CN105969720A - 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法 - Google Patents
一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺；本发明的人类血管内皮细胞培养液，相对于传统血管内皮细胞培养基，能够适用于多种血管内皮细胞，有效促进细胞增殖和减小分裂时间，维持血管内皮细胞的性状，大大增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间；同时本发明的细胞培养液各个组分一般实验室均可以获得，配制方便，无需使用成品专用培养基，大大降低了培养内皮细胞的成本，适合推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法。
背景技术
血管内皮细胞不仅参与调解血管通透性和凝血过程，还在免疫调解，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。在科研中常采用体外培养的方法来对血管内皮细胞进行研究。由于目前大多数人仍不承认使用永生化的血管内皮细胞系，故目前常规仍用从人身上纯化血管内皮细胞研究。而血管内皮细胞的培养，常常细胞增殖慢，细胞数代以后性状发生改变，或者死亡，使研究成本变大，研究时间拉长。
血管内皮细胞体外培养对于培养基营养要求较高，而提高生长速度，增加传代次数，维持传代后细胞性状对于利用血管内皮细胞体外研究多种疾病的显得尤其重要。目前市场上比较成熟的内皮细胞培养基主要有Lonza公司的EGM和EGM-2系列，以及Sciencell的ECM培养基，上述培养基在体外培养正常人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞都有相对不错的效果，但配方保密且价格昂贵。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种能够适用于多种血管内皮细胞(包括原代细胞和细胞株)，并且有效促进细胞增殖，减小分裂时间，同时成本相对低廉的人类血管内皮细胞培养液。
为了实现上述技术目的，本发明所采用的技术措施为：
一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述基础培养基选自DMEM培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基及Williams’sE培养基，或者其他任何适用的贴壁培养基；
优选地，上述培养液中还包括防污染组分、L-谷氨酰胺及肝素；进一步地，上述防污染组分选自青霉素、链霉素氨和两性霉素B的一种或几种；
优选地，本发明的培养液在每100ml的基础培养液中包含：
胎牛血清 10-20ml
青霉素 10000U
链霉素 10000U
L-谷氨酰胺 1.25-1.5ml
肝素 2-20mg
人重组表皮生长因子 10-1000ng
人重组成纤维细胞生长因子 100-2000ng
血管内皮生长因子 10-100ng
胰岛素样生长因子 0.1-5μg
维生素C 10-200μg
皮质醇 10-200μg
霍乱毒素 1-80μg
氨基乙醇 6.108-61.08 μg
磷酸乙醇胺 14.106-141.06 μg；
上述的各组分和比例可以进一步优选为，每100ml的DMEM/F12培养液中包含：
胎牛血清 10ml
青霉素 10000U
链霉素 10000U
L-谷氨酰胺 1.25ml
肝素 9mg
人重组表皮生长因子 500ng
人重组成纤维细胞生长因子 1000ng
血管内皮生长因子 50ng
胰岛素样生长因子 2μg
维生素C 100μg
皮质醇 100μg
霍乱毒素 10μg
氨基乙醇 30.54μg
磷酸乙醇胺 70.53μg。
另一方面，本发明还提供一种相应的人类血管内皮细胞的分离培养方法，，包括以下步骤：
步骤一，利用新鲜离体新生儿脐带分离得到脐静脉；
步骤二，使用预热的冲洗液对脐静脉进行冲洗灌流；
步骤三，利用预热的消化液对步骤二处理后的脐静脉进行灌流消化；
步骤四，收集灌流消化液，进行离心洗涤，然后使用基础培养基进行重悬并再次离心，最后利用本发明上述的细胞培养液再次重悬，分离得到人类血管内皮细胞；
步骤五，将分离得到的人类血管内皮细胞使用本发明上述细胞培养液稀释，接入细胞板或细胞瓶，使用本发明上述的细胞培养液进行培养。
为了进一步优化上述的人类血管内皮细胞的分离培养方法，上述步骤二中预热的冲洗液可以优选为37℃预热的D-hanks溶液、PBS溶液或基础培养液；上述步骤三中预热的消化液可以优选为37℃预热的含有II型胶原酶或IV型胶原酶的D-hanks溶液；上述步骤五中的培养条件优选为37±1℃，5% CO2，湿度为90%±2%。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
首先，本发明的人类血管内皮细胞培养液，相对于传统血管内皮细胞培养基，能够适用于多种血管内皮细胞，包括原代细胞和细胞株，同时可以有效促进细胞增殖和减小分裂时间；
其次，本发明的细胞培养液中各个生长因子及组分的配合添加，能够有效地维持了血管内皮细胞的性状，在体外扩充了10代以后，细胞仍能有较大程度维持原有性状，大大增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间；
再次，本发明的细胞培养液各个组分一般实验室均可以获得，配制方便，无需使用成品专用培养基，大大降低了培养内皮细胞的成本；
最后，本发明使用的内皮细胞分离培养方法开创新的使用灌流清洗和灌流消化的方式，使得分离得到的细胞分离度高，污染小，细胞活力和活率更高。
附图说明
图1为实施例一中利用本发明的培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞（HUVEC）传5代与10代的细胞形态学比较图。
图2为实施例一中利用本发明的培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞5代至9代平均传代时间的比较图；
图3为实施例一中本发明培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞5代与10代后的细胞活率比较图。
图4为实施例一中利用本发明的培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞经冻存复苏后传5代与10代后的细胞纯度比较。
图5为实施例二中利用本发明的培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1传30代与50代后细胞形态学比较图。
图6为实施例二中利用本发明的培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1传20代至40代平均传代时间的比较图；
图7为实施例二中利用本发明培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1 20代，35代与50代后的细胞活率比较图。
图8为实施例二中利用本发明培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-120代后不同培养天数细胞的收获量比较图。
具体实施方式
本发明提供了一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
本实施例采用本发明的培养液、含10%胎牛血清的M199完全培养基及ciencecell的ECM含血清培养基进行对比实验，三种培养液分别为：
本发明的培养液（改良培养基）：
在每百毫升DMEM/F12培养基的基础上，加入如下组分：10ml胎牛血清，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，1.25ml L-谷氨酰胺，90μg/ml 肝素，5ng/ml人重组表皮生长因子，10ng/ml人重组成纤维细胞生长因子，0.5ng/ml血管内皮生长因子，20ng/ml胰岛素样生长因子，1μg/ml维生素C，1μg/ml皮质醇。100 ng/ml霍乱毒素，10μM氨基乙醇，100pM磷酸乙醇胺。
对照培养基A：含10%胎牛血清的M199完全培养基
对照培养基B：Sciencecell的ECM含血清培养基
细胞的分离过程采用一般的方法，取健康产妇分娩后的新生儿脐带，长度>20cm，放入4°C脐带保存液中，1h内送到细胞实验室进行后续处理。在细胞实验室的生物安全柜中对脐静脉进行洗涤，用II型胶原酶消化，使内皮细胞脱落。消化后的酶液平均分成3份，加入到预热的三种含血清培养基中，收集的液体1000 rpm/min离心10min，弃上清，再加入相应培养基，置于60mm培养皿中放细胞培养箱培养，培养箱条件为37±1℃， 5% CO2，湿度为90±2%。
原代细胞生长到密度为80%左右时，进行传代，上清中悬浮细胞直接300g离心5min，用新鲜预热的培养基重悬。贴壁细胞用预热的PBS洗涤2遍，加入500μl胰酶消化液，在培养箱中消化1 min，轻拍培养皿发现细胞脱落，加入相应的三种含血清培养基3 ml终止消化，300g离心5min，弃上清，再加入相应的完全培养基重悬细胞，与培养上清离心后的重悬细胞混合，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种培养皿中继续培养。待细胞长到密度达80%左右时按上述方法继续传代培养。
结果分析：
分别利用本发明的改良培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人脐静脉内皮细胞生长，经原代培养传5代，三种培养基培养的细胞和原代细胞（第1代）相比都尽可能地保持了原有形态（图1A）。原代培养10代后，改良培养基培养的细胞增殖正常，对照培养基A和B培养10代后增殖明显减慢，并且形态明显改变（图1B）。
分别利用本发明的改良型培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人脐静脉内皮细胞生长，进行传代平均时间的比较。如图2所示，实验结果表明，随着传代次数的增多，对照培养基A和对照培养基B培养人脐静脉内皮细胞生长速度显著减缓，传代间隔时间显著增长（从第7代开始），其与改良型培养基培养的细胞存在显著的统计学差异。
分别利用本发明的改良型培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人脐静脉内皮细胞，传代5次和10次细胞计数仪台盼蓝染色计算细胞活率。结果表明改良型培养基培养的细胞活率明显高于对照培养基A和对照培养基B（如图3所示）。
分别利用本发明的改良培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人脐静脉内皮细胞生长，传代5次和10次时利用流式细胞计数对内皮细胞标志物CD31和CD309进行染色，检测培养后细胞纯度，可以发现传代5次时，三种细胞培养的内皮细胞纯度能保持95%以上，传代10次时，改良型培养基培养的内皮细胞纯度仍能保持95%以上，对照培养基A和对照培养基B培养的内皮细胞纯度均降低到50%以下（如图4所示）。
实施例二
人微血管内皮细胞HMEC-1的复苏、传代培养，冻存和再复苏。所用三种细胞培养基详见实施例1。
首先将本发明的改良培养基、对照培养基A和对照培养基B三种培养基按1ml/5cm2的培养基用量放入3个培养皿，放入37±1℃，5% CO2，湿度为90±2%的培养箱内预热30min。
然后从液氮中取出同批冻存的HMEC-1细胞冻存管3支，迅速放入37°C水浴锅进行化冻。等冻存液全部融化后，将冻存管中1ml的冻存细胞转移到已含有9ml无血清培养基的离心管中，800rpm/min离心5min，细胞沉淀用1 ml对应的完全培养基重悬后将细胞悬液加入到已预热的三种培养基中，轻轻振荡分散细胞。接种后16-24小时后进行培养基换液，此后48小时需再换液。
复苏后细胞生长到密度为80%以上时，进行传代，贴壁细胞用预热的PBS洗涤2遍，加入500μl胰酶消化液，在培养箱中消化1 min，轻拍培养皿发现细胞脱落，加入相应的三种含血清培养基3 ml终止消化，800rpm/min离心5min，弃上清，再加入相应的完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种培养皿中继续培养。待细胞长到密度达80%以上时按上述方法继续传代培养。
每传代5次后，除继续培养的细胞，其余细胞进行冻存，利用完全培养基+10%DMSO的方法配置三种培养基相应冻存液，放入4°C预冷，细胞经计数后800rpm/min离心5min，按5×106个/ml的浓度加入相应冻存液，重悬后放入冻存管，置于程序冻存盒后，放-80°C冻存，24h后转移入液氮罐。
液氮罐冻存2周后按上述复苏方法进行重新复苏培养。
结果分析：
分别利用本发明的改良型培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人微血管内皮细胞HMEC-1生长，经细胞复苏后传30代，三种培养基培养的细胞和第1代细胞相比，都尽可能地保持了原有形态（图5A）。细胞复苏后培养50代后，改良型培养基培养的细胞形态与对照培养基A和B相比，更好地保持了第一代细胞原有形态（图5B）。
分别利用本发明的改良型培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人微血管内皮细胞HMEC-1生长，进行传代平均时间的比较。如图6所示，实验结果表明，随着传代次数的增多，对照培养基A和对照培养基B培养HMEC-1细胞生长速度显著减缓，传代间隔时间显著增长（从第30代开始），其与改良型培养基培养的细胞存在显著的统计学差异
分别利用本发明的改良型培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人微血管内皮细胞HMEC-1生长，传代20次，35次和50次时对细胞活率进行检测，实验结果表明，随着传代次数的增多，改良型培养基培养的细胞存活度高于对照培养基A和对照培养基B培养HMEC-1细胞（如图7所示）。
分别利用本发明的改良型培养基、对照培养基A和对照培养基B培养人微血管内皮细胞HMEC-1生长，传代20次，按照1*104 cell/cm2的密度接种10cm培养皿，计算细胞收获量。实验结果表明，改良型培养基细胞获取率高，可明显缩短细胞培养周期（如图8所示）。
通过上述实施例能够知道，本发明的人类血管内皮细胞培养液，相对于传统血管内皮细胞培养基，能够适用于多种血管内皮细胞，包括原代细胞和细胞株，同时可以有效促进细胞增殖和减小分裂时间；有效地维持了血管内皮细胞的性状，在体外扩充了10代以后，细胞仍能有较大程度维持原有性状，大大增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间；同时本发明的细胞培养液各个组分一般实验室均可以获得，配制方便，无需使用成品专用培养基，大大降低了培养内皮细胞的成本，适合推广应用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，其特征在于，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基及Williams’s E培养基。
3.根据权利要求2所述的细胞培养液，其特征在于，还包括防污染组分、L-谷氨酰胺及肝素。
4.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于，所述防污染组分选自青霉素、链霉素氨和两性霉素B的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的细胞培养液，其特征在于，每100ml的基础培养液中包含：
胎牛血清 10-20ml
青霉素 10000U
链霉素 10000U
L-谷氨酰胺 1.25-1.5ml
肝素 2-20mg
人重组表皮生长因子 10-1000ng
人重组成纤维细胞生长因子 100-2000ng
血管内皮生长因子 10-100ng
胰岛素样生长因子 0.1-5μg
维生素C 10-200μg
皮质醇 10-200μg
霍乱毒素 1-80μg
氨基乙醇 6.108-61.08 μg
磷酸乙醇胺 14.106-141.06 μg。
6.根据权利要求5所述的细胞培养液，其特征在于，每100ml的DMEM/F12培养液中包含：
胎牛血清 10ml
青霉素 10000U
链霉素 10000U
L-谷氨酰胺 1.25ml
肝素 9mg
人重组表皮生长因子 500ng
人重组成纤维细胞生长因子 1000ng
血管内皮生长因子 50ng
胰岛素样生长因子 2μg
维生素C 100μg
皮质醇 100μg
霍乱毒素 10μg
氨基乙醇 30.54μg
磷酸乙醇胺 70.53μg。
7.一种人类血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，利用新鲜离体新生儿脐带分离得到脐静脉；
步骤二，使用预热的冲洗液对脐静脉进行冲洗灌流；
步骤三，利用预热的消化液对步骤二处理后的脐静脉进行灌流消化；
步骤四，收集灌流消化液，进行离心洗涤，然后使用基础培养基进行重悬并再次离心，最后利用权利要求1-6任意一项所述细胞培养液再次重悬，分离得到人类血管内皮细胞；
步骤五，将分离得到的人类血管内皮细胞使用权利要求1-6任意一项所述细胞培养液稀释，接入细胞板或细胞瓶，使用权利要求1-6任意一项所述细胞培养液进行培养。
8.根据权利要求7所述的一种人类血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤二中预热的冲洗液为37℃预热的D-hanks溶液、PBS溶液或基础培养液。
9.根据权利要求7所述的一种人类血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤三中预热的消化液为37℃预热的含有II型胶原酶或IV型胶原酶的D-hanks溶液。
10.根据权利要求7所述的一种人类血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤五中的培养条件为37±1℃，5% CO2，湿度为90%±2%。
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