CN105754930A - 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法 - Google Patents

一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105754930A
CN105754930A CN201610160912.4A CN201610160912A CN105754930A CN 105754930 A CN105754930 A CN 105754930A CN 201610160912 A CN201610160912 A CN 201610160912A CN 105754930 A CN105754930 A CN 105754930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hair follicle
vascular endothelial
follicle stem
cell
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610160912.4A
Other languages
English (en)
Inventor
全仁夫
杜伟斌
郑宣
李强
曹国平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU CITY XIAOSHAN DISTRICT TRADITIONAL CHINESE MEDICAL HOSPITAL
Original Assignee
HANGZHOU CITY XIAOSHAN DISTRICT TRADITIONAL CHINESE MEDICAL HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU CITY XIAOSHAN DISTRICT TRADITIONAL CHINESE MEDICAL HOSPITAL filed Critical HANGZHOU CITY XIAOSHAN DISTRICT TRADITIONAL CHINESE MEDICAL HOSPITAL
Priority to CN201610160912.4A priority Critical patent/CN105754930A/zh
Publication of CN105754930A publication Critical patent/CN105754930A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及干细胞诱导培养领域，尤其涉及一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法。本发明所提供的毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法包括：(1)大鼠毛囊干细胞的分离；(2)大鼠毛囊干细胞的培养；(3)大鼠毛囊干细胞的纯化；(4)大鼠毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的培养。通过本发明所提供的培养方法得到了用于促进创伤后皮肤早期血管化的血管内皮细胞，从而有利于促进创伤皮肤的修复；同时，也可为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞来源。

Description

一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞诱导培养领域，尤其涉及一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法。
背景技术
干细胞作为再生医学第一要素，其生物学特性的深入研究对于再生医学的发展具有指引作用，再生医学中常用的干细胞分为胚胎干细胞及成体干细胞，由于胚胎干细胞的来源有限且涉及很严重的伦理道德争议，所以成体干细胞似乎更适合在再生医学中的应用。
研究表明，毛囊干细胞（Hair Follicle Stem Cells，HFSCs）是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点（Cotsarelis G, et al. 1990; Cotsarelis G. 2006）。体外培养的HFSCs表现出高克隆形成能力，具有非常高的再生潜能（Rochat A, et al. 1994）。它来源于皮肤、毛发，数量极其可观，且没有严重的并发症，无免疫原性，可供自体移植，是最容易获得的干细胞来源之一。研究毛囊干细胞的多方向分化潜能以及诱导毛囊干细胞定向分化为血管内皮细胞，为组织工程皮肤构建提供合适的种子细胞提供了新的途径。
1997年，Asahara等（Asahara T, et al. 1997)首次发现人体外周血中存在能分化为血管内皮细胞（Endothelial Cell，ECs）的前体细胞，将其命名为内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）。EPCs不仅参与胚胎期的血管发生，而且在成体的血管生长发育中发挥重要作用。但EPCs主要存在于骨髓和外周血中，其来源和数量非常有限，获取的细胞纯度较低、增殖能力较差，能够成功分化成ECs的效率更低，而且多个部位穿刺取材对患者的损伤大（Gehling UM, et al.2000; Casamassimi A, et al.2007）。此外，ECs在血管的发生和形成过程中也演绎着非常重要的角色。然而，ECs自体取材来源有限，取材后极易引起桥血管的狭窄、闭塞，易加重对患者的损伤，且经过原代分离培养的血管内皮细胞极易老化，细胞周期短，增殖能力非常局限。这些都限制了ECs的直接获取和应用。遂考虑利用干细胞诱导的方法。
近年来围绕血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。其中，VEGF是最重要的调控因子之一，其作为特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，在血管生成、组织缺血修复过程中起着重要作用，而VEGF165是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是体内发挥作用的主要形式（Neufeld G, et al. 1999; Robinson CJ, et al. 2001）。
发明内容
本发明旨在提供一种高效、简便和可靠的诱导大鼠毛囊干细胞定向分化为血管内皮细胞的培养方法，为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞的来源。
为此，本发明提供一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法，所述毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法包括以下步骤：
(1) 大鼠毛囊干细胞的分离：
取新生1周龄SD大鼠，大鼠的体重为24±4 g，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出；在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1% Ⅳ 型胶原酶和1% Dispase酶混合液37℃ 消化90 min后，用PBS洗两次，体视显微镜下用注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1 ml完全培养基；
(2) 大鼠毛囊干细胞的培养：
在37℃、5% CO2培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 ml完全培养基继续培养3 h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 ml完全培养基，之后每2-3 d换液；
(3) 大鼠毛囊干细胞的纯化：
培养8-10d后用胰蛋白酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA）-PBS稀释液（1:3）漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶37℃、5%CO2培养箱中消化约8min，用Ⅳ型胶原差速贴壁法，使Ⅳ型胶原室温预包被1h，利用15-20 min贴壁时间差，对此时间内贴壁的细胞继续用完全培养基培养，达到筛选纯化目的，之后每 2-3天换液1次；第2代细胞再纯化1次；
(4) 大鼠毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的培养：
取纯化后的第3代大鼠毛囊干细胞，待贴壁细胞达到约60%融合，进行体外诱导，诱导时吸去完全培养基，加入诱导培养基，37℃、5%CO2培养条件下培养，之后每2天换液1次。
优选地，所述完全培养基包括如下组分：44 ml DMEM/F12培养液、5 ml KSR血清替代物、500 μl 青链霉素混合液、500 μl L-谷氨酰胺、500 μl 非必需氨基酸、20 ng/ml 重组人表皮细胞生长因子、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μl 羟基乙醇和10 ng/ml 氢化可的松。
优选地，所述诱导培养基包括如下组分：88 ml DMEM/F12培养液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000 μl 非必需氨基酸、5-20 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、10-20 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。
优选地，所述诱导培养基包括如下组分：88 ml DMEM/F12培养液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000 μl 非必需氨基酸、10 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。
在本发明中，完全培养基和诱导培养基中各项成分均可通过市购的方式获得，例如：DMEM/F12培养液购自重组美国Gibco公司，商品号为12660-012；人碱性成纤维细胞生长因子购自美国R&D公司，商品号为233-FB-025。
本发明有如下优点：
（1） 作为干细胞，毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，长期体外传代培养，细胞功能旺盛等特点，并且具有很高的再生和分化能力，这将极大缩短体外培养扩增时间，提高临床治疗效率；
（2） 本研究中所用的种子细胞—毛囊干细胞取自自体毛发，来源非常丰富，也非常容易获得，且不会对患者造成任何损伤和痛苦，也极大地降低了免疫排斥反应和传播疾病等概率；
（3）本发明首次采用血管内皮细胞生长因子165为诱导因子使大鼠毛囊干细胞向血管内皮细胞高效定向分化；
（4）通过本发明所提供的培养方法得到了用于促进创伤后皮肤早期血管化的血管内皮细胞，从而有利于促进创伤皮肤的修复；
（5）本发明也可为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞来源。
附图说明
图1为本发明所提供的原代大鼠毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密 100×；
图2为本发明所提供的IV型胶原筛选纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞，呈典型的铺路石状 100×；
图3为本发明所提供的P3代大鼠毛囊干细胞的流式细胞仪检测，分别为整合素β1（A）、整合素a6（B）、角蛋白15（C）的阳性率；
图4为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在实验组试验中经诱导7天后，血管内皮细胞标记物CD31（A）和VE-cadherin（B）的免疫荧光染色结果；
图5为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在实验组试验中经诱导7天后，血管内皮细胞标记物CD31（A）和VE-cadherin（B）的流式阳性率检测结果；
图6为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在对照组试验中经诱导7天后，血管内皮细胞标记物CD31（A）和VE-cadherin（B）的流式阳性率检测结果；
图7为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在诱导7天后，透射电镜下的血管内皮细胞特有结构W-P小体图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
1. 大鼠毛囊干细胞的分离、培养、纯化和鉴定
1.1 大鼠毛囊干细胞的分离
取新生1周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出。在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次。然后用1%Ⅳ 型胶原酶和1%Dispase酶混合液37℃ 消化90min后，用PBS洗两次。体视显微镜下用1ml注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1 ml完全培养基。
所述完全培养基成分为：44 ml DMEM/F12培养液、5 ml KSR血清替代物、500 μl 青链霉素混合液、500 μl L-谷氨酰胺、500 μl 非必需氨基酸、20 ng/ml 重组人表皮细胞生长因子、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。
1.2 大鼠毛囊干细胞的培养
在37℃、5% CO2培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 ml完全培养基继续培养3 h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 ml完全培养基，之后每2-3 d换液。图1
1.3 大鼠毛囊干细胞的纯化
培养8-10d后用胰蛋白酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA）-PBS稀释液（1:3）漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶37℃、5%CO2培养箱中消化约8min，用Ⅳ型胶原差速贴壁法，使Ⅳ型胶原室温预包被1h，利用15-20 min贴壁时间差，对此时间内贴壁的细胞继续用完全培养基培养，达到筛选纯化目的，之后每 2-3天换液1次；第2代细胞再纯化1次。图2
1.4 大鼠毛囊干细胞的鉴定
采用流式细胞仪鉴定：收集第3代细胞，调整细胞密度为1.0x106个/ml，装入1.5 ml的EP管，1200转/3min离心弃上清。80%甲醇将细胞室温固定5 min；0.1% PBST将细胞室温静置20 min；5% BSA-PBS上摇床封闭30 min；PBS洗1次，1200转/3min离心弃上清。每管流式管100UL（1X annexin-binding buffer)，1×106 cell。分别加入Integrinβ1-PE；Integrinα6、CK15、抗体避光孵育30 min。再加入荧光素标记二抗避光孵育30 min。PBS洗1次，1200转/3min离心弃上清。PBS每管流式管500UL，上机流式检测。图3
2. 大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞
2.1 诱导培养基的制备
（1）含血管内皮细胞生长因子165的诱导培养基的制备（实验组）
将10ml FBS 胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000μl 非必需氨基酸、10 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松溶于88 ml DMEM/F12培养液，定溶后用规格为0.22滤膜过滤，最终得到的血管内皮细胞培养基备用。
（2）不含血管内皮细胞生长因子165的诱导培养基的制备（对照组）
将10ml FBS 胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000μl 非必需氨基酸、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松溶于88 ml DMEM/F12培养液，定溶后用规格为0.22滤膜过滤，最终得到不含血管内皮细胞生长因子165的培养基备用。
2.2 血管内皮细胞的诱导分化培养
待纯化后的毛囊干细胞在培养皿中达到60% ~ 70%生长融合后，将上述完全培养基换成诱导培养基进行诱导，每2天换一次液。在37℃、5% CO2培养条件下继续培养。
2.3 诱导分化后的血管内皮细胞的鉴定
采用细胞形态学观察记录，免疫荧光染色法、流式检测法、透射电镜对诱导后的细胞进行相关指标鉴定，最终得到了所测指标在7天时达到最佳。
免疫荧光染色法
（1） 诱导7天后的细胞用普通胰酶-PBS（1:3）稀释液漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5 min，1200转/5 min离心；
（2） 以1×105/孔浓度接种于事先用Matrix胶包被在37℃、5% CO2的培养箱中30 min的玻片上，贴壁培养1 d；
（3） 吸去诱导培养基，用1XPBS洗3次；
（4） 4% PFA-PBS固定10 min（室温）；
（5） 1XPBS洗3次，5 min/次；
（6） 1% BSA-PBS封闭30 min（室温）；
（7） 1XPBS洗2次，5 min/次；
（8） 孵化一抗(1:100)，每滴15-25UL一抗稀释液，4℃过夜；
（9） 1XPBS洗3次，5 min/次；
（10）孵化二抗（1:500)，避光1 h；
（11） 1XPBS洗3次，5 min/次；
（12） DAPI染核（1:2000)，室温10 min；
（13） 1XPBS洗2次，5 min/次；
（14） 封片，激光共聚焦下拍照。
结果表明，毛囊干细胞经过诱导7天后，血管内皮细胞特征性标记物CD31和VE-cadherin在细胞内阳性表达。
流式检测法
（1） 诱导7天后的细胞用普通胰酶-PBS（1:3）稀释液漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5 min，1200转/5 min离心，之后1XPBS洗2次；
（2） 80% 甲醇将细胞轻轻吹打成单悬液，室温固定5min，1200转/3min离心弃上清；
（3） 0.1% PBST将细胞轻轻吹打成单悬液，室温静置20 min，1200转/3 min离心弃上清；
（4） 5% BSA-PBS将细胞轻轻吹打成单悬液，上摇床封闭30 min，1200转/3 min离心弃上清；
（5） 1XPBS洗1次，1200转/3 min离心弃上清；
（6） 每管流式管100UL（1X annexin-binding buffer)，1×106cell；
（7） 加一抗(比例参照抗体说明书)，避光静置30 min；
（8） 1XPBS洗1次，1200转/3 min离心弃上清；
（9） 加二抗（比例参照抗体说明书），避光静置30 min；
（10） 1XPBS洗1次，1200转/3 min离心弃上清；
（11） 1XPBS每管流式管500UL，上机流式检测。
结果表明，实验组试验的毛囊干细胞在诱导7天后，内皮细胞特征性标记物CD31和VE-cadherin的阳性率分别为65.1%和95.9%；
对照组试验的毛囊干细胞在诱导7天后，内皮细胞特征标记物CD31和VE-cadherin的阳性率分别为13.6%和17.9%。
透射电镜法
（1） 2.5% 戊二酸-PBS冲液将消化离心所得的细胞固定4小时或过夜；
（2） 0.1 MPBS漂洗2次/10-15 min；
（3） 1% 锇酸固定于4℃下1 h；
（4） ddH2O漂洗2次/10-15 min；
（5） 2% 醋酸铀固定/染色30 min；
（6） 50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水1次/10-15 min；
（7） 100% 丙酮梯度脱水2次/10-20 min；
（8） 再经过渗透、包埋、聚合三个过程；
（9） 超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜下观察W-P小体。
结果表明，毛囊干细胞在诱导7天后，在17000X透射电镜下，可以在胞浆内观察到黑色的棒状结构即内皮细胞特有的结构W-P小体，该小体一般宽约0.1-0.3 um，长约0.5-5 um。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例而已，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法包括以下步骤：
(1) 大鼠毛囊干细胞的分离：
取新生1周龄SD大鼠，大鼠的体重为24±4 g，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出；在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1% Ⅳ 型胶原酶和1% Dispase酶混合液37℃ 消化90 min后，用PBS洗两次，体视显微镜下用注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1 ml完全培养基；
(2) 大鼠毛囊干细胞的培养：
在37℃、5% CO2培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 ml完全培养基继续培养3 h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 ml完全培养基，之后每2-3 d换液；
(3) 大鼠毛囊干细胞的纯化：
培养8-10d后用胰蛋白酶-PBS稀释液漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶37℃、5%CO2培养箱中消化约8min，用Ⅳ型胶原差速贴壁法，使Ⅳ型胶原室温预包被1h，利用15-20 min贴壁时间差，对此时间内贴壁的细胞继续用完全培养基培养，达到筛选纯化目的，之后每 2-3天换液1次；第2代细胞再纯化1次；
(4) 大鼠毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的培养：
取纯化后的第3代大鼠毛囊干细胞，待贴壁细胞达到约60%融合，进行体外诱导，诱导时吸去完全培养基，加入诱导培养基，37℃、5%CO2培养条件下培养，之后每2天换液1次。
2.根据权利要求1中所述的一种用于将毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述完全培养基包括如下组分：44 ml DMEM/F12培养液、5 ml KSR血清替代物、500 μl 青链霉素混合液、500 μl L-谷氨酰胺、500 μl 非必需氨基酸、20 ng/ml 重组人表皮细胞生长因子、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μl 羟基乙醇和10 ng/ml 氢化可的松。
3.根据权利要求1中所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述诱导培养基包括如下组分：88 ml DMEM/F12培养液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000 μl 非必需氨基酸、5-20 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、10-20 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。
4.根据权利要求3中所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述诱导培养基包括如下组分：88 ml DMEM/F12培养液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μl 青链霉素混合液、1000 μl L-谷氨酰胺、1000 μl 非必需氨基酸、10 ng/ml 血管内皮细胞生长因子165、10 ng/ml 重组人碱性成纤维细胞生长因子、100 μl 羟基乙醇、10 ng/ml 氢化可的松。
CN201610160912.4A 2016-03-21 2016-03-21 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法 Pending CN105754930A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610160912.4A CN105754930A (zh) 2016-03-21 2016-03-21 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610160912.4A CN105754930A (zh) 2016-03-21 2016-03-21 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105754930A true CN105754930A (zh) 2016-07-13

Family

ID=56345344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610160912.4A Pending CN105754930A (zh) 2016-03-21 2016-03-21 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105754930A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105969720A (zh) * 2016-07-29 2016-09-28 上海瑞鹿生物技术有限公司 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法
CN110564675A (zh) * 2019-09-30 2019-12-13 广东华夏健康生命科学有限公司 一种毛囊干细胞的分离提取方法
CN110713984A (zh) * 2018-11-27 2020-01-21 四川大学 诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法
CN110923197A (zh) * 2019-11-11 2020-03-27 浙江卫未生物医药科技有限公司 毛囊源细胞培养基
CN114317404A (zh) * 2021-12-17 2022-04-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3d毛囊干细胞的培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468744A (zh) * 2013-07-10 2013-12-25 杭州市萧山区中医院 Vegf165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法
CN103710297A (zh) * 2013-07-10 2014-04-09 杭州市萧山区中医院 大鼠毛囊干细胞的分离培养方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468744A (zh) * 2013-07-10 2013-12-25 杭州市萧山区中医院 Vegf165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法
CN103710297A (zh) * 2013-07-10 2014-04-09 杭州市萧山区中医院 大鼠毛囊干细胞的分离培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郑宣等: "毛囊干细胞的特性及其在皮肤修复中的应用", 《中医正骨》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105969720A (zh) * 2016-07-29 2016-09-28 上海瑞鹿生物技术有限公司 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法
CN105969720B (zh) * 2016-07-29 2019-11-05 上海瑞鹿生物技术有限公司 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法
CN110713984A (zh) * 2018-11-27 2020-01-21 四川大学 诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法
CN110564675A (zh) * 2019-09-30 2019-12-13 广东华夏健康生命科学有限公司 一种毛囊干细胞的分离提取方法
CN110923197A (zh) * 2019-11-11 2020-03-27 浙江卫未生物医药科技有限公司 毛囊源细胞培养基
CN114317404A (zh) * 2021-12-17 2022-04-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3d毛囊干细胞的培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105754930A (zh) 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法
CN105670987B (zh) 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法
CN103937743B (zh) 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法
US20220380733A1 (en) Method for culturing urine-derived kidney stem cells and use thereof
Zhang et al. Three dimensional dental epithelial-mesenchymal constructs of predetermined size and shape for tooth regeneration
CN102952777B (zh) 人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法
CN102344906B (zh) 一种毛囊干细胞的分离培养方法
CN106085952A (zh) 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法
CN106987555A (zh) 高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物
CN108300688A (zh) 原代肝细胞分离和培养方法
CN103333854B (zh) 一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法
Nejaddehbashi et al. Isolating human dermal fibroblasts using serial explant culture
CN106119191A (zh) 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及临床化制备方法
CN113559273B (zh) 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用
CN104403988B (zh) 一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法
CN105755098A (zh) 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法
CN104388381B (zh) 一种人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法
CN111909890B (zh) 一种绒山羊毛乳头细胞的分离、鉴定方法
CN105368773A (zh) 一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法
CN108048390B (zh) 一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒
Gao et al. Putative epidermal stem cell convert into corneal epithelium-like cell under corneal tissue in vitro
CN105925524A (zh) 一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法
CN102994447B (zh) 一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法
CN102899290A (zh) 一种培养坐骨神经许旺细胞的方法
CN107236703A (zh) 一种饲养层细胞、培养方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160713