CN117343190B - iPS诱导定向分化成心肌细胞的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及iPS诱导定向分化成心肌细胞的方法及应用。本发明基于SKP2抑制剂能够促进人iPS细胞分化成熟为心肌细胞的原理，利用重组SKP2蛋白蛋白免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，筛选出能够稳定分泌抗SKP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得的抗SKP2单克隆抗体具有高效价、高特异性、高亲和性的特点，同时通过使用SKP2单克隆抗体处理ips细胞后能够有效地促进分化为心肌细胞。
Description
技术领域
本申请涉及生物领域，具体的涉及iPS诱导定向分化成心肌细胞的方法及应用。
背景技术
iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相近，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同，其自我更新能力较强，且具有高度的分化能力。目前，iPS细胞可在体外被诱导生成所有210种构成人体的细胞，具有无限的疾病治疗前景。理论上，iPS细胞培养出的组织或器官移植回原患者身体内时，可避开自身免疫系统的攻击难题，同时以往ES细胞所产生的道德伦理问题也可以取得根本解决。因此，iPS细胞成为了再生医学中备受瞩目的重要细胞来源。干细胞技术颠覆了医学治疗的思路，未来的治病的药物，将不再是各种的化学合成物，而是秉持着「细胞的问题细胞解决，把像是小分子蛋白、抗体、干细胞等具有活性的物质送到体内，进而治疗疾病。诱导性多能干细胞（iPS干细胞），它的作用能分化与构成身体各种细胞，它能在极少量的皮肤碎片或血液中制造出来。日本干细胞科学家山中伸弥正是因为成功将成年细胞逆转为iPS细胞，于2012年得到了诺贝尔生医奖的殊荣。
目前iPS治疗是非常热门的干细胞种类，包括了眼角膜移植、帕金森氏症、黄斑部退化、心脏疾病、脊髓疾病、输血性疾病、关节炎、第一型糖尿病以及白血病等9 种疾病，在未来几年就有机会使用iPS干细胞在临床治疗。
我国自主研发的“人iPSC来源心肌细胞注射液”产品（HiCM-188）临床试验申请已获得批准，该产品就是利用iPS细胞分化而来的心肌细胞制成的。它可以通过静脉注射方式用于治疗严重慢性缺血性心力衰竭。与传统的治疗方法相比，这种治疗方法不仅更加安全，还能够显著改善患者的心功能和生命质量。化学诱导法的发展进一步丰富了体细胞“重编程”的方法。通过使用一些化学小分子，可以促使体细胞重新变成具有多能性的干细胞，进而分化成心肌细胞。这种方法的优点在于操作简便、效率高，而且可以避免使用基因编辑技术进行细胞改造所可能带来的伦理问题。此外，利用患者自身细胞加工形成的iPS细胞，其培养出的组织或器官在重新移植到患者体内后将被认定为自体组织，因此能够避开免疫系统的攻击。这种方法的优点在于避免了免疫排斥反应，从而提高了治疗的安全性和有效性。
总之，iPS细胞分化为心肌细胞的技术在心力衰竭治疗领域展现出了广阔的应用前景。在未来，随着相关研究的深入，这项技术有望为更多患者带来福音。但是目前，针对iPS细胞分化为心肌细胞的研究还不够多，提供可选择的替代产品还不够成熟。
发明内容
本发明一方面，根据研究发现ERRγ激动剂或SKP2抑制剂是在人iPS细胞来源的心肌细胞中毒性较小且促进蛋白质向TNNI3转移的化合物，促进心肌细胞的成熟。
因此，基于上述原理，本发明针对SKP2，提供了特异性的抑制剂SKP2单克隆抗体。
具体的，所述的SKP2单克隆抗体其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，本发明的抗体还可以采用本领域常规的抗体可变区修饰，包括以下步骤：1）将抗体可变区进行氨基酸序列改造，以改变其免疫学特性；2）将改造后的抗体可变区进行糖基化修饰，以改变其血清半衰期、免疫原性及药代动力学特性；3）将修饰后的抗体可变区进行二硫键还原，以增加其稳定性及生物活性。
进一步的，本发明还提供了所述单克隆抗体的同源物。
“同源物”是在单抗的编码的核苷酸序列、多肽序列、功能或结构水平上相似的生物活性分子。同源物可以包括与参考序列具有一定百分比同一性的序列衍生物。因此，在一个实施方案中，同源或衍生序列共有至少70％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少80％或85％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少95％的序列同一性。在一个更具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少50、55、60、65、70、75、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96，97、98或99％的序列同一性。同源或衍生核酸序列也可以通过它们在高严格性杂交条件下保持与参考核酸序列结合的能力来定义。与参考分子具有结构或功能相似性的同源物可以是参考分子的化学衍生物。检测、产生和筛选结构和功能同源物以及衍生物的方法是本领域已知的。
具体的，本发明的抗体可以是小鼠腹水制备也可以是通过基因工程和细胞工程手段，实现抗体可变区的改造和糖基化修饰，操作简单，生产效率较高，可实现工业化生产。
进一步的，本发明提供了一种将人皮肤成纤维细胞诱导生成心肌细胞的方法，所述方法包括使用本发明的SKP2单克隆抗体用于加速诱导成纤维细胞生成高活性的心肌细胞的步骤。
进一步的，所述的成纤维细胞是从皮肤组织分离的，或者采用商业化手段购买获得的。
进一步的，本发明提供了一种促进成纤维细胞诱导分化成为心肌细胞的培养基，其中所述培养基含有本发明的SKP2单克隆抗体。
具体的，本发明还提供了将成纤维细胞重编程为iPS细胞的步骤。其中分化步骤中使用的是本领域常规的心肌细胞诱导分化培养基。
一般而言，iPSC是通过宿主细胞中一种或多种“重编程因子”的瞬时表达(通常使用附加体载体引入的)而产生的。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(通常，此步骤的效率很低，因为没有使用选择标志物)。一旦细胞被“重新编程”并变得多能，它们就会失去附加体载体并利用内源基因产生因子。附加体载体的这样的损失导致被称为“零足迹”细胞的细胞。这是期望的，因为遗传修饰越少(尤其是在宿主细胞的基因组中)越好。因此，优选所得的hiPSC不具有永久的遗传修饰。
在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT：SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。
更进一步的，所述的重编程可以采用本领域较为成熟的重编程试剂盒转染获得。
本发明的分化的心脏细胞包括但不限于心肌细胞、结节心肌细胞、传导性心肌细胞、工作性心肌细胞、心肌细胞前体、心肌细胞祖细胞、心脏干细胞和心脏肌肉细胞。在一些实施方案中，心肌细胞前体是指能够(在没有去分化或重新编程的情况下)产生包括成熟(末期)心肌细胞的后代的细胞。心肌细胞前体细胞通常可以使用一种或多种选自GATA-4、Nkx2.5和MEF-2转录因子家族的标志物进行鉴定。在某些情况下，心肌细胞是指表达以下列表中的一个或多个标志物(有时至少3或5个标志物)的未成熟的心肌细胞或成熟的心肌细胞：心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白或心钠素因子(ANF)。在一些实施方案中，工程化的心脏细胞表现出自发2+的周期性收缩活性。在某些情况下，当在具有合适的Ca 浓度和电解质平衡的合适的组织培养环境中培养心脏细胞时，可以观察到细胞以周期性的方式沿细胞的一个轴收缩，然后从收缩释放，而没有必须将任何其他组分添加到培养基中。在一些实施方案中，心脏细胞是低免疫性心脏细胞。
本发明进一步的提供一种治疗心脏疾病的方法，包括给予本发明诱导的心肌细胞。在一些实施方案中，心脏病况或疾病选自小儿心肌病、年龄相关性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎症性心肌病、其他心肌病、心肌炎、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、局部缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症或心血管疾病。
该方法包括施用包含治疗有效量的本文所述的任一种分离的、工程化的分化的心肌细胞的组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含治疗有效的载体。在一些实施方案中，施用包括植入患者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。
在一些实施方案中，血管病况或疾病选自血管损伤、心血管疾病、血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、高血压、缺血性组织损伤、肢体缺血、中风、神经病和脑血管疾病。
在一些实施方案中，还向施用分化心脏细胞的患者施用了心脏药物。适用于联合疗法的心脏药物的举例说明性示例包括但不限于生长因子、编码生长因子的多核苷酸、血管生成剂、钙通道阻滞剂、降压剂、抗有丝分裂剂、正性肌力药、抗动脉粥样硬化剂、抗凝剂、β受体阻滞剂、抗心律失常药、抗炎药、血管扩张药、溶栓药、强心苷、抗生素、抗病毒药、抗真菌药、抑制原生动物的药物、硝酸盐、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、脑钠肽(BNP)；抗肿瘤药、类固醇等。
有益效果
本发明筛选出的能够稳定分泌抗SKP2单克隆抗体具有高效价、高特异性、高亲和性的特点；
本发明通过使用SKP2单克隆抗体处理ips细胞后能够有效地促进分化为心肌细胞，与不加单抗相比具有更好的促进分化效果，并且分化后的心肌细胞具有较好的活性。
附图说明
图1 不同单抗针对SKP2蛋白活性的影响
图2 SKP2-3F2单克隆抗体的Western blot分析结果
图3 各组心肌细胞的诱导率结果
实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被 这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解 本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语 具有与本公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1 SKP2单克隆抗体的制备
将100μg SKP2重组蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后对6-8周龄BALB/c雌性小鼠进行腹腔注射。此后每隔2周用等量的纯化蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行3次免疫。最后一次加强免疫3d后，取脾细胞融合。其中SKP2蛋白重组蛋白，品牌：LMAIBio，货号：ICA847Hu01。将处于对数生长期的SP2/0细胞与小鼠脾细胞按照常规方法进行细胞融合，将杂交瘤细胞培养在铺有饲养细胞的96孔板里。在37℃、5%CO2培养条件下用HAT选择性培养基培养。及时对融合细胞培养基半量换液，当杂交瘤细胞在96孔板中长至约三分之一面积时，开始采集细胞培养上清液通过间接ELISA法筛选阳性单克隆株。将筛选出来的杂交瘤细胞利用有限稀释法进行3次亚克隆，直至得到能够稳定分泌抗SKP2蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株共计7株。分别命名为2A3，4D6，3F2，4G1，4F6，5H2，5G7。
将上述7种单克隆抗体分别加入培养基的细胞密度为104个/ml的HFF-1人皮肤成纤维细胞（货号SNL-484，武汉尚恩生物），保证单抗在相同浓度100μg/ml下作用24h。离心收集细胞，使用PBS清洗细胞2次，选择同样细胞数量进行细胞裂解，通过Western blot检测处理前后各组的SKP2蛋白表达情况的变化，以未单抗处理的细胞蛋白表达量作为基础，计算各组SKP2蛋白表达抑制率，结果如图1所示。
从图1的结果可以看出，3F2单克隆抗体具有最好的抑制SKP2蛋白的效果，抑制率达到了90%以上，而其他几种单抗抑制率最高不到60%，因此，选择3F2单克隆抗体用于后续实验。
实施例2 SKP2-3F2单克隆抗体的制备及效价、亲和力和序列测定
取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.2mL灭菌过的液体石蜡，7d后每只小鼠腹腔注射2x106/0.5mL无血清的3F2杂交瘤细胞株，待小鼠腹腔胀大时采集腹水，3000xg离心10min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水，将单抗采用柱纯化后，冻存保存备用。利用间接ELISA方法测定腹水效价。亲和力测定公式:K＝([Ag′]/[Ag]t-1)/2(n[Ab′]-[Ab]t)，其中:[Ab′]表示抗原浓度为[Ag′]时OD＝1/2ODmax对应的抗体摩尔浓度，[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时OD＝1/2ODmax对应的抗体摩尔浓度，n为抗原[Ag′]与[Ag]t间的稀释倍数。结果如表1所示。
表1 SKP2-3F2单克隆抗体的腹水效价、亲和力结果
| SKP2-3F2单克隆抗体 | 结果 |
| 腹水效价 | 2.0×107 |
| 亲和力 | 5.63×109M-1 |
从表1的结果可以看出，本发明的单克隆抗体具有较强的亲和力，活性较好，适宜用于生物学实验。
委托快序生物进行抗体可变区序列分析，结果显示，所述SKP2单克隆抗体其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例3 SKP2-3F2单克隆抗体的特异性鉴定
取SKP2重组蛋白和BSA对照进行SDS-PAGE，使用Pyxis Protein Transfer Stack试剂盒快速转印NC膜，含5％脱脂奶的PBST室温封闭2h，PBST洗涤3次,以1：5000稀释的3F2单抗纯化后腹水抗体作为一抗，4℃过夜孵育，加入1：5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗，室温孵育2h，PBST洗涤6，BeyoECL Star显色液显色，超灵敏多功能成像仪观察并保存结果。
从图2的Western blot分析结果可以看出， SKP2-3F2单克隆抗体能够特异性的识别SKP2重组蛋白，而不能识别BSA。
实施例4 皮肤成纤维细胞制备iPS细胞
取手术后分离的儿童包皮皮肤约0.3cm×0.3cm， 将其置于含有青霉素(100kU/L)和链霉素(100mg/L)的HBSS中反复漂洗后，去除皮下脂肪。在60mm培养皿中用眼科剪将皮肤剪成1mm2大小，置于含有青霉素(100kU/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM/F12(1:1)液3ml 37℃下置于体积分数为5%的CO2、95%空气、饱和湿度孵箱中过夜。次日挑除汗腺腺体，待成纤维细胞生长明显时，吸弃旧培养液，用无Na+、Mg2+的HBSS洗2次，加入含有质量分数为0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的D-Hank消化液约1ml 37℃下置于5%CO2、95%空气、饱和湿度条件下孵育2min，加入含10%胎牛血清的DMEM约2ml终止消化，1000r/min离心6min并收集细胞，用含胎牛血清(10%)、青霉素(100kU/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM 分散细胞，细胞以1x104/ml接种4ml至25cm²的培养瓶中，在37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度条件下培养，经过连续5次传代培养后，可得到纯化的成纤维细胞。去少量细胞进行HE染色发现，细胞为长梭形，细胞核为淡蓝色，细胞浆为粉红色，通过染色体核型分析显示为46条染色体，鉴定制备获得了较为纯净的成纤维细胞。
将分离培养的皮肤成纤维细胞调整细胞数为1×106个，100μl电转缓冲液中加入3μl Epi5TM Episomal iPSC 重编程试剂盒中的重编程因子，采用常规电转染细胞按2ml/孔接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养。并使用ReproTeSRTM重编程培养基隔天换液，转染后第8天，将细胞消化后重新接种在5代小鼠成纤维细胞制作的饲养层上，第18天，观察iPSCs可见典型的克隆，采用试剂盒检测干细胞多能性基因发现OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28均阳性表达，表明制备获得了iPS细胞。将iPS克隆重新接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养，使用mTeSRTM培养基继续培养，筛选纯化后备用。
进一步的，为了检验iPS细胞的活性，将制备的iPS细胞体外悬浮培养形成EB，裂解细胞提取RNA，用于RT-PCR检测EB细胞基因表达量，结果显示，EB细胞的胚层分化基因外胚层Nestin、中胚层Eomes、内胚层AFP的表达水平均显著高于对照组iPS细胞5倍以上（P<0.01），实验结果表明所建立的人iPS细胞具有体外分化能力。
实施例5 iPS细胞向心肌细胞的分化
根据CardioEasy®人心肌细胞分化试剂盒(北京赛贝生物技术有限公司,货号CA2004500)说明配制心肌分化完全培养基I、II、Ⅲ液，平衡至室温。实施例4制备的iPSCs细胞生长至80%融合时吸去原液，PBS清洗，加入2mL心肌分化Ⅰ液，48h后吸去旧液，PBS清洗后加入心肌分化Ⅱ液；48h后更换为心肌分化Ⅲ液，37℃、5%CO2培养箱持续培养，每48h更换培养液，直至观察到细胞搏动。
低浓度单抗处理组：实施例4制备的iPSCs细胞生长至80%融合时吸去原液，PBS清洗，加入2mL心肌分化Ⅰ液（其中含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体100μg/mL），48h后吸去旧液，PBS清洗后加入心肌分化Ⅱ液（其中含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体100μg/mL）；48h后更换为心肌分化Ⅲ液（其中含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体100μg/mL），37℃、5%CO2培养箱持续培养，每48h更换培养液，每次更换的培养液中均含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体100μg/mL，直至观察到细胞搏动。
高浓度单抗处理组：实施例4制备的iPSCs细胞生长至80%融合时吸去原液，PBS清洗，加入2mL心肌分化Ⅰ液（其中含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体200μg/mL），48h后吸去旧液，PBS清洗后加入心肌分化Ⅱ液（其中含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体200μg/mL）；48h后更换为心肌分化Ⅲ液（其中含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体200μg/mL），37℃、5%CO2培养箱持续培养，每48h更换培养液，每次更换的培养液中均含有终浓度为实施例2纯化的SKP2-3F2单克隆抗体200μg/mL，直至观察到细胞搏动。以未分化完全培养基培养的iPS细胞作为对照。
各组细胞出现自主搏动的时间结果显示，未采用单抗处理的iPSCs心肌诱导分化1周左右聚集形成团簇，第8天可观察到细胞簇自主搏动；采用低浓度单抗处理的iPSCs第7天即可观察到细胞簇自主搏动；采用低浓度单抗处理的iPSCs第6天即可观察到细胞簇自主搏动，显著的降低了诱导心肌细胞的时间。这说明单克隆抗体能够通过抑制SKP2活性进而促进蛋白质向TNNI3转移的化合物，促进心肌细胞的分化成熟。
各组继续诱导到15d，统计各组中在同一光镜下各组的诱导效率，结果如图3所示。
从图3可以看出，与单独使用试剂盒组进行诱导相比，采用低浓度单抗和高浓度单抗处理后，能够显著的提高心肌细胞的诱导效率（P<0.05）,特别是采用高浓度单抗处理后心肌细胞的诱导效率达到（92.53±2.96）%，诱导成功率较高。
此外，将各组的搏动区域细胞采用4%多聚甲醛固定，0.2%TritonX-100处理1h，5%脱脂牛奶孵育2h，TNNT-2（1∶200）和α-actinin一抗孵育，加入AlexaFluor488二抗常温孵育，胞核DAPI染色，荧光显微镜观察拍照。结果显示搏动细胞中均表达心肌标志物TNNT-2和α-actinin，说明分化成为了高活性的心肌细胞。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种用于诱导ips细胞向心肌细胞分化的特异性针对SKP2的单克隆抗体，其特征在于轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的一种用于诱导ips细胞向心肌细胞分化的特异性针对SKP2的单克隆抗体在制备用于促进ips细胞分化为心肌细胞的培养基中的用途；其中所述的ips细胞是从人皮肤成纤维细胞重编程后制备获得的；所述的重编程是采用Epi5TM Episomal iPSC重编程试剂盒实现；其中所述的培养基基础为CardioEasy®人心肌细胞分化试剂盒制备的。
3.一种ips细胞诱导定向分化成心肌细胞iHCM的方法，其特征在于：将皮肤成纤维细胞调整细胞数为1×106个，100μl电转缓冲液中加入 3μl Epi5TM Episomal iPSC 重编程试剂盒中的重编程因子，采用常规电转染细胞按2ml/孔接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养；并使用ReproTeSRTM重编程培养基隔天换液，转染后第8天，将细胞消化后重新接种在第5代小鼠成纤维细胞制作的饲养层上，培养18天，观察iPSCs可见典型的克隆，将ips克隆重新接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养，使用mTeSRTM培养基继续培养；根据CardioEasy®人心肌细胞分化试剂盒说明配制心肌分化完全培养基I、II、Ⅲ液，将制备的iPSCs细胞生长至80%融合时吸去原液，PBS清洗，加入2mL心肌分化Ⅰ液其中含有权利要求1中所述的一种用于诱导ips细胞向心肌细胞分化的特异性针对SKP2的单克隆抗体终浓度200μg/mL，48h后吸去旧液，PBS清洗后加入心肌分化Ⅱ液其中含有权利要求1中所述的一种用于诱导ips细胞向心肌细胞分化的特异性针对SKP2的单克隆抗体终浓度为200μg/mL；48h后更换为心肌分化Ⅲ液其中含有权利要求1中所述的一种用于诱导ips细胞向心肌细胞分化的特异性针对SKP2的单克隆抗体终浓度200μg/mL，37℃、5%CO2培养箱持续培养，每48h更换培养液，每次更换的培养液中均含有权利要求1中所述的一种用于诱导ips细胞向心肌细胞分化的特异性针对SKP2的单克隆抗体终浓度200μg/mL，直至观察到细胞搏动，即得分化的心肌细胞。
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