CN105358680B - 用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物 - Google Patents

用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本文中提供了用于使已在限定条件下扩增和/或维持的诱导多潜能干细胞体外分化成能够产生单激素β细胞的内胚层前体细胞(EPC)的方法。

Description

用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物
本申请要求于2013年4月3日提交的美国临时申请号61/808,003的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
1.技术领域
本发明一般性地涉及内分泌学、干细胞和分化细胞领域。更具体地，本发明涉及由未分化细胞在悬浮培养物中产生自我更新的内胚层祖细胞。
2.相关技术说明
内胚层衍生组织(包括胰腺)潜在地可用于细胞替代治疗。可能的是，由多潜能干细胞(pluripotent stem cell，PSC)通过顺序暴露于模拟胚胎形态发生的细胞因子来体外产生在发育期间形成原肠管的定形内胚层(definitive endoderm)及其衍生谱系。以此方式，可由胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和诱导多潜能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPSC)产生胰腺细胞(D’Amour等，2006；Gouon-Evans等，2006)。尽管这些研究强调了PSC衍生的内胚层组织用于移植治疗的前景，但是仍存在若干障碍。由PSC产生的内胚层细胞易于表现出未成熟表型，并且在很多情况下，不是全功能的。例如，目前由人ESC体外产生的大部分胰腺β细胞是多激素(poly-hormonal)的并且不是葡萄糖响应性的(D’Amour等，2006；Nostro等，2011)。产生用于移植之内胚层细胞的另一个障碍是扩大生产规模以产生所需数目细胞的能力，对于胰腺细胞而言，这目前受限于在固体表面上产生的必要性。本发明的一个目的是提供避免了这些限制的培养方法和分离方法。
发明内容
本发明通过提供用于产生自我更新的内胚层祖细胞(下文中为“EPC”、“EP”或“EP细胞”)的有效方法克服了本领域中的一大缺陷。在第一实施方案中，提供了这样的用于产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括a)在包含激活蛋白A(Activin A)或Nodal的无血清培养基中培养多潜能干细胞以实现内胚层细胞的诱导；以及b)在无血清培养基中之含有BMP4、VEGF、FGF2和EGF或其同源物的悬浮培养物中培养所述内胚层细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长。在一个实施方案中，提供了这样的用于产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括a)在包含激活蛋白A的无血清培养基中培养多潜能干细胞以实现内胚层细胞的诱导；以及b)在无血清培养基中之含有激活蛋白A、BMP4、VEGF、FGF2和EGF或其同源物的悬浮培养物中培养所述内胚层细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长。在一些方面，步骤b)中的悬浮培养物还可包含TGFβ。在某些方面，内胚层细胞包括定形内胚层细胞和内胚层祖细胞的群。在一些方面，将步骤b)中的内胚层细胞以约104细胞/ml、105细胞/ml、106细胞/ml、107细胞/ml、108细胞/ml或可来源于其中的任意范围的初浓度悬浮培养。优选地，将内胚层细胞以约250,000细胞/ml至2,000,000细胞/ml，更优选250,000细胞/ml至500,000细胞/ml的初浓度悬浮培养。
在一些方面，步骤a)中的无血清培养基还可包含Wnt3A或GSK3抑制剂。在另一些方面，步骤a)中的无血清培养基可不包含Wnt3A或GSK3抑制剂。GSK3抑制剂的一个优选实例是CHIR 99021。在一些方面，步骤a)中的培养可进行至少或约1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天，或可来源于其中的任意范围。优选地，所述培养进行约4天至12天，更优选约5天至8天。在一些方面，步骤a)中的培养可以以贴壁培养进行。
在一些方面，步骤b)中使用的内胚层祖细胞促生长因子还可包括TGF-β、潜在TGF-β结合蛋白(latent TGF-βbinding protein)、Nodal、GSK3抑制剂、促滤泡素抑制素相关蛋白(Follistatin-related protein，FSRP)、Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-relatedprotein 1)、IndolactamV和/或胰岛素样生长因子。GSK3抑制剂的一个优选实例是CHIR99021。在一些方面，步骤b)中的培养可进行至少或约1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天，或可来源于其中的任意范围。在一些方面，步骤b)中的所述培养可进行至少1、2、3、4、5、6个月，或可来源于其中的任意范围。优选地，所述培养进行至少约5天至约40天，更优选约10天至约15天。在一些方面，在ROCK抑制剂存在下可发生步骤b)中的培养。ROCK抑制剂可以是Y-27632、H1152或HA-100。在一些方面，可在进行最初的约12小时培养之后除去ROCK抑制剂。
在一些方面，步骤b)中的悬浮培养物还可包含基质组分(例如基膜制备物(basement membrane preparation))以支持细胞群的培养。基质组分的非限制性实例包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白凝块(fibrin clot)、纤连蛋白及其混合物，例如MatrigelTM和经裂解的细胞膜制备物。基膜制备物可以以约0.06mg/ml至0.6mg/ml，优选约0.3mg/ml至0.6mg/ml的终浓度存在。
在一些方面，可大约每1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15(或可来源于其中的任意范围)天使步骤b)中的悬浮培养物解离并重新聚集。优选地，可大约每4天至5天使悬浮培养物解离并重新聚集。在一些方面，可将步骤b)中的悬浮培养物维持在转瓶中。可以以约40rpm至70rpm运行转瓶。在一些方面，可将步骤b)中的悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。
在一些方面，内胚层祖细胞可表达CXCR4、CD 117(c-KIT)和CD34。在一些方面，内胚层祖细胞还可表达Sox17、FOXA1、FOXA2和CD31。所述表达可通过蛋白质表达分析(例如ELISA或FACS分析)或者RNA表达分析(例如qRT-PCR)来检测。在一些方面，自我更新的内胚层祖细胞的形成不需要MEF饲养层或MEF条件化(MEF-conditioned)培养基的存在。在一些方面，培养发生在常氧条件下。在一些方面，培养发生在低氧条件下。在一些方面，在步骤a)之前，可将多潜能干细胞维持在低氧条件下。
在一些方面，多潜能干细胞可以是胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。干细胞还可包括多能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞或单能干细胞。干细胞还可包括胎儿干细胞或成体干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞和皮肤干细胞。在某些方面，干细胞可分离自脐带、胎盘、羊水、绒毛膜绒毛、胚泡、骨髓、脂肪组织、脑、外周血、脐带血、月经血、血管、骨骼肌、皮肤和肝。
在某些方面，所述方法还包括将内胚层祖细胞与胰岛β细胞促生长因子一起培养以实现单激素胰岛β细胞(mono-hormonal pancreatic islet beta cell)的形成。在一些方面，可在培养之前对内胚层祖细胞进行纯化。所述纯化可基于标志物(例如CD34、CD 117和CXCR4)的表达。在某些方面，可以以悬浮培养方式进行培养。在一些方面，可以以贴壁培养进行培养。胰岛β细胞促生长因子可包括AMP活化蛋白激酶(AMPK)的有效抑制剂、BMP拮抗剂、hedgehog抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、ALK5抑制剂、视黄酸、FGF10、B27和Wnt3A或GSK3抑制剂。GSK3抑制剂的一个优选实例是CHIR 99021。在一些方面，在ROCK抑制剂存在下可发生所述进一步培养。ROCK抑制剂可以是Y-27632、H1152或HA-100。
在某些方面，实现单激素胰岛β细胞形成的方法还包括i)将内胚层祖细胞与BMP拮抗剂、Wnt3A和FGF 10一起培养以实现前肠内胚层细胞的形成；ii)将所述前肠内胚层细胞与B27、BMP拮抗剂、Hedgehog抑制剂、视黄酸和FGF10一起培养以实现胰腺内胚层细胞的形成；iii)将所述胰腺内胚层细胞与B27、BMP拮抗剂、γ-分泌酶抑制剂和ALK5抑制剂一起培养以实现内分泌前体细胞的形成；以及iv)将所述内分泌前体细胞与BMP拮抗剂、ALK5抑制剂、胰岛素、葡萄糖和烟酰胺一起培养以实现单激素胰岛β细胞的形成。
步骤i)中使用的BMP拮抗剂可以是dorsomorphin或LDN-193189。优选地，BMP拮抗剂是dorsomorphin。步骤ii)、iii)和iv)中使用的BMP拮抗剂可以是头蛋白(Noggin)、Gremlin、USAG-1、促滤泡素抑制素(Follistatin)、PRDC、Cerberus、Coeo、壳硬蛋白(Sclerostin)或脊索发生素(Chordin)。优选地，BMP拮抗剂是头蛋白。步骤iii)中使用的γ-分泌酶抑制剂可以是DAPT、RO4929097、BMS-708163、Semagacestat、MK-0752、YO-01027、LY-411575或(R)-氟比洛芬(flurbiprofen)。优选地，γ-分泌酶抑制剂是DAPT。步骤iii)和iv)中使用的ALK5抑制剂可以是SB431542、ALX-270-448、A 83-01、EW-7195、KI26894、LY2109761、LY-364947、SB-525334、SB-505124、SD-208、IN-1233或SKI2162。优选地，ALK5抑制剂是SB431542。步骤ii)中使用的Hedgehog抑制剂可以是KAAD-环巴胺(cyclopamine)、维莫德吉(vismodegib)、LY2940680、MRT-10、MRT-83或GDC-0449。优选地，Hedgehog抑制剂是KAAD-环巴胺。
在一些方面，细胞可包含编码Erg1的诱导型表达盒。在某些方面，实现单激素胰岛β细胞形成之方法中的步骤iv)还可包括诱导细胞表达Erg1。在一些方面，细胞可包含编码Gfi1的诱导型表达盒。在某些方面，实现单激素胰岛β细胞形成之方法中的步骤iv)还可包括诱导细胞表达Gfi1。在一些方面，细胞可包含编码Erg1和Gfi1两者的诱导型表达盒。在某些方面，实现单激素胰岛β细胞形成之方法中的步骤iv)还可包括诱导细胞表达Erg1和Gfi1两者。在多个方面，可将诱导型表达盒整合到细胞的基因组中。在多个方面，诱导型表达盒可包含在转座子(例如piggyBac)中。在多个方面，诱导型表达盒可包含在游离型载体(episomal vector)中。
在一些方面，步骤i)、ii)和iii)中的培养可进行至少或约1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天，或可来源于其中的任意范围。优选地，所述培养进行约3天至5天。在一些方面，步骤iv)中的培养可进行至少或约1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天，或可来源于其中的任意范围。优选地，所述培养进行约3天至40天。
在一些方面，培养物可包含基膜制备物。在一些方面，培养可发生在低氧条件下。在一些方面，培养物可不含MEF饲养细胞和MEF条件化培养基。
在一些方面，单激素胰岛β细胞可表达PDX、胰岛素、C肽以及NeuroD1、低水平的促生长素抑制素(somatostatin)和Nkx6.1，但不表达胰高血糖素。所述表达可通过蛋白质表达分析(例如ELISA或FACS分析)或者RNA表达分析(例如qRT-PCR)来检测。在一些方面，单激素胰岛β细胞是细胞群的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％(或任意中间范围)，或可来源于其中的任意范围。优选地，单激素胰岛β细胞的纯度为约12％或约20％。单激素胰岛β细胞的另外特征包括，但不限于，葡萄糖响应性C肽释放及其通过胰腺移入在动物模型中逆转糖尿病的能力。
在一些方面，可将单激素胰岛β细胞培养1周至4周。在某些方面，所述培养可包括悬浮培养。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了这样的产生自我更新的内胚层祖细胞聚集体的方法，其包括a)在包含激活蛋白A或Nodal的无血清培养基中培养多潜能干细胞以实现内胚层细胞的诱导；以及b)在无血清培养基中之含有BMP4、VEGF、FGF2和EGF或其同源物的悬浮培养物中培养所述内胚层细胞以实现自我更新的内胚层祖细胞聚集体的形成。
在又一个实施方案中，本公开内容提供了这样的产生自我更新的内胚层祖细胞聚集体的方法，其包括a)在包含激活蛋白A的无血清培养基中培养多潜能干细胞以实现内胚层细胞的诱导；以及b)在无血清培养基中之含有激活蛋白A、BMP4、VEGF、FGF2、EGF和TGFβ或其同源物的悬浮培养物中培养所述内胚层细胞以实现自我更新的内胚层祖细胞聚集体的形成。
在多个方面，可使实施方案中的细胞与足以引起干细胞分化为内胚层祖细胞的量的分化因子接触。分化因子可包括分化因子基因的基因产物。基因产物可以是分化因子基因的多肽或RNA转录本。在另一个方面，分化因子可包含一个或更多个有利于其进入细胞内和/或进入细胞核的蛋白质转导结构域。这样的蛋白质转导结构域在本领域中是公知的，例如HIV TAT蛋白质转导结构域、HSV VP22蛋白质转导结构域、果蝇(Drosophila)触角足同源结构域或其变体。
在某些方面，用于本发明方法的起始细胞可包含至少或约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个细胞，或可来源于其中的任意范围。起始细胞群的接种密度可以为至少或约10、101、102、103、104、105、106、107、108细胞/ml，或可来源于其中的任意范围。
对于本文中所述的任何其他方法或组合物，可采用在本发明的方法和/或组合物背景下所讨论的实施方案。因此，涉及一种方法或组合物的一个实施方案也可应用于本发明的其他方法和组合物。
本说明书中使用的没有数量词修饰的名词可指一个/种或更多个/种。当在本文权利要求书中使用时，在与词语“包含/包括”联合使用的情况下，没有数量词修饰的名词可指一个/种或一个/种以上。
除非明确指出仅指替代方案或者替代方案互相排斥，否则在权利要求书中使用的术语“或/或者”用于指“和/或”，但是本公开内容支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。本文中使用的“另一个/种”可指至少第二个/种或更多个/种。
贯穿本申请通篇，术语“约/大约”用于指数值包含用来测定所述数值的装置、方法的固有误差变异，或者研究对象间存在的变异。
本发明的其他目的、特征和优点将由下文的详细描述而变得明显。然而，应当理解详细描述和具体实施例尽管指本发明的一些优选实施方案，但仅作为举例说明给出，因为根据该详细描述，在本发明之精神和范围内的多种改变和修改对本领域技术人员而言将是明显的。
附图简述
下列附图形成本说明书的一部分并包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或更多幅并结合对本文中所提出的具体实施方案的详细描述将更好地理解本发明。
图1A至1D.对在包含激活蛋白A或Nodal的培养基中培养的iPSC衍生细胞的表征。这些图表示对CXCR-4和CD 117表达的表面染色以及相关同种型对照染色。图1A表示所收获细胞的前向散射和侧向散射。图1B示出了群中存在的活细胞。图1C表示同种型对照抗体的染色谱。图1D示出了对CXCR-4和CD117表达的细胞表面染色。
图2A至2G.对由在E8培养基上维持的iPSC衍生的细胞(包括内胚层祖细胞群)的表征。这些图表示对Sox17、FoxA1和FoxA2表达的细胞内染色以及相关同种型对照染色。图2A表示所收获细胞的前向散射和侧向散射。图2B示出了群中存在的活细胞。图2C和2E表示同种型对照抗体的染色谱。图2D示出了对FoxA1和Sox17表达的细胞内染色。图2F示出了对FoxA2表达的细胞内染色。图2G示出了对由iPSC衍生的内胚层祖细胞的免疫染色。
图3.iPSC衍生的EP悬浮培养物在15天内的细胞生存力和存活。EP由4种不同的iPSC系衍生而来。该图示出了如通过流式细胞术所量化的活细胞的存在数目。在常氧条件下进行实验。
图4.iPSC衍生的EP悬浮培养物在15天内的细胞生存力和存活。EP由4种不同的iPSC系衍生而来。在常氧条件下进行实验。该图表示如通过流式细胞术所量化的CXCR-4/CD117(c-kit)/FoxA1/Sox17表达的水平。
图5.置于胰腺分化方案下的15天EPC培养物的细胞生存力和存活。在常氧条件下进行实验。为了表征EPC聚集体中的新出现群，对聚集体进行个体化(individualize)并在分化过程中的不同天数下确定活细胞计数。
图6.置于胰腺分化培养基中的15天EPC培养物中出现PDX-1阳性细胞。在常氧条件下进行实验。为了表征EPC聚集体，通过进行细胞内染色对PDX-1的存在来染色经个体化的细胞并通过流式细胞术评估阳性细胞的百分比。
图7.PDX-1阳性细胞在胰腺分化过程中不同天数下的代表性染色谱。在常氧条件下进行实验。
图8.置于胰腺分化培养基中的3D EPC聚集体的相衬图像。照片拍摄于10x和20x放大倍数下。
图9.对在胰腺分化过程中第15天的15天龄EPC聚集体中PDX-1表达的免疫组织化学染色。在常氧条件下进行实验。经如下处理之悬浮培养物中完整15天EPC聚集体的代表性图像：置于胰腺分化培养基中15天，包埋于组织凝胶(histogel)中并通过免疫组织化学染色对PDX-1的存在进行染色。照片拍摄于10x和20x放大倍数下。
图10A至10I.对在胰腺分化过程中第18天的完整15天龄EPC聚集体中促生长素抑制素、胰高血糖素和胰岛素表达的免疫组织化学染色。在常氧条件下进行实验。经如下处理之悬浮培养物中完整15天EPC聚集体的代表性图像：置于胰腺分化培养基中18天，包埋于组织凝胶中并通过免疫组织化学染色对促生长素抑制素(图10A至10C)、胰高血糖素(图10D至10F)和胰岛素(图10G至10I)的存在进行染色。照片拍摄于20x放大倍数下。
图11.在解离聚集体之后，对在胰腺分化过程中第18天的15天龄EPC聚集体中C肽、胰高血糖素和胰岛素表达的细胞内染色。在常氧条件下进行实验。散点图表示对胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和C肽表达的细胞内染色。左侧的图揭示了在对收获后的活细胞进行染色前，所述细胞的前向散射和侧向散射。第三组图揭示了iPSC-1131细胞上C肽相对于胰高血糖素、C肽相对于促生长素抑制素以及胰岛素相对于胰高血糖素染色的双染色谱。第四幅和第五幅图示出了胰岛素、胰高血糖素、C肽和促生长素抑制素表达水平的总百分比。
图12.对在胰腺分化第20天的15天龄EPC聚集体的初步qPCR分析。在常氧条件下进行实验。
图13.置于胰腺分化中25天的15天龄EPC聚集体中葡萄糖刺激的C肽释放。以100,000细胞归一化所释放的C肽。阳性对照尸体人胰岛：在低葡萄糖下释放146pmol C肽，而在高葡萄糖下释放257pmol C肽。
图14.胰腺分化过程的示意图。
图15.对胰腺分化过程中不同阶段的一般性概述。这些行从上到下表示阶段、分化过程期间该阶段发生的天数、在该阶段期间分化过程中所使用的因子、所产生的细胞类型以及所产生细胞类型的标志物。
图16A至16D.接种密度对由未分化iPSC产生定形内胚层(definitive endoderm，DE)的作用。在不存在CHIR的情况下和在2.5ng/ml BMP4存在下进行DE产生。图16A.每个时间点下的总活细胞产率。图16B.DE产生的效率，其确定为每个时间点下DE细胞的绝对数/总细胞数的比。图16C.如通过细胞内流式细胞术所量化的每个时间点下表达FoxA1-Sox17细胞的百分比。图16D.如通过表面染色所量化的每个时间点下表达CXCR4-CD117细胞的百分比。
图17.低氧条件提高DE产生。通过流式细胞术经由细胞表面染色来确定共表达CXCR4-CD117细胞的百分比。使用细胞内流式细胞术来量化FoxA1-FoxA2-Sox17的百分比。
图18A至18E.Matrigel保护EPC，而MEF不是必需的。图18A.通过流式细胞术量化来自在有或无Matrigel之情况下培养的EPC培养物的细胞上DE标志物(即CXCR4、CD117、FoxA2和FoxA1)的百分比。效率确定为表达活DE细胞的绝对数/总活细胞数的比。图18B.对在有或无MEF的情况下培养的2.038克隆8777的活细胞计数。图18C.在有或无MEF的情况下培养的2.038克隆8777中EPC的纯度。图18D.对在有或无MEF的情况下培养的2.038克隆8776的活细胞计数。图18E.在有或无MEF的情况下培养的2.038克隆8776中EPC的纯度。
图19A-19B.在限定的无饲养低氧条件下的多种iPSC克隆的EPC循环(EPCcycling)。图19A.EPC在无饲养循环期间的增殖。图19B.循环期间的平均EPC纯度。每个时间点下，通过流式细胞术测定EPC培养物的纯度。量化CXCR4/CD117/FoxA1/FoxA2/Sox17的平均表达。对来自同一iPSC克隆之多个实验运行的EPC纯度进行平均并计算标准误。
图20A至20E.在限定的无饲养低氧条件下的EPC培养物的qPCR分析。图20A.CXCR4基因表达。图20B.CD117基因表达。图20C.Sox17基因表达。图20D.FoxA2基因表达。图20E.FoxA1基因表达。
图21.CD34为EPC的后期标志物。通过流式细胞术使用细胞表面染色来量化CD34的表达。
图22.对末期EPC培养物的纯化。在通过MACS进行分离之前，将经个体化的细胞与CD34、CD117和CXCR4的藻红蛋白(phycoerythrin，PE)缀合抗体一起孵育，其产生纯度为约88％的阳性级分。
图23.用于在无MEF的情况下由增殖为3D聚集体的EPC产生β细胞的方案。
图24A-24B.作为3D聚集体产生β细胞。对由2.038AT4细胞衍生的第28天末期β细胞的流式细胞术分析。收获细胞，使用4％多聚甲醛固定，使用0.1％皂苷透化并通过流式细胞术针对PDX、NeuroD1、Nkx6.1、促生长素抑制素、胰高血糖素和C肽的存在进行染色。阳性细胞百分比示于图24A中。对促生长素抑制素/C肽和胰高血糖素/C肽染色后产生的点图如图24B所示。
图25.用于由以2D增殖的EPC产生β细胞的方案。
图26A至26B.由2.038细胞产生的末期β细胞的葡萄糖响应性。图26A.通过细胞内流式细胞术量化于分化的第15天收获的β细胞的PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素的表达。图26B.未经归一化的和经归一化的C肽释放测定。以总活细胞数归一化数据。
图27A至27L.由2.038AT4细胞产生的末期β细胞的葡萄糖响应性。在β细胞分化过程的不同阶段添加Dox。在β细胞分化的第6天至15天、β细胞分化的第8天至15天或者β细胞分化的第10天至15天期间进行Dox(1.5μg/ml)诱导。在β细胞分化的第15天收获细胞，固定并染色以通过细胞内流式细胞术量化PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素。对第15天的新出现β细胞的分析揭示了PDX(图27A至27D)、NeuroD1(图27E至27H)和促生长素抑制素/胰高血糖素/C肽(图27I至27L)的存在。
图28.由2.038AT4细胞产生的末期β细胞的葡萄糖响应性。在β细胞分化过程的不同阶段添加Dox。示出了经归一化的和未经归一化的C肽释放测定结果。归一化基于对于每份样品取得的总活细胞数。
图29A至29D.由2.038AT4细胞产生的末期β细胞的葡萄糖响应性。在β细胞分化过程的不同阶段添加Dox。在β细胞分化的第15天收获细胞以通过细胞内流式细胞术量化PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素。将β细胞置于末期培养基中以对末期β细胞培养物进行扩展分析。培养物揭示了单激素细胞在培养物中存在多至4周。
图30A至30D.由2.038AT4细胞产生的末期β细胞的葡萄糖响应性。在β细胞分化过程的不同阶段添加Dox。图30A.在无Dox诱导下未归一化的C肽释放测定。图30B.在无Dox诱导下经归一化的C肽释放测定。图30C.在有Dox诱导下未经归一化的C肽释放测定。图30D.在有Dox诱导下经归一化的C肽释放测定。归一化基于对于每份样品取得的总活细胞数。
图31A至31G.对由2.038AT4细胞产生的末期β细胞的qPCR分析。在β细胞分化过程的不同阶段添加Dox。图31A.胰岛素基因表达。图31B.胰高血糖素基因表达。图31C.促生长素抑制素基因表达。图31D.PDX1基因表达。图31E.NeuroD1基因表达。图31F.Nkx6.1基因表达。图31G.神经元素3(Neurogenin3)基因表达。
图32A至32B.来自2.038亲代细胞和2.038AT4细胞之iPSC/DE/EPC/β细胞的ERG和GFI表达的qPCR分析。图32A.ERG基因表达。图32B.GFI1基因表达。
具体实施方式
由于人胚胎干细胞(ESC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)能够被体外扩增并且具有在体内分化成任何细胞类型的潜能，因此其提供了在基础生物学和用于广泛多种疾病之基于细胞的治疗两方面的巨大潜能。ES/iPS细胞的分化似乎模拟在胚胎发生期间发生的发育过程。在产生成熟的细胞类型之前，这些干细胞群以相继受限的潜能继续向下发展至发育中间物。首先形成原胚层、中胚层、内胚层和外胚层，随后它们进一步成熟为衍生细胞类型。干细胞替代治疗尤其需要的一种内胚层衍生组织类型是用于治疗I型糖尿病的胰岛β细胞。目前，严重缺乏在移植背景下使用的胰岛。由于必需使多潜能干细胞分化经历所有的发育阶段，因此目前产生用于移植之成熟的功能组织类型的能力受到限制。
本文中提供了用于由在无饲养条件下维持的诱导多潜能干细胞产生内胚层祖细胞(EPC)的方法。通过此方法获得的EP细胞能够产生单激素β细胞。图14中提供了该过程的示意图。图15中提供了该过程中的阶段。
定形内胚层(DE)是一种瞬时状态，其快速分化、不能增殖、无明显的形态并且可不完全定向于内胚层命运。另一方面，内胚层祖(EP)细胞(或EPC)不是瞬时的、具有明显的形态并且可被无限地培养(Cheng等，2013)。内胚层祖细胞的特征还在于表达CXCR4、CD117、FOXA1、FOXA2、CD31、CD34和SOX17。内胚层祖细胞可产生内胚层谱系(例如肝、胰腺和肠)中的细胞，但不能体外或体内产生中胚层和外胚层。同样地，EP细胞在免疫缺陷小鼠中不形成畸胎瘤。因此，DE和EP细胞可代表不同的发育中间物并且可具有不同的发育潜能。
iPSC衍生的EP细胞表达CXCR-4、CD117、SOX17、FOXA1、FOXA2、CD34、CD31和HNF4A并且可在悬浮培养物中维持5天至40天。在Matrigel、BMP4、VEGF、FGF、EGF2、激活蛋白以及任选的TGFβ存在下在旋转或静态条件下，EP扩增并作为3D聚集体维持标志物的表型表达。当被置于用于产生胰腺谱系细胞的培养条件下时，EP培养物产生在功能上响应于D葡萄糖刺激的单激素β细胞。
总之，提供了用于由在无血清培养基中维持的人iPSC有效产生EP细胞的培养方法。EP细胞保留其表型特征并且作为3D培养物扩增至少30天。置于胰腺分化培养基中的EP细胞产生单激素β细胞。这些细胞将用作用于高通量筛选应用的理想细胞类型并且保留用于治疗应用中的潜能。
I.定义
“分化”指这样的过程，与其在相同条件下但不进行分化相比，通过该过程较不特化的细胞变成更特化的细胞以形成至少一种新细胞类型的后代，不管是在培养物中还是在体内。“去分化”是这样的细胞过程，其中部分分化细胞或终末分化细胞回复至较早的发育阶段，例如多潜能性或多能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化成另一种分化细胞类型的过程。在某些条件下，具有新细胞类型之特征的后代的比例可以为至少约1％、5％、25％或更大(以优选性增加的顺序)。
“多能的”指细胞能够通过其后代产生成体动物中可见的数种不同细胞类型。
“多潜能的”指细胞能够通过其后代产生构成成体动物的所有细胞类型，包括生殖细胞。胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和胚胎生殖细胞是这一定义之下的多潜能细胞。
本文中使用的术语“自体细胞”指从遗传方面与接受者相容的供体细胞。
本文中使用的术语“全能的”可指产生活的出生动物的细胞。术语“全能的”还可指产生特定动物中所有细胞的细胞。当将全能细胞用于由一个或更多个核转移步骤发育胚胎的过程中时，其可产生动物中的所有细胞。
全能细胞还可用于产生不完整的动物，例如可用于进行器官收获的那些，例如通过操作同源异型基因而具有消除器官或附肢之生长的遗传修饰的那些。另外，致使卵母细胞(例如由ES细胞衍生的那些)不能够在子宫内发育的遗传修饰将确保人衍生ES细胞不可用于得到用于生殖而仅用于诸如治疗性克隆应用的人卵母细胞。
本文中使用的术语“胚胎干细胞”可指从胚胎分离的维持在体外细胞培养物中的多潜能细胞。这样的细胞是从经培养胚胎分离的快速分裂培养细胞，其在培养物中保留体内产生构成成体动物的所有细胞类型(包括生殖细胞)的能力。胚胎干细胞可在有或无饲养细胞下进行培养。胚胎干细胞可由从任意发育阶段的胚胎(包括胚泡阶段胚胎和前胚泡阶段胚胎)分离的胚胎细胞建立。胚胎干细胞可具有圆形的细胞形态并且可在饲养层上以圆形细胞团生长。胚胎干细胞是本领域的普通技术人员所公知的。参见，例如WO 97/37009；Yang和Anderson(1992)；Piedrahita等(1998)；Wianny等(1997)；Moore和Piedrahita(1997)；Moore和Piedrahita(1996)；Wheeler(1994)；Hochereau-de Reviers和Perreau(1993)；Strojek等(1990)；Piedrahita等(1990)；以及Evans等(1990)。
本文中使用的术语“重编程”或“重编程的”可指可将更特化细胞转变成多潜能细胞的材料和方法。
本文中使用的术语“分离的”可指与另一组细胞机械分离的细胞。一组细胞的实例是发育中的细胞团、细胞培养物、细胞系和动物。
本文中使用的术语“分化细胞”可指由已非特化表型发育为特化表型的前体细胞。例如，胚胎细胞可分化为肠的上皮细胞内衬(lining)。例如，分化细胞可分离自胎儿或活的出生动物。
本文中使用的术语“未分化细胞”可指具有非特化表型并且能够分化的前体细胞。未分化细胞的一个实例是干细胞。
II.参与内胚层祖细胞形成的细胞
在本发明的某些实施方案中，公开了用于由多潜能细胞提供内胚层祖细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，所述细胞可以是干细胞，包括但不限于，胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞或诱导多潜能干细胞。
A.干细胞
干细胞是见于大多数(如果不是全部的话)多细胞生物体中的细胞。它们的特征在于能够通过细胞有丝分裂自我更新并且能够分化成多种特化细胞类型。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：见于胚泡中的胚胎干细胞和见于成体组织中的成体干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可分化成所有的特化胚胎组织。在成体生物体中，干细胞和祖细胞作为身体的修复系统，补充特化细胞，并且还维持再生器官(例如血液、皮肤或肠组织)的正常更新而起作用。
人胚胎干细胞(ESC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)能够在体外进行长期增殖而仍保留分化成身体所有细胞类型(包括内胚层祖细胞和胰岛β细胞)的潜能。内胚层祖细胞可潜在地提供不受限供应的患者特异性功能胰岛β细胞以用于进行药物开发和治疗用途两者。人ESC/iPSC经由内胚层祖细胞体外分化为胰岛β细胞概括了正常的体内发育，即它们经历包括内胚层分化和内分泌特化的正常顺序发育阶段。所述顺序发育过程需要在不同的分化阶段添加不同的生长因子。本发明的某些方面通过使人ESC/iPSC分化提供了全功能胰岛β细胞。这种方法产生与人原代成体β细胞具有高度类似(如果不相同的话)功能的胰岛β细胞。此外，其增殖能力不受限制之本发明的内胚层祖细胞作为用于β细胞分化的起始细胞群具有独特的优势。
1.胚胎干细胞
胚胎干细胞(ES细胞)是由胚泡或早期桑椹胚期胚胎之内细胞团的上胚层组织衍生的多潜能干细胞。ES细胞的突出之处在于其两个独特特性：其多潜能性及其无限地自我更新的能力。ES细胞是多潜能的，即，其能够分化成3个原胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的所有衍生物。另外，在限定条件下，胚胎干细胞能够无限地自我增殖。这使得胚胎干细胞能够被用作用于研究和再生医学两者的可用工具，因为它们自身可无限数量地产生以用于继续研究或临床使用。对于特定的细胞类型，当给予充分且必需的刺激时，ES细胞可发育成为成体200种以上细胞类型中的每一种细胞类型。然而。它们对胚外膜或胎盘没有贡献。
迄今，几乎所有的研究都是使用小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell，mES)或人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES)来进行的。两者都具有基本的干细胞特征，但是它们需要非常不同的环境以维持未分化状态。小鼠ES细胞可在明胶层上生长并且需要白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)的存在。人ES细胞可在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)的饲养层上生长并且通常需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)的存在。在无最佳培养条件或遗传操作的情况下(Chambers等，2003)，胚胎干细胞将迅速分化。
还可通过数种转录因子和细胞表面蛋白的存在来定义人胚胎干细胞。转录因子Oct-4、Nanog和Sox-2形成核心调控网络，其确保维持多潜能性和导致分化的基因被抑制(Boyer等，2005)。鉴定hES细胞最常用的细胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4以及硫酸角质素抗原Tra-1-60和Tra-1-81。
用于获得小鼠ES细胞的方法是公知的。在一种方法中，将来自129品系小鼠的植入前胚泡用小鼠抗血清处理以除去滋养外胚层，并在含有胎牛血清之培养基中在经化学失活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养内细胞团。将形成的未分化ES细胞集落在胎牛血清存在下在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行传代培养以产生ES细胞群。在一些方法中，可在不存在饲养层的情况下通过向含血清培养基添加细胞因子白血病抑制因子(LIF)来培养小鼠ES细胞(Smith，2000)。在另一些方法中，可在骨形态发生蛋白和LIF存在下在无血清培养基中培养小鼠ES细胞(Ying等，2003)。
可使用之前所述的方法从胚泡获得人ES细胞(Thomson等，1995；Thomson等，1998；Thomson和Marshall，1998；Reubinoff等，2000)。在一种方法中，使第5天人胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清，然后暴露于1∶5稀释度的豚鼠补体以裂解滋养外胚层细胞。在从完整的内细胞团除去经裂解的滋养外胚层细胞后，将内细胞团在经γ失活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上并且在胎牛血清存在下培养。9天至15天后，将由内细胞团衍生的细胞团化学方式(即暴露于胰蛋白酶)或机械方式分离并重新铺板在含有胎牛血清和小鼠成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。在进一步增殖后，通过微量移液管选择具有未分化形态的集落，将其机械解离成团并重新铺板(参见美国专利No.6,833,269)。ES样形态的特征为具有明显高的核质比和显著核仁的致密集落。通过简单胰蛋白酶化或者通过借助微量移液管选择单个集落来常规传代所得ES细胞。在一些方法中，可如下在无血清的情况下培养人ES细胞：将ES细胞在碱性成纤维细胞生长因子存在下于成纤维细胞的饲养层上培养(Amit等，2000)。在另一些方法中，可如下在无饲养细胞层的情况下培养人ES细胞：将细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件化”培养基存在下于蛋白质基质(例如MatrigelTM或层粘连蛋白)上培养(Xu等，2001)。所述培养基是此前已通过与成纤维细胞共培养进行了条件化的。
用于分离恒河猴ES细胞和常见的绒猴ES细胞的方法也是已知的(Thomson和Marshall，1998；Thomson等，1995；Thomson和Odorico，2000)。
ES细胞的另一来源是已建立的ES细胞系。多种小鼠细胞系和人ES细胞系是已知的并且用于其生长和增殖的条件是已经限定的。例如，小鼠CGR8细胞系是由小鼠品系129胚胎的内细胞团建立的并且CGR8细胞的培养物可在无饲养层的情况下于LIF存在下生长。作为另一个实例，人ES细胞系H1、H7、H9、H13和H14是由Thompson等(1995)建立的。此外，已开发了H9系的亚克隆H9.1和H9.2。预期，几乎本领域中已知的任何ES或干细胞系均可用于本发明，例如，如Yu和Thompson(2008)中所述那些，其通过引用并入本文。
结合本发明使用的ES细胞来源可以是胚泡、通过培养胚泡的内细胞团衍生的细胞或从已建立细胞系的培养物获得的细胞。因此，本文中使用的术语“ES细胞”可指胚泡的内细胞团细胞、从内团细胞之培养物获得的ES细胞和从ES细胞系之培养物获得的ES细胞。
2.诱导多潜能干细胞
诱导多潜能干细胞(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是由非多潜能细胞(常常是成体体细胞)人工衍生的一类多潜能干细胞。认为诱导多潜能干细胞与天然多潜能干细胞(例如胚胎干细胞)在很多方面都是类似的(如果不相同的话)，例如在以下方面：某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、活嵌合体(viable chimera)形成以及效力和分化能力，但是其与天然多潜能干细胞相关的充分程度仍需进行评估。
通过重编程分化体细胞获得iPS细胞。期望产生由非胚胎来源的人组织衍生的诱导多潜能细胞以缓解与胚胎和胚胎组织之实验性使用有关的伦理问题。已宣扬诱导多潜能细胞的治疗应用前景。医学应用包括治疗阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease)、糖尿病和脊髓损伤等。另一些应用包括疾病建模和药物筛选。
已通过多种方法获得了诱导多潜能干细胞。使用慢病毒转导用四种基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转染人胎儿或新生儿成纤维细胞(Yu等，2007)。在感染后12天至20天，具有人ES细胞形态的集落变得可见。挑选集落并扩增。构成集落的诱导多潜能干细胞与人ES细胞在形态上类似、表达多种人ES细胞标志物并且在被注射到小鼠中后形成具有神经组织、软骨和肠上皮的畸胎瘤。
在另一种方法中，使用逆转录病毒转导用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4转染成体人皮肤成纤维细胞(Takahashi等，2007)。将经转染的细胞铺板在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)之培养基中的SNL饲养细胞(产生LIF的小鼠细胞成纤维细胞细胞系)上。约25天后，培养物中出现与人ES细胞集落类似的集落。挑选ES细胞样集落，并使其在bFGF存在下在饲养细胞上扩增。
iPS细胞最初于2006年由小鼠细胞产生(Takahashi等，2006)以及于2007年由人细胞产生(Takahashi等，2007；Yu等，2007)。这已被列为干细胞研究中的重要进展，因为其可允许研究人员获得对研究具有重要意义并且潜在地具有治疗用途的多潜能干细胞而无需有争议地使用胚胎。由小鼠或人组织产生诱导多潜能细胞(iPS细胞)的首次成功证明包括使用表达特定转录因子组的逆转录病毒载体。James Thomson和Shinya Yamanaka之实验室中的研究已证明：通过逆转录病毒载体向小鼠或人成纤维细胞中引入特定的转录因子足以将这些细胞重编程为未分化的多潜能干细胞。Thomson使用的因子包括Oct4、Sox2、Nanog和Lin28。Yamanaka使用的因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。通过任一基因的组的重编程都可通过将转录因子整合到宿主细胞基因组中并表达来实现或者通过由随后可从经重编程细胞丢失产生无痕(scarless)iPS细胞的游离型质粒进行表达来实现。
基于细胞特征，ES细胞样集落的细胞是诱导多潜能干细胞。诱导多潜能干细胞与人ES细胞在形态上类似并且表达多种人ES细胞标志物。此外，当在已知导致人ES细胞分化的条件下培养时，诱导多潜能干细胞相应地分化。例如，诱导多潜能干细胞可分化成具有内胚层祖细胞或胰岛β细胞结构和标志物的细胞。预期，几乎任何iPS细胞或细胞系都可用于本发明，包括，例如Yu和Thompson，(2008)中所述的那些。
从小鼠制备诱导多潜能干细胞的方法也是已知的(Takahashi和Yamanaka，2006)。iPS细胞的诱导通常需要表达或暴露于来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员。Sox和Oct被认为是特化ES细胞身份的转录调控层次的中心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可以是Oct-4。另外的因子可提高重编程效率，如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；重编程因子的特定组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选的Lin-28的组；或包含Sox-2、Oct4、Klf和任选的c-Myc的组。
与ES细胞类似，iPS细胞具有特征性的抗原，所述抗原可使用SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4(发育研究杂交瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank)，国家儿童健康和人类发育研究所(National Institute of Child Health and Human Development)，Bethesda Md.)以及TRA-1-60和TRA-1-81的抗体通过免疫组织化学或流式细胞术被鉴定或确认(Andrews等，1987)。可通过将约0.5×106至10×106个细胞注射到8至12周龄大的雄性SCID小鼠的后腿肌肉中来确认iPS细胞的多潜能性。发生证明3个胚层中每一个胚层的至少一种细胞类型的畸胎瘤。
在本发明的某些方面，使用包括Oct家族成员和Sox家族成员(例如Oct4和Sox2)的重编程因子与上述以及WO2009/149233中所述的K1f和/或Nanog的组合由重编程体细胞制备iPS细胞。用于重编程的体细胞可以是可被诱导多潜能性的任意体细胞，例如成纤维细胞、角质形成细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞、胃细胞或β细胞。在某一个方面，也可使用T细胞作为用于重编程的体细胞的来源(参见WO2010/141801，其通过引用并入本文)。
重编程因子可由包含在一种或更多种载体中的表达盒表达，所述载体例如整合型载体或游离型载体，例如基于EBV元件的系统(参见UWO2009/149233，其通过引用并入本文；Yu等，2009)。在另一个方面，可通过蛋白质转导将重编程蛋白直接引入体细胞中。
2.038AT4细胞是被设计来诱导血细胞生成的人iPSC。它们被工程化来组成型地表达rtTET蛋白以用于进行诱导型基因表达。选择3号染色体上的人Rosa26基因座以允许表达rtTET。通过同源重组将LoxP重组位点(LOX71和LOX2272)引入人ROSA26基因的第一个内含子中。将来自人BCL2基因(SA)的剪接受体信号置于LOX71位点之前以允许从内源人ROSA26启动子表达选择标志物。使用新霉素磷酸转移酶(Neo)进行阳性选择。将ERG1和GFI1的编码区克隆到在TET诱导型启动子(Ptight)控制之下的基于PiggyBac转座子的表达载体中，所述启动子是一种rtTET响应性的诱导型启动子。ERG1和GFI1在诱导型启动子Ptight的控制之下。为了诱导转基因表达，用多西环素(DOX；0.2μg/ml)处理细胞。经正确重组的诱导型细胞对嘌呤霉素(Puro+)和新霉素(Neo+)具有抗性。
2.038MAFA细胞是被设计来过表达转录因子MaFA的人iPSC。将含有与新霉素融合之MaFA的编码区的质粒电穿孔到iPSC中。使用新霉素选择对新出现的克隆进行选择。外源MaFA在TET诱导型启动子(Ptight)的控制之下，所述启动子是MaFa_新霉素载体中存在的rtTET响应性的诱导型启动子。为了诱导转基因表达，用多西环素(DOX；0.1μg/ml至10μg/ml)处理细胞。经正确重组的诱导型细胞对新霉素(Neo+)具有抗性。对多克隆群进一步进行亚克隆以获得2.038Mafa细胞。
III.内胚层祖(EP)细胞特征
可根据多个表型标准对细胞进行表征。所述标准包括但不限于对所表达细胞标志物的检测或量化、酶活性以及对形态特征和细胞内信号转导的表征。
本发明某些方面包括的内胚层细胞具有天然内胚层细胞的特征性形态特征。所述特征为评价此类事物的技术人员所容易理解，并且包括圈样(doughnut-like)形态(当在2D培养物中培养时)。单个细胞中存在的一个或更多个这样的特征与为内胚层细胞谱系之成员的细胞一致。可如下对细胞是否具有内胚层细胞的特征性形态特征进行无偏确定：加密分化的后代细胞、成体或胎儿内胚层细胞以及一种或更多种阴性对照细胞(例如成纤维细胞或RPE(视网膜色素上皮)细胞)的显微图，然后以盲法方式评价这些显微图并破译密码以确定是否精确地鉴定了来自分化的内胚层细胞。
定形内胚层(DE)是一种瞬时状态，其快速分化、不能增殖、无明显的形态并且可不完全定向于内胚层命运。另一方面，内胚层祖细胞不是瞬时的、具有明显的形态并且可被无限地培养(Cheng等，2013)。内胚层祖细胞可产生内胚层谱系(例如肝、胰腺和肠)中的细胞，但不能体外或体内产生中胚层或外胚层。同样地，EP细胞在免疫缺陷小鼠中不形成畸胎瘤。因此，DE和EP细胞可代表不同的发育中间物并且可具有不同的发育潜能。
胰腺(约手大小的器官)位于胃下部之后。其包括两个在形态和生理两方面均不相同的结构：产生参与消化之酶(淀粉酶、脂肪酶等)和碳酸氢钠的外分泌胰腺，和产生参与血糖控制之激素(胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和胰腺多肽)的内分泌胰腺。内分泌胰腺中的细胞被组织为以岛形式分散在胰腺中的微器官(朗格汉斯岛(islets ofLangerhans)或胰岛)。每个胰岛由四种细胞类型构成：α细胞、β细胞、δ细胞和PP(γ)细胞以及ε细胞。β细胞见于胰岛的中心并且是唯一能够响应于葡萄糖而分泌胰岛素的细胞。
本发明的细胞还可根据其是否表达胰腺内胚层谱系的特征性表型标志物来进行表征。内胚层祖细胞的特征还在于表达CXCR4、CD117、FOXA1、FOXA2、CD31、CD34和SOX17。可用于区别胰岛β细胞的细胞标志物的非限制性实例包括PDX-1、神经元素3、neuroD1、胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和C肽。成熟胰岛β细胞标志物包括，但不限于，PDX1、C肽和胰岛素。与胎儿胰腺之未成熟细胞同类的未成熟胰岛β细胞是多激素的，而成熟胰岛β细胞是单激素的和葡萄糖响应性的。
本公开内容中列举的内胚层祖蛋白决定簇可使用任何合适的免疫学技术来检测，例如针对细胞表面标志物的流式免疫细胞化学、针对细胞内或细胞表面标志物的免疫组织化学(例如，对固定细胞或组织切片进行免疫组织化学)、细胞提取物的Western印迹分析以及针对分泌到培养基中的细胞提取物或产物的酶联免疫测定。任选地固定细胞并且任选地使用经标记二抗或其他缀合物(例如生物素-抗生物素蛋白缀合物)以放大标记之后，如果在标准免疫细胞化学或流式细胞术测定中显著可检测量的抗体将与抗原结合，则细胞的抗原表达被认为是“抗体可检测的”。
还可通过Northern印迹分析、斑点印迹杂交分析或者在标准扩增方法中使用序列特异性引物通过实时聚合酶链式反应(PCR)来在mRNA水平检测特定标志物的表达(美国专利No.5,843,780)。用于本公开内容中所列举的特定标志物的序列数据可从公开数据库(例如GenBank)获得。如果根据典型控制实验中的标准操作对细胞样品进行测定在标准时间窗口内导致明确可辨别的杂交或扩增产物，则认为根据本公开内容中所述的一种测定在mRNA水平的表达是“可检测的”。除非另有要求，否则如果通过RT-PCR可检测到相应的mRNA，则指示特定标志物的表达。如果所述水平至少2倍，并且优选10倍或50倍以上高于对照细胞(例如，未分化多潜能干细胞、成纤维细胞或其他不相关细胞类型)的水平，则认为在蛋白质或mRNA水平检测的内胚层祖细胞或β细胞特异性标志物的表达是阳性的。
还可根据细胞是否表现出胰岛β细胞谱系细胞的特征性酶促活性来对其进行表征。例如，葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Glucose-Stimulated Insulin Secretion，GSIS)测定测量响应暴露于葡萄糖刺激而释放的C肽。这一测定提供了针对每个胰岛批次的葡萄糖刺激指数。所述指数是在高葡萄糖浓度相对于低葡萄糖浓度下释放的胰岛素的比。
在另一个方面，例如通过确定响应于葡萄糖刺激产生的胰岛素水平和在移植分化细胞后对糖尿病小鼠模型的体内营救(rescue)来评价通过分化提供之β细胞的生物学功能。在又一个方面，β细胞可通过其高锌含量来鉴定(Shiroi等，2002)。
可使用功能性测定对内胚层祖细胞进行测试。例如，可将所述细胞移植到小鼠胚胎的内胚层区室中以测试其鉴定内源内胚层和与内源内胚层相互作用的能力。
有技能的读者将容易理解：培养内胚层祖细胞的一个优势是所述细胞可在同源的未分化细胞群中生长。因而，其产生下游谱系的用途可导致更特化细胞类型的分化效率提高。这也降低污染细胞类型(例如来自其他胚层的那些)的不想要作用的潜能。如通过免疫染色和荧光激活定量或其他合适技术所确定的，如果少于0.1％(优选少于100ppm或10ppm)携带不期望细胞类型的标志物或其他特征，则本发明的EP细胞可被表征为基本不含一些或所有污染细胞类型。此外，EP细胞可不含或者基本不含间充质细胞或造血细胞。
根据本发明某些方面提供的细胞可具有从原始来源获得之细胞的多个特征。特定细胞中存在这些特征中的越多特征，其越可被表征为内胚层祖细胞谱系细胞。递增性地更优选具有这些特征中至少2、3、5、7或9个特征的细胞。涉及如可存在于培养容器或施用制备物中的特定细胞群时，细胞之间在表达这些特征方面的一致性通常是有利的。在此情况下，递增性地更优选其中至少约40％、60％、80％、90％、95％或98％的细胞具有期望特征的群。
IV.内胚层祖细胞和β细胞分化因子
本发明的某些方面提供了内胚层祖细胞或β细胞分化因子。本发明人还考虑了这一部分中列举的基因的所有同种型和变体均包括在本发明中。
A.细胞信号转导抑制剂/拮抗剂
在本发明的某些方面，在分化过程的至少一部分期间，可在抑制参与信号转导级联之信号转导物的一种或更多种信号转导抑制剂存在下维持细胞。应当理解，在这些方面和实施方案中，当期望时，可替换抑制相同信号转导途径中信号转导组分的其他信号转导抑制剂。这可包括抑制上游刺激。同样地，当期望时，可将抑制剂替换为相关信号转导途径的其他抑制剂。
这样的信号转导抑制剂(例如，GSK3抑制剂、ALK5抑制剂、BMP拮抗剂)可以以下列有效浓度使用：至少或约0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、500至约1000μM或可来源于其中的任意范围。
用于鉴定激酶抑制剂的多种测定都是已知的。例如，Davies等(2000)描述了其中在肽底物和经放射性标记ATP存在下孵育激酶的激酶测定。通过激酶磷酸化底物导致标记被并入到底物中。将每个反应的等分试样固定在磷酸纤维素纸上并在磷酸中洗涤以除去游离的ATP。然后，测量经历孵育之后的底物的活性并提供激酶活性的指示。在存在和不存在候选激酶抑制剂的情况下的相关激酶活性可容易地使用这样的测定来确定。Downey等(1996)也描述了可用于鉴定激酶抑制剂的针对激酶活性的测定。
1.糖原合酶激酶3抑制剂
糖原合酶激酶3(GSK3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导特定细胞底物中某些丝氨酸和苏氨酸氨基酸上磷酸分子的添加。通过GSK3磷酸化这些其他蛋白质通常抑制靶蛋白(也称为“底物”)。如所提及的，已知GSK3用于磷酸化并由此失活糖原合酶。其还涉及控制对损伤DNA和Wnt信号转导的细胞响应。GSK3还磷酸化Hedgehog(Hh)途径中的Ci，靶向其以蛋白水解成失活形式。除糖原合酶之外，GSK3还具有很多其他底物。然而，GSK3是不寻常的激酶，因为其通常需要“引发激酶(priming kinase)”来首先使底物磷酸化。
GSK3磷酸化的结果通常是抑制底物。例如，当GSK3磷酸化其另一底物转录因子中的NFAT家族时，这些转录因子不能易位到细胞核并由此被抑制。除其在Wnt信号转导途径(其是在发育期间建立组织模式所需的)中的重要作用之外，GSK3还对在诸如骨骼肌肥大的背景下诱导的蛋白质合成具有关键作用。其作为NFAT激酶的作用还使其成为分化和细胞增殖两者的关键调节因子。
GSK3抑制可指抑制一种或更多种GSK3酶。GSK3酶家族是公知的并且已对多个变体进行了描述(参见例如Schaffer等，2003)。在一些具体实施方案中，GSK3-β被抑制。GSK3-α抑制剂也是合适的，并且在某些方面，用于本发明中的抑制剂抑制GSK3-α和GSK3-β两者。GSK3抑制剂可激活例如Wnt/β-联蛋白途径。
GSK3抑制剂的具体实例包括，但不限于，坎帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂坎帕罗酮(1-Azakenpaullone)、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418(参见，例如Gould等，2004)、CT99021(参见，例如Wagman，2004)、CT 20026(参见，例如Wagman，2004)、SB415286、SB216763(参见，例如Martin等，2005)、AR-A014418(参见，例如Noble等，2005)、锂(参见，例如Gould等，2003)、SB 415286(参见，例如Frame等，2001)和TDZD-8(参见，例如Chin等，2005)。另一些可从Calbiochem获得的示例性GSK3抑制剂(参见，例如WO2008/094597，其通过引用并入本文)包括但不限于BIO(2’Z，3’￡)-6-Bromomdirubm-3’-肟(GSK3抑制剂IX)；BIO-丙酮肟(2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-丙酮肟(GSK3抑制剂X)；(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3抑制剂XIII)；吡啶并咔唑-环戊二烯钌复合物(GSK3抑制剂XV)；TDZD-84-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮(GSK3β抑制剂I)；2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-二唑(GSK3β抑制剂II)；OTDZT 2，4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(GSK3β抑制剂III)；α-4-二溴苯乙酮(GSK3β抑制剂VII)；AR-AO 14418N-(4-甲氧基苄基)-N’-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(GSK-3β抑制剂VIII)；3-(1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2，3-b吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮(GSK3β抑制剂XI)；TWS1 19吡咯并嘧啶化合物(GSK3β抑制剂XII)；L803H-KEAPP APPQSpP-NH2或其肉豆蔻酰化形式(GSK3β抑制剂XIII)；2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3β抑制剂VI)；AR-AO144-18；SB216763；以及SB415286。
本文中使用的抑制剂优选对所靶向的激酶具有特异性。已用对GSK3具有特异性的CHIR99021获得了良好结果。适用于CHIR99021的浓度为0.01微摩尔至100微摩尔，优选0.1微摩尔至20微摩尔，更优选0.3微摩尔至10微摩尔。
2.ALK5抑制剂
TGF-β受体抑制剂总体上可包括TGF信号转导的任何抑制剂或对TGF-β受体(例如，ALK5)抑制剂具有特异性的抑制剂，其可包括针对TGF-β受体之显性负性变体以及抑制TGF-β受体表达的siRNA和反义核酸的抗体。示例性的TGF-β受体/ALK5抑制剂包括，但不限于，SB431542(参见，例如Inman等，2002)、A-83-01，也称为3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺(参见，例如Tojo等，2005；可从例如Tocris Bioscience商购)；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1、5-二氮杂萘、Wnt3a/BIO(参见，例如WO2008/094597，其通过引用并入本文)、BMP4(参见，例如WO 2008/094597)、GW788388(-(4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(参见，例如Gellibert等，2006)、SM16(参见，例如Suzuki等，2007)、IN-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(参见，例如Kim等，2008)、GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)(参见，例如de Gouville等，2006)、SB-505124(2-(5-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)(参见，例如DaCosta等，2004)；SU5416；lerdelimumb(CAT-152)；美替木单抗(metelimumab)(CAT-192)；GC-1008；ID11；AP-12009；AP-11014；LY550410；LY580276；LY364947；LY2109761；SB-431542；SD-208；SM16；NPC-30345；Ki26894；SB-203580；SD-093；ALX-270-448；EW-7195；SB-525334；IN-1233；SKI2162；Gleevec；3，5，7，2’，4’-五羟基黄酮(pentahydroxyfiavone)(Morin)；激活蛋白-M108A；P144；可溶性TBR2-Fc；嘧啶衍生物(参见，例如WO 2008/006583中列举的那些，其通过引用并入本文)以及Roth等(2010)中报道的吲哚满酮。
此外，尽管“ALK5抑制剂”并非旨在涵盖非特异性激酶抑制剂，但是“ALK5抑制剂”应被理解为涵盖除ALK5之外，还抑制ALK4和/或ALK7的抑制剂，例如SB-431542(参见，例如Inman等，2002)。
认为，抑制TGF-β/激活蛋白途径将具有类似作用。因此，TGF-β/激活蛋白途径的任何抑制剂(例如，上游或下游)可与本文中所述的TGF-β/ALK5抑制剂组合使用，或者替代本文中所述的TGF-β/ALK5抑制剂。示例性的TGF-β/激活蛋白途径抑制剂包括但不限于：TGF-β受体抑制剂、SMAD 2/3磷酸化的抑制剂、SMAD 2/3与SMAD 4之相互作用的抑制剂以及SMAD6和SMAD 7的活化剂/激动剂。此外，本文中所述的分类仅出于组织目的并且本领域技术人员将认识到化合物可影响某一途径内的一个或更多个点，因此化合物可以以一种以上限定的类别发挥功能。
3.ROCK抑制剂
多潜能干细胞(特别是人ES细胞和iPS细胞)在细胞脱离和解离之后易于凋亡，而细胞脱离和解离对克隆分离或扩增以及分化诱导具有重要意义。最近，已发现一小类分子提高经解离多潜能干细胞的克隆效率和存活，例如Rho相关激酶(Rho-associated kinase，ROCK)抑制剂，其是用于ROCK相关信号转导途径的抑制剂，例如Rho特异性抑制剂、ROCK特异性抑制剂或肌球蛋白II特异性抑制剂。在本发明的某些方面，ROCK抑制剂可用于培养和传代多潜能干细胞和/或干细胞的分化。因此，ROCK抑制剂可存在于多潜能干细胞生长、解离、形成聚集体或经历分化的任何细胞培养基(例如贴壁培养物或悬浮培养物)中。除非本文中另有声明，否则肌球蛋白II抑制剂(例如blebbistatin)可替代ROCK抑制剂的实验性用途。
ROCK信号转导途径可包括Rho家族GTP酶；ROCK，Rho下游的主要效应物激酶；肌球蛋白II，ROCK下游的主要效应物(Harb等，2008)；以及任何中间体、上游或下游信号加工物(processor)。ROCK可磷酸化并失活肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase targetsubunit 1，MYPT1)(一种ROCK的主要下游靶标)，其通过去磷酸化肌球蛋白调控轻链(myosin regulatory light chain，MRLC)负调节肌球蛋白功能。
ROCK是用作Rho(其中存在三种同种型-RhoA、RhoB和RhoC)的靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸激酶。这些激酶最初被表征为形成RhoA诱导应力纤维和黏着斑的介体。两种ROCK同种型-ROCK1(p160ROCK，也称为ROKβ)和ROCK2(ROKα)由N端激酶结构域，接着含有Rho结合结构域的卷曲-螺旋结构域以及普列克底物蛋白同源结构域(pleckstrin-homology domain，PH)构成。两种ROCK都是细胞骨架调节剂，介导RhoA对应力纤维形成、平滑肌收缩、细胞黏着、膜起皱和细胞运动性的作用。ROCK可通过靶向下游分子(例如肌球蛋白II、肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)、MLC磷酸酶(MLCP)以及磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)来发挥其生物学活性。
ROCK抑制剂的非限制性实例包括HA-100、Y-27632、H-1152、Fasudil(也称为HA1077)、Y-30141(描述于美国专利5,478,838中)、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B及其衍生物。此外，由于其他低分子化合物作为ROCK抑制剂是已知的，因此这样的化合物或其衍生物也可用于实施方案中(例如，参考美国专利公开No.2005/0209261、2005/0192304、2004/0014755、2004/0002508、2004/0002507、2003/0125344和2003/0087919，以及国际专利公开No.2003/062227、2003/059913、2003/062225、2002/076976和2004/039796，其通过引用并入本文)。在本发明的某些方面，还可使用一种或两种或更多种ROCK抑制剂的组合。在本发明的某些方面，还可使用Rho特异性抑制剂(例如，肉毒杆菌(Clostridium botulinum)C3胞外酶)和/或肌球蛋白II特异性抑制剂作为ROCK抑制剂。
4.BMP途径拮抗剂
在一个实施方案中，BMP信号转导途径的拮抗剂(即BMP信号转导拮抗剂或BMP拮抗剂)抑制或下调组成型活性BMP信号转导途径。在一个实施方案中，BMP信号途径是BMP2或BMP4介导的信号转导途径。在一个实施方案中，BMP信号转导的拮抗剂抑制I型BMP受体信号转导。在一个实施方案中，BMP信号转导途径的拮抗剂通过与I型BMP受体结合来抑制I型BMP受体信号转导。在一个实施方案中，I型BMP受体包括ALK2、ALK3或ALK6。在一个实施方案中，BMP信号转导途径的拮抗剂抑制对SMAD 1、SMAD 5或SMAD 8的磷酸化。在又一个实施方案中，BMP信号转导途径的拮抗剂抑制BMP2或BMP4与BMP受体的结合或者II型BMP受体与I型BMP受体的相互作用。BMP信号转导途径的拮抗剂是化学试剂。化学试剂可包括，但不限于，dorsomorphin、LDN1 93189及其类似物。多肽衍生的BMP途径拮抗剂包括，但不限于，头蛋白、gremlin、脊索发生素、促滤泡素抑制素、cerberus、PRDC、USAG-1、Coco和壳硬蛋白。
5.Hedgehog抑制剂
Hedgehog抑制剂包括，但不限于，KAAD-环巴胺；GDC-0449；(Solinas等，2012)中报道的酰基硫脲、酰基脲和酰基胍衍生物；(Brunton等，2008)中报道的苯基喹唑酮脲；(Winkler等，2009)中报道的环巴胺类似物；AY9944、LY2940680、MRT-10、MRT-83、GDC-0449、三苯乙醇(triparanol)、蒜藜芦碱、伊曲康唑、磺胺索嘧啶(sulfisomadine)、鬼臼树脂、秋水仙碱。术语“hedgehog抑制剂”意指将降低smoothened的活性并降低Hh途径靶标patched和GIi 1的活性的试剂。本文中使用的术语“hedgehog抑制剂”不仅指可通过直接抑制hedgehog蛋白的正常功能来起作用的任何试剂，而且指抑制hedgehog途径活性并由此概括ptc功能的任何试剂。
6.γ分泌酶抑制剂
活性γ分泌酶是四种蛋白质的复合物，其中早老蛋白(PS)被认为通过位于蛋白质之跨膜结构域内的两个高度保守的天冬氨酸D257和D385来提供活性位点。为了变得有活性，必须对未成熟的PS进行加工并将其与其他蛋白质一起并入复合物中以变得稳定。这包括通过称为“早老蛋白酶(presenilinase)”的酶进行蛋白水解切割，这产生在成熟蛋白酶中保持彼此相关联的N端片段和C端片段，其中每个片段均含有两个必需天冬氨酸中的一个。然而，在不存在复合物之其他成员的情况下，即使该成熟PS也不足以切割APP。这些蛋白质(经鉴定为呆蛋白(nicastrin)、Aph-1和Pen-2)调节复合物的成熟、稳定和运输。例如，一旦将Pen-2与Aph-1和呆蛋白一起并入复合物，其是未成熟PS进行早老蛋白酶切割所需要的。共同地，四种蛋白质的复合物可重构γ分泌酶活性，其中基于PS被提议作为复合物之活性核心的作用，有时单独PS本身就被称为“γ分泌酶”。
迄今所述的最特异性和有效的γ分泌酶抑制剂为N-tN-fS.S-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基1-S-苯基甘氨酸-f-丁酯(DAPT)，其抑制PS-1和PS-2两者。DAPT是一种细胞可透过的二肽非过渡态类似物，其在置换测定中可适度地竞争γ分泌酶活性位点，表明活性位点和DAPT之结合位点之间存在一些重叠。
肽模拟物(peptidomimetic)抑制剂包括Shearmen等(2000)所述的L-685，458((5S)-(叔丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)羟基-(2R)苄基己酰基)-L-leu-L-phe-酰胺)。ALX-260-127是Wolfe等(1998)所述的γ分泌酶的可逆二氟酮肽模拟物抑制剂。Li等(2000)描述了针对γ分泌酶活性位点的光活化γ分泌酶抑制剂。在使用重组淀粉样β前体蛋白C100作为底物的体外γ分泌酶测定中，硫化舒林酸(sulindac sulfide，SSide)直接作用于γ分泌酶并且优先抑制γ分泌酶活性，Takahashi等(2003)。已知γ分泌酶抑制剂的其他实例包括，但不限于，RO4929097、BMS-708163、Semagacestat、MK-0752、YO-01027、LY-411575、LY2811376和(R)-氟比洛芬。
此外，已描述了用于筛选γ分泌酶抑制剂的多种测定，例如通过Takahashi等(2003)，Pinnix等(2000)之基于检测APP的推定C端片段-γ的测定；McLendon等(2000)的γ分泌酶活性的无细胞测定。
B.分化因子
本公开内容中举例说明的内胚层祖细胞促生长因子可包括能够促进可进一步分化成单激素胰腺β细胞之细胞生长的可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配体-受体复合物及其他化合物)。这样的试剂的非限制性性实例包括，但不限于，生长因子，例如碱性FGF(bFGF)、BMP-4、EGF、激活蛋白A、TGFβ和VEGF，或者其同种型或变体。
在某些实施方案中，一种或更多种分化因子是BMP-4，其对调节造血祖细胞的增殖和分化潜能具有重要作用(Bhardwaj等，2001；Bhatia等，1999；Chadwick 2003)。BMP-4还可促进内胚层祖细胞的自我更新。
在另一些实施方案中，一种或更多种分化因子是血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)，其是参与形成胚胎循环系统和血管生成的重要信号转导蛋白。VEGF可影响多种细胞类型，包括血管内皮以及其他细胞类型(例如，神经元、癌细胞、肾上皮细胞)。还已表明，VEGF功能对多种疾病状态(包括癌症、糖尿病、自身免疫病和眼血管病)具有重要意义。
提供内胚层祖细胞和胰岛β细胞的分化可通过使细胞与这一部分中所述的任意一种或更多种因子接触来实现，所述因子包括但不限于激活蛋白A、Nodal、Wnt3A、BMP4、VEGF、FGF2/bFGF、EGF、FGF 10、B27、TGFβ、烟酰胺和视黄酸。此外，已知Ets转录因子(例如Erg-1以及GFI)直接和/或间接地参与β细胞分化(Kobberup等，2007；Shroyer等，2005)。另外，不受理论的束缚，已知由低氧诱导其表达的HIF-1α是经调节的β细胞功能(Cheng等，2010)。
V.细胞培养
本文中使用的术语“培养的/经培养的”在提及细胞时可指在体外环境中正经历细胞分裂或不经历细胞分裂的一个或更多个细胞。例如，体外环境可以是本领域中已知的适合体外维持细胞的任何培养基，例如合适的液体培养基或琼脂。适用于细胞培养的体外环境的具体实例在Culture of Animal Cells：a manual of basic techniques(1994)；Cells：a laboratory manual(1998)；以及Animal Cells：culture and media(1994)中进行了描述。
本文中使用的术语“细胞系”可指可以被传代至少一次而不终止的经培养细胞。本发明涉及可被无限地传代的细胞系。下文中对细胞传代进行了定义。
本文中使用的术语“悬浮”可指其中细胞不附着于固体支持物的细胞培养条件。可在增殖的同时使用本领域技术人员公知的仪器搅拌悬浮增殖的细胞。
本文中使用的术语“单层”可指附着于固体支持物同时在合适培养条件下进行增殖的细胞。在合适生长条件下以单层增殖的细胞中的一小部分可附着于单层中的细胞而不附着于固体支持物。
本文中使用的术语“经铺板的”或“铺板”在提及细胞时可指体外建立细胞培养物。例如，可将细胞在细胞培养基中稀释，然后添加至细胞培养板、培养皿或培养瓶。细胞培养板是本领域中普通技术人员所通常知道的。可将细胞以多种浓度和/或细胞密度铺板。
术语“细胞铺板”还可延伸为术语“细胞传代”。可使用本领域技术人员公知的细胞培养技术来传代本发明的细胞。术语“细胞传代”可指涉及以下步骤的技术：(1)从固体支持物或基底释放细胞并将这些细胞解离，以及(2)在适合进行进一步细胞增殖的培养基中稀释所述细胞。细胞传代还可指除去含有经培养细胞的液体培养基部分并向原始培养容器添加液体培养基以稀释细胞和允许进一步的细胞增殖。此外，还可将细胞添加至已补充有适合进行进一步细胞增殖之培养基的新培养容器。
与环境空气中的氧浓度(约15％至20％氧)相比，本文中使用的术语“低氧”和“低氧条件”可指以较低氧浓度为特征的条件。在一个方面，低氧条件以低于约10％的氧浓度为特征。在另一个方面，低氧条件以如下氧浓度为特征：约1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％或1％至2％，或者可来源于其中的任意范围。
本文中使用的术语“增殖”在提及细胞时可指数目可随时间增加的细胞组。
本文中使用的术语“永久性的”或“无限增殖化的”在提及细胞时可指这样的细胞，其在于体外环境中培养的同时可经历细胞分裂并且细胞数目加倍多次直至细胞终止。在显著数目的细胞于培养物中终止之前，永久性细胞系可加倍超过10次。优选地，在显著数目的细胞于培养物中终止之前，永久性细胞系可加倍超过20次或超过30次。更优选地，在显著数目的细胞于培养物中终止之前，永久性细胞系可加倍超过40次或50次。最优选地，在显著数目的细胞于培养物中死亡之前，永久性细胞系可加倍超过60次。
起始细胞和分化细胞一般对培养基和培养条件具有不同的需求。通常在引入分化因子后，在已知适合起始细胞生长的培养基存在下并在已知适合起始细胞生长的培养条件下进行至少初始培养阶段。接着，在已知适合分化细胞的分化培养基存在下并且在已知适合分化细胞的条件下进行后续培养时期。在进行足够时间的分化之后，可在扩增培养基中对分化细胞进行进一步培养以扩增所述分化细胞。这样的扩增培养基可包含上文所述的一种或更多种信号转导抑制剂或者包含基本不含这些抑制剂的培养基。
初始培养阶段优选持续至多6天，更优选至多4天，并且在下文所述的一些具体实施方案中不超过3天，更具体为至多1天或大约1天。在包含一种或更多种信号转导抑制剂之分化培养基中的后续培养阶段适当地持续至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33天，或可来源于其中的任意范围，并且可持续至多120天，优选至多10天。在下文所述的用于产生内胚层祖细胞或β细胞的一个具体实施方案中，初始培养阶段持续约5天，并且通过在多种分化培养基存在下进行培养，后续阶段持续约26天至44天。分化条件可基本不包含饲养细胞。在另一些方面，分化培养基可以是化学成分确定的培养基。为了提高分化，分化培养基还可包含高浓度的FGF并且可基本不含TGF-β。在一些情况下，所述培养基可包含TGF-β。
A.一般性条件
将基于所使用的培养基和干细胞对根据本发明的培养条件进行适当限定。根据本发明某些方面的培养基可通过使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养来进行制备，例如以下中的任意及其任意组合：TeSR、Essential 8培养基、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、改进的MEM Zinc Option、IMDM、培养基199(Medium 199)、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI 1640和Fischer培养基，但所述培养基并不特别限于此，只要其可用于培养动物细胞即可。
根据本发明的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。无血清培养基指不含未经处理或未经纯化的血清的培养基，因此可包括具有经纯化的血液来源组分或动物组织来源组分(例如生长因子)的培养基。从防止异源动物来源组分的污染方面考虑，血清可与干细胞来源于同一动物。
根据本发明的培养基可包含或者可不包含血清的任何替代物。血清的替代物可包括适当含有以下物质的材料：白蛋白(例如富脂质白蛋白、白蛋白替代物例如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油(thiolgiycerol)或其等同物。例如，血清的替代物可通过国际公开No.98/30679中公开的方法来制备。或者，为了更方便，可使用任何市售可得的材料。市售可得的材料包括敲除血清替代物(knockout Serum Replacement，KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated，Gibco)和Glutamax(Gibco)。
本发明的培养基还可包含脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以为例如约0.05mM至1.0mM，特别是约0.1mM至0.5mM，但是所述浓度并不特别限于此，只要其适合培养干细胞即可。
用于培养本发明细胞的培养容器可包括，但不特别限于：瓶、组织培养瓶、皿、培养皿、组织培养皿、多皿、微板、微孔板、多板、多孔板、微载玻片、腔室载玻片、管、盘、 Chamber、培养袋和滚瓶，只要其能够培养其中的细胞即可。根据培养的需求，可在以下体积中培养干细胞：至少或约0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml，或可来源于其中的任意范围。在某个实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可指支持生物学活性环境的任何装置或系统。生物反应器的体积可以为至少或约2升、4升、5升、6升、8升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、150升、200升、500升、1立方米、2立方米、4立方米、6立方米、8立方米、10立方米、15立方米，或可来源于其中的任意范围。
培养容器可以是细胞粘附型的或非粘附型的，并且可根据目的来选择。细胞粘附型培养容器可包被有用于细胞粘附的任何底物(例如胞外基质(ECM))以改善容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的底物可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何物质。用于细胞粘附的底物包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶，和RetroNectin及其混合物，例如MatrigelTM，以及经裂解的细胞膜制备物(Klimanskaya等，2005)。
可适当地限定其他培养条件。例如，培养温度可以为约30℃至40℃，例如，至少或约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃，但不特别限于这些。CO2浓度可以为约1％至10％，例如约2％至5％，或可来源于其中的任意范围。氧张力可以为至少或约1％、5％、8％、10％、20％，或可来源于其中的任意范围。对于常氧培养物，氧张力优选为20％。常氧和低氧培养条件在下文进行了进一步描述。
例如，在某些方面，本发明的方法可用于细胞的贴壁培养。在此情况下，可在饲养细胞存在下培养细胞。在本发明的方法中使用饲养细胞的情况下，可使用基质细胞(例如胎儿成纤维细胞)作为饲养细胞(例如，参考：Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，ALaboratory Manual(1994)；Gene Targeting，A Practical Approach(1993)；Martin(1981)；Evans和Kaufman(1981)；Jainchill等，(1969)；Nakano等(1996)；Kodama等(1982)；以及国际公开No.01/088100和2005/080554)。
在某些方面，本发明的方法还可用于细胞的悬浮培养，包括在载体上的悬浮培养(Fernandes等，2004)或凝胶/生物聚合物包封(美国公开2007/0116680)。相对于培养容器或培养基中的饲养细胞(如果使用的话)，术语细胞的悬浮培养意指在非贴壁条件下培养细胞。细胞的悬浮培养包括细胞的解离培养和细胞的聚集体悬浮培养。术语细胞的解离培养意指培养悬浮的细胞，并且细胞的解离培养物包括单个细胞的解离培养物或由多个细胞(例如，约2至400个细胞)构成之小的细胞聚集体的解离培养物。当继续进行上述解离培养时，经培养的解离细胞形成较大的细胞聚集体，并且此后可进行聚集体悬浮培养。聚集体悬浮培养包括胚状体培养方法(参见Keller等，1995)和SFEB方法(Watanabe等，2005；国际公开No.2005/123902)。
根据本发明一些实施方案的方法，用于悬浮培养细胞的培养容器可以是具有合适纯度级别的任何组织培养容器，其具有被设计成使得在其中培养的细胞不能够粘附或附着于此表面(例如，非组织培养处理的细胞，以防止附着或粘附于表面)的内表面。优选地，为了获得可扩展培养，使用受控培养系统(优选计算机控制的培养系统)来实现根据本发明一些实施方案的培养，其中使用合适的装置自动执行培养参数(例如温度、搅拌、pH和pO2)。一旦培养参数被记录，系统被设置成根据促进细胞扩增的需要自动调节培养参数。可在动态条件下(即，在其中在悬浮培养的同时使细胞持续移动的条件下)或非动态条件下(即，静态培养)培养细胞而同时保留其增殖能力。对于细胞的非动态培养，可在未经包被的58mm培养皿(Greiner，Frickenhausen，Germany)中培养细胞。对于细胞的动态培养，可在转瓶中(例如，200ml至1000ml，例如250ml；100ml；或者在125ml锥形瓶中)培养细胞，其可与控制单元连接，并由此呈现为受控培养系统。持续摇动培养容器(例如，转瓶，锥形瓶)。根据本发明的一些实施方案，使用摇床以90转/分钟(rpm)摇动培养容器。根据本发明的一些实施方案，每日更换培养基。
B.培养多潜能干细胞
当群中相当比例的干细胞及其衍生物表现出未分化细胞的形态特征，使其明显区别于胚胎或成体来源的分化细胞时，将多潜能干细胞的培养物描述为“未分化的”。未分化的ES或iPS细胞可为本领域技术人员所识别，并且通常出现在具有高核质比和显著核仁的细胞集落的二维显微镜视野中。应理解，未分化细胞的集落可具有分化的邻近细胞。
可通过在血清和饲养层(通常为小鼠胚胎成纤维细胞)存在下培养细胞来使ES细胞维持在未分化状态。用于使干细胞维持在未分化状态的其他方法也是已知的。例如，可通过在无饲养层而有LIF存在下培养来使小鼠ES细胞维持在未分化状态。然而，不同于小鼠ES细胞，已有的人ES细胞不响应于LIF。可如下使人ES细胞维持在未分化状态：在碱性成纤维细胞生长因子存在下，在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞(Amit等，2000)，或者在无饲养层以及在成纤维细胞条件化培养基加碱性成纤维细胞生长因子存在下在蛋白质基质(例如MatrigelTM或层粘连蛋白)上进行培养(Xu等，2001；美国专利No.6,833,269)。
用于制备和培养ES细胞的方法可见于标准教科书中以及细胞生物学、组织培养和胚胎学(包括畸胎癌和胚胎干细胞)的综述中：A practical approach(1987)；Guide toTechniques in Mouse Development(1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation invitro(1993)；Properties and uses of Embryonic Stem Cells：Prospects forApplication to Human Biology and Gene Therapy(1998)，所有均通过引用并入本文。用于组织培养的标准方法一般描述于Animal Cell Culture(1987)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(1987)；以及Current Protocols in Molecular Biology andShort Protocols in Molecular Biology(1987和1995)中。
在引入体细胞或使其与重编程因子接触之后，可在足以维持多潜能性和未分化状态的培养基中培养这些细胞。培养本发明中产生的诱导多潜能干(iPS)细胞可使用开发来培养灵长类动物多潜能干细胞(更特别地，胚胎干细胞)的多种培养基和技术，如美国专利公开2007/0238170、2003/0211603和2008/0171385中所述，其在此通过引用并入。应认识到，如技术人员所了解的，用于培养和维持多潜能干细胞的另一些方法也可用于本发明。
在某些实施方案中，可使用未限定的条件；例如，可在成纤维细胞饲养细胞上或者在已暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养多潜能细胞以使干细胞维持在未分化状态。
或者，可使用限定的饲养独立性培养系统(例如TeSR培养基(Ludwig等，2006a；Ludwig等，2006b)或Essential 8培养基(Chen等，2011))来培养多潜能干细胞并使其维持在基本不分化的状态。饲养独立性培养系统和培养基可用于培养和维持多潜能细胞。这些方法使衍生的人iPS细胞以及人胚胎干细胞保持在基本不分化的状态而无需小鼠成纤维细胞“饲养层”。如本文中所述，可如所预期的对这些方法进行多种修改以降低成本。
多种基质组分可用于培养和维持人多潜能干细胞。例如，如Ludwig等(2006a；2006b)中所述(其通过引用以其整体并入)，作为提供用于多潜能细胞生长的固体支持物的手段，可使用MatrigelTM、胶原蛋白IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、PLO层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤维蛋白凝块和玻连蛋白的组合来包被培养表面。特别地，MatrigelTM可用于提供用于进行细胞培养和维持人多潜能干细胞的底物。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的胶状蛋白质混合物，并可从BD Biosciences(New Jersey，USA)商购。这种混合物类似于见于很多组织中的复杂胞外环境，并且被细胞生物学家用作进行细胞培养的底物。
C.细胞传代
本发明的某些方面还可涉及解离细胞的步骤。可使用任何已知的程序来进行细胞解离。这些程序包括用螯合剂(例如EDTA)、酶(例如胰蛋白酶、胶原酶)处理等以及诸如机械解离(例如用移液管抽打)的操作。可在解离之前和/或之后，用ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂处理细胞。例如，可仅在解离之后对细胞进行处理。
在细胞培养的另一些实施方案中，一旦培养容器是满的，就可通过适于解离的任何方法将集落分成聚集的细胞或者甚至单个细胞，然后将细胞置于用于进行传代的新培养容器中。细胞传代是能够使细胞保持存活并在培养条件下长期生长的技术。通常在细胞大约70％至100％汇合时，对其进行传代。
本发明的方法中可使用在对细胞进行单细胞解离之后进行单细胞传代，其具有若干优势，例如有利于细胞扩增、细胞分选和限定的分化接种以及实现培养程序和克隆扩增的自动化。例如，由单个细胞通过克隆衍生的后代细胞可在遗传结构方面是同源的和/或在细胞周期中同步化，这可提高靶向分化。用于单细胞传代的示例性方法可如美国专利公开2008/0171385中所述，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，可将细胞解离成单个独立细胞或含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个细胞的小细胞簇和单个独立细胞的组合。可通过机械力或者通过细胞解离剂(例如柠檬酸钠)或酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、TrypLE Select等)来实现所述解离。
基于细胞来源和扩增需要，可将经解离的细胞以如下分传比(splitting ratio)单独或以小簇转移至新的培养容器，例如至少或约1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200或可来源于其中的任意范围。可根据培养细胞悬浮物的体积来确定悬浮细胞系的分传比。传代间隔可以为至少或约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或可来源于其中的任意范围。例如，不同酶促传代方案的可实现分传比可以是1∶2每3至7天、1∶3每4至7天以及1∶5至1∶10约每7天、1∶50至1∶100每7天。当使用高分传比时，可将传代间隔延长为至少12天至14天或不会因过度的自发分化或细胞死亡而引起细胞损失的任意时间段。
在某些方面，单细胞传代可发生在存在有效提高克隆效率和细胞存活的小分子(例如上述ROCK抑制剂)的情况下。这样的ROCK抑制剂(例如，Y-27632、HA-1077、H-1152、HA-100或blebbistatin)可以以有效浓度使用，例如至少或约0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50至约100μM，或可来源于其中的任意范围。
D.常氧和低氧
低氧培养可用本领域中已知的多种培养室中的任意来实现，例如，如ProOxC(BioSpherix，Lacona，NY)；低氧手套箱(Hypoxic Glove Box)(Coy Laboratory Products，Inc.，Grass Lake，MI)；HypOxystation(HypOxygen，Frederick MD)或低氧室(HypoxiaChamber)(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC)。
常氧条件一般包括用于培养细胞的标准氧水平。除非本文中另有指出，否则在常氧条件下进行细胞培养可利用本领域技术人员已知的方法、仪器和组分。这样的方法可直接利用或者进行修改以用作常氧培养条件。
在本教导的多个方面，可用常氧气氛来替代培养或维持细胞的低氧气氛。在一些实施方案中，细胞可在低氧条件下生长而可在常氧条件下分化。将培养物维持在低氧条件下的持续时间可由本领域技术人员通过常规实验来确定。类似地，在低氧培养之后将培养物维持在常氧条件下的持续时间也可本领域技术人员通过常规实验来确定。
与环境空气中的氧浓度(约15％至20％氧)相比，本文中使用的低氧条件的特征在于较低的氧浓度。作为参考，人体中O2浓度的范围为：脑中0.5％至7％；眼中1％至5％；肝、心脏和肾中4％至12％；以及子宫中3％至5％。在一个方面，低氧条件的特征在于低于约10％的氧浓度。在另一个方面，低氧条件以如下氧浓度为特征：约1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％或1％至2％。在某一方面，系统维持培养容器内约1％至3％的氧。可通过使用允许来控制环境气体浓度的培养仪器(例如厌氧室)产生和维持低氧条件。
通常在用于扩增和接种之具有15％至20％氧和5％CO2的常规气氛中进行细胞培养物的孵育，在此点，将低氧培养物分至充满95％氮/5％CO2的不透气室以使得在培养基中产生低氧环境。
本发明的任意培养步骤(不管在常氧条件下还是在低氧条件下)中使用的生长培养基或培养基均可包含血清或者是无血清的。另外，可使用相同的培养基来进行低氧和需氧培养两者。
孵育条件将可在pH、温度和气体(例如，O2、CO2等)的合适条件下以维持低氧生长条件。
VI.标志物的表达
为了确定细胞培养物或细胞群中特定细胞类型的量，期望使特定细胞类型与培养物或群中的其他细胞区分开来的方法。因此，提供了其存在、不存在和/或相对表达水平对根据本发明产生的某些细胞类型具有特异性的标志物以及用于检测和确定这些标志物表达的方法。
本文中使用的“表达”指材料或物质的产生以及材料或物质的产生水平或产生量。因此，确定特异性标志物的表达指检测所表达标志物的相对量或绝对量，或者简单地检测标志物是否存在。
本文中使用的“标志物”指可观察到或检测到的任何分子。例如，标志物可包括，但不限于，核酸(例如特异性基因的转录本)、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、碳水化合物、糖脂、脂质、脂蛋白或小分子。
标志物的存在、不存在和/或表达水平可通过定量PCR(qPCR)来确定。例如，通过定量PCR来确定由某些遗传标志物产生的转录本的量，所述标志物例如CXCR-4、CD117、SOX17、FOXA2、FOXA1、CD31、CD34和HNF4A。另外，可使用免疫组织化学或流式细胞术来检测上述基因表达的蛋白质。qPCR、流式细胞术和免疫组织化学可用于鉴定和确定这些标志物的量或相对比例。
VII.内胚层祖细胞和β细胞的用途
通过本发明某些方面的方法和组合物提供的内胚层祖细胞和β细胞可用于多种应用中。这些包括但不限于β细胞的体内移植或植入；体外筛选细胞毒性化合物、致癌剂、诱变剂生长/调控因子、药物化合物等；阐明糖尿病的机制；研究药物和/或生长因子作用的机制；在患者中诊断和监测糖尿病；基因疗法；以及产生生物学活性产物等等。
A.受试化合物的筛选
本发明分化衍生的内胚层祖细胞或β细胞可用于筛选影响本文提供之β细胞特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。
在一些应用中，使用干细胞(分化的或未分化的)来筛选这样的因子，其促进细胞沿胰岛β细胞谱系成熟，或者促进这些细胞在长期培养中增殖和维持。例如，如下测试候选β细胞成熟因子或生长因子：将它们添加至不同孔中的内胚层祖细胞，然后根据进一步培养和使用这些细胞的期望标准确定所产生的任何表型变化。
本发明的特定筛选应用涉及在药物研究中测试药物化合物。读者一般参考标准教科书In vitro Methods in Pharmaceutical Research，Academic Press，1997，和美国专利No.5,030,015)。在本发明的某些方面，分化成内胚层祖细胞谱系或β细胞谱系的细胞起用于标准药物筛选和毒性测定的测试细胞的作用，如此前已在短期培养中对于内胚层细胞系或原代内胚层细胞所进行的。评估候选药物化合物的活性一般涉及将本发明某些方面所提供的内胚层祖细胞或β细胞与候选化合物组合，确定可归因于所述化合物之细胞在形态学、标志物表型或代谢活性方面的任何变化(相比较于未经处理的细胞或经惰性化合物处理的细胞)，然后将该化合物的作用与所观察到的变化联系起来。筛选可进行是因为化合物被设计成对内胚层祖细胞或β细胞具有药理学作用，或者是因为被设计成具有作用的化合物另外可能对β细胞具有非预期的副作用。可组合测试两种或更多种药物(通过同时或依次与细胞组合)，以检测可能的药物-药物相互作用。在一些应用中，根据对β细胞的毒性来筛选化合物。参见，例如Kuzuya等，2001。
B.β细胞治疗和移植
本发明还提供了本文中提供的β细胞使可能由于糖尿病而有此治疗需要的对象恢复一定程度的胰腺功能的用途。例如，通过此处所公开的方法获得的胰岛β细胞和内胚层祖细胞可用于治疗糖尿病(例如通过移植物的工程化)。
为了测定本文中提供的β细胞用于治疗应用的适宜性，首先可在合适的动物模型中对该细胞进行测试。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。在适合进行进一步观察的部位(例如肾囊以下、脾内或肝小叶内)向免疫缺陷动物(例如SCID小鼠，或通过化学方法或通过辐照致使免疫缺陷的动物)施用本文提供的β细胞。几天至数周或更长时间段后收获组织并评估是否仍存在起始细胞类型(例如多潜能干细胞)。这可通过提供具有可检测标签(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)的施用细胞来进行；或通过测量对所施用细胞特异性的组成型标志物来进行。当在啮齿类动物模型中测试本文提供的β细胞时，可通过免疫组织化学或ELISA使用人特异性抗体来评估所施用细胞的存在和表型，或者通过RT-PCR分析使用引起人多核苷酸序列之特异性扩增的引物和杂交条件来评估所施用细胞的存在和表型。本公开内容中的其他部分提供了用于在mRNA或蛋白质水平上评估基因表达的合适标志物。
可在多种动物模型中测试通过本发明方法提供的β细胞和内胚层祖细胞治疗糖尿病的能力。可用于本发明某些方面的多种这样的动物模型在例如Srinivasan和Ramarao(2007)以及King(2012)中进行了讨论。一个优选的动物模型是经链脲佐菌素处理以诱导实验性糖尿病的免疫受损小鼠。可将分化的β细胞植入肾囊内，并且如果细胞是功能性的，则将使糖尿病逆转。这种测定通常用于测试尸体胰岛的功能。
本发明某些方面提供的根据其在动物模型中的酶特性或效力证明具有期望功能特征的β细胞和内胚层祖细胞还可适于直接施用于有此需要的人对象。也可将β细胞直接递送至胰腺。
本发明某些方面提供的β细胞或内胚层祖细胞可用于有此需要的任何对象的治疗。可适合进行这样治疗的一个优选人病症是糖尿病。对于人治疗，剂量一般为约109至1012个细胞，并且通常为约5×109至5×1010个细胞，根据对象的体重、病痛的性质和严重程度以及所施用细胞的复制能力进行调整。用于确定治疗方式和合适剂量的最终责任在于主管的临床医师。
本发明的某些方面包括本文提供的形成生物工程化组织移植物的一部分的β细胞或内胚层祖细胞。这样的组织移植物可以是胰腺组织移植物。
C.商业、治疗和研究目的的配送
出于制备、配送和使用的目的，本发明的β细胞谱系细胞(包括内胚层祖细胞)通常以等渗赋形剂或培养基中的细胞培养物或悬浮物的形式供应，任选地所述形式是经冷冻的以有利于运输或储存。
本发明还包括不同的试剂系统，其包含在制备、配送或使用期间的任意时间存在的细胞的组或组合。细胞组包含本公开内容中所述的两种或更多种细胞群的任意组合，例如但不限于分化衍生的细胞(β细胞谱系细胞、其前体以及亚型)与未分化干细胞或其他分化细胞类型的组合。所述组中的细胞群有时共有相同的基因组或其遗传修饰形式。可将所述组中的每种细胞类型包装在一起或者包装在同一设备的独立容器中，或者在不同的位置、相同或不同的时间、受控于同一实体或存在商务关系的不同实体。
VIII.实施例
包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实践本发明时作用良好的技术，因此可被认为是构成实践本发明的一些优选模式。然而，本领域技术人员应该理解，根据本公开内容，可对所公开的一些具体实施方案进行许多改变并且仍获得相同或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1-定形内胚层(DE)细胞的产生
在TeSR或Essential 8培养基存在下在无饲养条件下维持人iPSC。对于iPSC的单层内胚层祖细胞分化，将PSC以80％汇合率铺板在经Matrigel包被的皿上。在第0天，在无血清条件下在补充有10％SFD、1×谷氨酰胺、MTG(4.5×10-4M)的RPMI培养基中在激活蛋白A(100ng/ml)或Nodal(100ng/ml)存在下培养未分化的iPSC，随后在无血清条件下在进一步补充有抗坏血酸(50μg/mL)、BMP4(0.5ng/ml)、bFGF(10ng/ml)和VEGF(10ng/ml)的RPMI/10％SFD培养基中培养2天。接着，2天后更换培养基，在补充有MTG(4.5×10-4M)、抗坏血酸(50μg/ml)、BMP4(0.5ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、激活蛋白A(100ng/ml)和VEGF(10ng/ml)的SFD培养基中培养4天。SFD培养基根据Cheng等(2012b)制备而成。对于取样，收获一部分细胞，使其个体化，使用特异性抗体针对CXCR4和CD117的表面表达以及FoxA1、Sox17和FoxA2的细胞内表达进行染色并使用流式细胞术可视化(图1和图2A至2F)。于第5天至第7天产生如由CXCR4、CD117、FoxA2和FoxA1的共表达限定的这一细胞群。下文提供了DE产生的进一步优化及另外的实施方案。
实施例2-接种密度对DE产生的作用
将在Matrigel上使用Essential 8维持的未分化iPSC以不同的接种密度/cm2(例如5000、15,000和20,000)铺板在Matrigel上。在铺板后4天，将以15,000和20,00细胞/cm2接种的细胞置于含有100ng/mL激活蛋白A的90％RPMI/10％SFD培养基中24小时(T0)。第二天，将培养物置于含有100ng/mL激活蛋白A、2.5ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF和10ng/mL斑马鱼FGF2的培养基中48小时(T1/T2)。最后，将培养物置于补充有100ng/mL激活蛋白A、2.5ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF和10ng/mL斑马鱼FGF2的SFD培养基中，接下来持续4至5天(T3至T6)。在这一步骤中，可任选地将细胞孵育至多12天。从3天至第6天使用TrypLE收获细胞。在每个时间点确定消化后的总活细胞数(图16A)。通过表面染色确定CXCR4、CD117共表达细胞的百分比(图16D)，同时通过细胞内流式细胞术来量化FoxA2和FoxA1(图16C)表达的百分比。将这一过程的效率确定为每个时间点的表达DE细胞的绝对数/总细胞数的比。
实施例3-CHIR的补充不是DE产生所必需的
将在Matrigel上使用Essential 8维持的未分化iPSC以13,000细胞/cm2的接种密度铺板在Matrigel上。在铺板后4天，将细胞置于含有100ng/mL激活蛋白A的90％RPMI/10％SFD培养基中1天，之后在接下来的2天，用补充有100ng/mL激活蛋白A、2.5ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF和10ng/mL斑马鱼FGF2的90％RPMI/10％SFD孵育。从第4天至第12天，将细胞置于补充有100ng/mL激活蛋白A、2.5ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF和10ng/mL斑马鱼FGF2的SFD培养基中。在分化的第一天，在一组中包括2μM CHIR的补充，而在另一组中将其省略。在第7天使用TrypLE收获细胞。在每个时间点确定消化后的总活细胞数。通过流式细胞术借助细胞表面染色来确定CXCR4、CD117共表达细胞的百分比(表1)。计算CXCR4/CD117双阳性细胞的绝对数目。还量化输入iPSC与输出DE的比(表1)。在内胚层诱导的第0天添加CHIR并未导致DE形成效率的提高。
表1.CHIR的补充不是DE形成所必需的
实施例4-低氧对DE诱导的作用
干细胞小生境(niche)中的氧浓度(通常为2％至9％O2)在维持内稳态中起至关重要的作用，有利于胚胎发育，调节多个信号转导级联并维持干细胞多潜能性以诱导分化(Langner等，2010)。在新霉素(100μg/mL)和嘌呤霉素(600ng/mL)存在下在低氧条件(5％O2)下在Matrigel上使用Essential 8维持未分化的iPSC(2.038AT4EGN)以进行至少5次传代。使用0.5mM EDTA和Essential 8培养基增殖细胞。在Matrigel上的细胞接种密度由15,000细胞/cm2至30,000细胞/cm2变化。
在使iPSC适应低氧条件，最佳进行至少5次传代之后，将细胞以15,000细胞/cm2的密度铺板在Matrigel上。在铺板后4天，将细胞置于包含100ng/mL激活蛋白A、2.5ng/mLBMP4、10ng/mL VEGF和10ng/mL斑马鱼FGF2的SFD培养基中，持续接下来的8天。使用在常氧条件下使用Essential 8在Matrigel上维持的iPSC建立平行分化。在第8天，使用TrypLE收获这两组。确定消化后的总活细胞数并通过流式细胞术借助细胞表面染色来确定CXCR4、CD117共表达细胞的百分比。使用细胞内流式细胞术来量化FoxA1/FoxA2/Sox17的百分比(图17)。
当与在常氧条件下维持的iPSC相比时，在低氧条件下维持的iPSC以较高的纯度产生DE。常氧细胞显示出约50％的DE阳性染色，而低氧细胞呈现出80％至90％的DE阳性染色。低氧条件为提高DE产生提供了方法以及延长了EPC循环的持续时间，如下文所讨论。该方法的效率为约1∶20(iPSC∶DE)。
实施例5-内胚层祖(EP)细胞的产生
使用TrypLE收获DE细胞，并将经个体化的细胞用猝灭介质洗涤。确定培养物的总活细胞计数。将细胞再次洗涤并将所得细胞沉淀放置在冰上。以0.3mg/ml至0.6mg/ml的浓度向细胞沉淀添加冷的预先冷却的洁净(neat)Matrigel溶液。使用预先冷却的移液管尖向冰上之细胞和Matrigel的混合物添加预先冷却的含有谷氨酰胺(1×)、MTG(4.5×10-4M)、抗坏血酸(50μg/ml)、100ng/ml BMP4、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF2和20ng/ml VEGF并含有Rock抑制剂(1μM H1152或10μM Y-27632)的无血清SFD培养基，并温和混合以防止形成气泡。最终的细胞密度为25万至1百万细胞/ml。将所得Matrigel-细胞悬浮物转移至125转瓶。将转瓶放置在常规氧(20％)和5％CO2下并且转速由40RPM至70RPM变化。在12至18小时内形成聚集体。第二天，使细胞聚集体沉降并弃掉来自转瓶的上清液培养基。将细胞聚集体置于含有谷氨酰胺(1×)、MTG(4.5×10-4M)、抗坏血酸(50μg/ml)、100ng/ml BMP4，并分别含有20ng/ml VEGF、EGF和FGF2的无血清SFD培养基中。每天一半地进料转瓶或者每48小时进行完全培养基更换。在其他相关实验中，使悬浮聚集体解离并大约每5天重新聚集。在整个过程中在不同时间点对EP聚集体进行取样。
对于取样，从转瓶中取出期望体积的聚集体并通过离心(1200rpm，5分钟)使聚集体旋转沉淀。将聚集体通过胰蛋白酶消化来个体化、猝灭、洗涤并将细胞重悬于用于细胞计数和FAC染色的合适介质中。图2G提供了包埋于组织凝胶中并针对HNF3α、HNF4α和Sox17表达的存在进行了染色的悬浮培养物中完整15天EPC聚集体的代表性图像。对活细胞的存在的量化在图3中示出。通过流式细胞术量化CXCR4/CD117/FoxA1/Sox17表达的水平(图4)。
实施例6-Matrigel保护DE而MEF不是EPC循环所必需的
使用TrypLE收获由使用Matrigel和Essential 8培养基维持的未分化iPSC产生的定形内胚层细胞。收获之后，将经个体化的细胞用猝灭介质洗涤。确定培养物的总活细胞计数。将细胞再次洗涤，并将所得细胞沉淀放置在冰上。以0.3mg/ml的浓度向细胞沉淀添加冷的预先冷却的洁净Matrigel溶液。以25万至50万细胞/mL的终密度向冰上之细胞和Matrigel的混合物添加补充有Rock抑制剂(1μM H1152或10μM Y-27632)的预先冷却的无血清EPC循环培养基(IMDM∶Ham F12(3∶1)，0.5％B27、0.5％N2、0.1％BSA、1％Glutamax、0.45μM MTG、50μg/mL抗坏血酸、50ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF、10ng/mL EGF、50ng/mL FGF(斑马鱼FGF2或热稳定FGF1)、2.5ng/mL激活蛋白和0.1ng/mL TGFβ)。将所得细胞悬浮物转移至125转瓶或者置于静态条件下的超低附着容器中。将培养物旋转沉淀并在12小时后置于不含ROCK抑制剂的新鲜EPC循环培养基中。
将EPC聚集体旋转沉淀并每隔一天进料新鲜的EPC循环培养基。在第4天、第8天和第12天，使培养物重新聚集。将聚集体用TrypLE个体化5至10分钟，猝灭并洗涤。在新鲜Matrigel和Rock抑制剂存在下使培养物重新聚集。12至18小时后，更换培养基，在此点，将培养物置于不含ROCK抑制剂的EPC循环培养基中。
在每100个EPC有或无0.3mg/mL Matrigel以及有或无1MEF的情况下将EPC培养物维持15天。在15天结束后，使用TrypLE或0.5％胰蛋白酶或分散酶(2mg/ml)和胰蛋白酶的组合收获EPC培养物。将经个体化的细胞悬浮物猝灭并洗涤，并确定消化后的总活细胞数。通过流式细胞术量化DE标志物CXCR4、CD117、FoxA2和FoxA1的百分比。将这一过程的效率确定为在实验结束时获得的活DE细胞的绝对数/总活细胞数的比。
Matrigel的存在保护了表达DE细胞的表型表达(图18A)。在不存在Matrigel时，EPC培养物的纯度降低(图18A)。在存在Matrigel时，DE产生的效率也得以提高。在EPC循环期间MEF的存在不是必需的。在不存在MEF时，3D培养物保持了EPC的纯度(图18C和18E)和产量(图18B和18D)。
实施例7-在限定的无饲养低氧条件下的EPC循环
使用TrypLE收获由使用Matrigel和Essential 8培养基维持的多种未分化iPSC产生的定形内胚层细胞5至10分钟。将经个体化的DE猝灭并洗涤。确定培养物的总活细胞计数。将细胞再次洗涤，并将所得细胞沉淀放置在冰上。以0.3mg/ml的浓度向细胞沉淀添加冷的预先冷却的洁净Matrigel溶液。以25万至50万细胞/mL的终密度向冰上之细胞和Matrigel的混合物添加补充有Rock抑制剂(1μM H1152)的预先冷却的T3/T6培养基(补充有100ng/mL激活蛋白A、2.5ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF和10ng/mL斑马鱼FGF2的SFD培养基)。将所得细胞悬浮物转移至125转瓶。在低氧条件下，将转速设定为70rpm。将培养物旋转沉淀并在12至18小时后置于包含50％T3/T6培养基和50％不含ROCK抑制剂的无血清EPC循环培养基的新鲜培养基中。将EPC聚集体旋转沉淀，此后每隔一天用无血清EPC循环培养基进料新鲜的EPC循环培养基。如上文所述，在进行TrypLE消化之后的第4天、第8天和第12天用0.3mg/ml Matrigel使培养物重新聚集。存在Rock抑制剂(H1152)下，除2.038AT4的所有细胞系均重新聚集。在每次对EPC进行传代时估计总活细胞计数。将旋转培养物仍维持在低氧条件下。结果示出了在无饲养EPC循环期期间EPC的增殖(图19A)。与亲代iPSC相比，2.038AT4(在存在100μg/mL新霉素和600ng/mL嘌呤霉素的情况下维持)是增殖最多的。该细胞系包含其表达由多西环素诱导控制的Erg和GFI1表达盒。2.038MAFA细胞(除在EPC循环期间，在存在G418的情况下维持)包含其表达由西环素诱导控制的MAFA表达盒。在EPC循环期间的每个时间点，通过流式细胞术确定EPC培养物的纯度。量化CXCR4/CD117/FoxA1/FoxA2/Sox17的平均表达。对来自同一iPSC克隆的多个实验运行的EPC纯度进行平均并计算标准误(图19B)。结果揭示了在无饲养低氧条件下循环的多个iPSC克隆的平均纯度为约50％。
实施例8-在限定的无饲养低氧条件下的EPC培养物的qPCR分析
通过实时RT-PCR量化与定形内胚层和EPC聚集体循环相关的基因的表达(图20)。每4至5天使用0.5％胰蛋白酶-EDTA在37℃下收获EPC 10至20分钟。用移液管剧烈抽打细胞以产生单细胞悬浮物。用不含RNase的DNase处理RNA并使用来自Qiagen的Rneasy Plus微型试剂盒(目录#74136)根据生产商的说明进行分离。使用Nanodrop 2000进行RNA量化。
用来自Promega的ImProm-II RT系统(目录#A3800)根据生产商的说明逆转录RNA。使用TaqMan Gene Expression Master Mix(目录#4369016)和TaqMan探针(目录#4331182；CXCR4：Hs00237052_m1；Ckit：Hs00174029_m1；Sox17：Hs00751752_s1；FoxA1：Hs00270129_m1；FoxA2：Hs00232764_m1；GAPDH：Hs99999905_m1)进行rtPCR(技术性地重复三次)并在Roche LightCycler上运行40个循环。通过用GAPDH归一化的DeltaCp计算倍数诱导。在相同遗传背景的未分化iPSC中未观察到基因表达(阴性对照)。阳性对照(W2 P 16和2.038 P2)证明对未知物具有类似谱。
发现CD34是后期EPC培养物的标志物。在EPC循环期间以不同代数收获由2.038AT4、2.038MAFA和2.038亲代细胞产生的3D EPC培养物，并针对CD34的存在进行染色。将EPC聚集体用胰蛋白酶个体化，猝灭，洗涤并针对CD34以及CXCR4和CD117的存在进行染色。使用流式细胞术量化在EPC循环中的不同阶段下CD34阳性细胞的百分比。CD34表达的程度对于不同的iPSC克隆有所不同。由2.038衍生的EPC表达2％-15％的CD34，由2.038(MAFA)衍生的EPC表达2％至25％的CD34阳性细胞，而2.038AT4表达4％至35％的CD34(图21)。新出现的CD34细胞是CD117/CXCR4阳性的。
实施例9-对末期EPC培养物的纯化
收获末期EPC培养物并使用0.5％胰蛋白酶溶液进行个体化。将细胞悬浮物猝灭，洗涤并与缀合有PE的CXCR-4/CD117/CD34一起在4℃下孵育20分钟。将细胞洗涤并与磁性抗PE抗体一起在4℃下孵育20分钟。将细胞洗涤并使用MACS柱根据生产商的说明进行纯化。确定阳性级分的纯度和细胞数目(图22)。将细胞放置在洁净Matrigel包被的板上补充有Rock抑制剂的EPC改良培养基中。在铺板后12至18小时后，将细胞置于不含Rock抑制剂的新鲜EPC改良培养基中。在铺板后5天，起始β细胞分化。
实施例10-EPC聚集体的胰腺分化
将在悬浮培养物中产生的EPC置于用于产生胰腺细胞类型的分化培养基(图8)中。对于EP细胞的胰腺分化，利用由Nostro等(2011)所述并由Cheng等(2012a)进一步改进的方案。以3D培养继续整个过程。
使EPC培养物扩增15天并在含有Wnt3A(3ng/ml)、FGF-10(50ng/ml)和Dorsomorphin(0.75μM)的SFD培养基中培养3天以产生前肠/中肠内胚层细胞。将细胞在含有GlutaMAX(1％)、无视黄酸的B27(1％)、抗坏血酸(50μg/ml)、Pen/Strep(1％)、KAAD-环巴胺(0.25μM)、反式视黄酸(2μM)、头蛋白(50ng/ml)和FGF-10(50ng/ml)的高葡萄糖DMEM培养基中培养3天以产生胰腺内胚层细胞。在这一步骤之后，将细胞在含有GlutaMAX(1％)、无视黄酸的B27(1％)、抗坏血酸(50μg/ml)、Pen/Strep(1％)、SB431542(6μM)和头蛋白(50ng/ml)的高葡萄糖DMEM培养基中培养3天。接着，将细胞在补充有γ分泌酶抑制剂(2μM的DAPT)的之前的高葡萄糖DMEM培养基中培养1至2天。从这一阶段，将细胞在含有葡萄糖(40mM)、烟酰胺(10mM)、SB431542(6μM)和头蛋白(50ng/ml)的SFD培养基中培养1至2天。最后，在接下来的10天内，将细胞在含有SB431542(5.4μM)、头蛋白(50ng/ml)、胰岛素(800pM，0.47μl/ml)和烟酰胺(10mM)的SFD培养基中进行培养，所述培养在另外添加葡萄糖(40mM)和未另外添加葡萄糖的此培养基之间每天交替。
对于取样，从转瓶中取出期望体积的聚集体并通过离心(1200rpm，5分钟)使聚集体旋转沉淀。将聚集体通过胰蛋白酶消化个体化，猝灭，洗涤并确定在该过程中不同天数的活细胞计数(图5)。针对PDX-1的存在通过进行细胞内染色来对经个体化的细胞进行染色，并通过流式细胞术获取阳性细胞百分比(图6和7)。在胰腺分化过程的第15天，将完整的15天龄EPC聚集体包埋在组织凝胶中并通过免疫组织化学针对PDX-1的存在进行染色(图8)。
为了评估聚集体的分化状态，在胰腺分化过程的第18天，将完整的15天龄EPC聚集体包埋在组织凝胶中并通过免疫组织化学针对促生长素抑制素(图10A至10C)、胰高血糖素(图10D至10F)和胰岛素(图10G至10I)的存在进行染色。发现，聚集体对促生长素抑制素和胰高血糖素的表达是阴性的但对胰岛素的表达是阳性的。在将聚集体解离之后，针对在胰腺分化第18天的15天龄EPC聚集体中的C肽、胰高血糖素和胰岛素表达进行细胞内染色(图11)。标志物表达的数据总结于表2中。由EPC产生β细胞的过程的效率为0.3％。
表2.β细胞聚集体培养物中的胰高血糖素、C肽、促生长素抑制素和胰岛素表达谱的总结
标志物 β细胞(IHC染色) β细胞(流式细胞术)
胰岛素 存在 1.9％±0.2％
C肽 ND 1.8％±0.3％
胰高血糖素 不存在 不存在
促生长素抑制素 不存在 不存在
Pdx 存在 40％至95％
为了进一步评估聚集体的分化状态，使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)从全胰腺、胰岛和20天龄聚集体分离总RNA并用不含RNase的DNase(Qiagen)处理。使用随机六聚体和寡聚(dT)用Superscript III逆转录酶(Applied Biosystems)将RNA逆转录成cDNA。使用前述Taqman探针和引物在LightCycler 480II(Roche)上进行qPCR(Nostro等，2008)(图12)。以管家基因GAPDH归一化表达水平。
使用Mercodia超灵敏C肽ELISA试剂盒(Mercodia)如先前所述(D’Amour等，2006)进行C肽释放测定。简言之，将来自每个iPSC克隆之在β细胞分化方案中超过25天的聚集体置于24孔板内的millicell PCF插入物中。将聚集体在37℃和5％CO2、20％O2下在1ml KRBH培养基中平衡1小时。接着，将聚集体置于包含1ml补充有2.8mM葡萄糖的KRBH培养基的第二孔中，并在37℃和5％CO2、20％O2下继续孵育1小时。最后，将聚集体置于1ml补充有2.8mM葡萄糖的KRBH培养基中并在37℃和5％CO2、20％O2下继续孵育1小时。需极度小心以在孔转移间排出聚集体的所有残余流体。收集留下的上清液并储存在-20℃。还使用约30个人成体胰岛作为该测定的阳性对照。在用D-葡萄糖以2.8mM(基础)或28mM(葡萄糖)刺激iPSC衍生的β细胞和尸体成体胰岛后，将聚集体用TryPLE消化并确定每份样品的总活细胞计数。基于从每份样品取得的总活细胞数归一化C肽分泌(图13)。原代人胰岛购买自威斯康星大学麦迪逊分校胰岛核心部(University of Wisconsin Madison islet core division)。
实施例11-在无MEF的情况下由以3D聚集体增殖的EPC产生β细胞
收获2.038AT4EPC培养物并使用0.5％胰蛋白酶溶液进行个体化。将所得细胞悬浮液猝灭，洗涤并与Matrigel(0.3mg/ml)混合。在低氧条件下，将聚集体以30万细胞/ml的细胞密度置于EPC循环培养基中。最初5天将细胞用新鲜的EPC循环培养基进料，并且使用由Nostro等(2011)所述并由Cheng等(2012a)进一步改进的方法在重新聚集后的第6天以3D形式起始β细胞分化。3D方法的方案如图23所提供。在该方案中，可在β细胞分化起始之前将EPC通过MACs分离进行纯化。
通过流式细胞术分析对由2.038AT4细胞衍生的第28天末期β细胞进行分析。收获细胞，使用4％多聚甲醛固定，使用0.1％皂苷透化并通过流式细胞术针对PDX、NeuroD1、Nkx6.1、促生长素抑制素、胰高血糖素和C肽的存在进行染色。图24A中示出了阳性细胞百分比。图24B中示出了在针对促生长素抑制素/C肽和胰高血糖素/C肽进行染色后产生的点图。
实施例12-在无MEF的情况下由以3D聚集体增殖的EPC产生β细胞
如上所述，通过MACS分离来纯化由2.038细胞在悬浮培养物中产生的EPC，并将其置于用于产生胰腺细胞类型的分化培养基中。对于EP细胞的胰腺分化，以2D形式利用由Nostro等(2011)所述并由Cheng等(2012a)进一步改进的方案。2D方法的方案如图25所提供。
纯化EPC培养物并在EPC循环培养基存在下将其铺板在洁净Matrigel上5天。如下起始β细胞分化：将细胞置于含有Wnt3A(3ng/ml)、FGF-10(50ng/ml)和Dorsomorphin(0.75μM)的SFD培养基中3天以产生前肠/中肠内胚层细胞。将细胞在含有GlutaMAX(1％)、无视黄酸的B27(1％)、抗坏血酸(50μg/ml)、Pen/Strep(1％)、KAAD-环巴胺(0.25μM)、反式视黄酸(2μM)、头蛋白(50ng/ml)和FGF-10(50ng/ml)的高葡萄糖DMEM培养基中培养3天以产生胰腺内胚层细胞。在这一步骤之后，将细胞在含有GlutaMAX(1％)、无视黄酸的B27(1％)、抗坏血酸(50μg/ml)、Pen/Strep(1％)、SB431542(6μM)和头蛋白(50ng/ml)的高葡萄糖DMEM培养基中培养3天。接着，将细胞在补充有γ分泌酶抑制剂(2μM的DAPT)的之前的高葡萄糖DMEM培养基中培养1至2天。从这一阶段，将细胞在含有葡萄糖(40mM)、烟酰胺(10mM)、SB431542(6μM)和头蛋白(50ng/ml)的SFD培养基中培养1至2天。最后，在接下来的10天内，将细胞在含有SB431542(5.4μM)、头蛋白(50ng/ml)、胰岛素(800pM，0.47μl/ml)和烟酰胺(10mM)的SFD培养基中进行培养，所述培养在另外添加葡萄糖(40mM)和未另外添加葡萄糖的此培养基之间每天交替。在以2D形式分化的第10天至第15天检测到单激素β细胞的存在。
在分化的第15天收获β细胞培养物，固定并染色以通过细胞内流式细胞术量化PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素(图26A)。末期培养物揭示了存在12％单激素细胞。末期培养物对PDX和NeuroD1呈阳性。末期聚集体揭示了对葡萄糖的响应性(图26B)。如所述进行葡萄糖响应测定并将数据以细胞数目归一化。
使用Mercodia超灵敏C肽ELISA试剂盒(Mercodia)如先前所述(D’Amour等，2006)进行C肽释放测定。简言之，将来自每个iPSC克隆之在β细胞分化方案中超过25天的聚集体置于24孔板内的millicell PCF插入物中。将聚集体在37℃和5％CO2、20％O2下在1ml KRBH培养基中平衡1小时。接着，将聚集体置于包含0.5ml补充有系列递增水平的葡萄糖(1mM至20mM)的KRBH培养基的第二孔中。每个孵育在37℃和5％CO2、20％O2下持续20分钟。需极度小心以在孔转移间排出所有残余流体中的聚集体。收集留下的上清液并储存在-20℃。在实验结束后，将聚集体用TryPLE消化并确定每份样品的总活细胞计数以归一化数据。基于从每份样品取得的总活细胞数归一化C肽分泌。
实施例13.在无MEF的情况下以3D聚集体增殖的2.038AT4EPC产生β细胞
使用2.5ng/ml BMP4在无CHIR的情况下在DE诱导期间于低氧条件下，将2.038AT4.14EGN(也称为2.038AT4)细胞维持在Essential 8中。在低氧条件下在无MEF的情况下，将DE维持在EPC循环培养基中。培养基补充有新霉素(100ug/ml)和嘌呤霉素(600ng/ml)以用于iPSC培养、DE培养和EPC循环。在P7，收获EPC，并使用CD34/CXCR4/CD117进行MACS纯化。在Rock抑制剂存在下，将经纯化的细胞铺板在洁净Matrigel上。
根据由Nostro等(2011)所述并由Cheng等(2012a)进一步改进的方案在重新聚集后5天以2D形式起始β细胞分化。在β细胞分化过程中的不同阶段添加Dox。在β细胞分化的第6天至15天、β细胞分化的第8天至15天或者β细胞分化的第10天至15天进行Dox(1.5μg/ml)诱导。在β细胞分化的第15天收获细胞，固定并染色以通过细胞内流式细胞术量化PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素。对第15天的新出现β细胞的分析揭示了PDX(图27A至27D)、NeuroD1(图27E至27H)和促生长素抑制素/胰高血糖素/C肽(图27I至27L)的存在。分化第15天的β细胞揭示了PDX、NeuroD1和C肽阳性细胞的存在以及少量的促生长素抑制素阳性细胞和缺乏胰高血糖素阳性细胞。在分化过程中的第10天至第15天添加Dox揭示了最高水平的单激素C肽阳性细胞。
实施例14-由2.038AT4细胞衍生的葡萄糖响应性末期β细胞
如实施例12中所述进行C肽释放测定。在第10天至第15天用Dox诱导来诱导的β细胞培养物对1mM至5mM葡萄糖产生响应(图28)。与未经诱导的条件相比，在Dox诱导的培养物中具有较高的细胞数目。
在β细胞分化的第15天收获细胞，固定并染色以通过细胞内流式细胞术量化PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素。将β细胞置于末期培养基中以对末期β细胞培养物进行大量分析。培养物揭示了单激素细胞在培养物中存在多至4周(图29)。
在β细胞分化的第10天至第15天，通过添加Dox(1.5μg/ml)再次进行该实验。在β细胞分化的第15天收获细胞并通过细胞内流式细胞术测定PDX/NeuroD1/C肽/胰高血糖素/促生长素抑制素的表达水平。细胞揭示了25％至30％的PDX/NeuroD1表达。总C肽水平为约10％，其中5％的细胞似乎是单激素的。未记录到胰高血糖素表达。如上文所述进行C肽释放测定。结果揭示了1mM至15mM葡萄糖的剂量依赖性响应。经Dox诱导的和未经诱导的β细胞培养物二者均能够引起对葡萄糖的剂量依赖性响应(图30)。
实施例15-对末期培养物的qPCR分析
在37℃下，使用0.5％胰蛋白酶-EDTA每4天至5天收获EPC 10分钟至20分钟。用移液管剧烈抽打细胞以产生单细胞悬浮物。使用来自Qiagen的Rneasy Plus微型试剂盒(目录#74136)根据生产商的说明分离RNA。使用Nanodrop 2000进行RNA量化。用来自Promega的ImProm-II RT系统(目录#A3800)根据生产商的说明逆转录RNA。使用TaqMan GeneExpressionMaster Mix(目录#4369016)和TaqMan探针(目录#4331182；INS：Hs02741908_m1；GCG：Hs01031536_m1；SST：Hs00356144_m1；神经元素3：Hs01875204_s1；NKX6.1：Hs00232355_m1；PDX1：Hs00236830_m1；NeuroD1：Hs01922995_s1；GAPDH：Hs99999905_m1)进行rt-PCR(技术性地重复三次)并在Roche LightCycler上运行45个循环(图31)。使用相同遗传背景的未分化iPSC作为阴性对照。使用由UW Islet Core提供的全胰腺RNA(Ambion目录#AM7954)和人胰岛作为阳性对照。使用相同遗传背景的未分化iPSC作为阴性对照。用GAPDH归一化通过DeltaCp计算倍数诱导。
实施例16-对iPSC/DE/EPC/β细胞之ERG和GFI表达的qPCR分析
由2.038和2.038AT4细胞量化在该过程中的不同阶段ERG(图32A)和GFI(图32B)转录本的水平。仅在β细胞分化阶段施加2.038AT4细胞的Dox诱导。通常在含有新霉素(100μg/mL)和嘌呤霉素(600ng/mL)的培养基中培养来自2.038AT4的细胞，不管分化阶段为何。使用来自Qiagen的Rneasy Plus微型试剂盒(目录#74136)根据生产商的说明从由2.038细胞和2.038AT4细胞衍生的未分化iPSC、DE、EPC和β细胞培养物分离RNA。使用Nanodrop 2000进行RNA量化。使用来自Promega的ImProm-II RT系统(目录#A3800)根据生产商的说明逆转录RNA。使用TaqManGene Expression Master Mix(目录#4369016)和TaqMan探针(ERG：Hs01554629_m1；GFI1：Hs00382207_m1；GAPDH：Hs99999905_m1)进行rtPCR(技术性地重复三次)并在Roche LightCycler上运行45个循环。以GAPDH归一化通过DeltaCp计算倍数诱导。使用相同遗传背景的未分化iPSC作为阴性对照。使用由UW Islet Core提供的全胰腺RNA(Ambion目录#AM7954)和人胰岛作为阳性对照。
2.038AT4iPSC揭示了在未经Dox诱导的选择条件下ERG/GFI转录本的存在并且在整个EPC循环期间维持一定水平。在β细胞分化期间，通过Dox诱导转录本的水平略微提高。亲代2.038EPC培养物揭示了：在EPC循环和β细胞分化期间，ERG的水平上调。不受理论的束缚，这些数据表明了在循环期间ERG和GFI在促进EPC培养物的存活和维持中的作用。与未经诱导的条件相比，经Dox诱导的培养物具有较高的细胞数目，因此这些转录因子可有助于保护由EPC衍生的β细胞。
* * *
根据本公开内容，无需过度实验即可进行和实践本文中所公开并要求保护的所有方法。虽然已经依据一些优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但是对本领域技术人员明显的是，可对本文中所述的方法、方法的步骤或方法的步骤顺序进行改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更特别地，明显的是，某些化学和生理学上均相关的物质可以替换本文中所述的物质，同时仍然获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的是，所有这样的类似替换和修改都被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (62)

1.产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括：
a)在包含激活蛋白A或Nodal的无血清培养基中培养多潜能干细胞；以及
b)在无血清培养基中之含有BMP4、VEGF、FGF2和EGF的悬浮培养物中培养从步骤a)得到的细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长，
其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含基膜制备物。
2.实现单激素胰岛β细胞的形成的方法，其包括在权利要求1所述的方法的步骤b)后，进一步进行以下步骤：
将根据权利要求1所述的方法产生的内胚层祖细胞与胰岛β细胞促生长因子一起培养。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述无血清培养基包含激活蛋白A。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养基还包含Wnt3A或GSK3抑制剂。
5.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养基不包含Wnt3A或GSK3抑制剂。
6.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养进行4天至12天。
7.权利要求6所述的方法，其中步骤a)中的所述培养进行4天至8天。
8.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养以贴壁培养进行。
9.权利要求1所述的方法，其中来自步骤a)的细胞包括定形内胚层细胞和内胚层祖细胞的群。
10.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中使用的所述无血清培养基还包含TGF-β、潜在TGF-β结合蛋白、Nodal、GSK3抑制剂、促滤泡素抑制素相关蛋白(FSRP)、Dickkopf相关蛋白1、IndolactamV和胰岛素样生长因子。
11.权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含激活蛋白A。
12.权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含TGFβ。
13.权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的所述培养进行至少7天至40天。
14.权利要求13所述的方法，其中步骤b)中的所述培养进行至少7天至25天。
15.权利要求1所述的方法，其中在ROCK抑制剂存在下发生步骤b)中的所述培养。
16.权利要求15所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632或H1152。
17.权利要求15所述的方法，其中在12小时后除去所述ROCK抑制剂。
18.权利要求16所述的方法，其中所述基膜制备物以0.06mg/mL至0.6mg/mL的终浓度存在。
19.权利要求18所述的方法，其中所述基膜制备物以0.3mg/mL至0.6mg/mL的终浓度存在。
20.权利要求1所述的方法，其还包括大每5天使步骤b)中的所述悬浮培养物解离并重新聚集。
21.权利要求1所述的方法，其中将步骤b)中的所述悬浮培养物维持在转瓶中。
22.权利要求21所述的方法，其中以40rpm至70rpm运行所述转瓶。
23.权利要求1所述的方法，其中将步骤b)中的所述悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。
24.权利要求1所述的方法，其中将步骤b)中的所述内胚层细胞以250,000细胞/mL至2,000,000细胞/mL的初浓度悬浮培养。
25.权利要求24所述的方法，其中将步骤b)中的所述内胚层细胞以250,000细胞/mL至500,000细胞/mL的初浓度悬浮培养。
26.权利要求1所述的方法，其中所述内胚层祖细胞表达CXCR4、CD34和CD117(c-KIT)。
27.权利要求26所述的方法，其中所述内胚层祖细胞还表达Sox 17、FoxA1、FoxA2和CD31中的至少一种。
28.权利要求1所述的方法，其中所述自我更新的内胚层祖细胞的形成不需要MEF饲养层或MEF条件化培养基的存在。
29.权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞是胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。
30.权利要求1所述的方法，其中所述培养发生在20％氧下。
31.权利要求1所述的方法，其中所述培养发生在低氧条件下。
32.权利要求31所述的方法，其中在步骤a)之前，将所述多潜能干细胞维持在低氧条件下。
33.权利要求2所述的方法，其中在进行所述培养之前，纯化所述内胚层祖细胞。
34.权利要求2所述的方法，其中所述胰岛β细胞促生长因子包括AMP活化蛋白激酶(AMPK)的有效抑制剂、BMP拮抗剂、hedgehog抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、ALK5抑制剂、视黄酸、FGF10、B27和Wnt3A或GSK3抑制剂。
35.权利要求2所述的方法，其还包括：
i)将所述内胚层祖细胞与BMP拮抗剂、Wnt3A和FGF 10一起培养以实现前肠内胚层细胞的形成；
ii)将所述前肠内胚层细胞与B27、BMP拮抗剂、Hedgehog抑制剂、视黄酸和FGF10一起培养以实现胰腺内胚层细胞的形成；
iii)将所述胰腺内胚层细胞与B27、BMP拮抗剂、γ-分泌酶抑制剂和ALK5抑制剂一起培养以实现内分泌前体细胞的形成；以及
iv)将所述内分泌前体细胞与BMP拮抗剂、ALK5抑制剂、胰岛素、葡萄糖和烟酰胺一起培养以实现单激素胰岛β细胞的形成。
36.权利要求35所述的方法，其中所述细胞包含编码Erg1的诱导型表达盒并且其中步骤iv)还包括诱导所述细胞表达Erg1。
37.权利要求35所述的方法，其中所述细胞包含编码Gfi1的诱导型表达盒并且其中步骤iv)还包括诱导所述细胞表达Gfi1。
38.权利要求35所述的方法，其中步骤i)中使用的所述BMP拮抗剂是dorsomorphin。
39.权利要求35所述的方法，其中步骤ii)、iii)和iv)中使用的所述BMP拮抗剂是头蛋白。
40.权利要求35所述的方法，其中步骤iii)中使用的所述γ-分泌酶抑制剂是DAPT。
41.权利要求35所述的方法，其中步骤iii)和iv)中使用的所述ALK5抑制剂是SB431542。
42.权利要求35所述的方法，其中步骤ii)中使用的所述Hedgehog抑制剂是KAAD-环巴胺。
43.权利要求35所述的方法，其中步骤i)、ii)和iii)中的所述培养各自进行3天至5天。
44.权利要求35所述的方法，其中步骤iv)中的所述培养进行4天至10天。
45.权利要求35所述的方法，其中将所述单激素胰岛β细胞培养1周至4周。
46.权利要求45所述的方法，其中在悬浮培养物中培养所述单激素胰岛β细胞。
47.权利要求2所述的方法，其中所述培养包括贴壁培养。
48.权利要求2所述的方法，其中所述培养物包含基膜制备物。
49.权利要求2所述的方法，其中所述培养发生在低氧条件下。
50.权利要求2所述的方法，其中所述培养物不含MEF饲养细胞和MEF条件化培养基。
51.权利要求2所述的方法，其中所述单激素胰岛β细胞表达PDX-1、胰岛素和C肽，但不表达胰高血糖素。
52.权利要求51所述的方法，其中所述单激素胰岛β细胞不表达促生长素抑制素。
53.权利要求51所述的方法，其中所述单激素胰岛β细胞表达低水平的促生长素抑制素。
54.权利要求2所述的方法，其中所述单激素胰岛β细胞的纯度为至少12％。
55.权利要求54所述的方法，其中所述单激素胰岛β细胞的纯度为至少20％。
56.权利要求4所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR 99021。
57.权利要求1所述的方法，其中所述自我更新的内胚层祖细胞是自我更新的内胚层祖细胞聚集体。
58.权利要求57所述的方法，其中步骤a)中的所述无血清培养基包含激活蛋白A。
59.权利要求57所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含激活蛋白A。
60.权利要求57所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含TGFβ。
61.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述无血清培养基包含激活蛋白A，并且其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含激活蛋白A。
62.权利要求61所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含TGFβ。
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