CN105670986A - 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法。该培养基含有活化素A、表皮生长因子、？β-神经生长因子、尼克酰胺、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的UltraCULTURE培养基。该诱导方法为：采用上述诱导培养基对间充质干细胞进行诱导分化培养即可。本发明诱导培养基含有简单的诱导因子，不含有毒有害物质，更安全。本发明诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，21天可获得聚团胰岛样细胞，28天可获得部分成熟分化的胰岛样细胞，建立了规范的、新颖的诱导方法，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细

胞的培养基及其诱导方法。

背景技术

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖、糖尿为特征的代谢性综合征。病人持续性的高血糖与长期的代谢紊乱等可导致全身各个系统的损害及其功能障碍。糖尿病的临床治疗包括糖尿病教育、运动治疗、饮食治疗、降糖药物及胰岛素治疗等常规疗法，但目前的治疗效果并不理想，因此需要寻找新的胰岛替代物治疗糖尿病。同种异体胰腺移植的效果差，手术复杂、死亡率高、移植排斥反应强烈，大量开展极为有限。

另一方面，干细胞作为再生医学和组织工程领域的研究热点之一，具有自我更新与多向分化潜能，干细胞具有自我更新与多向分化潜能，有研究证明，胚胎干细胞、骨髓干细胞、人脐带血干细胞等可被定向诱导分化为胰岛素分泌细胞，成为胰岛细胞新的来源，因此干细胞诱导分化胰岛样细胞成为研究热点。

基于以上两个方面原因，我们需要一个高效、快速和稳定的胰岛细胞分化平台作为

以上研究和应用的载体。但胚胎干细胞存在培养扩增难度大，成瘤性强，并存在伦理问题等；骨髓间充质干细胞来源受限，扩增难度大，而且对供者存在一定的损伤。因此诱导后的胰岛样细胞应用受限，无法满足大量需求，比如用于替代治疗糖尿病，以及进行细胞药物的筛选。目前国内外集中于以间充质干细胞为来源诱导胰岛细胞分化为主，人脐带间充质干细胞是从脐带华通胶质中分离出的新型干细胞，其再生能力强，来源丰富，表面抗原性很弱，不被受体的免疫系统所识别，移植物抗宿主病极少见，并且具有向胰岛细胞等方向分化的功能,可作为移植治疗糖尿病的种子细胞。采用策略主要是多种生长因子来联合诱导，从而获得成熟的定向分化细胞。

然而怎样才能将其高效诱导分化成胰岛样细胞，用于细胞生物治疗其中仍存在许多问题亟需解决:1)干细胞分化为胰岛样细胞，受干扰因素非常多，首先是诱导方案不确定；2)采用的诱导因子不规范，不能保证干细沿预期方向分化、增殖；3)多采用β-巯基乙醇，其毒性令人望而却步，影响后续临床应用；4)诱导分化后的胰岛样样细胞胰岛素分泌效率低。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种规范的、新颖的诱导方法，可高效、

稳定地将脐带间充质干细胞诱导为胰岛样细胞。

本发明的目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养

基；本发明的另一目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，该培养基含有以下组分：

活化素A2～6nmol/L

表皮生长因子20～30μg/L

β-神经生长因子80～120μg/L

尼克酰胺5～15mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒0.5～1.5%

碱性成纤维细胞生长因子5～15μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

进一步的，上述培养基含有以下组分：

活化素A4nmol/L

表皮生长因子25μg/L

β-神经生长因子100μg/L

尼克酰胺10mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒1%

碱性成纤维细胞生长因子10μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记。将第三代人脐带间充质干细胞用上述所述的培养基分两阶段诱导培养，第一阶段，在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，培养至14d；第二阶段，在UltraCULTURE的培养基中加入1%胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，培养诱导时间为14d。以UItraCULTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。

进一步的，上述诱导培养至少28天后即可获得成熟的胰岛样细胞。

本发明的有益效果是：

1）诱导培养基中所含细胞因子，均属于无毒害物质，更安全；

2）本发明诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，21天即可发现诱导细胞聚团生长并可释放胰岛素，28天可获得成熟的胰岛样细胞团，与现有技术诱导时间不稳定，诱导细胞不成熟，胰岛素分泌量过低相比，大大增加了诱导效率；

3）人脐带组织易于获得；分化后胰岛样细胞的胰岛素表达更高，可为胰岛缺失相关疾病细胞治疗提供理想的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面免疫表型，阴性表达CD14-FITC、CD34-PE、HLA-DR-APC，阳性表达CD44-FITC、CD90-PE、CD105-APC，符合干细胞表面标志表达；

图2脐带间充质干细胞在向胰岛样细胞分化的过程中形态变化。(A)第三代脐带间充质干细胞呈现梭型形态(100X)；(B)分化培养的14d后，干细胞形态开始呈现神经纤维样(100X)；(C)分化培养21d后，部分脐带间充质干细胞开始聚集抱团(100X)；(D)分化培养第28d后，脐带间充质干细胞形态变为典型的胰岛样细胞团(100X)；

图3干细胞诱导前、诱导14d以及诱导培养28d后的细胞流式检测胰岛素表达情况，在诱导培养的过程中，随着诱导时间延长，胰岛素表达量逐渐增加；

图4胰岛β细胞胞浆中高浓度的锌离子是其分泌胰岛素调节血糖所必须的基本条件之一，双硫腙（DTZ）能特异地与锌离子螯合，形成棕色络合物。与对照组相比，诱导组细胞双硫腙染色形成棕色络合物。

具体实施方式

一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，其特征在于：该培养基含有以下组分：

活化素A2～6nmol/L

表皮生长因子20～30μg/L

β-神经生长因子80～120μg/L

尼克酰胺5～15mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒0.5～1.5%

碱性成纤维细胞生长因子5～15μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

优选的，上述培养基含有以下组分：

活化素A4nmol/L

表皮生长因子25μg/L

β-神经生长因子100μg/L

尼克酰胺10mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒1%

碱性成纤维细胞生长因子10μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记。将第三代人脐带间充质干细胞用上述所述的培养基分两阶段诱导培养，第一阶段，在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，培养至14d；第二阶段，在UltraCULTURE的培养基中加入1%胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，培养诱导时间为14d。以UItraCULTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。

将通过组织块方法从脐带中分离获得的间充质干细胞，流式细胞仪鉴定其表面标记，确定其属于间充质干细胞。

上述诱导培养至少28天后即可获得成熟的胰岛样细胞。

上述诱导培养过程中每三天换一次液。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为脂肪样细胞的培养基含有以下组成：

活化素A4nmol/L

表皮生长因子25μg/L

β-神经生长因子100μg/L

尼克酰胺10mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒1%

碱性成纤维细胞生长因子10μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

上述培养基的制备：先将活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子加入到UItraCULTURE培养基（为市售的UItraCULTURE培养基）中，使终浓度分别为4nmol/L、25μg/L、100μg/L、10mmol/L及10μg/L，将1%胰岛素-转铁蛋白-硒加入到上述溶液中，置于37℃孵育半个小时即可。

实施例2：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为脂肪样细胞的培养基含有以下组成：

活化素A2nmol/L

表皮生长因子20μg/L

β-神经生长因子80μg/L

尼克酰胺5mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒0.5%

碱性成纤维细胞生长因子5μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

上述培养基的制备：先将活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子加入到UItraCULTURE培养基（为市售的UItraCULTURE培养基）中，使终浓度分别为2nmol/L、20μg/L、80μg/L、5mmol/L及5μg/L，将0.5%胰岛素-转铁蛋白-硒加入到上述溶液中，置于37℃孵育半个小时即可。

实施例3：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为脂肪样细胞的培养基含有以下组成：

活化素A6nmol/L

表皮生长因子30μg/L

β-神经生长因子120μg/L

尼克酰胺15mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒1.5%

碱性成纤维细胞生长因子15μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

上述培养基的制备：先将活化素A、表皮生长因子、β-神经生长因子、尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子加入到UItraCULTURE培养基（为市售的UItraCULTURE培养基）中，使终浓度分别为6nmol/L、30μg/L、120μg/L、15mmol/L及15μg/L，将1.5%胰岛素-转铁蛋白-硒加入到上述溶液中，置于37℃孵育半个小时即可。

实施例4：组织块培养技术获得人脐带间充质干细胞：

取新生儿脐带，通过下述步骤分离获得脐带间充质干细胞，分离操作步骤如下：

（1）按照无菌操作的要求，将取回的脐带通过传递窗送入细胞培养房；

（2）在超净工作台内打开装有脐带的无菌瓶，倒入PBS，使其没过脐带。用平口镊子夹住脐带一端，慢慢清洗脐带。然后用镊子将脐带取出，放入灭菌的无菌瓶，重新加入新鲜的PBS继续清洗，洗至尽量去除所有血块；

（3）用剪刀将脐带剪成2-3cm的小段。将其放在装有PBS的50ml离心管中第三次清

洗。清洗完后将其放在培养皿上，横向夹住脐带组织，明显可见2条脐动脉和1条脐静

脉，纵向剖开脐带，露出血管，将血管从周围组织剔除；

（4）将脐带组织漂洗干净，用剪刀将脐带剪成1-1.5mm³的小块；

（5）以1-1.5mm的小块接种于含有10mlUItraCULTURE培养基的T-75培养瓶中；

（6）放入37℃、5%CO2培养箱中培养；

（7）培养期间尽量不要移动瓶，于一周后首次换培养液并在显微镜下观察细胞生长情况；

（8）如果细胞长得比较密集，可将组织块去除，让其继续生长一至两天后传代；如果细胞

数量较少，可在培养板中补加一定量的培养液，让其继续生长；

（9）以后每3天换一次液，每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况；

（10）当细胞长到约80％-90％融合时可将其用0.25％的胰酶消化下来，进行传代扩大

培养，获得脐带间充质干细胞。

将通过组织方法从脐带中分离获得的间充质干细胞，流式细胞仪鉴定其表面标

记，确定其属于间充质干细胞。

实施例5：诱导脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞：

通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞，传至将第三代，使用上述实施例1所述的培养基分两阶段诱导培养，第一阶段，在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，培养至14d；第二阶段，在UltraCULTURE的培养基中加入1%胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，培养诱导时间为14d。以UItraCULTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。每三天换一次液，培养至少28天后即可获得胰岛样细胞。

细胞形态学的变化：脐带间充质干细胞在向胰岛细胞分化的过程中细胞形态发生了一系列变化。未分化的脐带间充质干细胞成纤维细胞样形态；而诱导培养21d后，部分脐带间充质干细胞开始聚集抱团；随着诱导培养时间的增加，更多的细胞抱团出现；分化培养28d后，间充质干细胞的形态变为典型的胰岛样细胞团(参见图2)。

脐带间充质干细胞表面标志的检测：取第3代人脐带间充质干细胞，PBS液洗涤细胞后，流式检测管中加入细胞数为5×10⁵/管，再分别加入鼠抗人单克隆抗体CD44、CD90、CD105、CD14、CD34、HLA-DR各10ul/管，常温避光静置15min，PBS液洗涤细胞，流式细胞仪检测其表型(参见图1)。

流式细胞术检测了诱导前、诱导14d以及诱导培养28d后的细胞胰岛素表达。发现在诱导培养的过程中，细胞的胰岛素表达逐渐增高，说明间充质干细胞诱导胰岛样细胞具有胰岛素分泌功能(参见图3)。

此外，还进行了双硫腙染色鉴定胰岛细胞锌离子表达，因为胰岛β细胞胞浆中高浓度的锌离子是其分泌胰岛素调节血糖所必须的基本条件之一，双硫腙能特异地与锌离子螯合，形成棕色络合物。与对照组相比，诱导组细胞双硫腙染色形成棕色络合物(参见图4)。

Claims (5)

1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，其特征在于：该培养基含有以下组分：

活化素A2～6nmol/L

表皮生长因子20～30μg/L

β-神经生长因子80～120μg/L

尼克酰胺5～15mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒0.5～1.5%

碱性成纤维细胞生长因子5～15μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：该培养基含有以下组分：

活化素A4nmol/L

表皮生长因子25μg/L

β-神经生长因子100μg/L

尼克酰胺10mmol/L

胰岛素-转铁蛋白-硒1%

碱性成纤维细胞生长因子10μg/L

UItraCULTURE培养基余量。

3.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以组织块法提取人脐带间充质干细胞进行分离培养，将人脐带间充质干细胞用权利要求1～2任一所述的培养基进行诱导培养，诱导培养至少28天即可获得胰岛样细胞。

4.权利要求3所述的诱导方法，其中所述分阶段定向诱导的具体步骤为：

(1)在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，培养至14d；

(2)在UltraCULTURE的培养基中加入1%胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，培养诱导时间为14d。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：诱导培养至少28天后即可获得成熟的胰岛样细胞。