JP6714932B2 - 脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)以下の工程(A)及び(B)を有することを特徴とする、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法;
(A)脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される1種又は2種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程;
(B)工程(A)で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程;や、
(2)1種又は2種以上の細胞が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞であることを特徴とする上記(1)に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
(3)脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際に沈殿する細胞であることを特徴とする上記(2)に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
(4)工程(A)における1種又は2種以上の細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導する工程が、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される1種又は2種以上の脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で、前記1種又は2種以上の細胞を培養する工程であることを特徴とする上記(1)〜(3)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
(5)工程(B)における成熟脂肪細胞を脱分化誘導することが、成熟脂肪細胞を天井培養することであることを特徴とする上記(1)〜(4)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
(6)脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素が、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン−EDTA、ディスパーゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ及びパパインからなる群から選択される1種又は2種以上の酵素であることを特徴とする上記(2)〜(5)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
(7)脊椎動物が哺乳動物であることを特徴とする上記(1)〜(6)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
(8)脂肪組織が皮下脂肪組織であることを特徴とする上記(1)〜(7)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法に関する。
(9)上記(1)〜(8)のいずれかに記載の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株や、
(10)巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される1種又は2種以上への分化能を有していることを特徴とする上記(9)に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株や、
(11)以下の間葉系細胞の表面マーカー群から選択される1種又は2種以上の表面マーカーを発現しており、かつ、以下の血液細胞の表面マーカー群から選択される1種又は2種以上の表面マーカーを発現していないことを特徴とする上記(9)又は(10)に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株;
間葉系細胞の表面マーカー群:CD13、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA−ABC;
血液細胞の表面マーカー群:CD11b、CD14、CD19、CD34、CD41、CD42b、CD45、CD56、HLA−DR;や、
(12)脊椎動物の脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞を脱分化誘導して得られた脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、中胚葉系細胞への分化誘導効率が、1.5倍以上であることを特徴とする上記(9)〜(11)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株に関する。
(13)上記(9)〜(12)のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有することを特徴とする中胚葉系細胞の製造方法や、
(14)中胚葉系細胞が、巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨又は脂肪細胞であることを特徴とする上記(13)に記載の中胚葉系細胞の製造方法に関する。
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法(以下、単に「本発明の細胞株の製造方法」と表示する。)としては、
(A)脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される1種又は2種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程;及び
(B)工程(A)で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程;
を有する方法である限り特に制限されない。
工程(A)の分化誘導により得られる成熟脂肪細胞は、脊椎動物の脂肪組織に存在していた成熟脂肪細胞よりも、脱分化を生じ易い成熟脂肪細胞(以下、本明細書において「易脱分化成熟脂肪細胞」とも表示する。)であるため、工程(B)における脱分化誘導によって、より簡便、より短期間、かつ、より効率的に脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を製造(樹立)することができると考えられる。なお、かかる製造方法は、生体外(ex vivo)又はin vitroでの製造方法とすることができる。
上記工程(A)としては、脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される1種又は2種以上の細胞(以下、本明細書において「間葉系幹細胞等」とも表示する。)を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程である限り特に制限されない。かかる分化誘導の工程は、生体外(ex vivo)又はin vitroでの分化誘導の工程である。
200mg/L 無水塩化カルシウム、0.1mg/L Fe(NO3)3・9H2O、200mg/L 塩化カリウム、97.67mg/L 無水硫酸マグネシウム、6400mg/L 塩化ナトリウム、3700mg/L 炭酸水素ナトリウム、125mg/L リン酸二水素ナトリウム一水和物、4500mg/L D−グルコース、15mg/L フェノールレッド、110mg/L ピルビン酸ナトリウム、84mg/L L−塩酸アルギニン、63mg/L L−シスチン二塩酸塩、584mg/L L−グルタミン、30mg/Lグリシン、42mg/L L−ヒスチジン塩酸塩一水和物、105mg/L L−イソロイシン、105mg/L L−ロイシン、146mg/L L−リジン塩酸塩、30mg/LL−メチオニン、66mg/L L−フェニルアラニン、42mg/L L−セリン、95mg/L L−スレオニン、16mg/L L−トリプトファン、104mg/L L−チロシン二ナトリウム二水和物、94mg/L L−バリン、4mg/L D−パントテン酸カルシウム、4mg/L 塩化コリン、4mg/L 葉酸、7.2mg/L i−イノシトール、4mg/L ニコチン酸アミド、4mg/L ピリドキシン塩酸塩、0.4mg/L リボフラビン、4mg/L 塩酸チアミン。
上記工程(B)としては、工程(A)で得られた成熟脂肪細胞(易脱分化成熟脂肪細胞)を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程である限り特に制限されない。かかる工程は、生体外(ex vivo)又はin vitroでの工程である。
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株としては、本発明の細胞株の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株である限り特に制限されない。本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、分化誘導作用を持たない通常の間葉系細胞培養用基本培養液で培養したときに自発的な分化を起こさず、長期継代培養が可能であり、かつ、長期継代培養後も増殖能及び中胚葉系細胞(巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される1種又は2種以上)への分化能を維持している。例えば、ヒトの皮下脂肪組織から製造した本発明の脂肪組織由来間葉系細胞株は、20代目においても増殖能を維持しており、また、ダブリングタイムは23時間であることが観察されている。
葉系細胞の表面マーカー群:CD13、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA−ABC;
血液細胞の表面マーカー群:CD11b、CD14、CD19、CD34、CD41、CD42b、CD45、CD56、HLA−DR;
本発明の中胚葉系細胞の製造方法としては、本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有している限り特に制限されない。かかる中胚葉系細胞としては、巨核球及び/又は血小板(巨核球・血小板)、骨芽細胞、軟骨、脂肪細胞などが挙げられる。
ヒトから皮下脂肪組織片を単離後、コラゲナーゼ(collagenase type II; sigma社製
)を加え37℃1時間インキュベーションし、細胞懸濁液を得た。かかる細胞懸濁液を遠心分離したところ、比重の軽い成熟脂肪細胞は上清に浮遊し、それ以外の種類の細胞は細胞ペレットとして沈殿した。細胞ペレットには、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞(ストローマ細胞)、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などが含まれている。この後の実験には細胞ペレットの細胞を用いた。培養ディッシュに入れたAdipocyte Differentiation Medium培養液(Cell Applications社製)にて、前述の細胞ペレットの細胞を37℃、CO2濃度5%条件下で10日間培養した。培養後の細胞には、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞を含む間質血管細胞群から分化誘導された成熟脂肪細胞(易脱分化成熟脂肪細胞)が多く含まれている。培養後の細胞を、トリプシンを用いて培養ディッシュからはがし、その細胞にトリプシン及びDMEM培養液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium、ライフテクノロジー社製)を加えて遠心分離器にかけ、その上清に浮いてくる成熟脂肪細胞(易脱分化成熟脂肪細胞)を回収した。20%FBSを含むDMEM培養液を十分量入れた培養フラスコに、前述の易脱分化成熟脂肪細胞を加え、その細胞を、培養液が充満した培養フラスコの内側の上面に浮遊、付着させて培養した(いわゆる「天井培養」)。かかる天井培養は、37℃、CO2濃度5%条件下で7日間行った。このように培養することにより、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株が得られた。このヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を位相差顕微鏡像で観察した結果を図1に示す。図1から分かるように、かかる細胞株は、繊維芽細胞様の形態を有しており、培養ディッシュ上に付着増殖することが示された。国際細胞治療学会では間葉系幹細胞の定義として、(A)付着細胞であること、(B)骨、軟骨、脂肪に分化することができること、(C)間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと、の条件を挙げている。図1の結果から、本発明におけるヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、間葉系幹細胞の上記定義の条件のうち、(A)を充たしていることが示された。
上記の実施例1で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、培養ディッシュに入れた骨芽細胞分化誘導培養液(Cell Applications社製)にて、37℃、CO2濃度5%条件下で21日間培養した。得られた細胞のアルカリフォスファターゼ活性を、その基質であるブロモクロロインドリルリン酸・ニトロブルーテトラゾリウムを添加して確認したところ、青紫色の発色(ただし、図面では黒っぽい色として表される)が認められた(図2の上から1段目の右パネル)。このことから、骨芽細胞への分化が確認された。
上記の実施例1で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、培養ディッシュに入れたAdipocyte Differentiation Medium培養液(Cell Applications社製)にて、37℃、CO2濃度5%条件下で7日間培養した。得られた細胞をオイルレッドOで染色して、脂肪球の有無を確認したところ、赤色の発色(ただし、図面では黒っぽい色として表される)が認められた(図2の上から3段目の右パネル)。このことから、成熟脂肪細胞への分化が確認された。このことから、本発明の製造方法により製造された脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、脂肪細胞への分化能を有していることが確認された。
上記の実施例1で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、培養ディッシュに入れたChondrogenic Differentiation medium培養液(PromoCell社製)にて、37℃、CO2濃度5%条件下で7日間培養した。得られた細胞をアリシアンブルーで染色して、軟骨細胞に特徴的な細胞外マトリクスの有無を確認したところ、青色の発色(ただし、図面では黒っぽい色として表される)が認められた(図2の上から3段目の右パネル)。このことから、軟骨細胞への分化が確認された。このことから、本発明の製造方法により製造された脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、軟骨細胞への分化能を有していることが確認された。
上記の実施例1で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株が、国際細胞治療学会における間葉系幹細胞の定義の「(C)間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと」という条件を充たしているかどうかを調べるために、間葉系細胞の表面マーカー(CD13、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA−ABC)や、血液細胞の表面マーカー(CD11b、CD14、CD19、CD34、CD41、CD42b、CD45、CD56、HLA−DR)を特異的に認識する抗体を用いて、前述の細胞における各表面マーカーの発現をフローサイトメトリー法にて解析した。また、ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体を用いて、同様のフローサイトメトリー法を行った。なお、表面マーカーを特異的に認識する抗体のうち、抗CD29抗体、抗CD42b抗体、抗CD71抗体については、BDファーミンジェン社製のものを用い、抗CD105抗体については、ベックマンコールター社製のものを用い、他の抗表面マーカー抗体についてはバイオレジェンド社製のものを用いた。前述のフローサイトメトリーの結果を、図3に示す。
培養ディッシュにコラーゲンをコーティングし、そこに培養培地を添加した。培養培地としては、造血幹細胞を巨核球、血小板へと分化誘導し得る培地として知られているMKLI培養液(megakaryocyte lineage induction medium)を用いた。該MKLI培地は、IMDM培養液(Iscove's Modified Dulbecco's Medium、ライフテクノロジー社製)に、2mM L−グルタミン(ライフテクノロジー社製)、100U/mL ペニシリン−ストレプトマイシン溶液(ライフテクノロジー社製)、0.5% BSA(シグマ社製)、4μg/mL LDLコレステロール(シグマ社製)、200μg/mL 鉄飽和トランスフェリン(シグマ社製)、10μg/mL インスリン(シグマ社製)、50μM 2−β−メルカプトエタノール(ライフテクノロジー社製)、20μM 各ヌクレオチド(ATP、UTP、GTP、及びCTP)(ライフテクノロジー社製)、及び50ng/mL ヒトトロンボポエチン(TPO、Stem Cell Technologies製)を添加し作製した。
上記の実施例1で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、上記のMKLI培養液にて、37℃、CO2濃度5%条件下で7日間培養した。培養後の細胞集団を分取した後、該細胞集団におけるCD41及びCD42b(巨核球や血小板の特異的マーカー)の陽性細胞の割合(%)を測定した。その結果を図4に示す。かかる測定は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)標識抗CD41抗体又は、APC(アロフィコシアニン)標識抗CD42b抗体で直接ラベルし、フローサイトメトリー法を用いて行った。かかる細胞集団におけるCD41陽性細胞の割合は70.4±3.9%であり、CD41陽性かつCD42b陽性の細胞の割合は23.6±2.4%であった。
巨核球は分化が進んでくると、核の倍数性が増加することが知られている。そこで、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をMKLI培養液にて、37℃、CO2濃度5%条件下で7日間培養して得られた細胞集団の核の倍数性(DNA Ploidy)を、萩原らの方法(Exp.Hematol.,26,228〜235,1998)により測定した。すなわち、前述の細胞集団の細胞の核をプロピジウムイオダイド(PI)で染色した後、フローサイトメトリーで各細胞のPIの蛍光強度を測定し、各細胞におけるDNA Ploidyを算出した。その結果を図5に示す。図5から分かるように、4Nや8Nなどの多倍体化した細胞が認められた。
血小板においてフィブリノーゲンは、血液凝固等の作用に寄与しており、また、PAC−1は、血小板活性化マーカーである。ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をMKLI培養液にて、37℃、CO2濃度5%条件下で7日間培養して得られた細胞集団が、血小板の機能を有しているかを確認するために、フィブリノーゲン及びPAC−1の発現を測定した。かかる測定は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)標識抗フィブリノーゲン抗体又はFITC標識抗PAC−1抗体で直接ラベルし、フローサイトメトリー法を用いて行った。また、コントロールとして、MKLI培養液で培養を開始する前のヒト脂肪組織由来間葉系細胞株についても同様のフローサイトメトリー法を行った。FITC標識抗フィブリノーゲン抗体を用いたフローサイトメトリー法の結果を図6に示し、FITC標識抗PAC−1抗体を用いたフローサイトメトリー法の結果を図7に示す。図6及び図7から分かるように、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をMKLI培養液で培養して得られた細胞集団では、フィブリノーゲン及びPAC−1の発現の亢進が確認された。
特許文献2記載の方法にしたがって、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株(以下、「従来法による脂肪組織由来間葉系細胞株」と表示する。)を作製した。一方、実施例1で作製したヒト脂肪組織由来間葉系細胞株(以下、「本発明による脂肪組織由来間葉系細胞株」と表示する。)を用意した。これら2種の脂肪組織由来間葉系細胞株を同量ずつ分取し、それぞれ、MKLI培養液(培地)にて37℃、CO2濃度5%条件下で7日間培養して、巨核球・血小板への分化誘導を行った。培養後の細胞集団を分取した後、該細胞集団におけるCD41及びCD42b(巨核球や血小板の特異的マーカー)の陽性細胞の割合(%)を測定した。その結果、本発明による脂肪組織由来間葉系細胞株を用いると、従来法による脂肪組織由来間葉系細胞株を同量用いた場合と比較して、CD41及びCD42b(巨核球や血小板の特異的マーカー)の陽性細胞が3倍量得られた。この結果から、本発明による脂肪組織由来間葉系細胞株は、従来法による脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、巨核球・血小板への誘導効率が3倍高い細胞株であることが示された。
Claims (13)
- 以下の工程(A)及び(B)を有することを特徴とする、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
(A)脊椎動物の間質血管細胞群のうち、脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を少なくとも含む細胞集団を、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される2種以上の脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で培養して成熟脂肪細胞に分化誘導する工程;
(B)工程(A)で得られた成熟脂肪細胞を天井培養により脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程; - 2種以上の脂肪細胞分化誘導物質のうち、1種がインスリンである請求項1に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
- 細胞集団が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞集団であることを特徴とする請求項1又は2に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
- 脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞集団が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際に沈殿する細胞集団であることを特徴とする請求項3に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
- 脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素が、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン−EDTA、ディスパーゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ及びパパインからなる群から選択される1種又は2種以上の酵素であることを特徴とする請求項3又は4に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
- 脊椎動物が哺乳動物であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
- 脂肪組織が皮下脂肪組織であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
- 巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される1種又は2種以上への分化能を有していることを特徴とする請求項8に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
- 以下の間葉系細胞の表面マーカー群から選択される1種又は2種以上の表面マーカーを発現しており、かつ、以下の血液細胞の表面マーカー群から選択される1種又は2種以上の表面マーカーを発現していないことを特徴とする請求項8又は9に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
間葉系細胞の表面マーカー群:CD13、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA−ABC;
血液細胞の表面マーカー群:CD11b、CD14、CD19、CD34、CD41、CD42b、CD45、CD56、HLA−DR; - 脊椎動物の脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞を天井培養により脱分化誘導して得られた脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、中胚葉系細胞への分化誘導効率が、1.5倍以上であることを特徴とする請求項8〜10のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
- 請求項8〜11のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有することを特徴とする中胚葉系細胞の製造方法。
- 中胚葉系細胞が、巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項12に記載の中胚葉系細胞の製造方法。
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