CN102965335A - 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 - Google Patents

用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 Download PDF

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本发明公开了一种用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80-120ng/ml细胞因子LIF与80-120ng/ml细胞因子bFGF的Knockout-DMEM培养基；所述细胞培养液B为胎牛血清。本发明提供的试剂盒能从离体脐带中分离脐带间充质干细胞，并培养所述脐带间充质干细胞，具有细胞扩增速度快、扩增效率高的优点，且多次传代后依然保持有细胞全能性。本发明解决了脐带间充质干细胞分离的纯度、数量和原代培养时间问题，可以获得大量脐带间充质干细胞，为利用脐带间充质干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源。

Description

用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞包括脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。
脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(CD44、CD105)、整合素受体(CD29、CD49b、CD49c、CD51)、不表达造血系标志(CD34、CD45)白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31。脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。目前，对脐带间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2～3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。
发明内容
本发明提供了一种用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用。
本发明的用于间充质干细胞培养的试剂盒包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80-120ng/ml细胞因子LIF(优选为100ng/ml)与80-120ng/ml细胞因子bFGF(优选为100ng/ml)的Knockout-DMEM培养基(液体)；所述细胞培养液B为胎牛血清。
所述所述细胞培养液A和所述细胞培养液B均为无菌的。
所述细胞培养液A和所述细胞培养液B均独立包装。
本发明的试剂盒还可包括细胞洗涤液和细胞消化液；所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞消化液为Collagenase II(胶原酶II)水溶液。
所述细胞消化液具体可为0.2g/100ml Collagenase II水溶液。
所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度具体可为0.9g/100ml。
所述细胞洗涤液、所述细胞培养液A、所述细胞培养液B和所述细胞消化液均为无菌的。
所述试剂盒中，所述细胞洗涤液、所述细胞培养液A、所述细胞培养液B和所述细胞消化液均独立包装。
所述间充质干细胞具体可为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞优选为离体的脐带间充质干细胞。所述间充质干细胞具体可为获自离体的哺乳动物组织的间充质干细胞，如获自离体的人脐带组织的脐带间充质干细胞。
所述试剂盒可用于间充质干细胞培养。
应用所述试剂盒时，所述细胞培养液A和所述细胞培养液B优选按照5∶1的体积比混合。
所述间充质干细胞具体可为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞优选为离体的脐带间充质干细胞。所述间充质干细胞具体可为获自离体的哺乳动物组织的间充质干细胞，如获自离体的人脐带组织的脐带间充质干细胞。
本发明的试剂盒的应用原理为：采用Collagenase II酶有效处理脐带蛋白胶质，利用细胞因子(LIF、bFGF)组合对脐带间充质干细胞的促进作用，从而确保了原代细胞分离数量和减少原代培养时间。本发明提供的试剂盒能从离体脐带中分离脐带间充质干细胞，并培养所述脐带间充质干细胞，具有细胞扩增速度快、扩增效率高的优点，且多次传代后依然保持有细胞全能性。本发明解决了脐带间充质干细胞分离的纯度、数量和原代培养时间问题，可以获得大量脐带间充质干细胞，为利用脐带间充质干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源。
附图说明
图1为原代细胞培养7天后的细胞照片。
图2为传代20次后细胞的表面抗原CD29表达情况。
图3为传代20次后细胞的表面抗原CD34表达情况。
图4为传代20次后细胞的多能性验证结果；A和B为茜素红染色；C和D为碱性磷酸酶染色；E和F为油红-O脂滴染色；A和C为进行成骨诱导后的细胞；E为进行脂肪细胞的诱导后的细胞；B、D和F为诱导前的细胞。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
细胞因子LIF：购自SIGMA，产品目录号为L5158。
细胞因子bFGF：购自SIGMA，产品目录号为F0291。
Knockout-DMEM培养基：购自GIBCO，产品目录号为10829018。
胎牛血清：购自GIBCO，产品目录号为10091-155。
Collagenase II(胶原酶II)：购自SIGMA，产品目录号为C6885。
用于检测CD29的抗体购自eBioscience公司，产品目录号为85-12-0291-81。
用于检测CD34的抗体购自eBioscience公司，产品目录号为11-0011-81。
L-抗坏血酸：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，产品目录号为47863。
地塞米松：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，产品目录号为46165。
β-甘油磷酸钠：Sigma，产品目录号为G9422。
甲基-异丁基黄嘌呤：Sigma，产品目录号为I7018。
胰岛素：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为DH174。
吲哚美辛：Sigma，产品目录号为I7378。
实施例1、用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒的制备
一、组分的制备
细胞洗涤液的制备：将9g NaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭菌后置于4℃冰箱内备用。
细胞培养液A的制备：将细胞因子LIF与细胞因子bFGF溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml，置于4℃冰箱内备用。
细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20℃冰箱内备用。
细胞消化液：将Collagenase II溶于去离子水使Collagenase II的浓度为0.2％(g/100ml)，置于4℃冰箱内备用。
二、组分的分装以及试剂盒的制备
用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(1次/盒)由独立包装的如下组分组成：1瓶细胞洗涤液(100ml/瓶)、1瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，1瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和1瓶细胞消化液(100ml/瓶)。
实施例2、脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养
用实施例1制备的试剂盒进行脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养。
细胞培养液的制备：将细胞培养液A和细胞培养液B按照5∶1的体积比混合。
1、无菌收集离体脐带(来源为人)，浸没于含双抗的细胞培养液(含双抗的细胞培养液由细胞培养液、青霉素和链霉素组成，青霉素的浓度为1g/100ml、链霉素的浓度为1g/100ml)中，玻璃容器密封运输至实验室。
2、在生物安全柜中剪取约10cm长的脐带，用细胞洗涤液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2条脐静脉和1条脐动脉，得到华尔通氏胶(动静脉之间的胚胎粘液样结缔组织)。
3、将华尔通氏胶剪碎成肉糜状，转移到离心管中，加入20ml细胞消化液，混匀37℃过夜消化(约6小时)；吸取液相、离心(2500rpm，5分钟)，收集沉淀(原代细胞)。
4、用细胞培养液重悬原代细胞，接种于0.2％明胶包被的培养瓶中(每106个细胞接种到1个25m2培养瓶)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；持续观察细胞贴壁生长情况，细胞多数贴壁后(约24小时)更换为新的细胞培养液，除去未贴壁细胞和杂质，以后每3天半量更换细胞培养液(半量即原细胞培养液体积的一半；也可每4天半量更换细胞培养液)，原代细胞培养7天后细胞密度达到90％，细胞照片见图1。
5、原代细胞培养至细胞密度达到90％(培养7天)后进行第一次传代，之后均在细胞密度达到90％(培养2-3天)时进行传代；传代20次后(及第一次传代后，又连续传代了19次)，取细胞样本进行流式细胞仪检测，以验证细胞样本的纯度和全能性相关参数。
通过流式细胞仪分别检测第20次传代后的细胞样本的表面抗原CD29的图谱，细胞样本的阳性率为98.2％，见图2。结果表明：采用本发明提供的细胞培养液将原代细胞传代20次后，细胞的纯度和全能性还是非常高的。
通过流式细胞仪分别检测第20次传代后的细胞样本的表面抗原CD34的图谱，见图3。
实施例3、脐带间充质干细胞多能性验证
为证实脐带间充质干细胞的多向分化潜能，本实施例对实施例2中第15次传代后的细胞样本向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能进行鉴定。
一、向成骨细胞分化
将细胞样本以3000cells/cm2接种，然后加入成骨诱导培养基(向Knockout-DMEM培养基中添加地塞米松至100nM、抗坏血酸至50μM、β-甘油磷酸钠至10mM)，于37℃、5％CO2培养箱中培养，大约5～7天后可观察到如下现象：细胞汇合成单层，细胞突起互相连接，并可重叠生长而不发生接触抑制；重叠生长的细胞逐渐形成结节状，随后胶原堆积及钙盐沉积，细胞间出现致密的圆形不透光团块物质。表明细胞样本可以向成骨细胞分化。
二、向脂肪细胞分化
将细胞样本以30000cells/cm2接种，然后加入成脂肪诱导培养基(向Knockout-DMEM培养基中添加地塞米松至1μM、甲基-异丁基黄嘌呤至0.5mM、胰岛素至10μg/ml、吲哚美辛至100μM)，持续培养，可观察到如下现象：第2天细胞汇合成单层；2周后部分细胞形态变圆，胞浆内出现亮圆形脂滴；随着时间延长，圆形细胞逐渐增多。表明细胞样本可以向脂肪细胞分化。
三、碱性磷酸酶(ALP)染色
应用碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号D001)对步骤一中培养6天的细胞样本和进行步骤一前的细胞样本分别进行碱性磷酸酶染色，具体步骤如下：用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后加入70％冰冷乙醇4℃固定30min，用去离子水洗3次(每次2分钟)以除去残留的乙醇；然后吸出去离子水，加入2ml α-磷酸萘酯底物，37℃作用15min后用去离子水洗2次(每次2分钟)；用1ml苏木素复染15min，用去离子水洗3次；晾干后，显微镜观察。
步骤一中培养6天的细胞样本见图4C。进行步骤一前的细胞样本见图4D。可见进行步骤一的培养后，细胞已经开始分化。
四、茜素红染色
将步骤一中培养6天的细胞样本和进行步骤一前的细胞样本分别进行茜素红染色，具体步骤如下：用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后加入70％冰冷乙醇4℃固定30min，用去离子水洗3次(每次2分钟)以除去残留的乙醇；加入1ml 40mM茜素红溶液(上海笛柏化学品技术有限公司，A202068；pH4.2)晃动铺匀，室温下染色15min；吸去未结合的茜素红，去离子水洗5次(每次3分钟)；晾干后，显微镜观察。
步骤一中培养6天的细胞样本见图4A。进行步骤一前的细胞样本见图4B。可见进行步骤一的培养后，细胞分化为成骨细胞。
五、油红-O脂滴染色
将步骤二中培养15天的细胞样本和进行步骤二前的细胞样本分别进行油红-O脂滴染色，具体步骤如下：细胞用PBS缓冲液洗三次，用10％中性福尔马林于4℃固定1h，用去离子水洗3次除去残留的中性福尔马林；加入1ml 3mg/mL的油红-O溶液(研域化学试剂有限公司，00625)，吸去未结合的油红-O，分别用60％异丙醇、30％异丙醇、去离子水洗3次，以减少非特异性染色；晾干后，显微镜观察。
步骤二中培养15天的细胞样本见图4E。进行步骤一前的细胞样本见图4F。可见进行步骤二的培养后，细胞分化为脂肪细胞。
以上结果表明，采用本发明提供的细胞培养液将脐带间充质干细胞传代15次后，细胞仍然维持很高的纯度和良好的全能性。采用本发明提供的细胞培养液培养骨髓间充质干细胞，也取得了同样好的效果。

Claims (10)

1.用于间充质干细胞培养的试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；
所述细胞培养液A为含80-120ng/ml细胞因子LIF与80-120ng/ml细胞因子bFGF的Knockout-DMEM培养基；
所述细胞培养液B为胎牛血清。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述培养液A中，含100ng/ml细胞因子LIF与100ng/ml细胞因子bFGF。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞洗涤液和细胞消化液；所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞消化液为Collagenase II水溶液。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞消化液为0.2g/100mlCollagenase II水溶液；所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞洗涤液、所述细胞培养液A、所述细胞培养液B和所述细胞消化液均为无菌的；所述试剂盒中，所述细胞洗涤液、所述细胞培养液A、所述细胞培养液B和所述细胞消化液均独立包装。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞培养液A和所述细胞培养液B均为无菌的；所述试剂盒中，所述细胞培养液A和所述细胞培养液B均独立包装。
7.如权利要求1至6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述脐带间充质干细胞优选为离体的脐带间充质干细胞。
8.权利要求1至7中任一所述试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述细胞培养液A和所述细胞培养液B按照5∶1的体积比混合。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述脐带间充质干细胞优选为离体的脐带间充质干细胞。
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