CN105779385A - 一种间充质干细胞培养试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞培养试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/ml Cephaloziellin N的Knockout‑DMEM培养基；所述细胞培养液B为胎牛血清。采用本发明提供的细胞培养液将脐带间充质干细胞传代15次后，细胞仍然维持很高的纯度和良好的全能性。采用本发明提供的细胞培养液培养骨髓间充质干细胞，也取得了同样好的效果。这些结果表明，本发明提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。

Description

一种间充质干细胞培养试剂盒
技术领域
本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种间充质干细胞培养试剂盒。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
间充质干细胞包括脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。
脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(CD44、CD105)、整合素受体(CD29、CD49b、CD49c、CD51)、不表达造血系标志(CD34、CD45)白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31。脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。目前，对脐带间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2～3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间的培养试剂盒，以使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种间充质干细胞培养试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；
所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/ml Cephaloziellin N的Knockout-DMEM培养基；
所述细胞培养液B为胎牛血清。
进一步地，所述细胞培养液A为含100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25μg/ml Cephaloziellin N的Knockout-DMEM培养基。
进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
进一步地，所述细胞培养液A和细胞培养液B均为无菌，并各自独立包装。
进一步地，所述的间充质干细胞培养试剂盒还包括细胞洗涤液和细胞消化液；所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞消化液为Collagenase II水溶液。
进一步地，所述细胞消化液为浓度为0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。
进一步地，所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。
进一步地，所述细胞培养液A、细胞培养液B、细胞洗涤液和细胞消化液均为无菌，并各自独立包装。
上述间充质干细胞培养试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。
本发明的优点：
本发明提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
本发明化合物Cephaloziellin N的制备方法参见文献：Secondary Metabolites from theChinese Liverwort Cephaloziella kiaeri,J.Nat.Prod.2013,76,1700-1708。
实施例1：试剂盒的制备
1、组分的制备
细胞洗涤液的制备：将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭菌后置于4℃冰箱内备用。
细胞培养液A的制备：将细胞因子LIF、细胞因子bFGF和化合物Cephaloziellin N溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml，化合物Cephaloziellin N的浓度为25μg/ml。置于4℃冰箱内备用。
细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20℃冰箱内备用。
细胞消化液：将Collagenase II溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4℃冰箱内备用。
2、组分的分装以及试剂盒的制备
用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(1次/盒)由独立包装的如下组分组成：1瓶细胞洗涤液(100ml/瓶)、1瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，1瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和1瓶细胞消化液(100ml/瓶)。
实施例2：试剂盒的制备，与实施例1对比，仅细胞培养液A中不添加Cephaloziellin N
1、组分的制备
细胞洗涤液的制备：将9g NaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭菌后置于4℃冰箱内备用。
细胞培养液A的制备：将细胞因子LIF和细胞因子bFGF溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml。置于4℃冰箱内备用。
细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20℃冰箱内备用。
细胞消化液：将Collagenase II溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4℃冰箱内备用。
2、组分的分装以及试剂盒的制备
用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(1次/盒)由独立包装的如下组分组成：1瓶细胞洗涤液(100ml/瓶)、1瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，1瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和1瓶细胞消化液(100ml/瓶)。
实施例3：脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养
分别用实施例1(实验组)和实施例2(对照组)制备的试剂盒进行脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养。
细胞培养液的制备：将细胞培养液A和细胞培养液B按照5:1的体积比混合。
1、无菌收集离体脐带(来源为人)，浸没于含双抗的细胞培养液(含双抗的细胞培养液由细胞培养液、青霉素和链霉素组成，青霉素的浓度为1g/100ml、链霉素的浓度为1g/100ml)中，玻璃容器密封运输至实验室。
2、在生物安全柜中剪取约10cm长的脐带，用细胞洗涤液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2条脐静脉和1条脐动脉，得到华尔通氏胶(动静脉之间的胚胎粘液样结缔组织)。
3、将华尔通氏胶剪碎成肉糜状，转移到离心管中，加入20ml细胞消化液，混匀37℃过夜消化(约6小时)；吸取液相、离心(2500rpm，5分钟)，收集沉淀(原代细胞)。
4、用细胞培养液重悬原代细胞，接种于0.2％明胶包被的培养瓶中(每106个细胞接种到1个25cm2培养瓶)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；持续观察细胞贴壁生长情况，细胞多数贴壁后(约24小时)更换为新的细胞培养液，除去未贴壁细胞和杂质，以后每3天半量更换细胞培养液(半量即原细胞培养液体积的一半；也可每4天半量更换细胞培养液)，原代细胞培养7天后细胞密度达到90％。
5、原代细胞培养至细胞密度达到90％后进行第一次传代，之后均在细胞密度达到90％(培养2～3天)时进行传代；继续传代20次(即第一次传代后，又连续传代了19次)。
实施例4：细胞纯度测定
分别取实施例1(实验组)和实施例2(对照组)制备的试剂盒按实施例3方法分离培养传代20次的细胞进行流式细胞仪检测，以验证细胞样本的纯度。
通过流式细胞仪分别检测第20次传代后的细胞样本的表面抗原CD29的图谱，实验组细胞样本的阳性率为98.5％，而对照组细胞样本的阳性率仅为81.3％。结果表明，采用本发明提供的细胞培养液将原代细胞传代20次后，细胞的纯度依然非常高。
实施例5：全能性验证
为证实脐带间充质干细胞的多向分化潜能，本实施例对实施例3中第15次传代后的细胞样本向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能进行鉴定。
1、向成骨细胞分化
将细胞样本以3000cells/cm2接种，然后加入成骨诱导培养基(向Knock out-DMEM培养基中添加地塞米松至100nM、抗坏血酸至50μM、β-甘油磷酸钠至10mM)，于37℃、5％CO2培养箱中培养，大约5～7天后观察。
结果实验组可观察到如下现象：细胞汇合成单层，细胞突起互相连接，并可重叠生长而不发生接触抑制；重叠生长的细胞逐渐形成结节状，随后胶原堆积及钙盐沉积，细胞间出现致密的圆形不透光团块物质，表明细胞样本可以向成骨细胞分化。
对照组未观察到实验组所见现象，说明使用实施例2制备的试剂盒所培养的脐带间充质干细胞传代15代后基本丧失继续分化为成骨细胞的能力。
2、向脂肪细胞分化
将细胞样本以3000cells/cm2接种，然后加入成脂肪诱导培养基(向Knock out-DMEM培养基中添加地塞米松至1μM、甲基-异丁基黄嘌呤至0.5mM、胰岛素至10μg/ml、吲哚美辛至100μM)，持续培养。
结果实验组可见如下现象：第2天细胞汇合成单层；2周后部分细胞形态变圆，胞浆内出现亮圆形脂滴；随着时间延长，圆形细胞逐渐增多。表明细胞样本可向脂肪细胞分化。
对照组未观察到实验组所见现象，说明使用实施例2制备的试剂盒所培养的脐带间充质干细胞传代15代后基本丧失继续分化为脂肪细胞的能力。
以上结果表明，采用本发明提供的细胞培养液将脐带间充质干细胞传代15次后，细胞仍然维持很高的纯度和良好的全能性。
采用本发明提供的细胞培养液培养骨髓间充质干细胞，也取得了同样好的效果。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：包括细胞培养液A和细胞培养液B；
所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/ml Cephaloziellin N的Knockout-DMEM培养基；
所述细胞培养液B为胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述细胞培养液A为含100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25μg/ml Cephaloziellin N的Knockout-DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述细胞培养液A和细胞培养液B均为无菌，并各自独立包装。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：还包括细胞洗涤液和细胞消化液；所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞消化液为Collagenase II水溶液。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述细胞消化液为浓度为0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。
8.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。
9.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述细胞培养液A、细胞培养液B、细胞洗涤液和细胞消化液均为无菌，并各自独立包装。
10.权利要求1～9任一所述间充质干细胞培养试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。
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