CN105039248B - 树鼩骨髓间充质干细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种树鼩骨髓间充质干细胞培养系统，通过使用成分明确的培养系统，并且提供特定的营养成分，和添加相关的小分子化合物等，维持细胞的多向分化潜能，可以在体外获取和培养高纯度的树鼩骨髓间充质干细胞，满足体内体外细胞实验的要求，让骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，低免疫原性，取材方便，扩增迅速，遗传背景稳定等特点，因此在组织工程和细胞及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。该树鼩骨髓间充质干细胞完全培养液的使用，为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。

Description

树鼩骨髓间充质干细胞培养系统

技术领域

本发明涉及一种树鼩骨髓间充质干细胞培养系统，特别是一种树鼩骨髓间充质干细胞培养系统用完全培养液，该培养体系可以有效维持树鼩 bMSCs 的多向分化潜能，降低体外培养导致的免疫原性，提高干细胞纯度。属于细胞生物学与组织工程领域。

背景技术

骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cell，简称BMSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的另一种重要的成体干细胞，参与构成造血微环境。骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，可诱导分化为脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞和肝细胞等；另外骨髓间充质干细胞，能分泌细胞因子和生长因子，可通过旁分泌和内分泌机制发挥免疫调节作用修复受损的组织器官。同时，骨髓间充质干细胞还具有低免疫原性，取材方便，扩增迅速，遗传背景稳定等特点，因此在组织工程和细胞及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。

BMSCs 最早由Friedenstein 和Petrakova 报道， 1999 年Pittenger统一将这类细胞正式命名为骨髓间充质干细胞，其仅占骨髓内单核细胞的1 /10⁴-1 /10⁵，因此纯化和大量扩增BM-MSCs 使其能作为组织工程的种子细胞，其纯化培养方法显得尤为重要。

目前已从人、猴、犬、兔、羊、猪和大小鼠中分离培养出BMSCs，但是在组织工程和细胞治疗的运用方面仍然存在问题。特别针对不同的实验动物，BMSCs 在形态和反应性上存在种属差异，如体外贴壁生长时，不同种属的BMSCs 细胞形态明显不同，对同样诱导剂的反应不同。因此，为了在体外培养获得不同物种的高纯度、活力强、生物特性均一的骨髓间充质干细胞的BMSCs，需要根据物种的特性，使用特定的完全培养液，进行骨髓间充质干细胞的分离和培养。

树鼩作为一种新型实验动物，近年来在生物医学研究中其应用范围越来越广，针对树鼩BMSCs 的体外培养，开发专门的树鼩骨髓间充质干细胞的完全培养液，维持细胞稳定的形态特征和反应性，以及细胞表面特征性分子，一方面有利于更好地使用树鼩作为实验动物的研究，另一方面，对细胞体内、体外实验至关重要，也有利于开展不同物种间BMSCs的比较生物学研究，促进BMSCs的临床运用。

传统的培养方法是使用小牛或者胎牛等动物来源的血清培养，由于血清的内容物复杂，每个批次的血清质量不均一，导致细胞的状态不稳定或者老化，甚至导致细胞在培养过程里的自发分化和多向分化潜能的丧失。

发明内容

本发明目的之一在于先使用常规的方法分离细胞后（如贴壁分离筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法等），再直接使用该树鼩骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞，可高效促进细胞的贴壁，存活和增值。

本发明的另一目的是，在后续传代过程中，使用树鼩骨髓间充质干细胞完全培养液，满足干细胞的营养需求，可以维持和控制骨髓间充质干细胞形态稳定，维持细胞多向分化的潜能,纯度高、活力强、生物特性均一。

为了完成本发明目的，本发明树鼩骨髓间充质干细胞培养系统采用以下技术方案：

先使用常规贴壁分离筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法分离细胞后，再直接使用该树鼩骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞，可高效促进细胞的贴壁，存活和增值；然后在后续传代过程中，不使用血清进行细胞培养，使用树鼩骨髓间充质干细胞完全培养液，完全培养液通过添加成分明确的血清替代物，一系列营养物质和小分子，维持树鼩骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞活力，纯度和均一的生物特性；在细胞汇合度达到90%以前，完全培养液每隔一天换液；超过90%以上，进行细胞传代，满足干细胞的营养需求，维持和控制骨髓间充质干细胞形态稳定，维持细胞多向分化的潜能,纯度高、活力强、生物特性均一；

对获得的细胞进行周期检测；特征分子表达量检测；细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；最终肯定培养所得的树鼩骨髓间充质干细胞可长期传代，并仍然维持较高纯度的间充质干细胞，具有较好的多向分化潜能。

使述树鼩间充质干细胞完全培养液的成分包括：

100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 低糖DMDM培养基(Gibco)+15%血清替代物KSR( Gibco) + 10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco)+10mM beta 巯基乙醇 +5ng/ml bFGF+ 15ng/mlEGF +3μM CHIR99021；其中：上述配方中，100U/ml青霉素(Sigma) +100μg/ml链霉素(Sigma) + 低糖DMDM培养基(Gibco)为基础成分；其余为添加成分；以上培养液，可以2-8 °C储存1个月。

对步骤（1）获得的细胞进行周期检测；细胞在第4代，第8代，第12代，第20代消化后收集到1.5ml 离心管中，每个代次收集细胞5x10⁶ 以上，加入70% 的酒精4℃过夜固定后，用PBS洗涤除去酒精，在PI溶液里（PI 0.05mg/ml）重悬细胞，避光4℃ 孵育 30分钟以上，通过流式细胞仪进行细胞周期检测。

对步骤（1）获得的细胞进行特征分子表达量检测；

通过实时荧光定量PCR检测间充质干细胞表达的分子标志物，利用定量的方法比较在新的培养体系和传统培养液中，树鼩间充质干细胞完全培养液第4代，第8代，第12代和第20代的特征分子标记物表达量。分子标志物主要有：CD44，CD29，CD73，CD90，CD106，CD166，CD34和CD45。

对步骤（1）获得的细胞进行细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；

将第12代的树鼩间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测；

成骨分化液：高糖DMEM + 10%FBS + 100 U/mL 青霉素+ 100 μg /mL 链霉素+0.2mM ascorbate-2-phosphate+10mMbeta-glycerophosphate；

茜素红染色鉴定；

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；

③ 去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；

成脂分化液：

高糖DMEM + 10% FBS+ 100 U/mL 青霉素和100 μg /mL 链霉素+ 1μmol /L 地塞米松+ 200μM吲哚美辛+ 0. 01mg /mL 胰岛素+ 0. 5 mmol /L IBMX；

油红染色鉴定

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；

③ 去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④ 弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。

成软骨分化液：

高糖DMEM + 10%FBS + 100 U/mL 青霉素+ 100 μg /mL 链霉素+100nM 地塞米松+10ng/ml TGF-beta3+0.17Mm ascorbate-2-phosphate+1/100 100XITS+

alcian blue 染色鉴定

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；

③ 去固定液，利用alcian blue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④ 弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。

本发明申请基于以往的血清培养方法，添加成分使用血清替代物和一系列的营养物质和小分子，成这完全培养液，实现树鼩骨髓间充质干细胞的体外长期培养和多能性的维持。

本申请完全培养液有其独特优势：①培养液成分明确，性能稳定；②可控均一性，不同批次的培养液性能均一，各培养成分作用明确可控，细胞状态均一，活力好。

附图说明

图1为培养到第20代，用该专利申请的树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞（A），其中细胞呈梭形，形态均一，部分区域出现蜂窝状生长。

图2为传统的培养方法培养细胞（B），其中 细胞拉长或者呈现分叉摊开样生长，形态多样。

图3为用树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞（A）,其中：%S=20.51,%G2=2.85。

图4为传统的培养方法培养细胞（B）,其中： %S=14.04,%G2=6.23。

图5为采用树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞到第16代，分别进行成骨（A），其中茜素红染色,显示矿化结节的形成。

图6为用树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞到第16代，分别进行成软骨（B）；其中成软骨分化，alcian blue染液，蓝色部分显示分化的软骨组织。

图7为用树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞到第16代，分别进行成脂分化（C）：其中C成脂分化，油红染色，显示脂肪滴。

图8为通过CD44的表达量，用该专利申请的树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞与传统的培养液相比图。

具体实施方式

1．本套培养系统中树鼩骨髓间充质干细胞培养液包含的基础成分如下：

100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 低糖DMDM培养基(Gibco)

2．在树鼩骨髓间充质干细胞的完全培养液中，我们新添加成分和浓度范围是：

10%-15%血清替代物KSR( Gibco) + 10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco)+10mM beta巯基乙醇 +5-8ng/ml bFGF+ 15-20ng/mlEGF +3-6μM CHIR99021

以上培养液，可以2-8 °C储存1个月

3, 培养液使用方法：

从树鼩骨髓中分离得到或者已经建系培养的树鼩骨髓间充质干细胞，可以每隔一天进行换液，细胞生长密度达到85%—90%时，进行细胞传代。细胞形态为梭形或三角形，呈蜂窝状生长，树鼩BM-MSCs 生长曲线呈S形，符合正常细胞的生长特性，细菌，真菌，霉菌，支原体和病毒感染检测为阴性。通过向成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞的分化，证实了培养的细胞具有良好的多方向分化潜能。

与以往的树鼩间充质干细胞完全培养液相比，该套新的培养体系，优化的实验参数主要如下：

A,细胞生长形态（见图1和图2）

B，细胞倍增时间：见下表

使用该专利申请的树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞，从P7—P20，平均细胞倍增时间为3-4天，使用传统的培养液进行培养，随着细胞代次的增加，细胞倍增时间

C，细胞周期（见图3和图4）

细胞培养到第16代，进行细胞周期的检测，在新的培养体系下，细胞处于较高比例的S期增值阶段。见图3和图4。

D，多向分化能力（见图5、图6和图7）。

E，骨髓间充质干细胞的特征分子表达

用该专利申请的树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞，在检测的20代细胞内，都正常表达骨髓间充质干细胞的特征分子，包括CD44，CD29，CD73，CD90，CD106，CD166，不表达CD34和CD45。

通过CD44的表达量，与传统的培养液相比，该专利申请的树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞后，CD44 的表达量增高（见图8）。原因是，新完全培养液可以维持高纯度的间充质干细胞，而普通培养液培养后，树鼩间充质干细胞的比例降低。

所以，使用血清替代物和添加特殊的小分子物质，能有效地维持骨髓间充质干细胞的干性，并且提高干细胞的纯度。

实施例1

一、培养P2代树鼩骨髓间充质干细胞，按照1.45×10⁴ – 1.8×10⁴ /cm²接种细胞，使用树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞。

本培养系统中树鼩骨髓间充质干细胞培养液包含的基础成分如下：100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 低糖DMDM培养基(Gibco)

该完全培养液成分包括：100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) +低糖DMDM培养基(Gibco) + 15%血清替代物KSR( Gibco) + 10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco) + 10mM beta 巯基乙醇 + 5ng/ml bFGF + 15ng/mlEGF +3μM CHIR99021，每隔一天更换培养液。

细胞汇合度达到90%以上，进行细胞传代；

二、不进行其他细胞实验时，使用上述同样树鼩间充质干细胞完全培养液培养细胞，隔天换液。

三、细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定

将第12代的树鼩间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测。

成骨分化液：高糖DMEM + 10%FBS + 100U/mL 青霉素+ 100μg /mL 链霉素+0.2mM ascorbate-2-phosphate+10mMbeta-glycerophosphate

茜素红染色鉴定

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；

③ 去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。

成脂分化液：高糖DMEM + 10% FBS+ 100 U/mL 青霉素和100 μg /mL 链霉素+ 1μmol /L 地塞米松+ 200μM吲哚美辛+ 0. 01mg /mL 胰岛素+ 0. 5 mmol /L IBMX；

油红染色鉴定

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；

③ 去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④ 弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。

成软骨分化液：高糖DMEM + 10%FBS + 100 U/mL 青霉素+ 100 μg /mL 链霉素+100nM 地塞米松+10ng/ml TGF-beta3+0.17Mm ascorbate-2-phosphate+1/100 100XITS+alcian blue 染色鉴定

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；

③ 去固定液，利用alcian blue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④ 弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。

实施例2——实施例5

本例培养系统中树鼩骨髓间充质干细胞培养液包含的基础成分和实验步骤都与实施例1相同，但每个实施例2-5中树鼩骨髓间充质干细胞完全培养液的新添加部分成分浓度有所不同，详细如下：

Claims (5)

1.一种树鼩骨髓间充质干细胞培养方法，其特征在于先使用常规贴壁分离筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法分离细胞后，再直接使用树鼩骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞；然后在后续传代过程中，使用树鼩骨髓间充质干细胞完全培养液进行培养，在细胞汇合度达到90%以前，完全培养液每隔一天换液；超过90%以上，进行细胞传代；

所述树鼩骨髓间充质干细胞培养液的基础成分包括：100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+低糖DMDM培养基；

所述完全培养液的成分包括：10%-15%血清替代物KSR +10mM非必需氨基酸NEAA +10mMbeta巯基乙醇+5-8ng/mL bFGF+15-20ng/mL EGF+3-6μM CHIR99021；

对获得的细胞进行周期检测，特征分子表达量检测，细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；最终肯定培养所得的树鼩骨髓间充质干细胞可长期传代，并仍然维持较高纯度的间充质干细胞，具有较好的多向分化潜能。

2.根据权利要求1所述的树鼩骨髓间充质干细胞培养方法，其特征在于所述树鼩间充质干细胞完全培养液的成分包括：100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+低糖DMDM培养基+15%血清替代物KSR +10mM非必需氨基酸NEAA +10mM beta巯基乙醇+5ng/mL bFGF+15ng/mLEGF+3μM CHIR99021；其中：上述配方中，100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+低糖DMDM培养基为基础成分；其余为添加成分；以上培养液可在2-8℃储存1个月。

3.根据权利要求1所述的树鼩骨髓间充质干细胞培养方法，其特征在于对获得的细胞进行周期检测操作如下：细胞在第4代，第8代，第12代，第20代消化后收集到1.5mL离心管中，每个代次收集细胞5×10⁶以上，加入70%的酒精4℃过夜固定后，用PBS洗涤除去酒精，在PI 浓度为0.05mg/mL 的PI溶液里重悬细胞，避光4℃孵育30分钟以上，通过流式细胞仪进行细胞周期检测。

4.根据权利要求1所述的树鼩骨髓间充质干细胞培养方法，其特征在于对获得的细胞进行特征分子表达量检测；通过实时荧光定量PCR检测间充质干细胞表达的分子标志物，利用定量的方法检测树鼩间充质干细胞完全培养液第4代，第8代，第12代和第20代的特征分子标记物表达量，分子标志物主要有：CD44，CD29，CD73，CD90，CD106，CD166，CD34和CD45。

5.根据权利要求1所述的树鼩骨髓间充质干细胞培养方法，其特征在于对获得的细胞进行细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；

将第12代的树鼩间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测；

成骨分化液：高糖DMEM+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+0.2mM ascorbate-2-phosphate+10mM beta-glycerophosphate；

茜素红染色鉴定

①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；

②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；

③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④弃去茜素红染液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；

成脂分化液：高糖DMEM+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素+1μmol/L地塞米松+200μM吲哚美辛+0.01mg/mL胰岛素+0.5mmol/L IBMX；

油红染色鉴定

①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；

②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；

③去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；

成软骨分化液：高糖DMEM+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100nM地塞米松+10ng/mL TGF-beta3+0.17Mm ascorbate-2-phosphate+1/100 100X ITS；

alcianblue染色鉴定

①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；

②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；

③去固定液，利用alcianblue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；

④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。