CN105802906A - 树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用，属于干细胞技术领域。该成骨诱导分化培养基包括如下组分：体积分数为5%‑15%FBS、100‑150U/mL 青霉素、100‑150μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mM β‑甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。采用本发明培养基可以实现树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化，提高了成骨诱导分化的专一性，诱导分化的细胞成骨钙结节丰富，ALP碱性磷酸酶染色率高，成骨诱导分化效率大大提高。

Description

树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用，该培养基可以有效的诱导树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
背景技术
骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcell，BM-MSCs）是一群来源于骨髓组织中的非造血细胞，能够自我更新和可诱导分化为脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞和肝细胞等具有多向分化潜能的细胞。骨髓间充质干细胞能分泌细胞因子和生长因子，可通过旁分泌和内分泌机制发挥免疫调节作用修复受损的组织器官，在组织工程中具有良好的应用前景。
目前已从人、猴、犬、兔、羊和大小鼠中分离培养出骨髓间充质干细胞，但各物种的骨髓间充质干细胞在形态和反应性上存在种属差异，如体外贴壁生长时，不同种属的骨髓间充质干细胞细胞形态明显不同，对同样诱导剂的反应不同。为验证体外培养的树鼩骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能，必须将树鼩骨髓间充质干细胞用成骨诱导培养基进行诱导分化。
树鼩作为一种新型实验动物，近年来在生物医学研究中其应用范围越来越广，对其骨髓间充质干细胞的研究也越来越多，但目前为止还没有针对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的试剂盒。
骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导经典的诱导方法是在培养基中加入维生素C，地塞米松和β-磷酸甘油纳的化学诱导方法，也可以用骨形态蛋白2（BMP-2）的生物诱导方法进行诱导。申请人参考了现有的骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其组成一般为：DMEM/F12培养基，10%FBS，1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素溶液，150μM维生素C，10mMβ-磷酸甘油，10nM地塞米松，同时我们也参考了人、鼠、猪、山羊等物种的诱导配方，均不能很好的将树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导。目前研究者使用猴的成骨诱导试剂盒进行诱导，可以将树鼩骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞，但其诱导效率不理想，亟需开发一种针对树鼩骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化培养基。
现有的间充质干细胞成骨诱导分化培养基存在对树鼩骨髓间充质干细胞诱导效率不理想、成骨诱导分化的专一性不强、无法成功诱导成骨分化的问题。因此如何克服现有技术的不足是目前干细胞技术领域亟需解决的问题。
发明内容
为解决现有的骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基存在对树鼩骨髓间充质干细胞诱导效率不理想、成骨诱导分化的专一性不强、无法成功诱导成骨分化的问题，申请人通过大量试验筛选，最终创新性以DMEM(4500mg/L葡萄糖）为基础培养基的基础上，同时不断调整和优化维生素C，地塞米松和β-磷酸甘油纳的浓度，找到了各个成分最适诱导浓度组合，该培养基很好的将树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化，成骨诱导效率大大提高，该方法价格低廉、使用方便，可以获得大量成骨细胞。同时申请人也找到了使用添加BMP-2组分诱导树鼩骨髓间充质干细胞向成骨诱导的最适浓度，但该方法由于BMP-2价格昂贵，诱导成本高，不适合进行大规模诱导，基于该方法的文章“树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导”已在2014年于中国比较医学杂志发表。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括如下组分：
体积分数为5-15%FBS、100-150U/mL青霉素、100-150μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；
所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
进一步，优选的是树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，包括如下组分：
体积分数为10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
上述树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，
步骤（1），以无水乙醇为溶剂配制1mmol/L地塞米松溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到地塞米松母液；
然后以D-hanks液为溶剂配制1mmol/L维生素C溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到维生素C母液；
之后以D-hanks液为溶剂配制1mol/Lβ-甘油磷酸钠溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到β-甘油磷酸钠母液；
步骤（2），向DMEM培养基中，按所述浓度加入FBS、青霉素、链霉素、地塞米松母液、维生素C母液和β甘油磷酸钠母液，混匀后，于2-8℃保存，即得到树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。
本发明还提供树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基在树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化中的应用，具体方法是对树鼩骨髓间充质干细胞进行培养，待原代细胞生长至细胞90%融合后消化，之后进行传代培养；将培养得到的第3代树鼩骨髓间充质干细胞消化后继续培养至细胞90%融合后，采用上述成骨诱导分化培养基进行诱导。
进一步优选的是，树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导方法包括以下步骤：
步骤（1），取树鼩骨髓间充质干细胞用间充质干细胞培养基在37℃，5%CO2条件下培养，培养72h后更换为新的间充质干细胞培养基，以后每3～4d换一次新的间充质干细胞培养基，待细胞生长至90%融合后，用0.25%胰酶消化，按1:2传代培养；
所述的间充质干细胞培养基为DMEM/F12+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素；
步骤（2），取步骤（1）培养的第三代树鼩骨髓间充质干细胞，用0.25%胰酶消化后，以1x104个/mL接种6孔板，使用间充质干细胞培养基培养细胞贴壁融合至90%后，更换为树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基进行诱导培养，每隔48h更换一次树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，诱导培养18d。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明首次提供了一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，可以实现树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的成骨诱导培养基的空白，提高了诱导分化的专一性，避免了向成脂细胞等其他组织细胞的分化，诱导分化的细胞成骨钙结节丰富，成骨诱导分化效率大大提高，提高了约70%以上。此外，本发明提供的培养基制备方法简单，价格低廉，与使用BMP-2的培养基相比，成本降低90%以上，制得的骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基可以实现稳定、高效的成骨诱导分化。
附图说明
图1是诱导培养基a~e对P3代树鼩骨髓间充质干细胞细胞成骨诱导效果显微镜图，1%茜素红染色，放大倍数为100x；
图2是诱导培养基a~e对P3代树鼩骨髓间充质干细胞细胞成骨诱导效果显微镜图，碱性磷酸酶染色，放大倍数为100x。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明中的各组分均为常规市售产品。
实施例1与对比例
1、骨髓间充质干细胞的原代取材、分离与培养
取成年树鼩，采用颈椎脱臼法处死动物，无菌条件下取出树鼩的双股骨和胫骨，粘膜用碘酒浸泡后移入超净工作台，用生理盐水清洗2遍后，剪去骨头两端，露出骨髓腔。1mL注射器吸取肝素钠并沿骨髓腔吸取骨髓，之后用生理盐水冲洗骨髓腔，反复2次，并将吸取物和冲洗物移入离心管，对倍加入PBS混悬细胞。在离心管中先加入2mL淋巴细胞分离液再沿管壁缓慢加入细胞悬液，室温3500r/min离心30min，取中间层，加入PBS混悬细胞，室温1500r/min离心10min，倒掉上清，用含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素DMEM/F12重悬细胞，吹打混匀后移至25cm2培养瓶中，在37℃，5%CO2条件下培养。
2、骨髓间充质干细胞的传代培养
培养72h后更换为新的间充质干细胞培养基，以后每3～4d换一次新的间充质干细胞培养基，待细胞生长至90%融合后，用0.25%胰酶消化，按1:2传代培养，传至P3代用于树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况。
所述的间充质干细胞培养基为DMEM/F12+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素。
3、成骨诱导培养基配制
用天平准确称量3.92mg地塞米松，加入10mL无水乙醇中，即浓度为1mmol/L，溶解混匀后过膜除菌，-20℃保存。
用天平准确称量0.88mg维生素C，加入5mLD-hanks中，即浓度为1mmol/L，溶解混匀后过膜除菌，-20℃保存。
用天平准确称量1.08gβ-甘油磷酸钠，加入5mLD-hanks中，即浓度为1mol/L，溶解混匀后过膜除菌，-20℃保存。
在基础培养基：DMEM(4500mg/L葡萄糖）+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素基础上按照表1添加组分地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、BMP-2成相应浓度，混匀后，2-8℃保存。
4、树鼩骨髓间充质干细胞成骨细胞诱导
取P3代树鼩骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化后，以1x104个/mL接种6孔板，使用间充质干细胞培养基培养细胞贴壁融合至90%后，使用树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基a~e分别进行诱导，每隔48h换液，诱导18d。
5树鼩骨髓间充质干细胞成骨细胞诱导后的性状鉴定
对诱导培养18d的细胞，用PBS(pH7.2-7.4)洗2-3次，每次2min；95%乙醇室温固定10min，双蒸水洗涤3次；1%茜素红-Tris-HCL，每孔500-1000μL，37℃，30min；双蒸水洗涤4次，每次5min；加入双蒸水1mL，显微镜下观察、拍照。结果见图1。
从图1可知，利用诱导培养基a，即本专利申请中所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基和添加BMP-2的诱导培养基b的成骨诱导效果最好，镜下可见大量红色结节，显现出典型的成骨细胞的特性。
本专利申请中所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基成分包括：DMEM(4500mg/L葡萄糖）+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+1μM地塞米松+100μM维生素C+10mMβ甘油磷酸钠。其中，上述配方中，DMEM(4500mg/L葡萄糖）+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素为基础培养基，其余为添加成分。
另外，对诱导培养18d的细胞，用PBS(pH7.2-7.4)洗2-3次，每次2min；95%乙醇室温固定10min，双蒸水洗涤3次；用碱性磷酸酶试剂盒染色，双蒸水洗涤4次，每次5min；加入双蒸水1mL，显微镜下观察、拍照。结果见图2。
从图2可知，利用诱导培养基a，即即本专利申请中所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基和添加BMP-2的诱导培养基b的成骨诱导效果最好，镜下可见胞浆内出现蓝色沉淀，显现出典型的成骨细胞的特性。
诱导培养基a~e的各组分列于表1中。
表1不同诱导培养基营养组分表
以上对比实验说明：采用本发明的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，可以实现树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化，提高了成骨诱导分化的专一性，诱导分化的细胞成骨钙结节丰富，ALP碱性磷酸酶染色率高，成骨诱导分化效率大大提高。
实施例2
一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基包括如下组分：
体积分数为5%FBS、150U/mL青霉素、150μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；
所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
其制备方法是：
步骤（1），以无水乙醇为溶剂配制1mmol/L地塞米松溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到地塞米松母液；
然后以D-hanks液为溶剂配制1mmol/L维生素C溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到维生素C母液；
之后以D-hanks液为溶剂配制1mol/Lβ-甘油磷酸钠溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到β-甘油磷酸钠母液；
步骤（2），向DMEM培养基中，按所述浓度加入FBS、青霉素、链霉素、地塞米松母液、维生素C母液和β甘油磷酸钠母液，混匀后，于3-5℃保存，即得到树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。
其应用方法，包括以下步骤：
步骤（1），取树鼩骨髓间充质干细胞用间充质干细胞培养基在37℃，5%CO2条件下培养，培养72h后更换为新的间充质干细胞培养基，以后每4d换一次新的间充质干细胞培养基，待细胞生长至90%融合后，用0.25%胰酶消化，按1:2传代培养；
步骤（2），取步骤（1）培养的第三代树鼩骨髓间充质干细胞，用0.25%胰酶消化后，以1x104个/mL接种6孔板，使用间充质干细胞培养基培养细胞贴壁融合至90%后，更换为树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基进行诱导培养，每隔48h更换一次树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，诱导培养18d；
所述的间充质干细胞培养基为DMEM/F12+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素。
实施例3
一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基包括如下组分：
体积分数为15%FBS、120U/mL青霉素、120μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；
所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
其制备方法是：
步骤（1），以无水乙醇为溶剂配制1mmol/L地塞米松溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到地塞米松母液；
然后以D-hanks液为溶剂配制1mmol/L维生素C溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到维生素C母液；
之后以D-hanks液为溶剂配制1mol/Lβ-甘油磷酸钠溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到β-甘油磷酸钠母液；
步骤（2），向DMEM培养基中，按所述浓度加入FBS、青霉素、链霉素、地塞米松母液、维生素C母液和β甘油磷酸钠母液，混匀后，于6-8℃保存，即得到树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。
其应用方法，包括以下步骤：
步骤（1），取树鼩骨髓间充质干细胞用间充质干细胞培养基在37℃，5%CO2条件下培养，培养72h后更换为新的间充质干细胞培养基，以后每3d换一次新的间充质干细胞培养基，待细胞生长至90%融合后，用0.25%胰酶消化，按1:2传代培养；
步骤（2），取步骤（1）培养的第三代树鼩骨髓间充质干细胞，用0.25%胰酶消化后，以1x104个/mL接种6孔板，使用间充质干细胞培养基培养细胞贴壁融合至90%后，更换为树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基进行诱导培养，每隔48h更换一次树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，诱导培养18d；
所述的间充质干细胞培养基为DMEM/F12+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素。
实施例4
一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基包括如下组分：
体积分数为12%FBS、130U/mL青霉素、140μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；
所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
其制备方法是：
步骤（1），以无水乙醇为溶剂配制1mmol/L地塞米松溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到地塞米松母液；
然后以D-hanks液为溶剂配制1mmol/L维生素C溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到维生素C母液；
之后以D-hanks液为溶剂配制1mol/Lβ-甘油磷酸钠溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到β-甘油磷酸钠母液；
步骤（2），向DMEM培养基中，按所述浓度加入FBS、青霉素、链霉素、地塞米松母液、维生素C母液和β甘油磷酸钠母液，混匀后，于2-4℃保存，即得到树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。
其应用方法，包括以下步骤：
步骤（1），取树鼩骨髓间充质干细胞用间充质干细胞培养基在37℃，5%CO2条件下培养，培养72h后更换为新的间充质干细胞培养基，以后每3.5d换一次新的间充质干细胞培养基，待细胞生长至90%融合后，用0.25%胰酶消化，按1:2传代培养；
步骤（2），取步骤（1）培养的第三代树鼩骨髓间充质干细胞，用0.25%胰酶消化后，以1x104个/mL接种6孔板，使用间充质干细胞培养基培养细胞贴壁融合至90%后，更换为树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基进行诱导培养，每隔48h更换一次树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，诱导培养18d；
所述的间充质干细胞培养基为DMEM/F12+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于，包括如下组分：
体积分数为5-15%FBS、100-150U/mL青霉素、100-150μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；
所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
2.根据权利要求1所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，其特征在于，包括如下组分：
体积分数为10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1μM地塞米松、100μM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠，余量为DMEM培养基；
所述的DMEM培养基中葡萄糖的浓度为4500mg/L。
3.权利要求1或2所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，
步骤（1），以无水乙醇为溶剂配制1mmol/L地塞米松溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到地塞米松母液；
然后以D-hanks液为溶剂配制1mmol/L维生素C溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到维生素C母液；
之后以D-hanks液为溶剂配制1mol/Lβ-甘油磷酸钠溶液，过膜除菌，-20℃保存，得到β-甘油磷酸钠母液；
步骤（2），向DMEM培养基中，按所述浓度加入FBS、青霉素、链霉素、地塞米松母液、维生素C母液和β甘油磷酸钠母液，混匀后，于2-8℃保存，即得到树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。
4.权利要求1所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基在树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化中的应用。
5.根据权利要求4所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基在树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化中的应用，其特征在于：对树鼩骨髓间充质干细胞进行培养，待原代细胞生长至细胞90%融合后消化，之后进行传代培养；将培养得到的第3代树鼩骨髓间充质干细胞消化后继续培养至细胞90%融合，然后采用上述成骨诱导分化培养基进行诱导。
6.根据权利要求4所述的树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基在树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1），取树鼩骨髓间充质干细胞用间充质干细胞培养基在37℃，5%CO2条件下培养，培养72h后更换为新的间充质干细胞培养基，以后每3～4d换一次新的间充质干细胞培养基，待细胞生长至90%融合后，用0.25%胰酶消化，按1:2传代培养；
步骤（2），取步骤（1）培养的第三代树鼩骨髓间充质干细胞，用0.25%胰酶消化后，以1x104个/mL接种6孔板，使用间充质干细胞培养基培养细胞贴壁融合至90%后，更换为树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基进行诱导培养，每隔48h更换一次树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，诱导培养18d；
所述的间充质干细胞培养基为DMEM/F12+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素。
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