CN106459922A - Cd82阳性心肌前体细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供一种向心肌细胞特异性分化诱导的心肌前体细胞、一种制备该心肌前体细胞的方法。如果使用具备下述步骤的CD82阳性细胞的制备方法，则能够制备用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞，该制备方法依次具备如下步骤：获得干细胞的步骤(a)；对干细胞进行向心血管细胞分化诱导的处理的步骤(b)；以及从在步骤(b)中经分化诱导处理的干细胞中分离CD82阳性细胞的步骤(c)，该CD82阳性细胞是选自CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18和CD120a中的至少一个细胞表面标记为阴性的细胞。

Description

CD82阳性心肌前体细胞
技术领域
本发明涉及一种选自CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18和CD120a中的至少一个细胞表面标记为阴性的用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞、一种包含该CD82阳性细胞的心脏病治疗剂、一种上述CD82阳性细胞的制备方法、一种通过该制备方法得到的用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞。
背景技术
心脏病在各发达国家中位列死因的前位，例如，根据2011～2013年日本厚生劳动省的死因统计资料，报告了心脏病在日本的死因中高居第二位。
狭心病和心肌梗塞这样的缺血性心脏病的发病原因是冠状动脉内变窄或者冠状动脉中血栓堵塞所导致的流向心肌的血流停滞。为治疗该缺血性心脏病，一直施行用导管来改善血流的介入治疗，但一旦心肌发生坏死则不能通过介入治疗来再生。因此，在因缺血消除后存活心肌的减少而导致的重度心力衰竭的病情、或者虽不是由缺血导致的但心肌细胞慢性进行性地逐渐丧失而发展为心力衰竭的病情等心脏病中，尚无有效的治疗方法已成为临床上的问题。
多能干细胞是具有能够分化为存在于生物体内的所有细胞的能力的细胞，胚胎干细胞(ES细胞)是其代表例。一直期待人ES细胞利用该性质而应用到心肌再生医疗等再生医疗中，但是存在由于移植分化的ES细胞而引发排斥反应的问题。
近年来，山中等人的研究小组报告了通过使用小鼠体细胞进行四种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc)的表达来诱导去分化，开发出具有类似于ES细胞的多能性和增殖能力的诱导性多能干细胞，即所谓的iPS细胞(Induced pluripotent stem cell)(非专利文献1)，并在随后报告了从人的分化细胞也可以制作iPS细胞(非专利文献2)。该人iPS细胞可以使用作为治疗对象的患者来源的细胞来制作，因此作为用于制备无排斥反应的心肌组织的工具而受到期待。因此，希望尽快建立使用人iPS细胞的心肌再生疗法。
使用人iPS细胞的心肌再生疗法中，认为能成为供给源的细胞候选是由人iPS细胞分化诱导而成的心肌细胞和处于其分化前阶段的心肌前体细胞。
在使用由人iPS细胞分化诱导而成的心肌细胞进行心肌再生疗法时，心肌细胞基本不增殖，而且在受体心脏的成活率也低，因此考虑在由人iPS细胞分化诱导对于移植足够数量的心肌细胞，并制成在心脏成活率提高的心肌细胞膜片后再进行给予。
另一方面，在使用心肌前体细胞进行心肌再生疗法时，首先关键是对特异性分化为心肌的前体细胞进行分离纯化。作为心肌前体细胞，例如，Gordon Keller等人报告了KDR阳性PDGFRα阳性细胞(非专利文献3、4)。但是，KDR和PDGFRα在早期的中胚层中也观察到有表达，因此不能认为是能够对具有心肌特异性分化能力的细胞群进行特定的细胞表面标记。此外，最近Irving L.Weissman等人报告了CD13和ROR2作为心肌和血管前体细胞(心血管前体细胞)的细胞表面标记(非专利文献5)。虽然确实CD13阳性ROR2阳性细胞中包含能够分化为心肌的细胞，但也包含能够分化为心肌以外的血管内皮或血管壁的细胞。此外，在原条(primitive streak)期的早期的中胚层中也观察到CD13和ROR2表达，因此不能认为CD13和ROR2是能够对具有心肌特异性分化能力的细胞群进行特定的细胞表面标记。此外还报告了Nkx2.5、islet1、Tbx5、Tbx20、GATA4、MEF2C等作为心肌前体细胞的标记(非专利文献6)，但这些均不是细胞表面标记而是转录因子，因此当对表达这些转录因子的心肌前体细胞进行分离纯化时，需要进行基因改造等，不能对保持原样的心肌前体细胞进行分离纯化。此外，报告了采集心肌组织并直接对其中含有的向心肌细胞分化的能力优异的多能干细胞进行选择/分离纯化的方法(专利文献1)，但是从将心肌组织作为供给源的角度来看，不能保证得到用于治疗的足够细胞数，而且能否进行临床应用也存在疑问，除此之外，从需要获得心肌组织供体的角度来看，难以认为其在通用性上优异。因此，需要对具有心肌特异性分化能力的心肌前体细胞的细胞表面标记进行鉴定。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006/093276号公报
非专利文献
非专利文献1：Takahashi,K.et al.,Cell 126:663-676(2006)
非专利文献2：Takahashi,K.et al.,Cell 131:861-872(2007)
非专利文献3：Abbott,G.W.et al.,Nature 453:524-528(2008)
非专利文献4：Kattman,S.J.et al.,Cell Stem Cell 8:228-240(2011)
非专利文献5：Ardehali,R.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.110:3405-3410(2013)
非专利文献6：Burridge,P.W.et al.,Cell Stem Cell 10:16-28(2012)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题是提供一种向心肌细胞特异性分化诱导的心肌前体细胞、一种制备该心肌前体细胞的方法。
用于解决课题的技术方案
本发明人等为了解决上述课题而不断进行了努力研究。在其过程中，发现了从人iPS细胞向心肌细胞进行分化诱导处理后，从第4天到第5天，开始出现特异性分化为心肌细胞的心肌前体细胞。此外，还发现了该心肌前体细胞是CD82阳性细胞。进一步地通过体外(in vitro)和体内(in vivo)的分析，确认了该CD82阳性细胞在各种培养条件下或向各种组织/脏器的移植中也一直高效地分化诱导成心肌细胞。本发明正是基于上述的发现而完成的。
即，本发明涉及(1)，一种用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞，其是选自下面的[细胞表面标记A组]中的至少一个细胞表面标记为阴性的细胞。
[细胞表面标记A组]：CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18、CD120a。
此外，本发明涉及(2)，经分离纯化而得到的上述(1)所述的CD82阳性细胞；(3)，上述(1)或(2)所述的CD82阳性细胞，其是选自下面的[细胞表面标记B组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的[细胞表面标记C组]中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞。
[细胞表面标记B组]：CD7、CD37、CD43、CD144、STRO-1、CD177、CD163，
[细胞表面标记C组]：CD137L、CD140b、CD180、CD252、CD344、CD118、CD99R。
此外，本发明涉及(4)，上述(1)～(3)中任一项所述的CD82阳性细胞，其是选自下面的[细胞表面标记D组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的[细胞表面标记E组]中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞。
[细胞表面标记D组]：CD49a、CD117、CD31、CD106、CD45、CD14、HLA-DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34、CD4，
[细胞表面标记E组]：CD166、CD304、CD90。
此外，本发明涉及(5)，上述(1)～(4)中任一项所述的CD82阳性细胞，其是选自下面的[细胞表面标记F组]中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞。
[细胞表面标记F组]：ROR2、CD13、PDGFRα、KDR。
此外，本发明涉及(6)，上述(1)～(5)中任一项所述的CD82阳性细胞，其用冷冻保存。
此外，本发明涉及(7)，一种心脏病治疗剂，其包含上述(1)～(6)中任一项所述的CD82阳性细胞
此外，本发明涉及(8)，一种CD82阳性细胞的制备方法，其具备下面的步骤(a)～(c)：
(a)获得干细胞的步骤；
(b)对干细胞进行向心血管细胞分化诱导处理的步骤；
(c)从在步骤(b)中经分化诱导处理的干细胞中分离CD82阳性细胞的步骤，该CD82阳性细胞是选自下面的[细胞表面标记A组]中的至少一个细胞表面标记为阴性的细胞；
[细胞表面标记A组]：CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18、CD120a。
此外，本发明涉及(9)，上述(8)所述的制备方法，其中，干细胞为人多能干细胞；(10)，上述(9)所述的制备方法，其中，人多能干细胞为人诱导性多能干细胞；(11)，上述(8)～(10)中任一项所述的制备方法，其中，向心血管细胞的分化诱导处理是向心肌前体细胞的分化诱导处理；(12)，上述(8)～(11)中任一项所述的制备方法，其中，CD82阳性细胞是选自下面的[细胞表面标记B组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的[细胞表面标记C组]中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞。
[细胞表面标记B组]：CD7、CD37、CD43、CD144、STRO-1、CD177、CD163，
[细胞表面标记C组]：CD137L、CD140b、CD180、CD252、CD344、CD118、CD99R。
此外，本发明涉及(13)，上述(8)～(12)中任一项所述的制备方法，其中，CD82阳性细胞是选自下面的[细胞表面标记D组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的[细胞表面标记E组]中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞。
[细胞表面标记D组]：CD49a、CD117、CD31、CD106、CD45、CD14、HLA-DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34、CD4，
[细胞表面标记E组]：CD166、CD304、CD90。
此外，本发明涉及(14)，上述(8)～(13)中任一项所述的制备方法，其中，CD82阳性细胞是选自下面的[细胞表面标记F组]中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞。
[细胞表面标记F组]：ROR2、CD13、PDGFRα、KDR。
此外，本发明涉及(15)，上述(8)～(14)中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(c)中，在步骤(b)中经分化诱导处理后第4～8天，分离CD82阳性细胞。
此外，本发明涉及(16)，一种用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞，其是通过上述(8)～(15)中任一项所述的制备方法而得到的。
此外，作为本发明其他的实施方式，除了可列举出由上述CD82阳性细胞组成的心肌前体细胞、包含上述CD82阳性细胞的含心肌前体细胞组合物之外，还可列举出通过将上述心脏病治疗剂给心脏病患者用药来治疗心脏病的方法、或用于治疗心脏病中的上述CD82阳性细胞、或为制造以治疗心脏病为目的的药物而使用上述CD82阳性细胞。
此外，作为本发明其他的实施方式，可举出包括通过荧光激活细胞分选器(FACS)或全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)，从细胞群体中分离纯化上述CD82阳性细胞来制备CD82阳性细胞的方法，其中，荧光激活细胞分选器(FACS)使用用荧光物质标记的抗CD82抗体、用荧光物质标记的针对选自上述[细胞表面标记A组]中的至少一个细胞表面标记的抗体；全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)使用用标记物质标记的抗CD82抗体、用标记物质标记的针对选自上述[细胞表面标记A组]中的至少一个细胞表面标记的抗体、针对所述标记物质的抗体与MACS微珠(磁性微珠)的共轭抗体。
发明效果
用作本发明心肌前体细胞的CD73阴性、CD44阴性、CD105阴性、CD121a阴性、CD18阴性或CD120a阴性、且CD82阳性细胞(下面有时称为“制备的心肌前体细胞”)由于能特异性分化诱导为心肌细胞，因此可用于如下心脏病的治疗：表现出梗阻性肥厚型心肌病、非梗阻性肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右心室发育不良、未分类心肌病、特发性心肌病、扩张型心肌病、扩张型心肌病样病态的缺血性心肌病、高血压性心肌病、瓣膜性心肌病、扩张期肥厚型心肌病、与胶原病或自我免疫性疾患相关联的心脏结节病或淀粉样变性病、遗传性心肌病、后天性心肌病、心肌炎、心肌炎后心肌病、药物或中毒引起的药物诱发性心肌病、酒精性心肌病、放射性心肌病、左心室致密化不全、肌营养不良性心肌病、线粒体心肌病、代谢异常引起的心肌病、围产期心肌病等心肌病；由急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、亚急性心肌梗塞、顽固性心绞痛等缺血性心脏病/心肌梗塞、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、重度心力衰竭、先天性心脏病引起的心力衰竭等心力衰竭、先天性心脏病、室性心律失常、室上性心律失常、快速性心律失常、缓慢性心律失常、致命性心律失常等心律失常等。例如，在使用心肌细胞进行心脏病治疗时，由于心肌细胞基本不增殖，此外在心脏的成活率低，因此通常在保证对于移植足够数量的心肌细胞的同时，需要制作在心脏成活率提高的心肌细胞膜片，但本发明制备的心肌前体细胞由于具有高自我增殖能力、高心肌分化能力和向心肌的高成活率，因此在作为细胞膜片或细胞悬浮液进行移植时，能够减少所需的细胞数，此外，将本发明制备的心肌前体细胞作为细胞悬浮液进行移植时，无需制作心肌细胞膜片，不仅在费用-效果或时间-效果方面上优异，而且可以用利用导管注入到心脏病患者患处(心脏)的方法给予制备的心肌前体细胞，因此期待着能以微创且可重复给予地对心脏病治疗作出贡献。
此外根据本发明，制备的心肌前体细胞即使在进行冷冻与解冻处理后，也具有高存活率和向心肌细胞的高分化能力，因此能够进行冷冻保存。
附图说明
图1中的图1A是示意性表示改良的DD方法(Modified DD protocol)的图。图1B是示意性表示在对改良的DD方法作进一步修改后的本实施例中使用的方法(下面称为“本发明方法”)的图。
图2是表示在使人iPS细胞(Induced pluripotent stem cell)向心肌细胞分化诱导后第4天和第5天，使用荧光激活细胞分选器(FACS)提纯KDR阳性PDGFRα阳性细胞，对在血清存在下培养该细胞时向心肌细胞(cTnT[心肌肌钙蛋白T]阳性细胞)的分化效率进行分析的结果图。纵轴表示心肌细胞(cTnT阳性细胞)占全部细胞的比例(％)(平均值±标准偏差、[n＝4])。此外，图中“*”表示统计学上具有显著性差异(P<0.0001)。
图3是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第3～11天，使用流式细胞仪分析CD82(纵轴)与PDGFRα(横轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“CD82阳性PDGFRα阴性细胞群(群体)”、“CD82阳性PDGFRα阳性细胞群”、“CD82阴性PDGFRα阴性细胞群”和“CD82阴性PDGFRα阳性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图4是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第4～6天，使用流式细胞仪分析CD82(横轴)与CD13(纵轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“CD82阴性CD13阳性细胞群”、“CD82阳性CD13阳性细胞群”、“CD82阴性CD13阴性细胞群”和“CD82阳性CD13阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图5是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第9天和第15天，使用流式细胞仪分析CD82(横轴)与cTnT(纵轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“CD82阴性cTnT阳性细胞群”、“CD82阳性cTnT阳性细胞群”、“CD82阴性cTnT阴性细胞群”和“CD82阳性cTnT阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图6是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第5天，分别提纯CD82阳性CD13阳性细胞(图中、“CD82阳性细胞”)和CD82阴性CD13阳性细胞(图中、“CD82阴性细胞”)，对在血清存在下培养该细胞时向心肌细胞(cTnT阳性细胞[cTnT阳性VCAM1阴性细胞+cTnT阳性VCAM1阳性细胞])的分化效率进行分析的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“cTnT阳性VCAM1阴性细胞群”、“cTnT阳性VCAM1阳性细胞群”、“cTnT阴性VCAM1阴性细胞群”和“cTnT阴性VCAM1阳性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。图中82.6％和26.4％表示分别在血清存在下培养CD82阳性细胞和CD82阴性细胞时的cTnT阳性细胞(将cTnT阳性VCAM1阳性细胞群与cTnT阳性VCAM1阴性细胞群加在一起的细胞)。
图7是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第6天，分离纯化CD82阳性细胞，并在移植到重症联合免疫缺陷C.B-17/lcr-scid/scidJcl(日本克莱尔株式会社(CLEAJapan,Inc.)制)(SCID；Sevefe Combined ImmunoDeficiency)小鼠的肾被膜下后第2周，制作肾被膜的组织切片，用免疫组织染色法进行分析的结果图。(a)表示DAPI(细胞核)染色图像，(b)表示HNA(Human Nuclear Antigen)(移植的CD82阳性细胞来源的细胞)染色图像，(c)表示cTnT(心肌细胞)染色图像、(d)表示DAPI染色图像与HNA染色图像叠加的图像，(e)表示DAPI染色图像、HNA染色图像及cTnT染色图像叠加的图像。
图8是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第6天，分离纯化CD82阳性细胞(CD82阳性CD13阳性PDGFRα阳性细胞)，并在移植到心肌梗塞模型大鼠F344N-Jcl rnu/rnu的心脏后第4周，制作心脏的组织切片，用免疫组织染色法进行分析的结果图。图8B表示发生梗塞的区域(Infarcted Area)的相位差图像，图8A表示在图8B方框内区域的cTnT和Hoechst33258染色图像。
图9是对在血清存在下培养冷冻保存的CD82阳性细胞时向心肌细胞(cTnT阳性细胞[cTnT阳性VCAM1阴性细胞+cTnT阳性VCAM1阳性细胞])的分化效率进行分析的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“cTnT阳性VCAM1阴性细胞群”、“cTnT阳性VCAM1阳性细胞群”、“cTnT阴性VCAM1阴性细胞群”和“cTnT阴性VCAM1阳性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。图中的94.4％表示在血清存在下培养冷冻保存的CD82阳性细胞时的cTnT阳性细胞(将cTnT阳性VCAM1阳性细胞群与cTnT阳性VCAM1阴性细胞群加在一起的细胞)。
图10是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第4天和第6.5天，使用流式细胞仪分析PDGFRα(纵轴)与9种细胞表面标记(CD105、CD121a、CD18、CD120a、CD45、CD14、CD31、HLA-DR和CD38)(横轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“各种细胞表面标记阴性PDGFRα阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阳性PDGFRα阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阴性PDGFRα阴性细胞群”和“各种细胞表面标记阳性PDGFRα阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图11是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第4天和第6.5天，使用流式细胞仪分析PDGFRα(纵轴)与9种细胞表面标记(CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e和CD62l)(横轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“各种细胞表面标记阴性PDGFRα阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阳性PDGFRα阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阴性PDGFRα阴性细胞群”和“各种细胞表面标记阳性PDGFRα阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图12是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第4天和第6.5天，使用流式细胞仪分析PDGFRα(纵轴)与4种细胞表面标记(CD62p、CD120b、CD34和CD4)(横轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“各种细胞表面标记阴性PDGFRα阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阳性PDGFRα阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阴性PDGFRα阴性细胞群”和“各种细胞表面标记阳性PDGFRα阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图13是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第6天，使用流式细胞仪分析CD82与15种细胞表面标记(CD7、CD37、CD43、CD49a、CD18、CD105、CD144、STRO-1、CD177、CD73、CD44、CD117[c-kit]、CD163、CD31和CD106)表达的结果图。图中从上起第1和2段、从第3段左起第1～3个中，方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“各种细胞表面标记阴性CD82阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阳性CD82阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阴性CD82阴性细胞群”和“各种细胞表面标记阳性CD82阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。此外，图中从上起第3段右起的第1和2个中，方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“CD82阴性各种细胞表面标记阳性细胞群”、“CD82阳性各种细胞表面标记阳性细胞群”、“CD82阴性各种细胞表面标记阴性细胞群”和“CD82阳性各种细胞表面标记阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
图14是表示在使人iPS细胞向心肌细胞分化诱导后第6天，使用流式细胞仪分析CD82(纵轴)与11种细胞表面标记(ROR2、CD137L、CD140b[PDGFRb]、CD166[ALCAM]、CD180、CD252[OX40L]、CD344[Frizzled4]、CD304[Neurophilin-1]、CD118[LIF-R]、CD99R和CD90)(横轴)表达的结果图。图中方框内的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“各种细胞表面标记阴性CD82阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阳性CD82阳性细胞群”、“各种细胞表面标记阴性CD82阴性细胞群”和“各种细胞表面标记阳性CD82阴性细胞群”，这4种细胞群中各细胞群的细胞数占全部细胞数的比例(％)表示在各区域中。
具体实施方式
本发明制备的心肌前体细胞是限定为“用作心肌前体细胞”用途的CD73阴性、CD44阴性、CD105阴性、CD121a阴性、CD18阴性或CD120a阴性、且CD82阳性细胞，此处的“CD82阳性”是指在细胞表面上表达CD(分化簇、cluster of differentiation)82抗原。CD82表达可通过利用以下方法予以确认：定量RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction)法、RT-PCR法、Southern印迹法等对CD82基因的mRNA表达进行分析的方法；蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA法、EIA法、RIA法等对CD82蛋白质表达进行分析的方法。
本发明中，“心肌前体细胞”是指在各种培养条件下或向组织/脏器的移植中，特异性分化为心肌细胞的细胞。
作为选自上述[细胞表面标记A组]中的至少一个细胞表面标记为阴性的CD82阳性细胞，具体地可列举出：CD73为阴性的CD82阳性细胞、CD44为阴性的CD82阳性细胞、CD105为阴性的CD82阳性细胞、CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD73和CD44为阴性的CD82阳性细胞、CD73和CD105为阴性的CD82阳性细胞、CD73和CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD73和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD73和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD44和CD105为阴性的CD82阳性细胞、CD44和CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD44和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD44和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD105和CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD105和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD105和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD121a和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD121a和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD18和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44和CD105为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44和CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD44、CD105和CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD44、CD105和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD44、CD105和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD105、CD121a和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD105、CD121a和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD121a、CD18和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44、CD105和CD121a为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44、CD105和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44、CD105和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD44、CD105、CD121a和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD44、CD105、CD121a和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD105、CD121a、CD18和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44、CD105、CD121a和CD18为阴性的CD82阳性细胞、CD73、CD44、CD105、CD121a和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、CD44、CD105、CD121a、CD18和CD120a为阴性的CD82阳性细胞、以及CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18和CD120a为阴性的CD82阳性细胞。
本发明制备的心肌前体细胞是CD73阴性、CD44阴性、CD105阴性、CD121a阴性、CD18阴性或CD120a阴性、且CD82阳性细胞，也可以是包含在CD82阴性细胞等其他细胞群体中的状态，作为此处包含在其他细胞群体中的制备的心肌前体细胞的比例，可列举出：至少为4％、至少为10％、至少为30％、至少为40％、至少为50％、至少为60％、至少为70％、至少为80％、至少为85％、至少为88％、至少为90％、至少为93％、至少为95％、至少为98％等。
用本发明制备的心肌前体细胞来制备高纯度心肌细胞群体时，优选使用经分离纯化处理的“CD73阴性、CD44阴性、CD105阴性、CD121a阴性、CD18阴性或CD120a阴性、且CD82阳性细胞”，即高纯度制备的心肌前体细胞。上述“高纯度心肌细胞群体”或“高纯度制备的心肌前体细胞”是指细胞群体中所包含的心肌细胞或制备的心肌前体细胞数的比例为至少80％、优选为至少85％、更优选为至少88％、进一步优选为至少90％、更进一步优选为至少93％、特别优选为至少95％、最优选为至少98％。
制备的心肌前体细胞可以通过荧光激活细胞分选器(FACS)或全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)进行分离纯化处理，其中，荧光激活细胞分选器(FACS)使用用荧光物质标记的抗CD82抗体；全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)使用用荧光物质或生物素、抗生物素蛋白等标记物质标记的抗CD82抗体、针对该标记物质的抗体与MACS微珠(磁性微珠)的共轭抗体。作为上述荧光物质，可列举出：别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(PE)、FITC(异硫氰酸荧光素)、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、PE-Texas Red、PE-Cy5、PE-Cy7等。
制备的心肌前体细胞的纯度可以用上述用荧光物质标记的抗CD82抗体对CD82阳性细胞进行染色、用Hoechst 33342、Hoechst 33258等细胞核染色荧光物质对活细胞进行染色、或者用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚、4',6-diamidino-2-phenylindole)、TO-PRO-3Iodide Quinolinium,4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodide、LIVE/DEAD可固定死细胞染料(Fixable DeadCell Stain)(美国生命技术公司(Life Technology)制)等细胞核染色荧光物质对死细胞进行染色，并通过FACS分析对活细胞数与CD82阳性细胞数进行分析，从而计算出活细胞数与CD82阳性细胞之比。
本发明制备的心肌前体细胞通过如下方式使其更具有特征：选自上述[细胞表面标记B组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自上述[细胞表面标记C组]中的至少一个细胞表面标记为阳性；选自上述[细胞表面标记D组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自上述[细胞表面标记E组]中的至少一个细胞表面标记为阳性；选自上述[细胞表面标记F组]中的至少一个细胞表面标记为阳性。
上述[细胞表面标记A组]、[细胞表面标记B组]、[细胞表面标记C组]、[细胞表面标记D组]、[细胞表面标记E组]和[细胞表面标记F组]中所包含的细胞表面标记表达可通过利用以下方法进行检测来予以确认：定量RT-PCR法、RT-PCR法、Southern印迹法等分析mRNA表达的方法；蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA法、EIA法、RIA法等分析蛋白质表达的方法。
本发明制备的心肌前体细胞通常以存在于液体中的状态或用液体弄湿的(潮湿的)状态下使用。作为该液体，只要能使CD82阳性细胞存活/保持的液体，就没有特别限制，包括：含血清或无血清培养液、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水、林格氏液(乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、碳酸氢盐林格氏液等)、5％葡萄糖水溶液等生理性水溶液。作为上述含血清培养液，可列举出：含0.1～30(v/v)％的血清(胎牛血清[Fetal bovine serum；FBS]、小牛血清[Calf bovine serum；CS]等)的动物细胞培养用培养液(DMEM、EMEM、IMDM、RPMI1640、αMEM、F-12、F-10、M-199、AIM-V等)，此外，作为上述无血清培养液，可列举出：适量(例如1～30％)添加有市售的B27添加剂(不含胰岛素)(美国生命技术公司制)、N2添加剂(美国生命技术公司制)、B27添加剂(美国生命技术公司制)、Knockout血清替代物(Serum Replacement)(美国英杰生命技术公司(InvitrogenCorporation)制)等血清替代物的上述动物细胞培养用培养液等。
此外，上述含血清或无血清培养液中，根据需要也可以适当补充如下：例如，还原剂(例如，2-巯基乙醇、二硫苏糖醇[dithiothreitol；DTT]等)、细胞生长因子(例如，胰岛素、表皮生长因子[EGF；Epidermal growth factor]、胰岛素样生长因子[IGF；Insulin-like growth factor]、碱性成纤维细胞生长因子[bFGF；basic fibroblast growthfactor]、血小板衍生生长因子[PDGF；Platelet-derived growth factor]、血管内皮细胞生长因子[VEGF；Vesicular endothelial growthfactor]、肝细胞生长因子[HGF；Hepatocyte growth factor]、FGF9、骨形成蛋白4[BMP4；bone morphogenetic protein4]、BMP5、活化素A、干细胞因子[SCF]、Dkk1[Dickkopf-1]、Wnt抑制剂[XAV、IWP4等]、Wnt激活剂[CHIR、Kenpaullone等]、白血病抑制因子[LIF；Leukemia Inhibitory Factor]、Wnt、TGF-β等)、铁源(例如，转铁蛋白等)、矿物质(例如，亚硒酸钠)、氨基酸(例如，谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸等非必需氨基酸)、维生素类(例如，氯化胆碱、泛酸、叶酸、尼克酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、抗坏血酸、生物素、肌醇等)、糖类(例如，葡萄糖等)、有机胺类(例如，腐胺等)、类固醇(例如，孕酮、β-雌二醇等)、抗生素(例如，青霉素、链霉素等)、白细胞介素类(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-6等)、贴壁因子(例如，肝素、硫酸乙酰肝素、胶原蛋白、纤连蛋白等)、有机酸(例如，丙酮酸、琥珀酸、乳酸等)或其盐、缓冲剂(例如，HEPES等)以及它们的组合。
本发明制备的心肌前体细胞即使在进行冷冻与解冻处理后，也具有高存活率和向心肌细胞的高分化能力。因此，在长期保存本发明制备的心肌前体细胞时，优选用冷冻保存。通常在冷冻保存液中冷冻保存，作为该冷冻保存液，可列举出：含有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、角蛋白水解物、水解明胶、血清、血清白蛋白等冻存保护剂的上述生理性水溶液。此外，作为上述冷冻保存液，也可列举出：CELLBANKER 1、CELLBANKER 1plus、CELLBANKER 2、CELLBANKER 3(均为十慈Field株式会社(JUJI FIELD Inc.)制)、TC-Protector(DS PharmaBiomedical株式会社制)、Bambanker hRM(日本Genetics公司制)、人类胚胎干细胞/多能干细胞冻存液(Freezing Medium for human ES/iPS Cells)(株式会社ReproCELL制)、CryoScarless DMSO-Free(株式会社BioVerde制)、StemCell Keep(株式会社BioVerde制)等市售品。
本发明制备的心肌前体细胞可以在以下状态下使用：贴壁在经涂层剂处理的培养容器上的状态、悬浮于上述生理性水溶液中或上述冷冻保存液中的状态、细胞团块的状态、单层或多层(例如2～300层、20～300层)CD82阳性细胞膜片的状态。作为上述涂层剂，例如可列举出：基质胶(Matrigel)、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin)、纤连蛋白、温度响应性聚合物(PIPAAm)以及它们的组合。
本发明的心脏病治疗剂含有本发明制备的心肌前体细胞、即在各种培养条件下或向组织/脏器的移植中特异性分化为心肌细胞的细胞为有效成分，优选含有高纯度的该细胞，对心肌病或心脏病具有治疗或予防作用。该心肌病或心脏病中包括由遗传性、炎症或应激等后天因素的负荷所致、或由其混合因素引发的各种心肌病或心脏病，作为心肌病，例如可列举出：表现出梗阻性肥厚型心肌病、非梗阻性肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右心室发育不良、未分类心肌病、特发性心肌病、扩张型心肌病、扩张型心肌病样病态的缺血性心肌病、高血压性心肌病、瓣膜性心肌病、扩张期肥厚型心肌病、与胶原病或自我免疫性疾患相关联的心脏结节病或心脏淀粉样变性病、遗传性心肌病、后天性心肌病、心肌炎、心肌炎后心肌病、药物或中毒引起的药物诱发性心肌病、酒精性心肌病、放射性心肌病、左心室致密化不全、肌营养不良性心肌病、线粒体心肌病、代谢异常引起的心肌病、围产期心肌病；作为心脏病，例如可列举出：急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、亚急性心肌梗塞、顽固性心绞痛等缺血性心脏病/心肌梗塞、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、重度心力衰竭、先天性心脏病引起的心力衰竭等心力衰竭、先天性心脏病、室性心律失常、室上性心律失常、快速性心律失常、缓慢性心律失常、致命性心律失常等心律失常。制备的心肌前体细胞具有高自我增殖能力、高心肌分化能力和向心肌的高成活率。因此，含有制备的心肌前体细胞为有效成分的本发明的心脏病治疗剂特别是可应用在重症(难治性)心脏病的治疗或在予防上有优势。
作为本发明的心脏病治疗剂中所含的本发明制备的心肌前体细胞的细胞数，根据因心脏病导致的心肌细胞的损伤程度、本发明制备的心肌前体细胞的形式而不同，因此不能一概而定，但通常为1×104～1×109、优选为1×105～1×108、更优选为1×106～1×107。
作为本发明的心脏病治疗剂对患有上述心脏病患者的用药方法，可考虑本发明的心脏病治疗剂中所含的制备的心肌前体细胞的形式并进行适当选择，例如，在本发明的心脏病治疗剂中所含的制备的心肌前体细胞的使用形式是细胞膜片时，可列举出以下方法：通过外科处理，将该细胞膜片贴附于心外膜表面，由此移植到上述患者的心脏；此外，在本发明的心脏病治疗剂中所含的制备的心肌前体细胞的使用形式是贴壁在经涂层剂处理的培养容器上的状态时，可列举出以下方法：通过用细胞分散液(胰蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、链酶蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶等)处理使细胞从培养容器上剥离，再悬浮于上述生理性水溶液中，通过插入导管，注入到冠状动静脉内或直接注入到心脏的静脉注射等方法，由此给上述患者用药；此外，在本发明的心脏病治疗剂中所含的制备的心肌前体细胞的使用形式是细胞团块的状态时，可列举出以下方法：悬浮于上述生理性水溶液中，通过插入导管，注入到冠状动静脉内或直接注入到心脏的静脉注射等方法，由此给上述患者用药；此外，在本发明的心脏病治疗剂中所含的制备的心肌前体细胞的使用形式是冷冻保存于上述冷冻保存液中的状态时，可列举出以下方法：在35～38℃的恒温槽内解冻溶解细胞后，再悬浮于上述生理性水溶液中，通过插入导管，注入到冠状动静脉内或直接注入到心脏的静脉注射等方法，由此给上述患者用药；此外，在本发明的心脏病治疗剂中所含的制备的心肌前体细胞的使用形式是悬浮于上述生理性水溶液中的状态时，根据需要再悬浮于上述生理性水溶液中，通过插入导管，注入到冠状动静脉内或直接注入到心脏的静脉注射等方法，由此给上述患者用药。
另外，本发明制备的心肌前体细胞除了用作心脏病治疗剂之外，还可以用作制作心肌模型细胞所用的材料。
本发明制备的心肌前体细胞可按照下面的步骤进行制备。首先，获得干细胞。作为该干细胞的物种，没有特别限制，例如可列举出：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类；兔等兔目；猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄目；狗、猫等猫科；人、猴、猕猴、食蟹猕猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类，其中，优选为小鼠、猪或人，本发明制备的心肌前体细胞用于治疗心脏病时，特别优选以人为例。
根据分化能力，上述干细胞中包括多能干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)等亚群。多能干细胞是指其自身不能发育为个体，但具有能分化成构成生物体的全部组织或细胞能力的细胞。多潜能干细胞是指不能分化成全部种类，但具有能分化成多种组织或细胞能力的细胞。
作为多能干细胞，可列举出：由早期胚胎中分离纯化出的胚胎干细胞(embryonicstem cells：ES细胞)；从胎儿期的原始生殖细胞中分离纯化出的胚胎生殖细胞(embryonicgerm cells：EG细胞)(例如，参照Proc Natl Acad Sci U S A.1998,95:13726-31)；从刚出生后的睾丸中分离纯化出的生殖细胞系列干细胞(germline stem cells：GS细胞)(例如，参照Nature.2008,456:344-9)；髂骨骨髓、颚骨骨髓等骨髓来源的干细胞；脂肪组织来源的干细胞等间质干细胞；通过对淋巴细胞等体细胞给予细胞刺激，诱导体细胞去分化，使其具有与ES细胞同样多能性的体细胞来源的刺激触发性多能性获得细胞(STAP细胞；Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency cells)；选自皮肤、骨髓等间质组织而得到的具有多能性的细胞(Muse细胞[多系分化持续应激细胞、Multi-lineage differentiatingStress Enduring cell])；通过将多个基因导入皮肤细胞等体细胞，诱导受检体自身的体细胞去分化，使其具有与ES细胞同样多能性的体细胞来源的诱导性多能干细胞(iPS；induced pluripotent stemcell)，其中，优选为iPS细胞，在将本发明制备的心肌前体细胞用于治疗心脏病时，如果考虑到由移植发生排斥反应的危险，则可优选示例如下细胞：从患有心脏病患者来源的体细胞中获得的iPS细胞、从与患有心脏病患者的人白血球抗原(HLA；Human leukocyte antigen)基因型相同或实质上相同的对象(人)来源的体细胞中获得的iPS细胞。此处“HLA基因型实质上相同”是指对于移植的细胞在可通过免疫抑制剂抑制免疫反应的程度上HLA基因型一致。因此，作为上述HLA基因型实质上相同的对象(人)来源的体细胞，具体地可列举出：HLA-A、HLA-B和HLA-DR的3种HLA基因型、或者在该3种HLA基因型中加入HLA-C的4种HLA基因型一致的HLA基因型相同的对象(人)来源的体细胞。
ES细胞可通过将内细胞团在丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎来源的初代成纤维细胞[MEF]、STO细胞、SNL细胞等饲养细胞上并在上述含血清或无血清培养液中培养来制作。ES细胞的制作方法例如记载于WO96/22362、WO02/101057、US5843780、US6200806、US6280718等中。EG细胞可通过将原始生殖细胞在含有mSCF、LIF和bFGF的上述含血清或无血清培养液中培养来制作(例如，参照Cell.1992,70:841-847)。STAP细胞可通过用酸性溶液(pH4.5～6.0)处理体细胞(例如，淋巴细胞等)来制作(国际公开第2013/163296号公报、Obokata,H.et al.,Nature 505:676-680(2014))。Muse细胞通过对皮肤、骨髓等间质组织给予胰蛋白酶或低氧处理等应激而选择抗应激性的细胞、或者以作为多能干细胞表面抗原的SSEA-3表达为指标选择细胞，进一步以单一细胞的状态再次进行悬浮培养，由此可通过分离纯化细胞来制作(专利第5185443号公报、Proc Natl Acad Sci U S A.2010,107:8639-8643)。iPS细胞可通过将Oct3/4、Sox2和Klf4(根据需要还可以是c-Myc或n-Myc)等重编程因子导入体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞等)来制作(例如，参照Cell.2006,126:663-676、Nature.2007,448:313-317、Nat Biotechno1.2008,26；101-106、Cel1.2007,131:861-872、Science.2007,318:1917-1920、Cell Stem Cells.2007,1:55-70、Nat Biotechnol.2007,25:1177-1181、Nature.2007,448:318-324、Cell Stem Cells.2008,2:10-12、Nature.2008,451:141-146、Science.2007,318:1917-1920)。作为多能干细胞还优选通过对体细胞核进行核移植而制作的早期胚胎进行培养而建立的干细胞(例如，参照Nature.1997,385:810-813、Science.1998,280:1256-1258、Nature Biotechnology.1999,17:456-461、Nature.1998,394:369-374、Nature Genetics.1999,22:127-128、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1999,96:14984-14989)、Rideout III等人(NatureGenetics.2000,24:109-110)。作为多能干细胞，具体可示例有：人ES细胞H9株(WA09)、人ES细胞H1(WA01)株(National Stem Cell bank、WISC Bank)；KhES-1、KhES-2和KhES-3(均为京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心)；HES3、HES4和HES6(National Stem Cell bank、莫纳什大学)等人ES细胞；通过导入Oct3/4基因、Klf4基因、C-Myc基因和Sox2基因而获得的iPS细胞(理化学研究所生物资源中心(RIKEN BRC)、京都大学)；Tic(JCRB1331株)、Dotcom(JCRB1327株)、Squeaky(JCRB1329株)和Toe(JCRB1338株)、Lollipop(JCRB1336株)(以上均为国立成育医疗研究中心、国家生物医学创新研究所(National Institute of Biomedical Innovation)难病与疾患资源研究部/JCRB细胞库)；UTA-1株和UTA-1-SF-2-2株(均为东京大学)；通过导入Oct3/4基因、Klf4基因和Sox2基因而获得的iPS细胞(Nat Biotechnol.2008,26:101-106)等iPS细胞。
作为多潜能干细胞，例如可列举出以下成体干细胞(somatic stem cells)：可分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞的间质干细胞；可分化成白血球、红血球、血小板等血细胞的造血干细胞；可分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞等细胞的神经干细胞等。多潜能干细胞可通过其本身公知的方法，从生物体中分离纯化出。例如，间质干细胞可用公知一般的方法从哺乳动物的骨髓、脂肪组织、末梢血、脐带血等采集。例如，可通过对骨髓穿刺后的造血干细胞等培养、传代来分离纯化出人间质干细胞(Journalof Autoimmunity，30(2008)163-171)。此外，造血干细胞可用细胞分离装置(流式细胞仪等)和针对造血干细胞表面抗原(例如CD34)的抗体，从骨髓、脐带血、脾脏、肝脏、末梢血等生物试样中分离纯化出。此外，上述多潜能干细胞也可以通过在适当的诱导条件下培养上述多能干细胞来得到。另外，本发明的干细胞中也包括在本发明申请后通过新方法制作的干细胞。
接着，对获得的干细胞进行向心血管细胞的分化诱导处理。此处作为向心血管细胞的分化诱导处理方法，只要至少能向心肌前体细胞分化诱导，就没有特别限制，除了向心肌前体细胞分化诱导处理的方法之外，还包括以下方法：通过在向心肌前体细胞分化诱导后，进一步在含有VEGF的培养液中培养，制备由心肌前体细胞、内皮细胞和壁细胞构成的混合细胞(国际公开第2013/137491号公报)。
具体而言，例如可列举出以下方法：根据文献(Yamashita,J.et al.,Nature 408:92-96(2000)、Yamashita,J.K.et al.,FASEB J.19:1534-1536(2005)、Narazaki,G.,Circulation 118:498-506(2008))中所述的方法，通过在胶原蛋白IV型涂层培养皿(不含LIF、无饲养细胞)上培养干细胞，向中胚层前体细胞即Flk1(也称为血管内皮生长因子受体-2[VEGFR2])阳性细胞分化诱导，进一步通过在含有环孢菌素A(CSA)的培养液中培养Flk1阳性细胞，使其向心肌前体细胞分化诱导(日本特表2011-515064号公报)；通过在含有EGF和bFGF的培养液中悬浮培养干细胞，使其向心肌前体细胞分化诱导的方法(国际公开第2006/093276号公报)；通过在头蛋白(Noggin)、腱蛋白(Chordin)等含有BMP拮抗剂的培养液中贴壁培养或悬浮培养干细胞，使其向心肌前体细胞分化诱导的方法(国际公开第2005/033298号公报)；通过在含有Wnt-1、Wnt-3a或Wnt-5a、GSK3β抑制剂、或者含有氨基嘧啶衍生物即Wnt激动剂的培养液中培养干细胞，激活Wnt信号通路，使其向心肌前体细胞分化诱导的方法(国际公开第2007/126077号公报)；通过在含有活化素A的培养液中培养干细胞后，并在含有BMP4的培养液中培养，使其向心肌前体细胞分化诱导的方法(日本专利特开2013-215206号公报、Laflamme,M.A.et al.,Nat Biotechnol,25:1015-1024(2007))；在经上述涂层剂(优选基质胶)处理的培养容器上贴壁培养干细胞，进一步添加上述涂层剂(优选基质胶)，用上述涂层剂对干细胞全部进行涂层(基质胶夹层处理)，在含有活化素A的培养液中培养后，并在含有BMP4和bFGF的培养液中培养，由此使其向心肌前体细胞分化诱导的方法(国际公开第2013/137491号公报)；在经上述涂层剂(优选基质胶)处理的培养容器上贴壁培养干细胞，进一步添加上述涂层剂(优选基质胶)，用所述涂层剂对干细胞全部进行涂层(基质胶夹层处理)，在含有活化素A的培养液中培养后，并在含有BMP4和bFGF的培养液中培养，进一步在含有Dkk1的培养液中培养，由此使其向心肌前体细胞分化诱导的方法(Uosaki H,et al,PLoS One 2011；6:e23657、如下面的实施例所示的[本发明方法])。
干细胞培养可通过在经上述涂层剂处理的培养容器上、在贴壁有上述饲养细胞的培养容器上贴壁培养来进行。作为用于干细胞培养的培养液，可列举出：含有0.1～30(v/v)％血清(FBS、CS等)的动物细胞培养用培养液(DMEM、EMEM、IMDM、RPMI1640、αMEM、F-12、F-10、M-199、AIM-V等)；适量(例如1～30％)添加了市售的B27添加剂(不含胰岛素)(美国生命技术公司制)、N2添加剂(美国生命技术公司制)、B27添加剂(美国生命技术公司制)、Knockout血清替代物(美国英杰生命技术公司制)等血清替代物的上述动物细胞培养用培养液；在这些培养液中进一步添加了LIF、bFGF、SCF等分化抑制因子等。
用于干细胞培养的培养液中，根据需要也可以适当补充：还原剂(例如，2-巯基乙醇、二硫苏糖醇[dithiothreitol；DTT]等)、铁源(例如，转铁蛋白等)、矿物质(例如，亚硒酸钠)、氨基酸(例如，谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸等非必需氨基酸)、维生素类(例如，氯化胆碱、泛酸、叶酸、尼克酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、抗坏血酸、生物素、肌醇等)、糖类(例如，葡萄糖等)、有机胺类(例如，腐胺等)、类固醇(例如，孕酮、β-雌二醇等)、抗生素(例如，青霉素、链霉素等)、白细胞介素类(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-6等)、贴壁因子(例如，肝素、硫酸乙酰肝素、胶原蛋白、纤连蛋白等)、有机酸(例如，丙酮酸、琥珀酸、乳酸等)或其盐、缓冲剂(例如，HEPES等)等添加剂。
干细胞培养温度通常约30～40℃的范围内，优选为37℃。培养时的CO2浓度通常约1～10％的范围内，优选为约5％。此外，培养时的湿度通常约70～100％的范围内，优选在约95～100％的范围内。此外，培养时的O2浓度可为正常氧浓度(18～22％O2)，也可为低氧浓度(0～10％O2)。
接着，从向心肌前体细胞进行分化诱导处理的干细胞中分离CD82阳性细胞。此处，“分离”是指从培养容器用物理方法取出CD82阳性细胞。在CD82阳性细胞为贴壁培养时，通过在20～37℃范围内的温度条件下进行上述细胞分散液的处理，从培养容器上剥离CD82阳性细胞，可用倾析将含有CD82阳性细胞的培养液从培养容器分离到其他容器中、或使用移液器、Pipetman移液器分离到其他容器中，此外，在CD82阳性细胞为培养液中悬浮培养时，可用倾析将含有CD82阳性细胞的培养液从培养容器分离到其他容器中、或使用Pipetman移液器分离到其他其他容器中。
对于分离出的CD82阳性细胞，确认为如下：选自上述[细胞表面标记A组]中的至少一个细胞表面标记为阴性；选自上述[细胞表面标记B组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自上述[细胞表面标记C组]中的至少一个细胞表面标记为阳性；选自上述[细胞表面标记D组]中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自上述[细胞表面标记E组]中的至少一个细胞表面标记为阳性；选自上述[细胞表面标记F组]中的至少一个细胞表面标记为阳性。在分离出的CD82阳性细胞中，上述[细胞表面标记A组]、[细胞表面标记B组]和[细胞表面标记C组]中所含的细胞表面标记表达可通过利用以下方法检测予以确认：定量RT-PCR法、RT-PCR法、Southern印迹法等分析mRNA表达的方法；蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA法、EIA法、RIA法等分析蛋白质表达的方法。
使用该分离出的CD82阳性细胞来制备高纯度心肌细胞时，作为高纯度CD82阳性细胞优选使用施以分离纯化处理的CD82阳性细胞。CD82阳性细胞的分离纯化如前所述，可通过FACS或全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)来进行，其中，FACS使用用荧光物质标记的抗CD82抗体；全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)使用用荧光物质或生物素或抗生物素蛋白等标记物质标记的抗CD82抗体、针对该标记物质的抗体与MACS微珠(磁性微珠)的共轭抗体。作为上述荧光物质，可列举出：APC、PE、FITC、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 700、PE-Texas Red、PE-Cy5、PE-Cy7等。
干细胞向CD82阳性细胞分化诱导的时期，对于分化诱导后各时间的细胞样本，可使用分析上述CD82基因的mRNA表达的方法、分析上述CD82蛋白质表达的方法，通过检测CD82阳性细胞来进行确认。
作为从经分化诱导处理的干细胞中分离CD82阳性细胞的时期，因为根据分化诱导处理方法或培养条件而不同，因此不能一概而定，但通常为分化诱导处理后第1～20天、优选为第2～14天、更优选为第3～11天、进一步优选为第4～11天、更进一步优选为第4～8天。
分离出的CD82阳性细胞(制备的心肌前体细胞)向心肌细胞的分化诱导，通过在体外或体内的实验使CD82阳性细胞向心肌细胞分化诱导，对于心肌细胞特异性标记(cTnT、αMHC等)表达，可通过利用以下方法检测予以确认：定量RT-PCR法、RT-PCR法、Southern印迹法等对心肌细胞特异性标记基因的mRNA表达进行分析的方法；蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA法、EIA法、RIA法等对心肌细胞特异性标记蛋白质表达进行分析的方法。
在制备CD82阳性细胞的方法中的各步骤中，为避免灰尘或细菌等混入(污染)，优选使用超净工作台等在无菌环境下进行。
下面通过实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1
[人iPS细胞的传代培养]
人iPS细胞(201B6)(由京都大学山中教授惠赠)的传代培养是在含有4ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子、basic fibroblast growth factor)(日本和光纯药株式会社(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)制)的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液(MEF-CM；Mouse embryonic fibroblast-conditioned medium)(Knockout SR[Gibco公司制]与含有2-ME[Gibco公司制]的Knockout DMEM[Gibco公司制])(下面称为“本发明MEF条件培养液”)中，在37℃、5％CO2条件下进行，贴壁在用基质胶(1：60稀释、美国英杰生命技术公司制)涂布的培养皿(10cm培养皿[Falcon公司制])上。
[本发明方法]
1)向心肌细胞的分化诱导使用对改良的DD方法(Uosaki H,et al,PLoS One2011；6:e23657)(图1A)作进一步修改的本发明方法(图1B)来进行。本发明方法的详细内容如下面的2)～5)所示。
2)对贴壁培养的人iPS细胞，在37℃下用细胞分散液(Versene[美国英杰生命技术公司制])孵育3～5分钟，使得从培养皿上剥离，以1×105细胞/cm2的浓度接种到用基质胶涂布的6孔板(低生长因子基质胶(Growth Factor Reduced Matrigel)、BD生物科学公司(BDBiosciences)制)，在本发明MEF条件培养液中培养2～3天，融合至约100％。
3)将基质胶(1：60稀释、美国英杰生命技术公司制)添加到培养液中(基质胶夹层处理)，经24小时培养后，将培养液与含有100ng/mL活化素A(美国安迪生物科技公司(R&DSystems)制)的“RPMI+B27不含胰岛素”(含有2mM L-谷氨酰胺和B27添加剂[不含胰岛素][美国生命技术公司制]的RPMI1640[美国生命技术公司制]；下面称为“本发明无血清培养液(A)”)培养液进行更换，进行向心肌细胞的分化诱导。另外，更换培养液为含有活化素A的本发明无血清培养液的时间点设在分化诱导后0日(时间)。
4)24小时培养后，将培养液与含有10ng/mL人bFGF(hbFGF)(日本和光纯药株式会社制)和10ng/mL人BMP4(hBMP4；人骨形态发生蛋白4)(美国安迪生物科技公司制)的本发明无血清培养液(A)进行更换，培养至分化诱导后第5天。
5)在分化诱导后第5天，将培养液更换为含有100ng/mL Dkk1(美国安迪生物科技公司制)的“RPMI+B27”(含有2mM L-谷氨酰胺和B27添加剂[美国生命技术公司制]的RPMI1640[美国生命技术公司制]；下面称为“本发明无血清培养液(B)”)培养液，进一步培养48小时(到分化诱导后第7天)。
[细胞分选与流式细胞术分析]
通过将细胞在37℃下用细胞分散液(AccuMax[Innovative Cell Technologies公司制])孵育3～5分钟，使其从培养皿上剥离，在含有5％FBS和5mM EDTA的PBS溶液中悬浮细胞后，使用用标记物质标记的针对5种细胞表面标记(KDR、PDGFRα、CD82、CD13和VCAM1)的抗体(参照表1)，在4℃条件下进行抗原抗体反应30分钟。此外，对于细胞质中表达的TnT，用4％PFA溶液进行15分钟固定处理，并用表面活性剂(0.75％皂苷溶液[美国西格玛公司(Sigma)制])处理后，在上述细胞悬浮液中加入抗cTnT抗体(第一抗体)(参照表1)与用荧光物质标记的第二抗体(参照表1)的共轭物，在4℃条件下进行抗原抗体反应30分钟。使用FACS(FACS Aria II[BD生物科学公司制])，对各自的细胞进行用上述抗体检测的细胞的提纯(分类)。此外，使用流式细胞仪(FACS Aria II[BD生物科学公司制])对用上述抗体检测的细胞表面标记表达进行了分析。
[表1]
[在体外向心肌细胞分化的能力的评价方法]
按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法提纯细胞后，以1～1.5×105细胞/cm2的浓度接种到用基质胶涂布的6孔板(低生长因子基质胶、BD生物科学公司制)上，在含有10％FBS的“RPMI”(含有2mM L-谷氨酰胺和B27添加剂[美国生命技术公司制]的RPMI1640[美国生命技术公司制])培养液(下面称为“本发明含血清培养液”)中进行培养。另外，此处通过在含有血清的本发明含血清培养液存在下培养细胞，也可以在能向心肌细胞以外的细胞进行分化的条件下培养，研究是否向心肌细胞特异性分化。此外，到接种后48小时，为防止接种后的细胞死亡，在Rho结合磷酸酶(Rho-associated proteinkinase：ROCK)抑制剂即Y-27632(日本和光纯药株式会社制)存在下培养。培养液每2天日更换为新的本发明含血清培养液。在本发明含血清培养液中从进行培养开始2星期后，按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法进行流式细胞术分析，分析了心肌细胞(cTnT阳性细胞)的比例。另外，作为心肌细胞的表面标记，也对本研究小组鉴定的VCAM1(CD106)阳性细胞(Uosaki H,et al,PLoS One 2011；6:e23657)的比例进行了分析。
[RNA微阵列分析]
根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第4天和第5天，按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法，提纯/分离纯化中胚层来源的细胞(KDR阳性PDGFRα阳性细胞)，在使用RNeasyMini kit(德国凯杰公司(QIAGEN)制)进行总RNA的提纯后，用Superscript II ReverseTranscriptase(美国生命技术公司制)合成cDNA。在使用Bioarray HighYield RNAtranscript labeling kit(T7)(Enzo Life Science公司制)，用Cy3荧光标记合成的cDNA后，使荧光标记的cDNA与Human Genome U133Plus2.0Array(美国昂飞公司(Affymetrix)制)杂交。杂交使用GeneChip Hybridization Control Kit(美国昂飞公司制)和GeneChipFluidics Station 450(美国昂飞公司制)，在45℃的条件下进行16小时。荧光信号的扫描使用GeneChip Scanner 3000 7G(美国昂飞公司制)进行，获得的荧光信号的图像分析使用GeneChip Operating Software(美国昂飞公司制)进行。之后的统计学分析使用GeneSpring GX(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)制)用RMA法进行。根据选择标准(Fold-change>2.0、P值<0.05)，从分化诱导后第4天到第5天，对观测到表达增减变化的细胞表面标记进行鉴定。
[在体内向心肌细胞分化的能力的评价方法1]
根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第6天，通过用细胞分散液(AccuMax[Innovative CellTechnologies公司制])在37℃下孵育细胞3～5分钟，将细胞从培养皿上剥离，悬浮于含有1％PBS、5mM EDTA和5％FBS的溶液中后，加入抗CD82-PE抗体(Biolegend公司制)，在室温下孵育了30分钟。接着，加入抗PE-MACS微珠(德国美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)制)，在4℃下孵育了20分钟。用含有1％PBS、5mM EDTA和5％FBS的溶液洗涤2次后，使用全自动磁性细胞分选仪(autoMACS[德国美天旎生物技术公司制])分离纯化CD82阳性细胞。另外，为用作对照，分离纯化CD13阳性细胞和DGFRα阳性细胞。将分离纯化出的CD82阳性细胞约5×106个悬浮于本发明含血清培养液10μL与基质胶(1：60稀释、美国英杰生命技术公司制)10μL的混合液中，移植到C.B-17/lcr-scid/scidJcl小鼠(由日本克莱尔株式会社获得)的肾被膜下。此处，并非在心脏进行移植而是在肾被膜下进行，由此来研究在与心脏无关的环境下，是否也能向心肌细胞分化。在移植后第2周，使小鼠安乐死，切除肾脏后放在4％PFA中固定，用30％蔗糖进行脱水处理后，包埋于OCT化合物(Sakura Finetek公司制)中，使用冷冻切片机(德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss)制)制作厚度为6μm的肾被膜冷冻切片。在对制作的肾被膜冷冻切片用0.1％TritonX-100/PBS溶液进行渗透化处理后，用2％脱脂牛奶进行封闭处理。接着，在室温下用第一抗体(抗cTnT抗体[abcam公司制]进行1小时或一晩抗原抗体反应处理后，在室温下用第二抗体(Alexa Fluor 488抗小鼠IgG抗体)进行1小时抗体反应处理，之后，在室温下用抗人核抗原[HNA；Human Nuclear Antigen]抗体[stemcells公司制])与Zenon Alexa Fluor 564(美国生命技术公司制)的共轭抗体进行2.5小时抗体反应处理，用10μg/mL DAPI(美国生命技术公司制)对细胞核染色。使用Zeiss LSM 710激光扫描显微镜(德国卡尔·蔡司公司制)获得共聚焦荧光图像。
[在体内向心肌细胞分化的能力的评价方法2]
根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第6天，通过在37℃下用细胞分散液(AccuMax[Innovative CellTechnologies公司制])孵育细胞10～15分钟，使细胞从培养皿上剥离，在悬浮于含有1％PBS、5mM EDTA和5％FBS的溶液中后，加入抗CD82-PE抗体(Biolegend公司制)、抗CD13-FITC抗体(abcam公司制)和抗PDGFRα-APC抗体(美国安迪生物科技公司制)，在室温下孵育了30分钟。用含有1％PBS、5mM EDTA和5％FBS的溶液洗涤2次后，用细胞分选仪分离纯化CD82阳性细胞(CD82阳性CD13阳性PDGFRα阳性细胞)，在约3×106个的细胞中加入Hoechst33258(美国英杰生命技术公司制)，在37℃下孵育15分钟，对细胞核进行染色后，移植到冠状动脉结扎的心肌梗塞模型大鼠F344N-Jcl rnu/rnu的心脏上。在移植后第4周，使大鼠安乐死，切除心脏后放在4％PFA中固定，用30％蔗糖进行脱水处理后，包埋于OCT化合物(SakuraFinetek公司制)，使用冷冻切片机(德国卡尔蔡司公司制)制作厚度为6～10μm的心脏冷冻切片。在对制作的心脏冷冻切片用0.2％Tween20/PBS溶液进行渗透化处理后，用2％脱脂牛奶进行封闭处理。接着，在室温下用第一抗体(抗cTnT抗体[abcam公司制]进行1小时或一晩抗原抗体反应处理后，在室温下用第二抗体(Alexa Fluor 488抗小鼠IgG抗体)进行1小时抗体反应处理，并进行了染色。使用BIOREVO BZ-9000(基恩士公司(KEYENCE)制)获得图像。
[冷冻保存的CD82阳性细胞向心肌细胞分化的能力的评价方法]
按照上述[在体内向心肌细胞分化的能力的评价方法1]的项目中记载的方法，分离纯化CD82阳性细胞，加入细胞冷冻保存液(CELLBANKER 3[十慈Field株式会社制])以达到1.0×106细胞/mL，分注入CryoELITE Cyogenicvials(WHEATON公司制、W985866)以达到1.0×106细胞/管。放入Cryo Box(Thermo公司制、5025-0505)，保存在-80℃冰箱内。之后，将冷冻的管移到液氮中保存。将储备的CD82阳性细胞从液氮中取出，在37℃的水浴器中迅速解冻，通过离心处理除去上清液(细胞冷冻保存液)，在用PBS洗涤细胞后，以1～1.5×105细胞/cm2的浓度接种到用基质胶涂布的6孔板(低生长因子基质胶、BD生物科学公司制)上，按照上述[在体外向心肌细胞分化的能力的评价方法]的项目中记载的方法，评价向心肌细胞分化的能力。
[结果1：确定心肌前体细胞被诱导的时期]
在从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导过程中，为了确定具有向心肌细胞分化能力的细胞即心肌前体细胞被诱导的时期，根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第4天和第5天，按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法，提纯中胚层来源的细胞(KDR阳性PDGFRα阳性细胞)，并按照上述[在体外向心肌细胞分化的能力的评价方法]的项目中记载的方法，分析心肌细胞(cTnT阳性细胞)的比例(参照图2)。
其结果可知，在分化诱导后第4天，KDR阳性PDGFRα阳性细胞向cTnT阳性细胞的分化效率为2.6％，与此相对，在分化诱导后第5天，KDR阳性PDGFRα阳性细胞向cTnT阳性细胞的分化效率为69.0％，是前者的27倍之高(参照图2)。此结果显示出在各种条件下只向心肌细胞分化即分化命运确定为向心肌分化的特异性前体细胞(下面有时称为“心肌特异性前体细胞”)被诱导。
[结果2：对在心肌前体细胞被诱导的时期表达增加的CD82进行鉴定]
由上述结果1显示出在从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导后第4天到第5天，心肌特异性前体细胞被诱导，因此具有在该时期观察到表达增减变化的细胞表面标记的细胞认为是心肌特异性前体细胞的可能性很高。所以，从分化诱导后第4天到第5天，为探究观察到表达增减变化的细胞表面标记，按照上述[RNA微阵列分析]的项目中记载的方法，从分化诱导后第4天到第5天，对观察到表达增减变化的细胞表面标记进行了分析。其结果是鉴定为CD82。该结果提示，表达CD82的细胞即CD82阳性细胞是心肌特异性前体细胞。
[结果3：在向心肌细胞的分化诱导过程中CD82阳性细胞的经时变化]
由上述结果2显示在从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导后第4天到第5天，CD82阳性细胞被诱导，因此对分化诱导后CD82阳性细胞的经时变化进行了分析。根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第3～11天，按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法，使用流式细胞仪对CD82和PDGFRα进行了分析(参照图3)。
其结果显示CD82阳性细胞在分化诱导后第4天，从PDGFRα阳性细胞群(群体)开始被诱导，其数量增加，在第6天PDGFRα阳性细胞群的约80％为CD82阳性细胞，在第7天CD82阳性细胞数达到峰值(相对于全部细胞数为62.2％)，之后(在第9天，相对于全部细胞数为22.2％；在第11天，相对于全部细胞数为5.25％)CD82阳性细胞数迅速减少(参照图3)。
此外，对于分化诱导后第4～6天的CD82和CD13表达也同样地使用流式细胞仪进行了分析，结果显示CD82阳性细胞在分化诱导后第4天从PDGFRα阳性细胞群(群体)开始被诱导(参照图4)。
这些结果显示出CD82阳性细胞是与迄今为止报告的心血管前体细胞群即PDGFRα阳性细胞或CD13阳性细胞相比向心肌细胞分化进行程度更高的细胞。
进一步地，对于分化诱导后第9天和第15天的CD82和cTnT表达也同样使用流式细胞仪进行了分析，结果显示在第9天的CD82阳性细胞中未检测到cTnT表达(参照图5的左图)，此外，在第15天的cTnT阳性细胞中未检测到CD82(参照图5的右图)。
该结果显示出如果CD82向心肌细胞(cTnT阳性细胞)分化完成，则不再表达。
[结果4：在体外CD82阳性细胞向心肌细胞分化的能力的评价]
由上述结果2和3可知，提示CD82阳性细胞是心肌特异性前体细胞，因此对CD82阳性细胞是否向心肌细胞特异性分化进行了分析。根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第5天，按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法，分别提纯CD82阳性CD13阳性细胞和CD82阴性CD13阳性细胞，按照上述[在体外向心肌细胞分化的能力的评价方法]的项目中记载的方法，分析了心肌细胞(cTnT阳性细胞)的比例(参照图6)。
其结果可知，CD82阴性CD13阳性细胞在血清存在下向cTnT阳性细胞的分化效率为26.4％，与此相对，CD82阳性CD13阳性细胞向cTnT阳性细胞的分化效率为82.8％，是前者的3.1倍之高(参照图6)。该结果提示，通过在体外的试验，CD82阳性细胞是向心肌细胞(cTnT阳性细胞)特异性分化诱导的心肌前体细胞、即心肌特异性前体细胞。
[结果5：在体内CD82阳性细胞向心肌细胞分化的能力的评价]
上述结果4提示，通过在体外的试验，CD82阳性细胞是向心肌细胞特异性分化诱导的心肌前体细胞，因此在体内也同样地研究了是否向心肌细胞特异性分化诱导。按照上述[在体内向心肌细胞分化的能力的评价方法1]的项目中记载的方法，将CD82阳性细胞移植到小鼠肾被膜下，可知在移植的CD82阳性细胞来源的HNA阳性细胞中，基本上所有的细胞(95％以上)是cTnT阳性细胞(心肌细胞)(参照图7)。另一方面，将CD13阳性细胞或PDGFRα阳性细胞移植到小鼠的肾被膜下时，未观察到在肾被膜下存活。
进一步地，按照上述[在体内向心肌细胞分化的能力的评价方法2]的项目中记载的方法，将CD82阳性细胞(CD82阳性CD13阳性PDGFRα阳性细胞)移植到心肌梗塞模型大鼠的心脏，可知在移植的CD82阳性细胞来源的Hoechst33258阳性细胞中，基本上所有的细胞(95％以上)是cTnT阳性细胞(心肌细胞)(参照图8)。
这些结果显示在支持上述体外结果的同时，CD82阳性细胞与迄今为止报告的CD13阳性细胞或PDGFRα阳性细胞等心血管前体细胞群相比，更是能在心脏有效地存活，并且为在心脏能向特异性心肌细胞分化的心肌前体细胞。
[结果6：CD82阳性细胞的冷冻保存的评价]
根据上述结果5，在将向心肌细胞特异性分化诱导的心肌前体细胞用于治疗时，对CD82阳性细胞是否可进行冷冻保存进行了研究。根据上述[冷冻保存的CD82阳性细胞向心肌细胞分化的能力的评价方法]的项目中记载的方法，对冷冻保存的CD82阳性细胞向心肌细胞分化的能力进行评价，结果显示cTnT阳性细胞(心肌细胞)的比例高达94.4％(参照图9)。该结果显示出CD82阳性细胞即使在进行冷冻与解冻处理后也具有向心肌细胞分化的高分化能力，可进行冷冻保存。
[结果7：细胞表面标记表达分析]
根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第4天和第6.5天，根据上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法，将细胞从培养皿上剥离，使用human PDGFRα-PE(PRa292、美国安迪生物科技公司制)，在4℃的条件下反应30分钟。之后，为全面分析细胞表面标记表达，使用抗体库(BDLyoplate Screening Panels、BD生物科学公司制)，在4℃的条件下反应30分钟。使用流式细胞仪(BD LSRFortessa流式细胞仪[BD生物科学公司制])对检测到的细胞表面标记表达进行了分析。
其结果可知在分化诱导后第6.5天的PDGFRα阳性细胞中，22种细胞表面标记(CD105、CD121a、CD18、CD120a、CD45、CD14、CD31、HLA-DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34和CD4)为阴性(参照图10～12)。如果该结果与在分化诱导后第6天的PDGFRα阳性细胞约50％显示为CD82阳性细胞的图3的结果进行综合，则显示出CD82阳性细胞中上述22种细胞表面标记为阴性。
进一步地，根据上述[本发明方法]的项目中记载的方法，进行从人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导，在分化诱导后第6天，按照上述[细胞分选与流式细胞术分析]的项目中记载的方法，将细胞从培养皿上剥离，用human CD82-PE(ASL-24、Biolegend公司制)或humanCD82-APC(ASL-24、Biolegend公司制)，在4℃的条件下反应30分钟。之后，用针对26种细胞表面标记(CD7、CD37、CD43、CD49a、CD18、CD105、CD144、STRO-1、CD177、CD73、CD44、CD117[c-kit]、CD163、CD31、CD106、ROR2、CD137L、CD140b[PDGFRb]、CD166[ALCAM]、CD180、CD252[OX40L]、CD344[Frizzled4]、CD304[Neurophilin-1]、CD118[LIF-R]、CD99R和CD90)的抗体(参照表2)，在4℃的条件下反应30分钟。使用流式细胞仪(FACS(FACS Aria II[BD生物科学公司制]))对检测到的细胞表面标记表达进行了分析。
[表2]
细胞表面标记 抗体
CD7 抗体：CD7-FITC(CD7-6B7、Biolgend公司制)
CD37 抗体：CD37-FITC(M-B371、Biolgend公司制)
CD43 抗体：CD43-FITC(1G10、Biolgend公司制)
CD49a 抗体：CD49a-FITC(TS2/7、Biolgend公司制)
CD18 抗体：CD18-FITC(TS1/18、Biolgend公司制)
CD105 抗体：CD105-FITC(43A3、Biolgend公司制)
CD144 抗体：CD144-PE(55-7H1、BD Parmingen公司制)
STRO-1 抗体：STRO-1-FITC(STRO-1、Biolgend公司制)
CD177 抗体：CD177-FITC(MEM-166、Biolgend公司制)
CD73 抗体：CD73-FITC(AD2、Biolgend公司制)
CD44 抗体：CD44-FITC(BJ18、Biolgend公司制)
CD117 抗体：CD117-PE(47233、R and D System公司制)
CD163 抗体：CD163-PE(GH1/61、BD Bioscience公司制)
CD31 抗体：CD31-APC(WM-59、eBioscience公司制)
CD106 抗体：CD106-APC(STA、Biolgend公司制)
ROR2 抗体：ROR2-APC(231509、R and D System公司制)
CD137L 抗体：CD137-PE(TKS-1、Biolgend公司制)
CD140b 抗体：CD140-PE(28D4、BD Parmingen公司制)
CD166 抗体：CD166-PE(3A6、Biolgend公司制)
CD180 抗体：CD180-PE(MHR73-11、Biolgend公司制)
CD252 抗体：CD252-PE(11C3.1、Biolgend公司制)
CD344 抗体：CD344-PE(CH3A4A7、Biolgend公司制)
CD304 抗体：CD304-PE(446921、R and D System公司制)
CD118 抗体：CD118-PE(32953、R and D System公司制)
CD99R 抗体：CD99R-PE(MEM-1310、abcam公司制)
CD90 抗体：CD90-APC(5E10、Biolgend公司制)
其结果显示在CD82阳性细胞中15种细胞表面标记(CD7、CD37、CD43、CD49a、CD18、CD105、CD144、STRO-1、CD177、CD73、CD44、CD117、CD163、CD31和CD106)为阴性(参照图13)，11种细胞表面标记(ROR2、CD137L、CD140b、CD166、CD180、CD252、CD344、CD304、CD118、CD99R和CD90)为阳性(参照图14)。
工业上的可利用性
根据本发明，能够制备出具有心肌特异性分化能力、且具有高自我增殖能力和向心肌的高成活率的心肌前体细胞，因此有助于心脏病的治疗、特别是心脏病的微创治疗。

Claims (16)

1.一种用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞，其是选自下面的细胞表面标记A组中的至少一个细胞表面标记为阴性的细胞，
细胞表面标记A组：CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18、CD120a。
2.根据权利要求1所述的CD82阳性细胞，其是经分离纯化而得到的。
3.根据权利要求1或2所述的CD82阳性细胞，其是选自下面的细胞表面标记B组中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的细胞表面标记C组中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞，
细胞表面标记B组：CD7、CD37、CD43、CD144、STRO-1、CD177、CD163，
细胞表面标记C组：CD137L、CD140b、CD180、CD252、CD344、CD118、CD99R。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的CD82阳性细胞，其是选自下面的细胞表面标记D组中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的细胞表面标记E组中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞，
细胞表面标记D组：CD49a、CD117、CD31、CD106、CD45、CD14、HLA-DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34、CD4，
细胞表面标记E组：CD166、CD304、CD90。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的CD82阳性细胞，其是选自下面的细胞表面标记F组中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞，
细胞表面标记F组：ROR2、CD13、PDGFRα、KDR。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的CD82阳性细胞，其用冷冻保存。
7.一种心脏病治疗剂，其包含权利要求1～6中任一项所述的CD82阳性细胞。
8.一种CD82阳性细胞的制备方法，其具备下面的步骤(a)～(c)：
(a)获得干细胞的步骤；
(b)对干细胞进行向心血管细胞分化诱导处理的步骤；
(c)从在步骤(b)中经分化诱导处理的干细胞中分离CD82阳性细胞的步骤，该CD82阳性细胞是选自下面的细胞表面标记A组中的至少一个细胞表面标记为阴性的细胞，
细胞表面标记A组：CD73、CD44、CD105、CD121a、CD18、CD120a。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，干细胞为人多能干细胞。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，人多能干细胞为人诱导性多能干细胞。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的制备方法，其中，向心血管细胞的分化诱导处理是向心肌前体细胞的分化诱导处理。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的制备方法，其中，CD82阳性细胞是选自下面的细胞表面标记B组中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的细胞表面标记C组中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞，
细胞表面标记B组：CD7、CD37、CD43、CD144、STRO-1、CD177、CD163，
细胞表面标记C组：CD137L、CD140b、CD180、CD252、CD344、CD118、CD99R。
13.根据权利要求8～12中任一项所述的制备方法，其中，CD82阳性细胞是选自下面的细胞表面标记D组中的至少一个细胞表面标记为阴性、和/或选自下面的细胞表面标记E组中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞，
细胞表面标记D组：CD49a、CD117、CD31、CD106、CD45、CD14、HLA-DR、CD38、CD121b、CD122、CD124、CD126、CD127、CD11a、CD104、CD62e、CD62l、CD62p、CD120b、CD34、CD4，
细胞表面标记E组：CD166、CD304、CD90。
14.根据权利要求8～13中任一项所述的制备方法，其中，CD82阳性细胞是选自下面的细胞表面标记F组中的至少一个细胞表面标记为阳性的细胞，
细胞表面标记F组：ROR2、CD13、PDGFRα、KDR。
15.根据权利要求8～14中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(c)中，在步骤(b)中经分化诱导处理后第4～8天，分离CD82阳性细胞。
16.一种用作心肌前体细胞的CD82阳性细胞，其是通过权利要求8～15中任一项所述的制备方法而得到的。
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