CN103153318B - 用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统 - Google Patents

用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在大规模的遵守GMP的条件下，使用满足GMP要求的介质和试剂来培养干细胞（例如MSC）同时保持干性以用于有效的下游治疗用途的方法，所述用途包括但不限于干细胞疗法、产品的生产，所述产品例如获自这种干细胞的有益因子、重组蛋白等。

Description

用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统
背景技术
多能（pluripotent）干细胞，比如间充质干细胞（MSC），是治疗多种人类疾病的理想候选者，所述疾病包括心肌梗塞、缺血性中风、各种自身免疫疾病等。示例性的干细胞，包括但不限于，ES或ESC（胚胎干细胞）、ADSC（脂肪细胞干细胞）、神经干细胞、iPSC（诱导性多能干细胞）、人类胚胎干细胞（hESC）、非人类灵长类ES细胞等，可用于下游的治疗应用，比如细胞疗法。有效的细胞疗法可能潜在地需要大量的这些细胞。随着通过临床的开发的细胞疗法的进展，制造规模和成本成为迫在眉睫的问题。对于MSC细胞类型，如脂肪来源的干细胞（ADSC）等，大多数临床试验已在小规模下进行，其中所需的细胞数是通过传统细胞培养技术获得的，传统细胞培养技术中细胞以二维方式在处理过的组织培养表面上贴附生长。然而，这些标准的二维培养方法过于劳动密集，且不足以满足多种细胞疗法应用的潜在大规模需求。展望未来的规模化和商品化，很有可能是需要源自一个同种异体供体的大约1012-1014或更多的细胞以用于有效的治疗用途，尤其是在需要多剂量的治疗期间。这个量的MSC细胞远远超过使用现有生产规程所能交付的量。更重要的是，为了用于人类细胞疗法，对于遵守监管的终产品而言，MSC细胞培养系统需要在培养期间完全排除动物血清。
到目前为止，MSC已经生长于各种系统，包括二维培养，二维培养是小规模的且微载体的、其使用血清或减量的（reduced）血清（DosSantos F等人，J Cell Physiol223:27-35,(2010)）。在本申请提交之时，据信，MSC是不会附着至微载体上的，除非介质包含至少一些血清，和/或，至少在预先包被有血清的微载体上。然而，MSC培养过程中即使是微量血清的存在都是不遵守GMP的。这些MSC在血清中培养过程中产生的另一个重要问题是，这种MSC能否保持多能（或维持其干性（stemness）），因为不同血清批次的血清含有可变的分化因子，其可能会导致培养物的分化。
因此，尽管存在用于在培养物中培养MSC的系统，在获得遵守GMP的、维持MSC干性并可有效用于动物治疗用途的MSC生长的大规模系统中仍然存在着许多障碍。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及用于培养干细胞（SC）的细胞培养系统，包括：在其中可培养SC的无血清（SF）细胞培养基；以及预先包被有无异种蛋白成分（exno-free）（XF）干细胞附着基质（substrate）的微载体珠。在某些实施方式中，SC是间充质干细胞（MSC），细胞附着基质是CELLStartTM，或MSC是脂肪细胞来源的干细胞（ADSC），或MSC源自自体或同种异体供体，或在一个具体方面中，系统进一步包括能够在受控条件下培养所述SC的生物反应器，以及在一些方面中，SC是IPSC。
在另一个方面中，本发明涉及组合物，该组合物包括：i）SF间充质细胞培养基；ii）微载体珠；iii）XF细胞附着基质；以及iv）MSC。在某些实施方式中，细胞附着基质是CELLStartTM，或MSC是脂肪细胞来源的干细胞（ADSC），或MSC源自自体或同种异体供体。
在另一个方面中，本发明涉及培养MSC的方法，其包括：在适宜所述MSC生长和扩增的受控条件下、在SF间充质细胞培养基中的包被有XF细胞附着基质的微载体珠上培养MSC。
在另一方面中，本发明涉及生产蛋白质的方法，其包括上面描述的方法，其中在培养之后从MSC中回收蛋白质。在某些实施方式中，细胞附着基质是CELLStartTM，或MSC是脂肪细胞来源的干细胞（ADSC），或MSC源自自体或同种异体供体，或MSC获自骨髓、血液、皮肤、脐带血或软骨膜；以及涉及上述方法，其中蛋白质是重组蛋白质，且MSC经工程化改造来生产重组蛋白质。
在又一个方面中，本发明涉及在悬浮培养物中将MSC培养至高密度的方法，其包括：将MSC附着至包被有无异种蛋白成分的细胞附着基质的微载体上；并在适宜所述MSC细胞生长和扩增的条件下、在支持所述细胞生长的无血清培养基中培养MSC。
本发明还涉及用于在悬浮液中体外大规模培养干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括一个或多个容器，其中第一容器包含可在其中培养干细胞的无血清介质；第二容器包含无异种蛋白成分的细胞附着基质；和干细胞。
本发明还涉及上述方法获得的MSC的用途，或获自MSC的重组蛋白质的用途；或获自干细胞的有益因子的用途，其均用于治疗特定疾病病症。
附图说明
图1：使用无血清和无异种蛋白成分（SF和XF）系统的微载体上的细胞生长动力学。基于无血清（SF）微载体的MSC扩增通过使用MSC SFM无异种蛋白成分（XF）介质进行（见实施例）。图1A和1B显示了在含有10％FBS的介质中培养的MSC，以及图1C和1D显示在MSC SFM无异种蛋白成分（XF）介质中培养的MSC。在100ml转瓶中，在MSC SFM无异种蛋白成分（XF）介质中观察到约15倍的MSC细胞扩增（也见图1E的图）。
图2：来自用MSC SFM无异种蛋白成分（XF）介质运行的DasGIP生物反应器的结果。MSC细胞以37,500个细胞/ml接种在400ml体积的SFM/XF介质中，在购自Invitrogen的包被有CELLStartTM的SoloHill125微米塑料珠上生长。每隔一天进行50％的介质更换。图2A显示第1天的珠上的细胞，和图2B显示第9天的珠上的细胞。对于DasGIP（DG珠）生物反应器的运行，细胞生长显示于图2C中。如图2D可见，第5天（120小时）的细胞数目倍增是显著的，到第7天（168小时）是急剧的6000倍增，并在第12天（288小时）继续增加。
图3：生长在MSC SFM无异种蛋白成分（XF）介质中的微载体上的骨髓MSC的介质消耗分析。图3A显示在5-11天之间葡萄糖被迅速消耗。每2-3天更换50％介质。图3B显示在3-11天之间乳酸相应迅速积累。
图4：采用细胞染色方法的生物反应器扩增后的MSC细胞的功能分析。图4A-C：用于脂肪细胞染色的60％异丙醇中的0.5％油红O溶液染色。4A：在微载体培养之前，生长在含有10％MSC级FBS的DMEM介质中的MSC；4B：在微载体培养之后，含有10％MSC级FBS的DMEM介质；4C：MSC SFM无异种蛋白成分介质微载体生长培养显示出可比较的脂肪形成分化。图4D-F：对于骨生成，用茜素红染料对细胞进行染色。4D：在微载体培养之前，生长在含有10％MSC级FBS的DMEM介质中的MSC；4E：在微载体培养之后，含有10％MSC级FBS的DMEM介质；4F：MSC SFM无异种蛋白成分介质微载体生长培养显示出可比较的骨生成分化。
图5：如图1中所示的使用含血清的介质（含有10％FBS的DMEM）在微载体上的细胞生长动力学的比较数据。
图6：采用流式细胞术的来自二维组织培养板和微载体培养的MSC的部分特征。这里显示的是二维和微载体培养中阳性MSC细胞表面标志物CD90的表达（克隆5E10）。
图7：二维培养中人骨髓MSC细胞培养的比较。图A和C：生长于MSC SFM无异种蛋白成分（XF）介质中的细胞（分别为传代1次和传代9次）。图B和D：生长在含有10％MSC级FBS的DMEM介质中的细胞（分别为传代1次和传代9次）。图7E显示在含有FBS或在XF条件下生长于二维和微载体培养中的细胞的可比较的群体倍增。
具体实施方式
本发明涉及用于在无血清和无异种蛋白成分条件下在大规模培养中培养干细胞，如MSC，的组合物和方法。本申请中的大多实施方式和实施例涉及使用MSC细胞培养用于细胞培养中大规模、无血清和无异种蛋白成分的扩增。然而，如本领域技术人员可以认识到，本发明的教导可被应用到多种细胞，包括其它已知的干细胞和干细胞系。本领域技术人员知道如何通过使用相应的无血清和无异种蛋白成分培养基来实施本发明，或培养特定的干细胞（包括MSCS、ESC等）。因此，除了MSC，本发明的组合物和方法可适用于其它干细胞，包括但不限于ES或ESC（胚胎干细胞）、ADSC（脂肪细胞干细胞）、神经干细胞、iPSC（诱导性多能干细胞）、人胚胎干细胞（hESC）、非人类灵长类ES细胞等。
间充质干细胞（MSC）是示例性的干细胞，其是多能中胚层衍生的祖细胞。它们有分化成多种细胞类型的能力，包括但不限于，脂肪或脂肪细胞（脂肪细胞）、骨（骨细胞）、软骨（软骨细胞）、肌腱（肌腱细胞）或肌肉组织（成肌细胞）等，其呈现出开发基于细胞的疗法的宽广潜能。成人间充质干细胞可以从骨髓间质（stroma）中分离，或从其它来源分离，包括但不限于血液、皮肤、脐带血和软骨膜。因此，MSC可替代地称为骨髓间质干细胞或骨骼干细胞。
间充质干细胞可以分化（transdifferentiate）为其它谱系的细胞，包括但不限于神经、肝、内皮细胞等。
MSC可用于骨、软骨、半月板或心肌组织等的多种受损组织或病症的修复或再生。一些研究者已经在多种动物疾病模型中使用MSC用于移植并取得令人鼓舞的结果，所述疾病包括但不限于成骨不全症、脊髓损伤、骨髓移植、心肌梗塞、缺血性中风等，以及近期地，各种免疫疾病。MSC已经与免疫疾病，包括但不限于涉及炎症的病症、上皮损伤、牛皮癣或过敏性反应、自身免疫性疾病、关节炎、发炎的创口、斑秃（Alopecia Areata）（秃头）、包括牙龈炎和牙周炎的牙周疾病以及其它疾病的治疗有关。
间充质干细胞标志物：可通过特定的标志物鉴定未分化的间充质干细胞，其可以用独特的单克隆抗体被鉴定。未分化的间充质干细胞标志物包括但不限于细胞内标志物，如核干因子（nucleostemin），以及细胞表面标志物，包括但不限于骨形态发生蛋白（BMPR）、内皮因子（Endoglin）、干细胞因子受体（SCF R）、STRO-1、CD90等。
间充质干细胞可获自包括自体的（个体自己的）或同种异体的（来自匹配供体的干细胞）来源的来源的谱。
此处提供的是涉及在大规模、无血清和无异种蛋白成分（没有来自除了干细胞来源的动物物种以外任何动物的物质）系统中、在微载体上、在任何合适的细胞培养容器中（比如组织培养瓶中，或优选地在可以大规模培养MSC的容器中，比如生物反应器中）培养干细胞（如MSC）的方法和组合物。在传统的搅拌罐生物反应器中基于微载体的培养系统具有产生大量细胞的潜能，其足以生产成千上万的MSC细胞或MSC细胞产品的剂量。用于生产大量细胞的相关规模放大的方案等会降低生产细胞产品的成本和时间。这将使得能够大规模制造细胞疗法产品，以供临床使用。
高密度培养临床级MSC要求无血清的培养条件，因为血清是许多成分的混合物，尽管可以相对较好地确定其特征，批次之间的血清仍可以变化。此外，血清包含可以导致干细胞分化的因子，从而导致其干细胞特征（干性）的丢失。这些高密度的、临床级的MSC培养物的产生还要求无异种蛋白成分的培养条件。例如，常用的动物蛋白质如白蛋白胶原蛋白在无异种蛋白成分的条件下不能用于将细胞附着至组织培养瓶或微载体上；只可以使用人源蛋白质。此外，正在开发支持长时间MSC增殖同时保持MSC身份以满足本领域需求的新型干细胞AOF（无动物源）介质和补料（feeds）（如，StemPro高效补料）。
可用于这些临床相关系统的培养中的一种工具将是简单的、确定的细胞（如，干细胞）基质（matrix），其具有有用的特征，这些特征接近或优选地改善和/或增加微载体上的细胞数目，从而增加了细胞产品成千上万的剂量的生产。通过联合某些介质，这种基质可用于例如产生确定的、无血清和/或无异种蛋白成分的干细胞培养物。这样的基质也可以用于其它细胞类型。例如，当与基质接触时表现出增强的生长特征的非干细胞。
根据本发明的一个方面，系统的方法和组合物使用微载体。“微载体”是指微载体珠，其中待培养的细胞培养在细胞培养容器（如细胞培养瓶、组织培养皿或生物反应器）内的微载体珠的表面上。在微载体培养中，细胞可以在小球表面上以单层的形式生长，或在珠中的大孔结构的孔内以多层的形式生长。微载体通常通过温和搅拌悬浮于培养基中。通过在简单悬浮培养中使用微载体，流化或固定床系统可产生高达每毫升2亿个细胞。示例性微载体珠包括但不仅限于Solohill珠、玻璃珠、微载体珠、等。
微载体珠可以是未包被的或包被有各种涂层，例如重组蛋白涂层、动物蛋白涂层（例如，胶原蛋白、明胶、荷电明胶等），其对待培养的细胞类型是具体的。对于培养也可用无蛋白微载体，例如玻璃、塑料、等。在一个优选的实施方式中，微载体珠包被有CELLStartTM（Invitrogen公司），其是用于人胚胎干细胞、间充质干细胞和神经干细胞附着和扩增的专用的、无异种蛋白成分、人源的基质。
在本发明的另一方面中，合适的细胞容器用于将微载体保持在悬浮液中以便细胞生长。合适的细胞培养容器可以包括但不仅限于生物反应器（例如DasGIP生物反应器），其包括采用温和搅拌来提供微载体的均匀悬浮的装置，并允许气体和培养基的充分交换。不稳定的搅拌运动是不可取的，因为它可导致圆细胞（rounded cell）（如来自微载体的有丝分裂细胞）的细胞脱落。培养容器的形状和搅拌机件可经过设计来防止培养容器任何部分中的微载体沉降。在一个实施方式中，优选带有略圆的底部的细胞培养容器。
在一些实施方式中，可以使用受控的生物反应器。可以根据干细胞的生长而进行控制的一些示例性条件是，pH（从约6.5至7.5，更优选从约7.0至7.5，最优选pH为7.2等）；主动泵送的（actively pumped）CO2（从约3-10％，优选从约5-8％，更优选约5％等）；温度（从约30℃至40℃，更优选约37℃）；搅拌（从约30-45rpm，更优选约40rpm）；溶解的O2（从约3％到20％大气O2，更优选约5％到20％大气O2，最优选约20％大气O2）。在优选的实施方案中，SF和XF MSC培养物生长在受控的生物反应器中，pH7.2、5％主动泵送的CO2、37℃、以40rpm搅拌、20％大气溶解O2。由于介质中自动调整pH的缓冲液是本领域众所周知的，如碳酸氢钠，因此介质的pH可以被保持。
在一些实施方式中，合适的细胞培养试剂可包括任何适用于细胞培养、生长、增殖的试剂，包括基础的无血清无异种蛋白成分的介质、再造（reconstituted）介质、无异种蛋白成分的介质补充剂、维生素、无异种蛋白成分的生长因子等。
当试图将粘附细胞类型规模放大时，至少有三种选择：1）改变细胞使其生长于悬浮液中，2）通过多个平行的小规模培养进行横向扩展（Scale-Out），或3）在相同体积内产生更大的表面积。改变细胞使其生长于悬浮液中是可能的，但可能会改变细胞的特征和/或功能，并需要针对每种细胞类型进行重新工程改造。横向扩展也是可能的，但是由于空间和成本上的考虑而不允许规模的经济节约并最终变得不切实际。然而，通过基于微载体的系统为粘附细胞培养的规模放大创造环境可避免这些缺点中的一个或多个，并可能提供一种成本低的、遵守监管的用来大规模扩增用于治疗目的的粘附细胞类型的方法。对于细胞比如MSC和ADSC，这种过程不仅包括微载体和方法，还潜在包括对介质和试剂的改变以便允许它们培养高密度的培养物，从载体除去并纯化细胞的系统，以及确保细胞的遗传和表型稳定性同时保持增殖潜能。
通过上述无血清和无异种蛋白成分条件获得的干细胞可有许多用途，例如用于疾病病症的治疗，或用于其它下游治疗用途包括但不限于干细胞疗法，或产品生产，比如获自本发明干细胞的有益因子。源自细胞的“有益因子”包括但不限于重组蛋白质、生长因子、伤口愈合促进因子或分泌物、细胞因子、基质成分、细胞附着因子等。
与MSC的用途一致，还提供了治疗动物疾病或病症的方法。该方法包括向动物施用治疗动物疾病或病症的有效量的间充质干细胞。要做到这一点，以有效的量施用间充质干细胞来治疗或缓解疾病或病症。因此，施用间充质干细胞的量可以从约1×105细胞/kg至约1×107细胞/kg。在另一个实施方式中，施用间充质干细胞的量是从约1×106细胞/kg至约5×106细胞/kg。待施用的间充质干细胞的量可取决于多种因素，包括待治疗的个体/患者的年龄、体重、性别以及疾病或病症的严重程度或严重性。
间充质干细胞可以和可接受的药用载体联合施用。例如，间充质干细胞可以在药学上可接受的用于注射或局部应用的液体介质或凝胶中以细胞悬浮液的形式来施用。
本领域技术人员还将知道，间充质干细胞可通过各种程序来施用，例如全身性的，比如通过静脉内、动脉内或通过腹膜内施用。
应当理解，虽然通过各种示例性实施方式详细描述了本教导，它不应该被认为局限于此，因为在不背离所附权利要求的广泛范围下的众多改变是可能的。
下面的具体实施例将被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。没有进一步阐述，相信本领域技术人员可以根据此处的描述，将本发明利用到其最大程度。此处引用的所有出版物的全部内容通过引用并入此处。另外，以下提出的任何机制不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实施例
实施例1：在搅拌罐系统中的MSC的生长和扩增：转瓶（100毫升）和DasGIP生物反应器（400毫升）。
利用人骨髓来源的MSC来观察细胞从传统二维培养到三维培养的适应性。此处显示的是搅拌罐系统（小规模转瓶以及在500ml生物反应器中）中微载体上的人骨髓来源MSC的生长数据，使用了友好监管（regulatory-friendly）的无异种蛋白成分的介质和试剂。
进行初步研究以评价MSC SFM无异种蛋白成分介质（Invitrogen，cat.A10675-01）支持MSC在微载体上扩增的能力。根据使用含血清的系统（由生物技术与生物工程研究所（Institute forBiotechnology and Bioengineering,IBB）的Cabral小组馈赠，葡萄牙里斯本Avenida Rovisco Pais）的MSC生长规程对XF细胞培养规程进行了内部调整。MSC细胞生长在预先包被有无异种蛋白成分的附着因子CELLStartTM（Invitrogen，cat.A1014201）的SoloHill125微米塑料珠上（SoloHill Engineering Inc.,cat.P102-1521）。以25,000细胞/ml接种细胞。细胞培养物起始于100ml转瓶中（来自Bellco Glass,Inc.的转瓶，带有90°桨（通用桨）和磁力搅拌棒）并且生长与传统细胞培养基（DMEM+10％FBS）进行比较。每2-3天补充50％完全介质。图1A、1B、1C和1D描述了这些超过14天的分析的结果，生长在微载体上的骨髓来源MSC至少和生长在二维培养中的细胞是不相上下的。使用无动物源性的分离试剂TrypLE（Invitrogen，cat.12604039）从微载体收获细胞。使用台盼蓝排除法并使用ViCell计数器确定细胞数目和活力。和小规模转瓶系统中的DMEM+FBS对照介质相比，XF配方中的细胞扩增约是15倍（图1E）。
在500毫升DasGIP搅拌罐生物反应器（400毫升工作体积）中，使用相同的预先包被有无异种蛋白成分的附着因子CELLStartTM的SoloHill塑料微载体珠以及MSC SFM无异种蛋白成分介质验证上述小规模实验。过程参数控制如下：pH-7.2、主动泵送的二氧化碳在5％、温度-37℃、以40rpm搅拌、受控的溶解氧（大气或20％）。每2-3天给培养物补充50％的新鲜介质。如图2A-D所示，无异种蛋白成分介质使得细胞扩增能够从37,500细胞/ml的初始接种密度到达约262,000细胞/ml。这表示，对于生物反应器运行而言，总共～105百万个细胞。该数据显示，在生物反应器中使用XF介质和微载体系统，使用无血清微载体扩增MSC的可行性。还核实了更进一步的大规模体积。
实施例2：扩增后MSC细胞的功能分析（细胞染色方法来自Chase等人，Stem Cell Research&Therapy2010,1:8）
进一步分析了MSC细胞的细胞生长动力学、细胞表型、葡萄糖消耗的介质消耗分析以及乳酸生产（分别为图3A和3B），以及生物反应器中培养后功能性。第5-11天之间葡萄糖被迅速消耗。介质更换或葡萄糖补充是必要的。通过其沿着特定分化通路（例如成骨、成软骨（chondrogenic）或成脂谱系）进行分化的能力测量所获得的MSC的这些特征。
为了评价这一点，使用无动物源性分离试剂TrypLE（Invitrogen，cat.12604039）从微载体收获细胞。将MSC设置于对于成骨、成软骨和成脂分化而言标准的培养条件下。根据制造商的规程将细胞接种于12孔板中，并使用商业可获得的试剂盒（Invitrogen，人间充质干细胞(hMSC)分化试剂盒：骨生成试剂盒cat.A10072-01；脂肪生成试剂盒cat.A10070-01）进行诱导而沿着脂肪生成和骨生成通路进行分化。分化过程中，每3-4天进行完全介质的更换。14天之后，通过使用谱系特异性生物染料监测培养物的分化（图4，A-F）。染色后，用0.1N HCl洗涤培养物并观察。为了监测成脂分化，用油红O（Sigma）（60％异丙醇中的0.5％油红O溶液）染培养物，用蒸馏水洗涤，并观察（图4，A-C）。对于成软骨分化，用4％甲醛固定微团（micromass）颗粒培养物，并用1％阿尔辛蓝（Alcian Blue）（Sigma）染色（未显示）。对于骨生成，21天分化条件之后，用茜素红染料染细胞（图4，D-F）。从生物反应器收获的MSC分化为成骨、成软骨和成脂谱系，并在微载体上稳定了14天（2周）。
实施例3：采用流式细胞术的来自二维和微载体培养的MSC的部分特征（规程来自Chase等人，Stem Cell Research&Therapy2010,1:8）
使用TrypLETMExpress（Invitrogen）收获微载体培养或组织培养板（二维）上的、在含血清介质（SCM）或无血清介质（SFM）中扩增的MSC，用补充有5％FBS的DPBS（无Ca2+/Mg2+）进行洗涤，并用以下抗体染色：CD11b（非缀合的，克隆VIM12）、CD34-APC（克隆581）、CD45-AF405（克隆HI30）、CD44-PE（克隆MEM-85）、CD105-APC（克隆SN6）（均来自Invitrogen）；CD90（克隆5E10）-阳性MSC细胞表面标志物（图6中所示）、CD73-PE（克隆AD2）（二者都来自BD Biosciences）；并且其中使用未缀合的第一抗体的，使用488抗-小鼠抗体（Invitrogen）。为了设置背景荧光水平，使用未染色的和/或匹配的同种型对照。
这些数据表明，使用微载体大规模培养MSC样细胞是可行的、成本有效的并可以在封闭系统中进行，具有更高程度的过程控制和最小的空间占用。在无异种蛋白成分条件下的微载体扩增是传统二维细胞培养方法的可行替代。无动物源性微载体系统（包括没有人类蛋白质的情况）的进一步开发正在进行过程中。此外，特异性MSC生长因子和营养补料浓缩物可以纳入生物反应器系统中来提供高效的流加式（fed-batch）生产模式。

Claims (8)

1.一种培养间充质干细胞的方法，其包括：
在适宜所述间充质干细胞生长和扩增的受控条件下、在无血清的间充质细胞培养基中的包被有无异种蛋白成分的细胞附着基质的微载体珠上悬浮培养间充质干细胞，
其中所述间充质干细胞培养于6.5至7.5的pH、3％至10％的CO2、30℃至40℃的温度、以30至45rpm进行搅拌以及3％至20％的溶解氧。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞附着基质是CELLStartTM。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞是脂肪细胞来源的干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞源自自体或同种异体供体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞获自骨髓、血液、皮肤、脐带血或软骨膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其中受控条件是：
pH为7.2、
5％主动泵送的CO2、
温度为37℃、
以40rpm搅拌、
溶解O2为20％大气压力。
7.一种获自权利要求1所述方法的间充质干细胞。
8.权利要求7的间充质干细胞在制备用于治疗疾病病症的药物中的用途。
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