CN105670987B

CN105670987B - 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法

Info

Publication number: CN105670987B
Application number: CN201610159935.3A
Authority: CN
Inventors: 全仁夫; 杜伟斌; 郑宣; 李强; 曹国平
Original assignee: HANGZHOU CITY XIAOSHAN DISTRICT TRADITIONAL CHINESE MEDICAL HOSPITAL
Current assignee: HANGZHOU CITY XIAOSHAN DISTRICT TRADITIONAL CHINESE MEDICAL HOSPITAL
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2036-03-21
Also published as: CN105670987A

Abstract

本发明公开了一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，所述抑制方法包括：(1)大鼠毛囊干细胞的分离；(2)大鼠毛囊干细胞的培养；(3)大鼠毛囊干细胞的纯化；(4)大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制。本发明所提供的抑制方法首次采用血管内皮细胞生长因子165为诱导因子使大鼠毛囊干细胞向血管内皮细胞高效定向分化；能够调节毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的形成与生长，促进伤口的有效愈合；也可为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞来源。

Description

一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其是涉及一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法。

背景技术

干细胞作为再生医学第一要素，其生物学特性的深入研究对于再生医学的发展具有指引作用，再生医学中常用的干细胞分为胚胎干细胞及成体干细胞，由于胚胎干细胞的来源有限且涉及很严重的伦理道德争议，所以成体干细胞似乎更适合在再生医学中的应用。

研究表明，毛囊干细胞（Hair Follicle Stem Cells，HFSCs）是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点（Cotsarelis G,et al. 1990; Cotsarelis G. 2006）。体外培养的HFSCs表现出高克隆形成能力，具有非常高的再生潜能（Rochat A, et al. 1994）。它来源于皮肤、毛发，数量极其可观，且没有严重的并发症，无免疫原性，可供自体移植，是最容易获得的干细胞来源之一。研究毛囊干细胞的多方向分化潜能、诱导毛囊干细胞定向分化为血管内皮细胞以及Notch通路对毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞效率的影响，为组织工程皮肤构建、缺血性疾病的治疗提供合适的种子细胞提供了新的途径。

1997年，Asahara等（Asahara T, et al. 1997)首次发现人体外周血中存在能分化为血管内皮细胞（Endothelial Cell，ECs）的前体细胞，将其命名为内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）。EPCs不仅参与胚胎期的血管发生，而且在成体的血管生长发育中发挥重要作用。但EPCs主要存在于骨髓和外周血中，其来源和数量非常有限，获取的细胞纯度较低、增殖能力较差，能够成功分化成ECs的效率更低，而且多个部位穿刺取材对患者的损伤大（Gehling UM, et al.2000; Casamassimi A, et al.2007）。此外，ECs在血管的发生和形成过程中也演绎着非常重要的角色。然而，ECs自体取材来源有限，取材后极易引起桥血管的狭窄、闭塞，易加重对患者的损伤，且经过原代分离培养的血管内皮细胞极易老化，细胞周期短，增殖能力非常局限。这些都限制了ECs的直接获取和应用。遂考虑利用干细胞诱导的方法。

近年来围绕血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。其中，VEGF是最重要的调控因子之一，其作为特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，在血管生成、组织缺血修复过程中起着重要作用，而VEGF165是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是体内发挥作用的主要形式（Neufeld G, et al. 1999; Robinson CJ, et al. 2001）。

γ－分泌酶主要参与了β-淀粉样蛋白前体（APP）和 Notch 等重要跨膜蛋白的切割和水解过程，其抑制剂（DAPT）则是Notch信号通路的特异性阻断剂，被较多的运用于Notch信号通路转导机制的研究中（ Li S, et al.2012；Mori M, et al.2012；Subramaniam D, et al.2012）。Notch信号通路是生物进化过程中的一条高度保守的通路，主要参与了细胞增殖、分化、凋亡、迁移、血管发生等多种演变过程，甚至也能介导细胞间的相互作用（Guo F, et al.2012；Liu W, et al.2013；Al Haj, et al.2009）。

发明内容

本发明的目的在于，针对以上存在的问题，提供一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法。

为此，本发明提供如下解决方案：

一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，所述抑制方法包括：

(1) 大鼠毛囊干细胞的分离：

取新生1周龄SD大鼠，大鼠的体重为24±4 g，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出；在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1% Ⅳ 型胶原酶和1% Dispase酶混合液37℃ 消化90 min后，用PBS洗两次，体视显微镜下用注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1 ml完全培养基；

(2) 大鼠毛囊干细胞的培养：

在37℃、5% CO₂培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 ml完全培养基继续培养3 h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 ml完全培养基，之后每2-3 d换液；

(3) 大鼠毛囊干细胞的纯化：

将100 μg/ml IV型胶原按照3 ml/100 mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100 mm培养皿的原代细胞用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20 min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；

(4) 大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制：

收集纯化后的第三代细胞用于该步实验，将纯化后的第三代细胞置于含有完全培养基的培养皿中，待贴壁细胞达到60% ~ 70%生长融合后，将上述完全培养基换成抑制培养基在37℃、5% CO₂培养条件下进行诱导抑制培养，且每两天换一次抑制培养基。

优选地，所述完全培养基包括如下组分：44 ml DMEM/F12培养液、5 ml KSR血清替代物、500 μl 青链霉素混合液、500 μl L-谷氨酰胺、500 μl 非必需氨基酸、20 ng/ml 重组人表皮细胞生长因子、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μl 羟基乙醇和10ng/ml 氢化可的松。

优选地，所述抑制培养基包括如下组分：88 ml DMEM/F12培养液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000 μl 非必需氨基酸、5-20 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、10-20 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5-1.0 μmol/L DAPT、 100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。

优选地，所述抑制培养基包括如下组分：88 ml DMEM/F12培养液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000 μl 非必需氨基酸、10 ng/ml血管内皮细胞生长因子165、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5 μmol/LDAPT、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。

本发明中，完全培养基和抑制培养基中的各项成分均可以通过市购的方式获得，例如：DMEM/F12培养液购自重组美国Gibco公司，商品号为12660-012；人碱性成纤维细胞生长因子购自美国R&D公司，商品号为233-FB-025。

本发明有如下优点：

（1）作为干细胞，毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，长期体外传代培养，细胞功能旺盛等特点，并且具有很高的再生和分化能力，这将极大缩短体外培养扩增时间，提高临床治疗效率；

（2）所用的种子细胞—毛囊干细胞取自自体毛发，来源非常丰富，也非常容易获得，且不会对患者造成任何损伤和痛苦，也极大地降低了免疫排斥反应和传播疾病等概率；

（3）首次采用血管内皮细胞生长因子165为诱导因子使大鼠毛囊干细胞向血管内皮细胞高效定向分化；

（4）本发明所提供的毛囊细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，能够调节毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的形成与生长，促进伤口的有效愈合；

（5）本发明所提供的毛囊细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法也可为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞来源。

附图说明

图1为本发明所提供的原代大鼠毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密 100×；

图2为本发明所提供的IV型胶原筛选纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞，呈典型的铺路石状 100×；

图3为本发明所提供的P3代大鼠毛囊干细胞的流式细胞仪检测，分别为整合素β1、整合素a6、角蛋白15、P63、CD31、VE-cadherin的阳性率；

图4为本发明所提供的P3代大鼠毛囊干细胞的透射电镜下超微结构；

图5为本发明所提供的抑制前后血管内皮细胞标记物CD31、VE-cadherin的蛋白表达情况；

图6为本发明所提供的抑制前后体外Dil-ac-LDL吞噬功能比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

1. 大鼠毛囊干细胞的分离、培养、纯化和鉴定

1.1 大鼠毛囊干细胞的分离

取新生1周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出。在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次。然后用1%Ⅳ 型胶原酶和1%Dispase酶混合液37℃ 消化90min后，用PBS洗两次。体视显微镜下用1ml注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1 ml完全培养基。

所述完全培养基成分为：44 ml DMEM/F12培养液、5 ml KSR血清替代物、500 μl青链霉素混合液、500 μl L-谷氨酰胺、500 μl 非必需氨基酸、20 ng/ml 重组人表皮细胞生长因子、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。

1.2 大鼠毛囊干细胞的培养

在37℃、5% CO₂培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 ml完全培养基继续培养3 h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 ml完全培养基，之后每2-3 d换液。图1

1.3 大鼠毛囊干细胞的纯化

将100 μg/ml IV型胶原按照3 ml/100 mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100 mm培养皿的原代细胞用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20 min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。图2

1.4 大鼠毛囊干细胞的鉴定

采用流式细胞仪鉴定：收集第3代细胞，调整细胞密度为1.0x106个/ml，装入1.5ml的EP管，1200转/3min离心弃上清。80%甲醇将细胞室温固定5 min；0.1% PBST将细胞室温静置20 min；5% BSA-PBS上摇床封闭30 min；PBS洗1次，1200转/3min离心弃上清。每管流式管100UL（1X annexin-binding buffer)，1×106 cell。分别加入Integrinβ1-PE；Integrinα6、CK15、P63、CD31、VE-cadherin抗体避光孵育30 min。再加入荧光素标记二抗避光孵育30min。PBS洗1次，1200转/3min离心弃上清。PBS每管流式管500UL，上机流式检测。图3

采用透射电镜观察

（1） 2.5% 戊二酸-PBS冲液将消化离心所得的细胞固定4小时或过夜；

（2） 0.1 MPBS漂洗2次/10-15 min；

（3） 1% 锇酸固定于4℃下1 h；

（4） ddH2O漂洗2次/10-15 min；

（5） 2% 醋酸铀固定/染色30 min；

（6） 50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水1次/10-15 min；

（7） 100% 丙酮梯度脱水2次/10-20 min；

（8）再经过渗透、包埋、聚合三个过程；

（9）超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜下观察内部结构。

图4的结果表明，透射电镜下可见细胞核大，核仁明显，核浆比例大，细胞器少而发育不成熟，是出于原始状态的细胞。

2. 毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制

2.1 抑制培养基的制备

将10ml FBS 胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、10 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、0.5μmol/L DAPT、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松溶于88 ml DMEM/F12培养液，定溶后用规格为0.22滤膜过滤，最终得到的抑制培养基备用。

将10ml FBS 胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、10 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、1.0 μmol/L DAPT、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松溶于88 ml DMEM/F12培养液，定溶后用规格为0.22滤膜过滤，最终得到的抑制培养基备用。

2.2血管内皮细胞诱导分化的抑制培养

诱导组：在不含DAPT的抑制培养基中进行诱导培养。

抑制组：在含不同浓度DAPT的抑制培养基中分别进行抑制培养。

2.3诱导分化抑制培养后的血管内皮细胞的鉴定

采用Western blot 和Dil-ac-LDL吞噬功能检测对抑制诱导后的细胞进行相关指标鉴定，最终得到了所测指标在7天时效果显现。

Western blot 相关蛋白检测：一周后对诱导组和抑制组的细胞采用Westernblot法检测CD31、VE-cadherin的蛋白表达。于冰上裂解细胞，经过提取细胞总蛋白；BCA法测蛋白浓度；SDS-PAGE电泳；转膜；免疫反应（一抗和二抗的孵育）；化学反光（ECLA和ECLB两种混合试剂显色）；上机拍照；Alpha软件凝胶图像分析等步骤，对诱导组和抑制组CD31、VE-cadherin的蛋白表达情况进行条带光密度值比较，结果见图5。

Dil-ac-LDL吞噬功能检测：一周后对诱导组和抑制组的细胞进行Dil-ac-LDL吞噬功能检测。用各自完全培养基稀释Dil-ac-LDL成10ug/ml的工作浓度；分别加入到各自组别的rHFSCs的6孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养4小时；去除含有Dil-ao-LDL的培养基，用不含Dil-ac-LDL的培养基及PBS洗3次；最后在倒置荧光显微镜下观察对比各组的吞噬情况，结果见图6。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例而已，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，其特征在于，所述抑制方法包括：

(1)大鼠毛囊干细胞的分离：

取新生1周龄SD大鼠，大鼠的体重为24±4g，颈椎脱臼法处死后，放入装有75％乙醇的烧杯消毒后取出；在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75％乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1％Ⅳ型胶原酶和1％Dispase酶混合液37℃消化90min后，用PBS洗两次，体视显微镜下用注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到预先包被的培养皿中，加入1ml完全培养基；

(2)大鼠毛囊干细胞的培养：

在37℃、5％CO₂培养条件下培养1h，再缓缓加入2ml完全培养基继续培养3h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3ml完全培养基，之后每2-3d换液；

(3)大鼠毛囊干细胞的纯化：

将100μg/ml IV型胶原按照3ml/100mm培养皿的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用TrypLE^TMSelect(1X)胰蛋白酶替代酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；

(4)大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制：

收集纯化后的第三代细胞用于该步实验，将纯化后的第三代细胞置于含有完全培养基的培养皿中，待贴壁细胞达到60％～70％生长融合后，将上述完全培养基换成抑制培养基在37℃、5％CO₂培养条件下进行诱导抑制培养，且每两天换一次抑制培养基；

所述抑制培养基包括如下组分：88ml DMEM/F12培养液、10ml FBS胎牛血清、1000μl青链霉素混合液、1000μl L-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、5-20ng/ml血管内皮细胞生长因子165、10-20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5-1.0μmol/L DAPT、100μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。

2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，其特征在于，所述完全培养基包括如下组分：44ml DMEM/F12培养液、5ml KSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇和10ng/ml氢化可的松。

3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，其特征在于，所述抑制培养基包括如下组分：88ml DMEM/F12培养液、10ml FBS胎牛血清、1000μl青链霉素混合液、1000μl L-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、10ng/ml血管内皮细胞生长因子165、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5μmol/L DAPT、100μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。