CN104611292B - 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，选择非酶消化法(TrypLE)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤，并选择1.3×10⁴个/cm²最佳接种密度培养细胞，使用无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)，并在培养基中加入合适浓度的EGF,在φ15cm的培养皿中进行大规模的培养。进而将脂肪间充质干细胞的传代次数提高至15代以上仍然能保持原来的干性。从而大大满足间充质干细胞在科学研究与应用上的需求。

Description

一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，具体地涉及一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法。

背景技术

干细胞(stem cells)不同于成熟细胞首先是因为它能够在长时间内保持自我更新和扩增的能力，其次干细胞能够向多种细胞系分化。干细胞的这些特点使其成为良好的种子细胞来源。其中，间充质来源的成体多能干细胞(MSC)，具有取材方便体外培养容易的优点，已成为多种临床细胞疗法最可行的细胞来源之一。脂肪间充质干细胞(ADSC)是存在于脂肪组织中的干细胞，具有多向分化的潜能。2001年，脂肪间充质干细胞首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得，与骨髓等的间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞来源更丰富易得，这使其已成为组织工程中种子细胞研究的热点。

脂肪间充质干细胞传代培养多采用低糖培养基L-DMEM，混合培养基DMEMF-12，培养液中添加双抗，采用较高的接种密度，细胞融合仍需要约5到7天时间。细胞状态增殖能力最佳的代次一般在P3代。最新研究显示，从脂肪组织中可以分离、培养得到间充质干细胞，通过鉴定其生物特征，可知其具有很强的增殖分化能力，免疫原性低。

目前脂肪间充质干细胞的分离与传代大规模培养中，在细胞传代过程中使用胰酶进行细胞消化，对细胞损伤太大，导致传代细胞容易衰老死亡。使用含血清培养基培养影响细胞培养的稳定性。而接种密度按照1：3～1：5来接种细胞，在大规模培养及传代中，这会增加工作量，无法一次收集大量均一的细胞。目前传统的传代技术将脂肪干细胞的应用代数限制在6代以内，大大的限制了脂肪干细胞的应用。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明结合非酶消化法(TrypLE)，去除了酶解对于细胞的损伤作用，选择最佳的传代接种密度，使用无血清培养基，并在其中添加合适的生长因子，进而将脂肪间充质干细胞的传代次数提高至15代以上仍然能保持原来的干性。从而大大满足间充质干细胞在科学研究与应用上的需求。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，包括以下步骤：

1)待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80-90％，吸去细胞培养皿中培养液，向每个培养皿内加PBS进行清洗后，吸去培养皿中的PBS；

2)消化：在培养皿加入tryplE，转移至CO₂培养箱孵育1-2min后，加入无血清培养基，用巴氏吸管反复吹打10-15次，待80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；

3)离心：将步骤2得到的细胞悬液转移至离心管中，1000rpm/min离心5min；

4)计数：离心结束后，弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，取20μl细胞悬液用细胞计数仪计数；

5)铺板及培养：将细胞悬液接种到细胞培养皿中，调整细胞密度为1.3×10⁴个/cm²,加入无血清培养基，无血清培养基中添加EGF，EGF的浓度为10ng/ml，转移至CO₂细胞培养箱中进行培养。

步骤1)所述PBS是沿着培养皿壁加入，不得直接冲洗培养皿底部；

步骤1)所述清洗是加入PBS后培养皿要前后、左右晃动大于10次。

步骤2)所述tryplE的用量为培养基总体积一半以内，最低用量为达到覆盖培养皿底部。

所述tryplE的用量为在φ10cm培养皿中加入2ml的tryplE或者在φ15cm培养皿中加入3ml的tryplE。

步骤2)所述无血清培养基的用量等于或者大于(tryplE)用量。

步骤2)所述无血清培养基的用量为在φ10cm的培养皿中加入3ml的无血清培养基或者在φ15cm的培养皿中加入5ml的无血清培养基。

无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM(Lonza)。

步骤4)所述无血清培养基的用量为5ml。

步骤4)所述细胞悬液计数前首先与0.4％的台盼蓝染色液按照1：1混合，染色后1h内计数。

在步骤2)，镜下观察细胞消化情况，待80-90％细胞不再贴壁，可以进行终止消化。

步骤5)所述无血清培养基的加入量为10ml或者15ml。

现有技术传代过程中存在的缺点：

(1)胰酶：传代过程中使用0.5％-0.125％胰酶消化细胞，通常不能准确根据细胞生长活力状态来选择胰酶浓度及作用时间(1min-5min)，常会超过一定程度而导致细胞传代后不能贴壁或者死亡，对细胞损伤过大，细胞增殖力下降。当细胞连续传代多次，则会出现细胞老化死亡现象。

(2)接种密度：按照1：3～1：5的细胞密度接种细胞，满足小规模的细胞培养，在操作中可行，而在大规模细胞培养中，无法准确确定细胞密度，细胞生长无法同步，细胞传代时间不统一，增加工作量，无法大量收集同一批次细胞。

(3)含血清培养基:血清对细胞的具有潜在毒性作用和血清源性污染。

本发明在细胞传代培养中，选择非酶消化法(TrypLE)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤，并选择1.3×10⁴个/cm²最佳接种密度培养细胞，使用无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)，并在培养基中加入合适浓度的EGF(10ng/ml),在φ15cm的培养皿中进行大规模的培养。

与现有技术相比，本发明具有的优点及有益效果：

(1)本发明培养细胞形态良好，呈现梭形，簇团性生长趋势。

(2)本发明培养的细胞活性高,细胞经细胞计数仪鉴定，细胞活力达到90％以上，符合细胞传代及储存条件。

(3)本发明培养的细胞增殖快，收获细胞数量大。2.5～3.5天即可长至80～90％。细胞培养皿收获的细胞总数可到3～4×10⁶,细胞培养皿收获细胞可达6～8×10^6.

(4)脂肪干细胞能够长期进行传代，15代之后仍然保持完整的干性，不出现衰老迹象。

为了实现(1)、(2)优点，本发明在细胞传代培养中，选择非酶消化法(TrypLE)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤。

为了实现(3)、(4)优点，本发明选择1.3×10⁴个/cm²的最佳接种密度培养细胞，在φ10cm(或φ15cm)的培养皿中进行大规模的培养，并在无血清培养基中添加合适浓度(10ng/ml)的EGF。

附图说明

图1为传统法与无酶法细胞形态对比；A为传统法第1代、第6代MSCs细胞(100×)；B为无酶法第1、6、15代MSCs细胞(100×)；

图2传统法与无酶法细胞增殖曲线；

图3为第1代细胞表面标记物流式检测结果；

图4为第6代细胞表面标记物流式检测结果；

图5为第15代细胞表面标记物流式检测结果；

图6为第15代细胞成脂分化；

图7为脂肪间充质干细胞成骨诱导后细胞形态变化(×100)。

图8为不同接种密度增殖曲线图。

具体实施方式

术语解释：

胰酶：0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA(是质量/体积百分数)

PBS:磷酸缓冲液

EGF:上皮生长因子

ADMSC:脂肪间充质干细胞

IBMX：3-异丁基-1-甲基化黄嘌呤

实施例1

待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80％，用移液管吸去φ10cm细胞培养皿中培养液，加入10ml PBS清洗2次，加入2ml TrypLE消化贴壁细胞，镜下观察细胞消化情况，待细胞基本不再贴壁后，加入3ml无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)终止消化，细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm/min离心5min，去上清液，用10ml无血清培养基重悬细胞，取20μl细胞悬液，用Countstar自动细胞计数仪获得细胞总数与细胞活性信息。将细胞悬液以1.3×10⁴个/cm²细胞密度接种到φ15cm细胞培养皿(无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM))中，加入15ml含有10ng/ml EGF的无血清培养基(UltraCULTUREMEDIUM)，在培养皿盖上做好标记，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中进行培养。

对比例1：

待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80％，用移液管吸去φ10cm细胞培养皿中培养液，加入10ml PBS清洗2次，加入2ml、胰酶消化贴壁细胞，镜下观察细胞消化情况，待细胞基本不再贴壁后，加入3ml完全培养基终止消化，细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm/min离心5min，去上清液，用10ml完全培养基(含10％FBS)重悬细胞，取20μl细胞悬液，通过细胞计数板计算细胞总数与细胞活率。将细胞悬液按照1：3的比例接种到φ10cm细胞培养皿中，加入10ml的无血清培养基，在培养皿盖上做好标记，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中进行培养。

细胞形态照片(P1、P6、P15传统法与无酶法对比)

将脂肪间充质干细胞进行分离后，获得P0代细胞，按照本发明无酶法进行传代，以传统酶解消化细胞的方法作为对照。连续传代，在光学显微镜下观察第1代、第6代、第15代细胞生长形态。

图1结果显示：培养过程中，发现通过无酶法，细胞形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，传代至15代以上，其形态及生长特点亦无明显改变。而对比例1(图中以A代表)中传统酶解消化细胞传代方法，在第6代后细胞形态发生改变，增殖速率降低。并且无法传代至15代。

实施例2：细胞增殖曲线(传统法、无酶法)

待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到90％，用移液管吸去φ15cm细胞培养皿中培养液，加入10ml PBS清洗2次，加入3ml非酶TrypLE消化贴壁细胞，镜下观察细胞消化情况，待细胞基本不再贴壁后，加入5ml无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)终止消化，细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm/min离心5min，去上清液，用15ml无血清培养基重悬细胞，取20μl细胞悬液，用Countstar自动细胞计数仪获得细胞总数与细胞活性信息。将细胞悬液以1.3×10⁴个/cm²细胞密度接种到φ15cm细胞培养皿中，加入15ml含有10ng/mlEGF的无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)，在培养皿盖上做好标记，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中进行培养。

分别取通过无酶法传代的第3代脂肪间充质干细胞，及用对比例1传统法得到的第3代脂肪间充质干细胞，按照2×10⁴细胞/孔接种于24孔板中，分别每隔48h消化收集3孔细胞，用0.4％的台盼蓝染色计数活细胞数量，算出平均值，绘制两者细胞生长曲线。

结果：图2结果显示可知无酶法得到的细胞倍增时间为明显优于传统法传代的细胞。实施例3：细胞表面标记物检测(P1、P6、P15)

(1)实施例1培养方法培养细胞，分别取第1、6、15代细胞，用流式细胞仪检测不同代数之间的细胞表面标志。分别消化收集细胞，计数后每个批次取4×10⁶个细胞，分装4管；染色缓冲液洗1次，200g离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD45、CD59、CD90及HLA-DRA抗体各10μl，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1500rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500ul的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。

结果：由图3、图4、图5分析可知，观察到第1、6、15代的细胞的表面标记物没有明显改变。造血细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时CD59、CD90均呈现阳性。第三代以后的脂肪间充质干细胞，细胞形态均一，纯度在90％以上。

实施例4：P15代细胞成脂分化实验

用实施例1方法将细胞培养至第14代时，按照5×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入无血清培养基，放置37℃、5％CO₂培养箱培养。待细胞生长汇合度至80-90％左右，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mMIBMX、1uM地塞米松、100uM吲哚美辛、5ug/ml胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等，每三天换液。三周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，如图7所示。

结果：由图6结果显示可知，培养三周后，镜下观察脂肪间充质干细胞经过油红O染色后，约90％的细胞富含脂肪滴，说明间充质干细胞依然可以具有诱导分化为脂肪细胞的能力。

实施例5：P15代细胞成骨试验

用实施例1培养方法将细胞培养至第14代进行传代时，按照5×10³细胞/cm²接种于明胶涂层的六孔板中，加入无血清培养基，放置37℃、5％CO₂培养箱培养。待细胞生长汇合度至90％左右，加入成骨诱导培养基进行培养。成骨诱导培养基包括：基础培养基DMEM/F12、10％胎牛血清、50μM抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油、0.1uM地塞米松。每2-3天换液，细胞在2-3周后进行固定及茜素红染色。

结果：由图7结果显示可知，第15代间充质干细胞形在体外成骨诱导分化过程中，在诱导后第7d开始由长梭形变为多角形,继而复层生长，2周左右形成散在的细胞结节，以后出现钙盐沉着,结节中央逐渐变浓,直至不透光，三周时可见明显的矿化结节(图B)，用茜素红染色可将其形成的钙结节染成红色(图C)。而对照组(A)细胞形态不变仍为长梭形。

实施例6：对比不同接种密度对细胞生长数目的影响；

将脂肪干细胞第3代细胞按照本发明细胞消化收集的方法收集细胞，并按照0.5×10⁴个/cm²、0.75×10⁴个/cm²、1×10⁴个/cm²、1.1×10⁴个/cm²、1.2×10⁴个/cm²、1.3×10⁴个/cm²、1.4×10⁴个/cm²、1.5×10⁴个/cm²；1.75×10⁴个/cm²、2×10⁴个/cm²；2.25×10⁴个/cm²、2.5×10⁴个/cm²细胞密度分别接种于φ10cm的培养皿中，用无血清培养基培养，转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中进行培养72h，计数细胞数目。

结果：如图8所示，可知细胞密度为1.3×10⁴个/cm²组增殖倍数远远优于其它组，取得了预料不到的技术效果。因此可知细胞密度在1.3×10⁴个/cm²是最合适的。

Claims (7)

1.一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80-90％，吸去细胞培养皿中培养液，向每个培养皿内加PBS进行清洗后，吸去培养皿中的PBS；

2)消化：在培养皿加入tryplE，转移至CO₂培养箱孵育1-2min后，加入无血清培养基，用巴氏吸管反复吹打10-15次，待80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；

3)离心：将步骤2)得到的细胞悬液转移至离心管中，1000rpm/min离心5min；

4)计数：离心结束后，弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到细胞悬液，取20μl用细胞计数仪计数；

5)铺板及培养：将步骤4)的细胞悬液接种到无血清培养基中，调整细胞密度为1.3×10⁴个/cm²，加入无血清培养基，无血清培养基中添加EGF，EGF的浓度为10ng/ml，转移至CO₂细胞培养箱中进行培养；

其中，所述步骤2)中tryplE的用量为在φ10cm培养皿加入的2ml的tryplE或者在φ15cm培养皿加入3ml的tryplE，且所述步骤2)中无血清培养基的用量大于或等于tryplE的用量。

2.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤1)所述PBS是沿着培养皿壁加入，不得直接冲洗培养皿底部；

步骤1)所述清洗是加入PBS后培养皿要前后、左右晃动大于10次。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤2)所述无血清培养基的用量为在φ10cm的培养皿中加入3ml的无血清培养基或者在φ15cm的培养皿中加入5ml的无血清培养基。

4.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM。

5.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤4)所述无血清培养基的用量为5ml。

6.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤4)所述细胞悬液计数前首先与0.4％的台盼蓝染色液按照体积比1:1混合，染色后1h内计数。

7.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤5)所述加入无血清培养基与EGF后，要前后和左右晃动培养皿混匀5-10次。