨醇。10μM的SB431542或1μM的A83-01或2μM的RepSox。
所述的肝细胞成熟培养基包括：
液体基础培养基为培养基为DMEM/F12，1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，20ng/ml抑瘤素M，10μM的SB431542或1μM的A83-01或2μM的RepSox，1μM的LY-411575，10μM的DAPT或1μM Compound E，10μM地塞米松或1μM氢化可的松，10μM的丙戊酸或1μM伏立诺他或1μM曲古柳菌素。
本发明提供了一种化学成分明确的用于哺乳动物包括鼠或人原代肝细胞胆管化培养基，可诱导原代肝细胞在体外转化为胆管样肝细胞，其具有胆管上皮细胞和肝脏前体细胞特征，可长期稳定培养和增殖。
本发明还提供了一种化学成分明确的肝细胞成熟培养基，增殖的胆管样肝细胞可在肝细胞成熟培养基中分化并表现出成熟肝细胞的功能和特征。
本发明获得的胆管样肝细胞来自成熟肝细胞，具有胆管上皮细胞和肝脏前体细胞的特性。
本发明的第二方面，提供了一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法，本发明的方法可诱导原代肝细胞在体外转化为胆管样肝细胞，具有胆管上皮细胞和肝脏前体细胞特征，并可长期稳定培养和扩增。该方法还可使增殖的胆管样肝细胞重新分化为成熟肝细胞，可在体外和体内实现成熟肝细胞功能。
一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法，包括以下步骤：
A、采用胞外基质蛋白对培养支持物进行预包被；
所述的胞外基质蛋白可以是胶原蛋白I、层粘蛋白或Matrigel基质胶等胞外基质蛋白。
优选的，所述的胶原蛋白I，包被液浓度为1-5μg/cm2。
优选的，所述的层粘蛋白，包被浓度为0.2-200μg/ml。
优选的，所述的Matrigel基质胶，包被浓度为0.05-10％。
所述的培养支持物是指培养皿或培养板等。
B、将原代肝脏细胞接种入步骤A提供的经预包被的培养支持物上，在前述的肝细胞胆管化培养基中进行培养和扩增；
所述的肝脏细胞是从成年哺乳动物包括鼠和人的肝脏中，经两步胶原酶灌注法获得的细胞，两步胶原酶灌注法为公知常识，可参考文献(Maurel P.，Hepatocytes-Methodsand Protocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)。
所述的原代肝脏细胞包括成熟肝细胞、小肝细胞和具有双向分化潜能的肝前体细胞。
所述的肝脏细胞在前述培养基中出现胆管样改变，并可长期稳定培养和扩增。
C、利用前述的肝细胞成熟培养基，将步骤B获得的可增殖的胆管样肝细胞分化为成熟肝细胞。
本发明的第四方面，是提供根据前述的一种哺乳动物包括鼠和人原代肝脏细胞长期稳定培养、扩增和分化成熟的方法，制备得到的可增殖的胆管样肝细胞和分化成熟的肝细胞。
本发明的第五方面，是提供根据所述的胆管样肝细胞和成熟肝细胞在化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、制备生物人工肝等方面的应用。
本发明证明肝细胞在体外发生胆管化改变，建立了扩增胆管化肝细胞的培养方法，体外培养的肝细胞可分化成熟，并可重建Fah小鼠肝脏。我们的研究提供了新的肝细胞体外扩增解决方案，为肝脏再生医学和药物发现提供了希望。
本发明的有益效果在于：
1)原代肝细胞在增殖培养基中向胆管样肝细胞转化，所述的胆管样肝细胞具有在体外长期稳定增殖的能力；
2)可增殖的胆管样肝细胞可在分化培养基中分化成熟，重新获得成熟肝细胞的功能；
3)肝细胞通过胆管化进行增殖和分化是体内肝再生的重要机制，该现象在体内广泛存在，本发明在体外重现了该过程，并解决了肝细胞在体外无法长期培养的难题；
4)本发明提供的培养体系和培养方法简便易行，有利于推广和应用；
5)本发明提供的肝细胞可反复冻存和复苏，为细胞的存储、转运和使用提供了便利；
6)不同个体肝细胞具有较大的异质性，通过本发明的方法可建立由不同个体肝细胞组成的肝细胞库，为药物筛选和毒性检测提供更全面群体样本，也为肝细胞的个性化治疗建立了基础。
附图说明
图1为明视野显示原代肝细胞在增殖培养基中出现胆管样改变，并可长期稳定增殖(A)；RT-PCR显示原代肝细胞在增殖培养基中成熟肝细胞标志逐渐降低，胆管上皮细胞和肝前体细胞标志物表达升高(B)；免疫荧光显示可增殖的胆管样肝细胞表达CK19，但不表达白蛋白(C)。HGM代表传统肝细胞培养基，HEM为本发明采用的培养基。
图2为基因芯片数据经Pearson分析显示胆管化可增殖的肝细胞(eHep)具有与胎肝前体细胞和原代胆管上皮细胞接近的基因表达模式。
图3为肝细胞增殖培养基(HEM)中的不同组成成分分别被去除后，肝细胞胆管化增殖能力均呈现不同程度的下降；***，p<0.001。
图4为核型分析显示可增殖的胆管样肝细胞具有正常的核型结构。
图5为Alb-Cre/R26-YFP小鼠模式图，该小鼠肝细胞分离培养后可见部分YFP阴性的细胞存活，经数次传代后，仅YFP阳性的肝细胞可长期稳定培养和扩增。
图6为RT-PCR显示在分化培养基中培养的胆管样肝细胞，其成熟肝细胞标志逐渐升高，胆管上皮细胞和肝前体细胞标志物表达下降(A)；明视野显示分化成熟的肝细胞具有多边形和双核形态，免疫荧光显示分化的肝细胞表达E-cadherin、HNF4α和白蛋白，但不表达CK19(B)；糖原染色显示分化成熟的肝细胞合成糖原；DCFDA染色显示分化成熟的肝细胞出现极性，形成微胆管结构；BODIPY染色显示分化后的细胞出现脂滴聚集(C)。
图7为基因芯片分析显示体外分化成熟的肝细胞与原代成熟肝细胞具有接近的基因表达模式。
图8为将体外培养、扩增并分化成熟的野生型肝细胞移植给Fah-/-小鼠后，可见移植细胞大量重建宿主的肝脏；下图为上图的局部放大。
图9明视野显示人原代肝细胞(第一天)在增殖培养基中出现胆管样改变(第三天)，并可长期稳定增殖。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作详细描述，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：培养小鼠原代肝细胞
采用1.25％的Matrigel或20μg/ml的Laminin包被培养皿，以覆盖底面为宜，放置37℃一小时后使用。
采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞。
接种1-2×104/cm2肝实质细胞至前述包被的培养皿中，肝细胞胆管化培养基为DMEM/F12(Invitrogen公司)，包含1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液(Invitrogen公司)，50ng/ml表皮生长因子(Peprotech公司)，20ng/ml肝细胞生长因子(Peprotech公司)，20ng/ml成纤维细胞生长因子-2(Peprotech公司)，20ng/ml白介素-6(Peprotech公司)，20ng/ml抑瘤素M(Peprotech公司)，200ng/ml的Shh蛋白(Peprotech公司)，1μM的SAG(MCE公司)或1μM的purmorphamine(MCE公司)，5μg/ml的Jagged-1(Abcam公司)或5μg/ml的DLL-1(Peprotech公司)，200ng/ml的Wnt3a(Peprotech公司)或500ng/ml的Rspo(Peprotech公司)，5μM的BIO(MCE公司)或1μM的CHIR99021(MCE公司)或5μM的TWS119(Secllek公司)，2μM的Thiazovivin(MCE公司)或10μM的Y27632(MCE公司)或3μM的Fasudil(MCE公司)，5μM的溶血磷脂酸(Santa Cruz公司)，1μM 1-磷酸神经鞘氨醇(Santa Cruz公司)，1μM的A83-01(MCE公司)或10μM的SB431542(Secllek公司)或2μM的RepSox(Secllek公司)。
原代细胞形态在肝细胞胆管化培养基中发生改变，肝细胞失去极性和双核特征，胞体拉长出现成纤维细胞样变化(图1A)。采用RT-PCR检测不同时间点肝细胞相关基因表达，结果发现成熟肝细胞标志白蛋白(Alb)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、肝细胞核转录因子4α(HNF4α)等表达水平逐渐降低，而胆管上皮细胞标志物如细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白19(CK19)和Sox9等表达逐渐升高(图1B)。免疫荧光检测进一步证实，该过程中成熟肝细胞标志如白蛋白逐渐消失，胆管上皮细胞标志物如CK19显著升高(图1C)。
上述结果提示在本方法的培养条件下，肝细胞发生了胆管化改变。采用安捷伦公司小鼠全基因组寡核苷酸基因芯片，对胆管化的肝细胞(eHep)进行基因表达分析，结合已发表的小鼠原代肝细胞、原代胆管上皮细胞、小鼠胎肝细胞(E13.5)、Fox1+成体肝脏干细胞等基因芯片数据进行Pearson分析，结果表明胆管化的肝细胞与胎肝细胞和胆管上皮细胞具有接近的基因表达模式，进一步表明肝细胞经体外培养后表现出胆管化的特征(图2)。
为了确定肝细胞增殖培养基(HEM)中不同成分的作用，分别将培养基中的各种组分去除，观察肝细胞胆管化增殖速度的变化：“HEM-生长因子”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除生长因子；“HEM-Hedgehog通路活化剂”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除Hedgehog信号通路活化剂；“HEM-Notch通路激动剂”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除Notch信号通路活化剂；“HEM-ROCK抑制剂”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除Rho相关蛋白激酶抑制剂；“HEM-GSK3β抑制剂”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除糖原合成酶激酶3β抑制剂；“HEM-GPCR激动剂”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除G蛋白偶联受体激动剂；“HEM-ALK抑制剂”表示本发明的肝细胞增殖培养基(HEM)中其他成份不变，仅去除转化生长因子-β通路抑制剂。
结果发现与HEM比较，减去以上这些不同成分后均不同程度地降低细胞增殖速率，提示HEM中的各种组分协同发挥促进肝细胞胆管化增殖的作用(图3)。
进入稳定增殖状态后，胆管化肝细胞可持续传代达到30代以上，核型分析显示可增殖的胆管化肝细胞保持正常核型(图4)。
为证明所述胆管样肝细胞来自成熟肝细胞，采用了Alb-Cre/Rosa26-YFP小鼠模型。Rosa26-stop-YFP转基因小鼠在黄绿色荧光蛋白(YFP)基因前有一个终止密码子，因此不表达YFP基因，当Alb-Cre小鼠和Rosa26-stop-YFP小鼠交配后，其子代的肝细胞在白蛋白启动子作用下表达Cre重组酶，可将YFP前的终止密码子切除，使YFP得以表达，在荧光显微镜下可观察到黄绿色荧光。该小鼠模型中，表达白蛋白的成熟肝细胞可同时表达黄绿色荧光蛋白YFP，而不表达白蛋白的非实质细胞不带有荧光。分离该小鼠原代肝脏细胞并在肝细胞胆管化培养基中培养，早期可见少数不带有荧光的细胞生长，经过传代后，仅带有荧光的细胞可长期稳定增殖，提示胆管样的肝细胞来自成熟肝细胞(图5)。
所述的可增殖的胆管样肝细胞传代采用Accutase(eBioscience)，吸去培养基后按50μl/cm2加入Accutase，消化5-10分钟待细胞完全从培养板上成团脱落，加入培养基重悬并离心(150G，5分钟)，细胞传代比例为1:2-1:4。所述的肝细胞可反复冻存和复苏，冻存和复苏方法同与普通细胞相同。
以上结果提示本发明建立的原代肝细胞增殖培养基可诱导原代肝细胞发生胆管样改变，并可长期稳定培养和扩增。
实施例2：诱导实施例1获得的小鼠胆管样肝细胞分化为成熟肝细胞
实施例1培养的小鼠胆管样肝细胞汇合率达到90-100％时，将培养基更换为肝细胞成熟培养基，培养基为DMEM/F12(Invitrogen公司)，包含1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液(Invitrogen公司)，20ng/ml抑瘤素M(Peprotech公司)，10μM的SB431542(Secllek公司)或1μM的A83-01(MCE公司)或2μM的RepSox(MCE公司)，1μM的LY-411575(MCE公司)，10μM的DAPT(Selleck公司)或1μM Compound E(Enzo公司)，10μM地塞米松(Sigma公司)或1μM氢化可的松(Sigma公司)，10)ma的丙戊酸或1或酸伏立诺他或1立诺曲古柳菌素。每两天换液。
经过2-3周的分化培养，RT-PCR检测不同时间肝细胞相关基因表达水平，结果发现成熟肝细胞标志物如Alb、G6PC、HNF4α、细胞角蛋白18和CYP家族基因等表达逐渐升高，而胆管上皮细胞标志物如CK7、CK19和Sox9等基因表达水平逐渐下降(图6A)。细胞出现了明显的形态改变，形成了多边形的结构，出现多个双核细胞。免疫荧光检测显示一些成熟肝细胞标志物如白蛋白表达升高，而胆管上皮细胞标志物如CK19表达下降(图6B)。分化的细胞可合成糖原，形成细胞间的微胆管结构，细胞内出现脂滴聚集等(图6C)。采用安捷伦公司小鼠全基因组寡核苷酸基因芯片，检测了3个来自不同小鼠的胆管化肝细胞(eHep1-3)，以及经体培养分化的肝细胞(mHep1-3)，同时以原代小鼠肝细胞的基因芯片数据作为对照，分析结果显示分化的肝细胞与原代肝细胞表达谱接近(图7)。上述结果表明，可增殖的胆管化肝细胞可在体外本方法的分化培养基中分化为接近原代肝细胞的成熟表型。
为了进一步验证体外分化细胞的功能，采用了延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetatehydrolase,Fah)基因剔除小鼠,简称Fah-/-小鼠，进行了体内移植实验。该小鼠模型是Grompe等[GenesDev,1993,7(12A):2 298-2 307]建立的遗传型酪氨酸血症I型(hereditarytyrosinaemiatypeI,HT1)小鼠模型。该模型小鼠由于Fah的缺失,酪氨酸分解代谢受阻,无法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸盐,导致酪氨酸在体内蓄积,从而造成肝损伤。Fah-/-小鼠存在广泛而持续的肝损伤,特别适合于移植细胞的再殖分化，是验证肝细胞功能的理想模型。
本发明中，我们将体外分化的野生型肝细胞消化后进行细胞计数，采用无酚红的William E培养基200μl重悬2×106个细胞，经小鼠脾脏注射移植入Fah-/-小鼠体内，移植后10周取小鼠肝脏组织进行Fah蛋白的免疫组化分析，由于受体小鼠肝脏Fah基因缺失，而染色可见大部分受体的肝细胞被Fah阳性的野生型肝细胞所替代(图8，下图为上图的局部放大)。该结果证实，经体外胆管化扩增并分化成熟的肝细胞具有肝脏再殖能力，并可重建损伤的肝组织。
以上结果表明本发明建立的细胞分化体系可有效的促进胆管样肝细胞重新分化成熟，并具备原代肝细胞的功能。
实施例3：扩增人原代肝细胞
培养皿包被如实施例1所述的方法。
人肝细胞分离：采用胶原酶两步灌注法分离新鲜人原代肝实质细胞，(Maurel P.，Hepatocytes-Methods and Protocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)。
具体方法如下：首先采用PBS在蠕动泵提供的压力下，利用肝脏表面暴露的管腔连续冲洗新鲜肝脏组织10分钟，随后将PBS更换为无钙镁离子的Hanks液灌注肝组织10分钟，然后采用加入质量体积比1％的BSA和质量体积比0.1％的四型胶原酶(美国Sigma公司)灌注30分钟。采用胶棒将肝细胞从肝组织中轻轻分离出来，500g离心1分钟并重复3次，沉淀细胞则为原代分离的肝实质细胞。
接种1-2×104/cm2肝实质细胞至前述包被的培养皿中，肝细胞胆管化培养基为DMEM/F12(Invitrogen公司)，包含1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液(Invitrogen公司)，50ng/ml表皮生长因子(Peprotech公司)，20ng/ml肝细胞生长因子(Peprotech公司)，20ng/ml成纤维细胞生长因子-2(Peprotech公司)，20ng/ml白介素-6(Peprotech公司)，20ng/ml抑瘤素M(Peprotech公司)，200ng/ml的Shh蛋白(Peprotech公司)，1μM的SAG(MCE公司)或1μM的purmorphamine(MCE公司)，5μg/ml的Jagged-1(Abcam公司)或5μg/ml的DLL-1(Peprotech公司)，200ng/ml的Wnt3a(Peprotech公司)或500ng/ml的Rspo(Peprotech公司)，5μM的BIO(MCE公司)或1μM的CHIR99021(MCE公司)或5μM的TWS119(Secllek公司)，2μM的Thiazovivin(MCE公司)或10μM的Y27632(MCE公司)或3μM的Fasudil(MCE公司)，5μM的溶血磷脂酸(Santa Cruz公司)，1μM 1-磷酸神经鞘氨醇(Santa Cruz公司)，2μM的RepSo(Secllek公司)或10μM的SB431542(Secllek公司)或1μM的A83-01(MCE公司)。人原代肝细胞的形态(第一天)在肝细胞胆管化培养基中表现与小鼠原代肝细胞类似，细胞发生胆管样改变(第三天)，即肝细胞失去极性和双核特征，胞体拉长出现成纤维细胞样变化，并可长期稳定培养和扩增(图9)。该结果表明人肝细胞也可在本方法建立的培养条件下进行体外胆管化和增殖。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (17)

1.一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，该体系包括一种肝细胞胆管化培养基和/或一种肝细胞成熟培养基；
所述的肝细胞胆管化培养基包括：
液体基础培养基、
细胞培养营养添加物、
生长因子、
Hedgehog信号通路活化剂、
Notch信号通路活化剂，和
Wnt信号通路活化剂；
所述的肝细胞成熟培养基包括：
液体基础培养基、
细胞培养营养添加物、
抑瘤素M、
糖皮质激素、
转化生长因子-β通路抑制剂，和
Notch信号通路抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的液体基础培养基，选自DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基，或F12细胞培养基中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的细胞培养营养添加物，选自胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液细胞培养添加物、N2细胞培养营养添加物、B27细胞培养营养添加物中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的生长因子，选自表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、白介素-6、抑瘤素中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的Hedgehog通路活化剂，选自重组Hh或Shh蛋白、SAG、purmorphamine中的一种或两种以上。
6.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的Notch通路活化剂，选自重组DLL-1蛋白、Jagged-1蛋白中的一种或两种。
7.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的Wnt通路活化剂，选自重组Wnt蛋白、重组R-spondin蛋白、糖原合成酶激酶3β抑制剂中的一种或两种以上。
8.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的糖皮质激素，选自地塞米松、氢化可的松中的一种或两种组合。
9.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的转化生长因子-β通路抑制剂，选自RepSox、SB431542、A83-01中的一种或两种以上。
10.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的Notch信号通路抑制剂，为γ-分泌酶抑制剂。
11.根据权利要求1或2所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的肝细胞胆管化培养基还包括：
Rho相关蛋白激酶抑制剂、G蛋白偶联受体激动剂，和转化生长因子-β通路抑制剂；
所述的肝细胞成熟培养基还包括：组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
12.根据权利要求11所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的Rho相关蛋白激酶抑制剂，为Fasudil、Y-27632、Thiazovivin、SB-772077-B中的一种或两种以上。
13.根据权利要求11所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的G蛋白偶联受体激动剂，为溶血磷脂酸、1-磷酸神经鞘氨醇中的一种或两种。
14.根据权利要求11所述的一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的体系，其特征在于，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，为丙戊酸(VPA)、伏立诺他(SAHA)、曲古柳菌素(TSA)中的一种或两种以上。
15.一种体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、采用胞外基质蛋白对培养支持物进行预包被；
B、将原代肝脏细胞接种入步骤A提供的经预包被的培养支持物上，在如权利要求1至10任一所述的肝细胞胆管化培养基中进行培养和扩增；
所述的原代肝脏细胞包括成熟肝细胞、小肝细胞或具有双向分化潜能的肝前体细胞；
C、利用如权利要求1至10任一所述的肝细胞成熟培养基，将步骤B获得的可增殖的胆管样肝细胞分化为成熟肝细胞。
16.如权利要求15所述的体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法制备得到的可增殖的胆管样肝细胞和分化成熟的肝细胞。
17.如权利要求16所述的可增殖的胆管样肝细胞和分化成熟的肝细胞在化合物或药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、制备生物人工肝中的应用。
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