CN113215197B - 基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途。本发明通过采用CRISPR技术将脂肪间充质干细胞中的γ分泌酶进行敲除后，再使用特异性针对γ分泌酶的单克隆抗体进行特异性的分化诱导，获得了胰岛样细胞，通过鼠实验证实了所述胰岛样细胞具有较好的降低血糖的效果。

Description

基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途
技术领域
本申请涉及生物领域。更具体的，涉及一种基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途。
背景技术
糖尿病主要由因遗传、环境、精神等因素相互作用而导致胰岛素相对或绝对缺乏，并以持续高血糖为其主要生化特征的一种慢性全身性代谢疾病，胰岛素的注射与药物治疗成为了当前临床上控制糖尿病和降低其并发症发生的主要方法，但是不能从根本上治愈糖尿病。研究证实，体外实验中胰岛细胞的移植能够有效降低血糖和减少其并发症的发生。由于干细胞能自我更新、增殖且具有多向分化潜能，因此干细胞移植成为一种更为理想的细胞替代疗法用于1型糖尿病的治疗。
MSCs具有干细胞的共性：自我更新、多向分化及归巢能力。实验中在特定的诱导条件下，MSCs能够向多种组织或细胞分化，其可塑性较强。体外MSCs在诱导过程中首先分化为胰腺祖细胞或干细胞，其次才分化为具有分泌功能的胰岛样细胞，在诱导成功的细胞中检测到干细胞或祖细胞和成熟的胰岛细胞共存目前国内外研究证实，胰岛素分泌细胞可以由干细胞诱导分化而来。诱导的条件不同，骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分化的细胞也不同。最近研究表明，BM-MSCs诱导分化为胰岛样细胞治疗糖尿病潜力巨大；特定诱导条件下BM-MSCs可以向多种组织细胞分化。试验中将人BM-MSCs通过特定诱导剂诱导分化后植入体内可控制血糖和改善机体免疫状态，同时可延缓其并发症的发生，且与糖尿病血管病变及视网膜病变密切相关。
MSCs向胰岛样细胞诱导分化的方法有很多种，化学诱导法化学诱导法是目前最常用的方法，即通过化学试剂促进BM—MSCs分化成胰岛样分泌细胞。研究发现，MSCs在体外经药物诱导，或模拟体内胰岛细胞的微环境，能定向诱导分化为胰岛样细胞，并能表达出胰岛细胞的许多功能特性。诱导剂最常用的有细胞调节素、活化素A、尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、B77、巯基乙醇等。Chen等分离出大鼠的MSCs，体外经过数次传代后，在含血清的DMEM中加入巯基乙醇和尼克酰胺预诱导24h，然后在不含血清的H-DMEM培养液中加入巯基乙醇和尼克酰胺10h，细胞形态发生变化，nestin蛋白及胰岛素量发生改变，将诱导后的细胞移植入糖尿病鼠体内，能够观察到糖尿病鼠胰腺中聚集着移植后的细胞，形态类似胰岛样细胞，通过检测发现有微量胰岛素分泌，因而能控制糖尿病鼠的血糖。由此证明MSCs通过诱导可以分化为能够分泌胰岛素的细胞，且能降低糖尿病鼠的血糖。
尽管MSC的免疫调节作用目前研究的尚不清楚，但是其广泛的来源、低免疫原性以及免疫应答的效果使其成为治疗严重的顽固性自身免疫病最有前景的工具。虽然，大量研究表明，多种组织来源的MSC都可以诱导分化为IPCs，但是仍有许多关键的问题有待于进一步研究，例如，如何控制MSC的生长和分化，怎样提高MSC的诱导分化效率，诱导其分化后细胞表面抗原如何变化，以及长期培养后细胞有无恶变的倾向，移植后的长期作用效果等。此外，分化后的细胞在体内的作用机制也需要进一步的研究和解决。
基因编辑技术是指用可编程的核酸酶识别基因组特定位点并介导DNA双链断裂，随后诱发DNA非同源末端连接(non-homology end-joining，NHEJ)或同源重组修复(homology directed repair，HDR)等机制，从而实现对DNA序列的定点修饰，包括靶向敲除或敲入基因。近年来建立的成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat，CRISPR)/Cas系统，具有效率高、操作简单、易于改造优化等优势，目前已经成为最重要的基因编辑工具，并被广泛应用于基因表达调控、细胞成像、核酸标记、表观遗传修饰、疾病治疗、功能基因筛选等领域。但是，目前采用CRISPR针对脂肪间充质干细胞的编辑后用于提高向胰岛样细胞的分化研究还比较少。
发明内容
本发明涉及提高脂肪间充质干细胞的诱导为胰岛样细胞的方法。
更具体的，本申请涉及一种γ分泌酶敲除的脂肪间充质干细胞的制备方法。所述方法为采用CRISPR技术进行敲除。
具体的，CRISPR靶标为：acctgggcattcttagctgcggg
sgRNA序列为：
accugggcauucuuagcugcGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO：1)
更进一步的，本发明还提供特异性针对γ分泌酶的单克隆抗体。所述单克隆抗体是以γ-分泌酶的表位肽VELGQVALRTSLELWMHTDPVSQKNESVRNQVEDLLATLEK作为免疫原，通过常规的单抗制备方法制备获得。
单克隆抗体细胞株分泌的抗体为IgG1，轻链为Lambda链。轻链可变区(SEQ ID NO：2)，重链可变区(SEQ ID NO：3)。
本发明进一步的，提供一种将转基因脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括(1)制备基因敲除的脂肪间充质干细胞；所述敲除采用CRISPR方法，具体的sgRNA序列如SEQ ID NO：1所示；(2)步骤(1)制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞培养融合至80％-90％时用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，单抗50μg/L，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d；其中单抗的轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
一种胰岛样细胞，其特征在于采用前述将转基因脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法制备得到。
一种药物组合物，其特征在于含有前述所示的胰岛样细胞。
前述所述的胰岛样细胞在制备用于糖尿病治疗的药物组合物中的用途。
具体的，胰岛样细胞的治疗细胞数量1×109个-1×1011个/kg。
进一步的，所述药物组合物中还含有第二治疗药剂。
进一步的，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
有益效果
本发明通过采用CRISPR技术将脂肪间充质干细胞中的γ分泌酶进行敲除后，再使用特异性针对γ分泌酶的单克隆抗体进行特异性的分化诱导，获得了胰岛样细胞，通过鼠实验证实了所述胰岛样细胞具有较好的降低血糖的效果。
附图说明
图1质粒pTrcHis2B图谱
图2单克隆抗体亚型结果图
图3Western印迹法检测胰岛细胞相关标记物的蛋白表达结果图
图4治疗后空腹血糖水平结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。
实施例1脂肪间充质干细胞的制备
人脂肪颗粒15ml，离心1000r/min，5min。取上层脂肪组织及下层细胞。向脂肪组织中加入终浓度0.1％的胰蛋白酶和胶原酶。放入37℃的水浴摇床中消化30min。离心700g/min，5min。留取下层细胞，将两细胞混匀，加PBS缓冲液重悬细胞，再次离心700g/min，5min。α-MEM培养液重悬细胞后接种至培养瓶，37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养。记为P0代。观察细胞生长情况。首次第3天半量换液，以后每3d换液一次，细胞达90％融合时传代培养，用0.05％胰蛋白酶消化，按照1∶5的比例传代。传至第3代做鉴定。通过流式细胞仪测定hADSCs表面标记物CD13、CD29、CD31、CD34、CD45、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-DR的表达情况。hADSCs免疫表型检测结果显示CD90、CD105表达呈阳性，阳性率＞95.9％；CD34、CD45和HLA-DR表达阴性，阳性率＜1.5％。将分离的脂肪间充质干细胞保存备用。
实施例2γ分泌酶敲除的脂肪间充质干细胞的制备
本发明中的序列，均为5’-3’。
根据γ分泌酶APH1B的序列，通过靶标序列优化，获得数十个靶标，经过鉴定，发现靶标1效果最好。具体以靶标1和2作为示例。
靶标1：acctgggcattcttagctgcggg
sgRNA1序列：
accugggcauucuuagcugcGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO：1)
靶标2：tagtcagtgtctctgggttttgg
sgRNA2序列：
uagucagugucucuggguuuGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
AsCpf1蛋白的制备：
载体构建质粒pTrcHis2B(购自Invitrogen公司)，质粒图谱如图1所示，AsCpf1基因序列3’端加上his标签序列插入质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间，得到重组表达载体pTrcHis2B-AsCpf1。将原核表达载体转入表达宿主菌中，挑取单克隆接种至新鲜LB培养基(含氨苄青霉素)。待细菌扩增8小时左右加入0.8mM的IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖)诱导AsCpf1表达。诱导6个小时后收集菌体，加入破碎缓冲液(pH7.5 20mM Tris-HCl，50mMNaCl，1％Triton-100，20％甘油，)超声破碎取上清，将上清过镍柱，上样完成后，用洗脱液(20mM Tris—HCl pH7.5，50mM NaCl，0.1％TritonX-1 00，500mM咪唑，20％甘油)洗脱镍柱后收集洗脱液，并将收集的蛋白进行透析至20mM Tris,50mM NaCl pH7.5，20％甘油中，透析完成后进行超滤浓缩，即得到AsCpf1蛋白。
电转进行基因敲除:
取实施例1制备的脂肪间充质干细胞，按照20μl体系/电击杯，离心弃培养基，1640不完全培养基洗涤细胞，用电转液(PostElectroporationMediumPEM-2)重悬细胞，调整细胞密度在2.0x106个/20μl，加入AsCpf1蛋白和sgRNA(比例1μg：1μg，sgRNAs的序列分别如SEQIDNO:1或2所示)，加入电击杯中，注意不能有气泡。电转条件为520V,25ms，电转之前先调好参数，进行预热。电转完成后取电转后的细胞，放入电转后液(ElectroporationBuffer103)中富集备用。
收集电转富集后的脂肪干细胞，提取基因组DNA。采用引物对APH1BF1:agcatttataatcctggtgc和R1:agaacaccttgggtattcct进行常规PCR扩增。PCR反应完成后，收集PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后做胶回收纯化DNA片段。委托上海生工公司进行基因测序，根据测序结果发现靶基因缺失了一段序列，基因敲除成功。检测出的敲除效率分别为77.5％和13.6％，其中敲除基本上在该基因的gRNA位置导致了移码，蛋白翻译被终止。阴性对照未检测出敲除发生。这说明SEQ ID NO：1的sgRNA具有较好的敲除效果。将PCR鉴定后的经SEQ ID NO：1的sgRNA敲除成功的脂肪干细胞进行传代培养备用。
实施例3γ-分泌酶单克隆抗体的制备
(1)蛋白免疫及抗体制备
筛选获得高免疫表位肽序列，即γ-分泌酶的表位肽VELGQVALRTSLELWMHTDPVSQKNESVRNQVEDLLATLEK，将所述多肽与弗氏完全佐剂乳化并混匀，皮下免疫BALB/c小鼠，3周后，加强免疫2次，免疫的剂量和方法同第一次。融合3d前，用不含佐剂的抗原通过腹腔注射追加免疫。细胞的融合方法采用本领域常规的方法制备。用间接ELISA检测筛选获得可分泌抗体的阳性细胞，采用有限稀释法亚克隆，3次克隆后，获得稳定的杂交瘤细胞系，将其扩大培养并冻存。1周后将杂交瘤细胞株通过腹腔注射至小鼠体内。成功制备得到一株抗γ-分泌酶的抗体4M11。
(2)单克隆抗体亚型
使用小鼠抗体分型试剂盒检测单克隆细胞培养上清和腹水中抗体亚型，结果见图2。由图2可知，单克隆抗体细胞株分泌的抗体为IgG1，轻链为Lambda链。
(3)交叉反应率实验
将γ-分泌酶、BSA、小鼠血清、几种样品作系列稀释，进行间接竞争ELISA试验，绘制曲线方程并计算出各个药物半数抑制浓度IC50，比较各个组分与本发明单克隆抗体的交叉反应率(CR)，判定抗体的特异性。交叉反应物浓度范围0.001～1000ng/mL。交叉反应率(％)＝IC50(γ-分泌酶)/IC50(竞争物)×100％.结果见表1所示。
表1交叉反应率及抑制效果
Figure BDA0003071860770000071
由表1可知，本发明的单克隆抗体对γ-分泌酶的抑制率为100％，与BSA、小鼠血清均无交叉反应，说明该抗体特异性良好。
(4)抗体性能鉴定
此外，采用本领域常规的抗体结合能力检测方法检测得到γ-分泌酶抗体抗体的结合活性为0.23nM。
抗γ-分泌酶小鼠单克隆抗体的可变区蛋白测序，结果4M11的可变区序列分别如下所示。
轻链可变区(SEQ ID NO：2)
DIVITQSPALMAASPGEKVTITCTYRLRAHGWIMTWYQQKSGISPKPWIYEVFLYSIGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCGVFKKHYKGFGAGTKLELK
重链可变区(SEQ ID NO：3)
EVQLEESGTELARPGASVKLSCKASGYIFSCMLYAWIKQRPGQGLEWIGGHNASHSVGQSGMGSIGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGVDIWAVFWGLGTTLAVSS。
实施例4脂肪间充质干细胞的诱导实验
转基因脂肪干细胞多抗诱导组：取实施例2制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞，将细胞分别融合至80％-90％时用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，实施例3单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，实施例3单抗50μg/L，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d。
人脐带间充质干细胞多抗诱导组：实施例1的正常脂肪间充质干细胞，将细胞分别融合至80％-90％时用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，实施例3单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，实施例3单抗50μg/L，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d。
转基因脂肪干细胞诱导组：取实施例2制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞，将细胞分别融合至80％-90％时用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，继续诱导10d，共诱导20d。
人脐带间充质干细胞诱导组：实施例1的正常脂肪间充质干细胞，将细胞分别融合至80％-90％时用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d。
双硫腙(DTZ)染色：细胞诱导后行DTZ染色，如果细胞团被染成棕红色
(DTZ阳性)，提示诱导的细胞胞浆中富含锌离子，说明有胰岛样细胞的存在。具体诱导率如表2所示。
表2胰岛样细胞诱导结果
分组 诱导率(％)
转基因脂肪干细胞多抗诱导组 99.42±0.25
未转基因间充质干细胞多抗诱导组 89.37±0.36
转基因脂肪干细胞诱导组 90.49±0.41
未转基因间充质干细胞诱导组 76.33±0.29
从表2的结果可以看出，将脂肪干细胞的γ-分泌酶基因敲除后，再采用特异性的γ-分泌酶单克隆抗体一起诱导后，能够在20d的较短诱导时间内，实现接近99.42±0.25的胰岛样细胞诱导效果，具有极好的应用价值。
Western印迹法检测胰岛细胞相关标记物的蛋白表达：按消化传代方法收获诱导后细胞，RIPA细胞裂解液提取总蛋白，吹打混匀，4℃、1000g离心15min，收集上清，BCA法测定总蛋白浓度，100℃沸水煮沸3～5min，充分变性后加上样缓冲液，于SDS-PAGE变性凝胶上电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，5％脱脂牛奶室温封闭1.5h。分别用小鼠抗大鼠胰岛素(1∶1000)、小鼠抗大鼠胰高血糖素(1∶100)、兔抗大鼠Ngn3(1∶100)4℃孵育过夜，HRP-羊抗兔或小鼠IgG二抗孵育2h。用ECL发光液在暗室进行压片、显影、曝光。以GAPDH作为相对表达量基础，结果如下图3所示。
诱导后细胞胰岛相关蛋白的表达：Western印迹结果显示：胰岛细胞成熟标志物胰岛素、胰高血糖素、Ngn3蛋白的表达在转基因脂肪干细胞加多抗诱导组的表达量最高。
(5)葡萄糖刺激的胰岛素分泌诱导后细胞以33.0mmol/L葡萄糖培养后，ELISA法检测细胞培养上清液的胰岛素含量，参照试剂盒说明书操作。
葡萄糖刺激对诱导后细胞分泌胰岛素的影响结果如下表所示。
表3葡萄糖刺激对诱导后细胞分泌胰岛素的影响结果
分组 胰岛素浓度ng/mg
转基因脂肪干细胞多抗诱导组 29.42±0.19
未转基因间充质干细胞多抗诱导组 23.54±0.22
转基因脂肪干细胞诱导组 22.33±0.16
未转基因间充质干细胞诱导组 15.31±0.13
从表3的结果可以看出，用33.0mmol/L葡萄糖加诱导后细胞共培养，ELISA法检测细胞上清的胰岛素浓度，转基因脂肪干细胞多抗诱导组的最高，达到了29.42±0.19ng/mg蛋白质。说明转基因的干细胞以及抗体的联合作用下，具有较好的分化效果，细胞对葡萄糖有明显的胰岛素分泌反应。
实施例5小鼠模型试验
建立糖尿病动物模型：大鼠进行适应性饲养3d后，随机取10只作为正常对照组，其余建立糖尿病模型。首先用0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.2-4.5)将链脲佐菌素配制成0.1％注射液，避光冰浴，大鼠空腹18h后腹腔注射70mg/kg。注射后3d检测血糖，连续3次血糖浓度高于16.7mol/L表示造模成功。细胞移植：造模10d后，四组诱导组的细胞分别经尾静脉移植相应的细胞悬液2mL/只(细胞数量2×106个)。正常对照组和模型对照组经尾静脉注射不含任何细胞的培养液2mL/只。每2周移植1次，共移植2次。第2次移植后继续观察4周，然后血糖检测时先用体积分数为75％乙醇消毒大鼠尾端，然后使用罗氏血糖仪通过尾静脉采血检测大鼠空腹血糖水平。结果如图4所示。
细胞移植治疗后，与模型对照组相比，各治疗组大鼠血糖显著降低，由此可见，各治疗组细胞移植后均可不同程度的降低大鼠血糖，而转基因脂肪干细胞多抗诱导组降糖效果优于其他各组，具有较好的效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 洛阳轩智生物科技有限公司
<120> 基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accugggcau ucuuagcugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Thr Tyr Arg Leu Arg Ala His Gly Trp
20 25 30
Ile Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Glu Val Phe Leu Tyr Ser Ile Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Val Phe Lys Lys His Tyr
85 90 95
Lys Gly Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Cys Met
20 25 30
Leu Tyr Ala Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly His Asn Ala Ser His Ser Val Gly Gln Ser Gly Met Gly Ser
50 55 60
Ile Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Val Asp Ile Trp Ala Val Phe Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种将脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括(1)制备基因敲除的脂肪间充质干细胞；所述敲除采用CRISPR方法，具体的sgRNA序列如SEQ ID NO：1所示；(2)步骤(1)制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞培养融合至80％-90％后用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，单抗50μg/L，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d；其中单抗的轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种胰岛样细胞，其特征在于权利要求1所述脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法制备得到。
3.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求2所示的胰岛样细胞。
4.权利要求2所述的胰岛样细胞在制备用于糖尿病治疗的药物组合物中的用途。
5.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
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