WO2021065971A1 - 凍結保存細胞の希釈用緩衝液 - Google Patents

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WO2021065971A1
WO2021065971A1 PCT/JP2020/037058 JP2020037058W WO2021065971A1 WO 2021065971 A1 WO2021065971 A1 WO 2021065971A1 JP 2020037058 W JP2020037058 W JP 2020037058W WO 2021065971 A1 WO2021065971 A1 WO 2021065971A1
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cells
cell
buffer solution
human
cell suspension
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PCT/JP2020/037058
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賢二 大山
勇 松田
文哉 大橋
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テルモ株式会社
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for recovering live cells from cryopreserved cells and a method for producing a cell culture containing the method.
  • autologous cells are frozen and stored to form three-dimensional structures such as artificial tissues and sheet-like cell cultures, and cells are directly transplanted.
  • cryopreserved cells recover autologous cells, and perform treatment using the cells.
  • Cells can be stored semi-permanently by freezing, but the cells are damaged by the latent heat generated during freezing and stress such as ice crystals generated inside the cells, and the cells are stored frozen. When recovering the cells, not all of them can be recovered as living cells. Normally, after thawing cryopreserved cells, it is necessary to culture and proliferate the thawed cells in order to secure a required amount of cells, which requires labor and cost. In the case of cell sheets prepared without culturing after thawing, the proportion of living cells directly affects the quality. Therefore, it is desirable to collect as many living cells as possible in order to reduce costs and improve quality. Therefore, attempts have been made to increase the number of living cells by devising a freezing / thawing method to reduce physical damage to cells.
  • the present inventors attempted to prepare a sheet-like cell culture for biological transplantation using cells having sufficient functions even when prepared in a xenofree environment, and prepared a cell suspension in which cryopreserved cells were thawed.
  • HSA human serum albumin
  • the present invention relates to the following: ⁇ 1> A human-derived albumin-containing buffer solution for diluting a cell suspension in which cryopreserved cells containing somatic cells are thawed. ⁇ 2> The buffer solution according to ⁇ 1>, wherein the human-derived albumin is human serum albumin. ⁇ 3> The buffer solution according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the concentration of human-derived albumin is 1.0% or more. ⁇ 4> The buffer solution according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the buffer solution contains sugars, amino acids and vitamins.
  • ⁇ 5> The buffer solution according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, for diluting the buffer solution by dropping it onto the cell suspension at a constant rate.
  • ⁇ 6> A kit containing the human-derived albumin-containing buffer solution according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • the method for recovering live cells from cryopreserved cells including somatic cells which comprises a step of diluting a cell suspension obtained by thawing the cryopreserved cells with a buffer solution containing human-derived albumin.
  • Recovery of cryopreserved cells including somatic cells A method of increasing the ratio of 1 or more selected from the group consisting of the number of viable cells, survival rate, and recovery rate, which is a cell suspension in which cryopreserved cells are thawed.
  • the method comprising diluting with a human-derived albumin-containing buffer.
  • ⁇ 9> The method according to ⁇ 7> or ⁇ 8>, wherein the somatic cells are skeletal myoblasts and the ratio of CD56-positive cells is further increased.
  • the step of diluting includes a step of dropping the buffer solution onto the cell suspension at a constant rate.
  • the buffer solution contains sugars, amino acids and vitamins.
  • a method for producing a graft which comprises the method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 11>.
  • ⁇ 13> A graft produced by the method described in ⁇ 12>.
  • ⁇ 14> A method for treating heart disease in a subject, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the graft produced by the method according to ⁇ 12> to a subject in need thereof.
  • Recovery of cryopreserved cells including somatic cells A method for increasing the ratio of 1 or more selected from the group consisting of the number of viable cells, survival rate, and recovery rate, which is a human-derived albumin-containing buffer solution containing sugars and vitamins. The method comprising adding one or more components selected from the group consisting of class and amino acids, and diluting the cell suspension in which the cryopreserved cells are thawed with the added buffer solution with a human-derived albumin-containing buffer solution. ..
  • ⁇ 16> The method according to ⁇ 15>, wherein the somatic cells are skeletal myoblasts and the ratio of CD56-positive cells is further increased.
  • the step of diluting comprises dropping the buffer solution onto the cell suspension at a constant rate.
  • the cells in order to dilute a cell suspension in which cryopreserved cells are thawed, the cells are diluted with a buffer solution containing human-derived albumin instead of a culture solution containing FBS, which is a heterologous component, in a xenofree environment. It improves the number of viable cells that can be recovered. According to the present invention, the number of recovered viable cells, survival rate, recovery rate and / or the ratio of CD56-positive cells can be recovered even after freezing and thawing. However, it is possible to secure a sufficient number of viable cells. As a result, not only the cost and labor of cell culture after thawing can be reduced, but also the choice of cell sheets applicable to regenerative medicine can be expanded.
  • FIG. 1 shows the number of recovered viable cells (Recovered viable cell ratio) diluted with HSA-containing DMEM at each concentration when the number of recovered cells diluted with DMEM containing no HSA is 1.
  • Human-derived albumin-containing buffer includes a human-derived albumin-containing buffer for diluting a cell suspension in which cryopreserved cells are thawed.
  • the "cryopreserved cell” usually means the cryopreserved cell itself, but may also mean one cryopreserved unit of the cryopreserved cell.
  • the cryopreservation unit means a group of cells that are cryopreserved together as a group, for example, one tube. Therefore, in this case, when the "cryopreserved cells" are thawed, the frozen "cell suspension” is obtained.
  • the buffer solution of the present invention relates to a buffer solution for diluting a cell suspension obtained by thawing cryopreserved cells, and is characterized by containing human serum albumin.
  • FBS is contained in the thawed cell suspension for the purpose of reducing the influence of cytotoxic components such as DMSO in the thawed cell suspension.
  • cytotoxic components such as DMSO
  • the present inventors realize high recovery viable cell number and survival rate of cells while realizing xenofree by diluting with a buffer solution containing human serum albumin (HSA) instead of FBS-containing culture medium. , Recovery rate and / or CD56 positive cell rate.
  • HSA human serum albumin
  • the buffer solution that can be used in the present invention is not particularly limited, but one that does not cause physicochemical damage to the cells is preferable from the viewpoint of increasing the high recovery rate of the cells.
  • Examples of the buffer solution are not limited to this, but in addition to known buffer solutions such as Hanks equilibrium salt solution and phosphate buffered saline, for example, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME.
  • the saccharide to be added is not limited as long as it is a saccharide normally used in cell culture, and any monosaccharide or polysaccharide such as glucose, galactose, fructose, mannose, lactose, and sucrose can be used. Further, in the present invention, saccharides include pyruvic acid and lactic acid produced by decomposition of glucose in glycolysis. The preferred saccharide to be added is glucose.
  • the vitamins to be added are not limited as long as they are vitamins commonly used in cell culture, for example, thiamine, choline, riboflavin, niacin, pantothenic acid, pyridoxal, biotin, folic acid, cyanocobalamine, ascorbic acid, niacinamide, vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin K, i-inosito, D-pantothenic acid, pyridoxal, riboflavin, thiamine, ascorbic or analogs thereof, salts and / or hydrates can be used.
  • vitamins commonly used in cell culture for example, thiamine, choline, riboflavin, niacin, pantothenic acid, pyridoxal, biotin, folic acid, cyanocobalamine, ascorbic acid, niacinamide, vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin K, i-inosito, D-pantothenic acid, pyridoxal,
  • Amino acids are not limited to saccharides commonly used in cell culture, and are L or D forms of alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, Phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine or salts and / or hydrates thereof can be used, L-arginine HCl, L-cystine 2HCl, L-glutamine, glycine, L-histidine, etc.
  • L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like are preferable.
  • pyruvic acid, hypoxanthine, linoleic acid, ⁇ -lipoic acid, putrescine, thymidine and the like may be included as any component usually used in cell culture.
  • human-derived albumin used in the present invention is not particularly limited, and for example, human serum albumin, human lactalbumin, and human muscle albumin can be used, and human serum albumin is preferable.
  • human-derived albumin includes not only those derived from living organisms derived from blood, breast milk, etc., but also albumin produced by gene recombination using a gene encoding human-derived albumin.
  • the buffer solution containing human-derived albumin is, for example, 60% by weight or less, 50% by weight or less, 45% by weight or less, 40% by weight or less, 35% by weight or less, 30% by weight or less, 25% by weight or less, 20% by weight or less. , 15% by weight or less, 10% by weight or less, 5% by weight or less, 3% by weight or less, 1% by weight or less, 0.5% by weight or less. Therefore, the range of human-derived albumin content may be any combination of these upper and lower limits, and is not limited to, for example, 0.5 to 60% by weight, 1 to 20% by weight. %, 1.25 to 15% by weight, 2.5 to 20% by weight, and the like.
  • the method of the present invention is a method for recovering live cells from cryopreserved cells, in which a cell suspension obtained by thawing the cryopreserved cells is buffered with human-derived albumin.
  • the present invention relates to the above-mentioned method including diluting with a liquid.
  • the method of this embodiment will be described for each step.
  • ⁇ Thaw of cryopreserved cells any conditions known in the art may be used. Generally, if the cells are slowly thawed, physical damage to the cells is likely to occur due to ice crystals or the like. Therefore, usually, for example, a water bath set at about 37 ° C. is used to warm the cells at once and thaw them. In this step, any method known in the art to improve the recovery of live cells can be used.
  • any cell known in the art is not particularly limited as long as it can be cryopreserved.
  • a living cell means a living cell or a cell population containing the living cell, a cell mixture, a structure, a tissue, or the like.
  • the living cell is a cell into which no gene has been introduced.
  • the living cell is not particularly limited as long as it can form a graft such as a sheet-shaped cell culture, and is, for example, a somatic cell.
  • the living cells are preferably adherent cells (adhesive cells).
  • Adhesive cells include, for example, adherent somatic cells (eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin. Includes cells, synovial cells, cartilage cells, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, muscle satellite cells, heart stem cells, mesenchymal stem cells, etc.). Somatic cells may be stem cells, particularly those differentiated from iPS cells (iPS cell-derived adherent cells).
  • adherent somatic cells eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin. Includes cells, synovial cells, cartilage cells, etc.
  • stem cells eg, tissue stem cells such as myoblasts
  • Non-limiting examples of cells constituting the sheet-like cell culture include, for example, myoblasts, muscle satellite cells, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocellular cells, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells. , Dental membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells, synovial cells, cartilage cells and the like, with CD56-positive cells such as myoblasts and / or muscle satellite cells being preferred.
  • myoblast is a progenitor cell of striated muscle cell and includes skeletal myoblast and myocardial blast.
  • skeletal myoblast means a myoblast present in skeletal muscle. Skeletal myoblasts are well known in the art and can be prepared from skeletal muscle by any known method (eg, the method described in JP-A-2007-89442) or commercially. It is also available (eg Lonza, Cat # CC-2580).
  • Skeletal myoblasts are not limited to markers such as, for example, CD56, ⁇ 7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx), MyoD, Myf5, Myf6, myogenin, desmin, PAX3. Can be identified by.
  • myosatellite cells are progenitor cells of skeletal myoblasts and are not limited, for example, but are identified by markers such as CD56, CD34, Myogenin, Myf5, Pax7. Can be done.
  • skeletal myoblasts are CD56 positive.
  • Skeletal myoblasts and / or myosatellite cells are any organism with skeletal muscle, including, but not limited to, humans, non-human primates, rodents (mouse, rat, hamster, guinea pig, etc.), rabbits, etc. It may be derived from mammals such as dogs, cats, pigs, horses, cows, goats and sheep.
  • the skeletal myoblasts and / or myosatellite cells are mammalian skeletal myoblasts and / or myosatellite cells.
  • the skeletal myoblasts and / or myosatellite cells are human skeletal myoblasts and / or human myosatellite cells.
  • the amount of cryopreserved cells can vary depending on the dose of the cryopreserved container, but usually the cell suspension for cryopreservation is adjusted to a cell density of about 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 7 cells / ml. , Dispense into a container for frozen cells. Ideally, all cryopreserved cells are recovered as viable cells, so the number of cells in the cell suspension before cryopreservation can be used as a parameter when calculating the number of viable cells to be recovered.
  • cryopreservation solution any solution known to be used for cryopreservation of cells in the art can be used and is sold by many manufacturers.
  • a normal cell culture medium may be used, and a medium to which a frost damage protective agent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) or glycerol is added, usually about 1 to 20%, preferably about 5 to 10% is used. May be good. Further, 100% human serum may be used instead of the medium.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycerol glycerol
  • 100% human serum may be used instead of the medium.
  • the container for frozen cells any container usually used in the art may be used, for example, a commercially available cryovial, ampoule, cryopreservation bag or the like is used.
  • the method of the present invention consists of a group consisting of the number of viable cells recovered, the survival rate, the recovery rate and / or the ratio of CD56-positive cells by using a buffer solution containing human-derived albumin at the time of this dilution. It is characterized by increasing one or more selected.
  • the buffers, albumin types and concentrations that can be used for dilution are as detailed in the buffers containing human-derived albumin described above.
  • the method of diluting is not particularly limited, but it is preferable to suppress the osmotic load when adding the buffer solution
  • the buffer solution may be added to the cell suspension by a dropping step at a constant dropping rate. it can. Dropping at a constant rate may be performed by a dropping step having a constant dropping rate of 1 or 2 or more. Dilution may be carried out with the thawed cell suspension in a cryopreservation container or transferred to another container. When transferring to another container, in order to increase the viability of thawed cells, the cryopreservation container after transferring the cell suspension is washed with a buffer solution containing human-derived albumin, and this washing solution is washed with the cell suspension. Add to.
  • the buffer solution is a washing solution in which the thawed cell suspension is transferred to another container and then the cryopreservation container is washed, and a newly prepared buffer solution in which the cryopreservation container is not washed. Including.
  • Cell dilution can be performed by any known technique and is achieved by diluting the cells by suspending them in buffer, centrifuging, discarding the supernatant and collecting the precipitated cells. However, it is not limited to this. Cell dilution is typically performed immediately after thawing the frozen cells, with one or more such suspension, centrifugation, and recovery cycles (eg, a few) in the cell dilution step. You may go (4, 5 times, etc.).
  • the recovery method of the present invention comprises the steps of thawing the cryopreserved cells, diluting them with albumin-containing buffer and recovering them, and washing the cells before forming a sheet-like cell culture.
  • the cells can be washed by any known technique, typically, for example, a wash solution containing or not containing human serum albumin (culture solution (eg, medium, etc.) or physiological buffer solution (eg, eg)). (PBS, HBSS, etc.)) is suspended, centrifuged, the supernatant is discarded, and the precipitated cells are collected, but is not limited to this.
  • a wash solution containing or not containing human serum albumin culture solution (eg, medium, etc.) or physiological buffer solution (eg, eg)).
  • PBS, HBSS, etc.) physiological buffer solution
  • the step of washing cells such suspension, centrifugation, and recovery cycles may be performed one or more times (for example, 2, 3, 4, 5 times, etc.).
  • the present disclosure consists of a group consisting of the number of recovered viable cells, survival rate and recovery rate of cryopreserved cells.
  • a method of increasing the ratio of one or more selected comprising the step of diluting a cell suspension of thawed cryopreserved cells with a human-derived albumin-containing buffer.
  • the number of recovered viable cells, survival rate by the step of diluting the thawed cell suspension with a human-derived albumin-containing buffer.
  • 1 or more selected from the group consisting of the proportion of CD56 positive cells in addition to the recovery rate can be increased.
  • the present inventors have recovered the number of viable cells and the survival rate by adding sugars, vitamins and / or amino acids to the components contained in the human-derived albumin-containing buffer used in the method of the present invention. It has been found that in addition to the recovery rate, one or more selected from the group consisting of the ratio of CD56 positive cells can be enhanced.
  • Recovery of cryopreserved cells A method of increasing one or more selected from the group consisting of the number of viable cells, survival rate, recovery rate and / or the ratio of CD56-positive cells, which is a method for increasing saccharides and vitamins in a human-derived albumin-containing buffer solution. The method comprises adding one or more components selected from the group consisting of species, amino acids, and diluting the cell suspension in which the cryopreserved cells have been thawed with the added buffer.
  • a human-derived albumin-containing buffer solution containing no or all of saccharides vitamins and amino acids
  • it contains all of sugars, amino acids and vitamins.
  • a Hanks equilibrium salt solution containing human-derived albumin is used as a dilution buffer
  • a cell suspension in which amino acids and vitamins are added to the dilution buffer and cryopreserved cells are thawed is prepared. Dilution can increase the number of viable cells recovered, survival rate, recovery rate and / or proportion of CD56-positive cells.
  • the cells recovered by the recovery method of the present invention can be particularly preferably used when used without undergoing proliferation culture thereafter. Therefore, in one aspect, the present invention relates to a method for producing a graft using cells recovered by the recovery method of the present invention.
  • the "graft" means a structure for transplantation into a living body, and particularly means a structure for transplantation containing cells as a constituent component.
  • the implant is a structure for transplantation that is free of cells and structures other than cell-derived substances (eg, scaffolds, etc.).
  • the implants in the present disclosure include, but are not limited to, sheet-like cell cultures, spheroids, cell aggregates, and the like, preferably sheet-like cell cultures or spheroids, and more preferably sheet-like cells. It is a culture.
  • sheet-shaped cell culture refers to cells connected to each other to form a sheet.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the mediator is preferably derived from cells, particularly from the cells that make up the sheet-like cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • the sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (laminate (multilayer), for example, two layers, three layers, etc. It may be 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without showing a clear layered structure of the cells. For example, in the vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, cells may be present in a non-uniformly (for example, mosaic-like) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction.
  • a non-uniformly for example, mosaic-like
  • the grafts of the present disclosure preferably do not contain scaffolds (supports). Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the scaffold to maintain the physical integrity of the implant, such as a sheet cell culture, eg, poly. Although membranes made of vinylidene fluoride (PVDF) and the like are known, the implants of the present disclosure can maintain their physical integrity without such scaffolds. In addition, the implants of the present disclosure preferably consist only of cell-derived substances constituting the implants and do not contain any other substances.
  • scaffolds supports
  • Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the scaffold to maintain the physical integrity of the implant, such as a sheet cell culture, eg, poly.
  • PVDF vinylidene fluoride
  • the implants of the present disclosure can maintain their physical integrity without such scaffolds.
  • the implants of the present disclosure preferably consist only of cell-derived substances constituting the implants and do not contain any other substances.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as the cells can form a cell culture on the cells, and includes, for example, containers of various materials and / or shapes, solid or semi-solid surfaces in the containers, and the like. ..
  • the container preferably has a structure / material that does not allow a liquid such as a culture solution to permeate.
  • Such materials include, without limitation, for example, polyethylene, polypropylene, Teflon®, polyethylene terephthalate, polymethylmethacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl.
  • Acrylamide, metals (eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass) and the like can be mentioned.
  • Preferred culture substrates include, without limitation, for example, a substrate having an adhesive surface suitable for forming a sheet-like cell culture, and a substrate having a low adhesive surface suitable for forming spheroids. And / or a substrate having a uniform well-like structure and the like.
  • a substrate coated with a hydrophilic compound such as corona discharge-treated polystyrene, collagen gel or hydrophilic polymer on the surface thereof, and further, collagen.
  • Fibronectin Fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan and other extracellular matrix, and base materials coated with cell adhesion factors such as cadoherin family, selectin family and integrin family on the surface.
  • base material is commercially available (for example, Corning (R) TC-Treated Culture Dish, Corning, etc.).
  • spheroid formation for example, soft agar, temperature-responsive gel obtained by cross-linking poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) with polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate (commercially available name: mebiol gel), polyhydroxyethyl methacrylate ( Examples include a base material coated with a non-cell adhesive compound such as a hydrogel such as poly-HEMA) and 2-methacryloyloxyethyl phosphorischoline (MPC) polymer and / or a base material having a uniform uneven structure on the surface. Be done. Such substrates are also commercially available (eg, EZSPHERE (R), etc.).
  • the culture medium may be transparent or opaque in whole or in part.
  • the surface of the culture substrate may be coated with a material whose physical properties change in response to irritation, for example, temperature or light.
  • a material whose physical properties change in response to irritation, for example, temperature or light.
  • Such materials include, but are not limited to, for example, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, etc.
  • the culture medium may have various shapes.
  • the area thereof is not particularly limited, but may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2, about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 .
  • a circular culture dish having a diameter of 10 cm can be mentioned. In this case, the area is 56.7 cm 2 .
  • the culture surface may be flat or may have an uneven structure. When it has a concavo-convex structure, it is preferable that it has a uniform concavo-convex structure.
  • pluripotent stem cell is a well-known term in the art and has the ability to differentiate into three germ layers, i.e. cells of all lineages belonging to endoderm, mesoderm and ectoderm. Means cell.
  • pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), nuclear-transplanted embryonic stem cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
  • iPS cells are cells induced by introducing a gene. Normally, when inducing differentiation of pluripotent stem cells into specific cells, pluripotent stem cells are first suspended-cultured to form aggregates of any of the above three germ layers, and then cells that form aggregates. Induce differentiation into specific cells of interest.
  • pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cell means any cell that has been subjected to differentiation-inducing treatment so as to differentiate from a pluripotent stem cell into a specific type of cell.
  • differentiation-inducing cells include musculoskeletal cells such as skeletal myoblasts, muscle satellite cells, and myocardial cells, neural cells such as neuron cells, oligodendrocytes, and dopamine-producing cells, and retinal pigment epithelial cells.
  • Hematopoietic cells such as retinal cells, blood cells, bone marrow cells, immune-related cells such as T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells, and B cells, and organs such as hepatocytes, pancreatic ⁇ cells, and renal cells.
  • immune-related cells such as T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells, and B cells
  • organs such as hepatocytes, pancreatic ⁇ cells, and renal cells.
  • progenitor cells and somatic stem cells include mesenchymal stem cells in myocardial cells, pluripotent cardiac progenitor cells, monopoly cardiac progenitor cells, neural stem cells in neural cells, hematopoietic cells and immunity.
  • Examples include hematopoietic stem cells and lymphoid stem cells in related cells.
  • Induction of differentiation of pluripotent stem cells can be performed using any known method. For example, the induction of differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes can be performed based on the methods described in Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and WO2014 / 185358.
  • a differentiation-inducing cell derived from a pluripotent stem cell such as an iPS-derived cardiomyocyte
  • the undifferentiated cell may be removed after the differentiation induction.
  • the treatment for removing undifferentiated cells is known in the art, and the methods described in, for example, WO2017 / 038562, WO2016 / 072519, WO2007 / 0888874, etc. can be used.
  • the differentiation-inducing cell may be a cell derived from an iPS cell into which any useful gene other than the gene for reprogramming has been introduced.
  • iPS cells into which the chimeric antigen receptor gene described in Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013 has been introduced. Examples include T cells derived from.
  • cells into which any useful gene has been introduced after induction of differentiation from pluripotent stem cells are also included in the differentiation-inducing cells of the present invention.
  • the culture substrate may be coated with blood-derived components and / or cell adhesion components in order to form higher density implants, especially sheet-like cell cultures.
  • "Coated with blood-derived components and / or cell-adhesive components” means a state in which blood-derived components such as serum and / or cell-adhesive components are attached to the surface of the culture medium. The state can be obtained without limitation, for example, by treating the culture medium with blood-derived components and / or cell adhesion components. Treatment with blood-derived components and / or cell-adhesive components includes, for example, contacting serum and / or cell-adhesive components with the culture substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period of time.
  • the serum and / or cell adhesion component used for coating may be the same type of serum as the seeded cell origin (homogeneous serum) or a different type of serum (heterologous serum), for example FBS, but is preferable. It is an allogeneic serum, more preferably a serum (autologous serum) obtained from an individual from which the seeded cells are derived. Other blood-derived components include albumin and platelet lysates. Examples of the cell adhesive component used for coating include extracellular matrix such as collagen, fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan, cadoherin family, selectin family, and integrin family.
  • Examples of higher densities include, for example, a density that reaches confluence, that is, a density at which cells are expected to cover the entire adhesive surface of the culture vessel when seeded, for example, cells come into contact with each other when seeded. It can be as dense as expected, the density at which contact inhibition occurs, or the density at which cell proliferation is substantially stopped by contact inhibition or higher.
  • the upper limit of the seeding density is not particularly limited, but if the seeding density is excessively high, more cells will die, resulting in inefficiency. In one aspect of the present disclosure, the seeding density is, for example, about 1.0 ⁇ 10 6 / cm 2 to about 1.0 ⁇ 10 7 / cm 2 , about 1.0 ⁇ 10 6 / cm 2 to about 5.
  • the seeded cell population may contain other cells as long as they contain the desired cells (eg, skeletal myoblasts or muscle satellite cells), and if the desired cells are skeletal myoblasts, For example, fibroblasts, mesenchymal hepatocytes, and the like may be further contained.
  • a cell population collected from a tissue for example, skeletal muscle tissue
  • the sheet cell culture produced by the production method of the present disclosure comprises skeletal myoblasts and / or satellite cells.
  • the sheet cell culture produced by the production method of the present disclosure comprises skeletal myoblasts, satellite cells, fibroblasts and / or mesenchymal stem cells.
  • the sheet cell cultures of the present disclosure are useful in treating diseases that are ameliorated by the application of sheet cell cultures, such as various diseases associated with tissue abnormalities.
  • diseases to be treated are not limited, for example, heart diseases (for example, myocardial injury (myocardial infarction, cardiac trauma), cardiomyopathy, etc.), corneal diseases (for example, corneal epithelial stem cell exhaustion, corneal membrane).
  • heart diseases for example, myocardial injury (myocardial infarction, cardiac trauma), cardiomyopathy, etc.
  • corneal diseases for example, corneal epithelial stem cell exhaustion, corneal membrane.
  • Eye / chemical corrosion corneal ulcer, corneal opacification, corneal perforation, corneal scar, Stevens Johnson syndrome, ocular herbitis, etc.
  • retinal disease eg, retinal pigment degeneration, age-related yellow spot degeneration, etc.
  • Esophageal disease eg, prevention of esophageal inflammation / stenosis after esophageal surgery (removal of esophageal cancer)
  • skin disease eg, skin injury (trauma, burn), etc.
  • joint disease eg, osteoarthritis
  • Cartilage disease eg, cartilage damage
  • Liver disease eg, chronic liver disease
  • Pancreatic disease eg, diabetes
  • Dental disease eg, periodontal disease, etc.
  • Kidney disease eg, renal failure
  • thyroid disease eg, hypothyroidism
  • muscle disease eg, muscle injury, myitis, etc.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1 Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013; 48 (9): 1081-9.
  • the sheet-like cell cultures of the present disclosure can also be fragmented to an injectable size and injected at the site requiring treatment for greater efficacy than injection with a single cell suspension (Wang et. al., Cardiovasc Res. 2008; 77 (3): 515-24). Therefore, such a use is also possible for the sheet-shaped cell culture of the present disclosure.
  • Another aspect of the present disclosure relates to a method of treating a disease in a subject in need thereof, including applying an effective amount of the implant produced by the method of the present disclosure to a subject in need thereof.
  • the diseases to be treated are as described above.
  • the term “treatment” shall include all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at the cure, temporary remission or prevention of disease, etc.
  • the term “treatment” is medically acceptable for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease associated with a tissue abnormality, regressing or eliminating a lesion, preventing the onset or recurrence of the disease, and the like. Including interventions to be performed.
  • an ingredient that enhances the viability, engraftment and / or function of the implant, other active ingredients useful for treating the target disease, etc. are used in combination with the implant of the present disclosure. be able to.
  • the treatment method of the present disclosure may further include the step of producing the implant of the present disclosure according to the production method of the present disclosure.
  • the treatment method of the present disclosure serves as a cell (for example, skin cells, blood cells, etc. when using iPS cells) or a source of cells for producing a graft from a subject before the step of producing the graft. It may further include the step of collecting tissue (for example, skin tissue, blood, etc. when using iPS cells).
  • the subject from which the cell or tissue from which the cell is source is collected is the same individual as the subject to whom the cell culture, composition, implant, or the like is administered.
  • the subject from which the cell or tissue from which the cell is sourced is harvested is a separate entity of the same species as the subject receiving the administration, such as a cell culture, composition, or implant.
  • the subject from which the cell or tissue that is the source of the cell is collected is an individual different from the subject to which the implant or the like is administered.
  • the effective amount is, for example, an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progression (for example, size, weight, number of sheet-like cell cultures, etc.).
  • the amount is preferably an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease.
  • an amount that does not cause an adverse effect exceeding the benefit of administration is preferable.
  • Such an amount can be appropriately determined by, for example, a test in an experimental animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, or a disease model animal, and such a test method is well known to those skilled in the art.
  • the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
  • Examples of the administration method include intravenous administration, intramuscular administration, intraosseous administration, intrathecal administration, and direct application to tissues.
  • the frequency of administration is typically once per treatment, but multiple doses can be administered if the desired effect is not obtained.
  • the cell culture, composition, sheet-like cell culture or the like of the present invention may be fixed to the target tissue by a locking means such as a suture or a staple.
  • Example 1 Correlation between albumin concentration and number of recovered viable cells
  • Cells obtained from skeletal muscle tissue aseptically collected from human adult thighs were seeded in culture flasks and grown in MCDB131 medium containing 20% FBS.
  • the proliferated cells were detached from the culture flask with a proteolytic enzyme solution, collected, and concentrated by centrifugation to obtain a cell population containing skeletal myoblasts.
  • cryopreserved cells Thaw of cryopreserved cells and recovery of live cells were performed as follows. Four cryo tubes were stored frozen obtained above cell population (1.0 ⁇ 10 7 cells), in a water bath set at 37 ° C. was placed 2-3 minutes, to melt the cryopreserved cells. The thawed cell suspensions were transferred from 1.8 mL cryotubes to 225 mL conical tubes, respectively. Next, DMEM containing 0%, 0.5%, 1.25%, and 2.5% by weight of human serum albumin (HSA) was added dropwise to each conical tube at a constant rate, and 30 mL of each was added. After centrifuging at 4 ° C. and 240 ⁇ g for 7 minutes, the supernatant was discarded.
  • HSA human serum albumin
  • FIG. 1 shows the results of the number of recovered viable cells at each concentration when the number of recovered viable cells when diluted with DMEM containing 0% HSA is 1.
  • the number of recovered viable cells increased as the human serum albumin concentration increased, and was highest at a concentration of 2.5% or more.
  • Example 2 Examination of buffer solution components
  • inorganic salts (ii) sugars, (iii) vitamins, and (iv) amino acids, which will be described later, are used.
  • Table 1 1 L of each of buffer solutions 1 to 5 was prepared. Pyruvic acid / Na: 55 mg, hypoxanthine Na: 2.39 mg, linoleic acid: 0.042 mg, ⁇ -lipoic acid: 0.105 mg, phenol red: 8.1 mg, putrescine 2HCL in all of the buffer solutions 1 to 5. : 0.081 mg and thymidine: 0.365 mg were added.
  • buffer solutions 1 to 5 containing 2.5% by weight HSA were used instead of the Hanks equilibrium salt solution containing four different concentrations of HSA as the buffer solution. ..
  • Inorganic salts Calcium chloride (anhydrous): 116.6 mg, copper (II) sulfate, 5H 2 O: 0.0013 mg, iron trinitrate (III), 9H 2 O: 0.05 mg, iron (II) sulfate, 7H 2 O: 0 .417 mg, magnesium chloride: 28.64 mg, magnesium sulfate (anhydrous): 48.84 mg, sodium hydrogen carbonate: 2438 mg, potassium chloride: 311.8 mg, sodium chloride: 6995.5 mg, disodium hydrogen phosphate: 71.02 mg, Sodium hydrogen phosphate ⁇ H 2 O: 62.5, zinc sulfate ⁇ 7H 2 O: 0.432 mg (Ii) Sugar D-glucose: 3151 mg (Iii) Vitamins Biotin: 0.0035 mg, choline chloride: 8.98 mg, calcium D-pantothenate: 2.24 mg, folic acid: 2.65 mg, niacinamide 2.02 mg,
  • Viability (%) number of viable cells after thawing / total number of cells after thawing x 100
  • Recovery rate (%) number of viable cells after thawing / number of viable cells before thawing x 100
  • buffer solution 1 in which three kinds of sugars, vitamins and amino acids were combined was particularly preferable as the buffer solution for dilution during freezing and thawing. Therefore, in addition to the inorganic salts that are the base of the buffer solution, sugars, vitamins and amino acids are added to the albumin-containing buffer solution and diluted using this to recover the number of viable cells, survival rate, recovery rate and CD56. It became clear that the proportion of positive cells could be increased.

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Abstract

ヒト以外の異種由来成分を含まないゼノフリーな緩衝液を用いて回収率が高い生細胞の回収方法を提供することを目的とする。体細胞を含む凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するためのヒト由来アルブミン含有緩衝液。

Description

凍結保存細胞の希釈用緩衝液
　本開示は、凍結保存細胞からの生細胞の回収方法、および当該方法を含む細胞培養物の製造方法に関する。
　近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている。
　このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（例えば、非特許文献１～３参照）。
　シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められている。
　このように、再生医療に基づく新たな治療方法の確立とともに、自家細胞を凍結させて保存し、人工組織やシート状細胞培養物などの三次元構造体を形成したり、直接細胞を移植したりする際に、かかる凍結保存細胞を融解して自家細胞を回収し、それを用いて治療を行う機会が近年増加してきている。
　細胞は、凍結することにより、半永久的に保存することが可能であるが、凍結する際に発生する潜熱や、細胞内に発生する氷晶などのストレスにより細胞がダメージを受けてしまい、凍結保存された細胞を回収する際には全てを生細胞として回収することはできない。通常は凍結保存細胞を融解後、必要な量の細胞を確保するために、融解後の細胞を培養して増殖させる必要があり、手間やコストを要する。また融解後に培養することなく作成する細胞シートの場合、生細胞の割合が品質に直接影響する。したがってコスト削減や品質向上のためになるべく多くの生細胞を回収することが望まれる。そのため、凍結・融解方法を工夫して細胞への物理的ダメージを減らし、生細胞数を多くする試みが為されている。
　従来、融解した凍結保存細胞の細胞懸濁液は、ＦＢＳ含有培養液など一般的な細胞培養に使用される血清含有培養液で希釈することで回収率の低下が抑制されることが知られている。
特表２００７－５２８７５５号公報
Shimizu et al., Circ Res. 2002 Feb 22;90(3):e40-e48 Matsuura et al., Biomaterials. 2011 Oct;32(30):7355-62 Kawamura et al., Circulation. 2012 Sep 11;126(11 Suppl 1):S29-37
　再生医療に用いる臨床用の移植片、例えばシート状細胞培養物などを製造する場合、対象と同種（例えばヒト）の生物に由来する成分以外の成分（異種由来成分）を含まない状態、いわゆるゼノフリーな状態で製造されることが望ましいが、かかる移植片を製造するために凍結保存細胞を融解（解凍）する際、従来から使用されてきたＦＢＳ含有培養液などの異種血清含有培養液を希釈液として使用すると、ゼノフリーではなくなり、アレルゲンや病原体が混入するリスクが生じる。しかしながら、ゼノフリー環境を維持し、かつ解凍した凍結保存細胞を従来と遜色ないかそれ以上の回収率で回収することができる希釈液については報告されていない。
　本発明者らは、ゼノフリー環境下で調製しても十分な機能を有する細胞を用いた生体移植用のシート状細胞培養物の調製を試みる中で、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するために、ＦＢＳ含有培養培地の代わりにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む緩衝液を用いると、ＦＢＳ含有培養液を用いた場合よりも生細胞を高効率で回収できるという新たな知見を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
＜１＞　体細胞を含む凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するためのヒト由来アルブミン含有緩衝液。
＜２＞　ヒト由来のアルブミンが、ヒト血清アルブミンである、＜１＞に記載の緩衝液。
＜３＞　ヒト由来のアルブミンの濃度が、１．０％以上である、＜１＞または＜２＞に記載の緩衝液。
＜４＞　緩衝液が、糖類、アミノ酸類およびビタミン類を含む、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の緩衝液。
＜５＞　緩衝液が、前記細胞懸濁液へ一定速度で滴下することより希釈するための、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の緩衝液。
＜６＞　＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載のヒト由来アルブミン含有緩衝液を含むキット。
＜７＞　体細胞を含む凍結保存細胞から生細胞を回収する方法であって、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来のアルブミンを含む緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法。
＜８＞　体細胞を含む凍結保存細胞の回収生細胞数、生残率、回収率からなる群から選択される1以上の比率を高める方法であって、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法。
＜９＞　体細胞が骨格筋芽細胞であり、さらにＣＤ５６陽性細胞の比率を高める＜７＞または＜８＞に記載の方法。
＜１０＞　希釈するステップが、前記緩衝液を細胞懸濁液へ一定速度により滴下するステップを含む、＜７＞～＜９＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１１＞　緩衝液が糖類、アミノ酸類およびビタミン類を含む、＜７＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１２＞　＜７＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の方法を含む、移植片の製造方法。
＜１３＞　＜１２＞に記載の方法により製造された移植片。
＜１４＞　＜１２＞に記載の方法によって製造された移植片の治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、前記対象における心疾患の治療方法。
＜１５＞　体細胞を含む凍結保存細胞の回収生細胞数、生残率、回収率からなる群から選択される1以上の比率を高める方法であって、ヒト由来アルブミン含有緩衝液へ糖類、ビタミン類、アミノ酸からなる群から選択される１以上の成分を添加し、添加した前記緩衝液により凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法。
＜１６＞　体細胞が骨格筋芽細胞であり、さらにＣＤ５６陽性細胞の比率を高める＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞　希釈するステップが、前記緩衝液を細胞懸濁液へ一定速度により滴下するステップを含む、＜１５＞または＜１６＞に記載の方法。
　本発明は、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するために、異種由来成分であるＦＢＳを含む培養液に代えてヒト由来アルブミンを含有した緩衝液で希釈することによりゼノフリー環境下で回収可能な生細胞数を向上させるものである。本発明により、凍結、融解を経ても回収生細胞数、生残率、回収率および／またはＣＤ５６陽性細胞の比率が高く回収できるため、とくに融解後に増殖培養を経ずに使用する場合であっても、十分な生細胞数を確保することが可能となる。それにより、融解後の細胞培養のコストや手間を削減できるだけでなく、再生医療に適用可能な細胞シートの選択肢を広げるものである。
図１は、ＨＳＡを含有しないＤＭＥＭで希釈した際の回収生数を１とした場合の各濃度のＨＳＡ含有ＤＭＥＭで希釈した回収生細胞数（Recovered viable cell ratio）を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
（１）ヒト由来アルブミン含有緩衝液
　本開示は、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するためのヒト由来アルブミン含有緩衝液を含む。
　本開示において、「凍結保存細胞」とは、通常は凍結保存された細胞そのものを意味するが、凍結保存された細胞の１つの凍結保存単位を意味することもある。この場合、凍結保存単位とは、例えば１つのチューブなど、１群として一緒に凍結保存される細胞群を意味する。したがってこの場合、「凍結保存細胞」を融解した場合、凍結されていた「細胞懸濁液」が得られることとなる。
　本発明の緩衝液は、凍結保存細胞を融解して得られた細胞懸濁液を希釈するための緩衝液に関するものであり、ヒト血清アルブミンを含むことを特徴とするものである。通常、凍結保存細胞を融解して生細胞を回収する際、融解した細胞懸濁液中にあるＤＭＳＯなどの細胞毒性成分の影響を低減させるため等の目的で融解した細胞懸濁液にＦＢＳ含有培養培地を加えて希釈する。本発明者らは、かかる希釈の工程においてＦＢＳ含有培養培地の代わりにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する緩衝液で希釈することでゼノフリーを実現しながら細胞の高い回収生細胞数、生残率、回収率および／またはＣＤ５６陽性細胞率を奏することを見出した。
　本発明において用い得る緩衝液は特に限定されないが、細胞の高い回収率を高める観点から細胞に物理化学的ダメージを与えないものが好ましい。例えば無機塩類のほか、糖類、アミノ酸類およびビタミン類からなる群から選択される１以上の成分を含むことが好ましく、無機塩類のほか糖類、アミノ酸類およびビタミン類の全てを含むことが特に好ましい。緩衝液の例としては、これに限定するものではないが、例えばハンクス平衡塩液、リン酸緩衝生理食塩水などの公知の緩衝液のほか、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７などの基礎液体培地が含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。しかしながら、本発明の製造方法に用いる場合は、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよく、公知の緩衝液へ糖類、アミノ酸類、ビタミン類からなる群から選択される１以上の成分を適宜添加してよい。
　添加する糖類は、細胞培養において通常に用いられる糖類であれば限定されず、例えばグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラクトース、スクロースなど任意の単糖または多糖を使用できる。また本発明において糖類はグルコースが解糖系で分解されて生ずるピルビン酸および乳酸を含む。添加する糖類として好ましい糖類は、グルコースである。
　添加するビタミンは、細胞培養において通常に用いられるビタミン類であれば限定されず、例えばチアミン、コリン、リボフラビン、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキサール、ビオチン、葉酸、シアノコバラミン、アスコルビン酸、ナイアシンアミド、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、i－イノシトー、Ｄ－パントテン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、アスコルビンまたはこれらの類似体、塩および／または水和物が使用できる。
　アミノ酸は、細胞培養において通常に用いられる糖類であれば限定されず、ＬまたはＤ体のアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたはそれらの塩および／または水和物などを使用でき、Ｌ－アルギニン・ＨＣｌ、Ｌ－シスチン・２ＨＣｌ、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンなどが好ましい。
　その他、細胞培養において通常に用いられる任意の成分としてピルビン酸、ヒポキサンチン、リノール酸、α－リポ酸、プトレシン、チミジンなどを含んでよい。
　糖類、ビタミン類またはアミノ酸類は、細胞を損傷しない濃度であれば限定されず、例えば糖類０．００１～０．０１％、ビタミン類は計０．００００１～０．０００１％、アミノ酸類は計０．０００５％～０．００５であればよい。
　本発明において用いられるヒト由来のアルブミンは、特に限定されず、例えばヒト血清アルブミン、ヒト乳アルブミン、ヒト筋アルブミンを用いることができ、好ましくはヒト血清アルブミンである。ここでヒト由来のアルブミンとは血液や母乳などに由来する生体由来のもののほかに、ヒト由来のアルブミンをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えにより製造されたアルブミンを含む。
　本発明において、ヒト由来のアルブミンを含む緩衝液は、例えば０．５重量％以上、１重量％以上、１.２５重量％以上、２.５重量％以上、３重量％以上、５重量％以上、１０重量％以上、１５重量％以上、２０重量％以上、２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上、５０重量％以上であり、好ましくは１．０％以上、更に好ましくは１．２５％以上、より好ましくは２．０％以上、特に好ましくは２．５％以上である。ヒト由来のアルブミンを含む緩衝液は、例えば６０重量％以下、５０重量％以下、４５重量％以下、４０重量％以下、３５重量％以下、３０重量％以下、２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、１重量％以下、０．５重量％以下が挙げられる。したがってのヒト由来のアルブミン含有量の範囲としては、これら上限値および下限値の任意の組み合わせであってよく、これに限定するものではないが、例えば０．５～６０重量％、１～２０重量％、１．２５～１５重量％、２.５～２０重量％の範囲などが挙げられる。
（２）凍結保存細胞からの生細胞の回収方法
　さらに本発明の方法は、凍結保存細胞からの生細胞の回収方法であって、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈することを含む前記方法に関する。
　以下本実施態様の方法について、工程ごとに説明する。
＜凍結保存細胞の融解＞
　本工程において、凍結保存細胞を融解する際の条件としては、当該技術分野において知られたいかなる条件を用いてもよい。一般に、緩慢に融解すると氷晶などにより細胞への物理的ダメージが起こりやすくなるため、通常は例えば約３７℃に設定したウォーターバスなどを用いて一気に温めて融解する。本工程においては、当該技術分野において生細胞の回収量を向上させるとして知られた任意の方法を用いることができる。
　本発明において、凍結保存することができる細胞であればとくに限定されず、当該技術分野において知られたあらゆる細胞を用いることができる。生細胞とは、生きている細胞またはそれを含む細胞集団、細胞混合物、構造物、組織などを意味する。好ましい一態様において、生細胞は、遺伝子導入されていない細胞である。生細胞としては、シート状細胞培養物などの移植片を形成し得るものであれば特に限定されず例えば、体細胞である。生細胞としては、好ましくは接着細胞（付着性細胞）である。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、筋衛星細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞、筋衛星細胞、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられ、筋芽細胞および／または筋衛星細胞などのＣＤ５６陽性細胞が好ましい。
　本開示において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。本開示において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７－８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Lonza、Cat# CC-2580）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。
　本開示において「筋衛星細胞」は、骨格筋芽細胞の前駆細胞であり、限定されずに、例えば、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ３４、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｍｙｆ５、Ｐａｘ７などのマーカーにより同定することができる。特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞は、哺乳動物の骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞はヒト骨格筋芽細胞および／またはヒト筋衛星細胞はである。
　凍結保存細胞の量は、凍結保存する容器の用量に応じて変化し得るが、通常凍結保存用の細胞懸濁液は１×１０５～５×１０７個／ｍｌ程度の細胞密度に調整し、凍結細胞用容器に分注したものを用いる。理想的には凍結保存した全ての細胞が生細胞として回収されるため、凍結保存前の細胞懸濁液中の細胞数が回収される生細胞数を計算する際の母数となり得る。
　凍結保存液としては、当該技術分野において細胞の凍結保存に用いられることが知られた任意のものを用いることができ、多くのメーカーから販売されている。また、通常の細胞培養培地を用いてもよく、培地にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセロールなどの凍害保護剤を、通常は１～２０％程度、好ましくは５～１０％程度添加したものを用いてもよい。さらに、培地に代えて１００％ヒト血清を用いてもよい。
　凍結細胞用容器は、当該技術分野において通常使用されている任意のものを用いてよく、例えば市販のクライオバイアル、アンプル、凍結保存バッグ等が用いられる。
＜細胞懸濁液の希釈＞
　上述のとおり、融解により得られた細胞懸濁液は細胞毒性成分（例えばＤＭＳＯなど）を含み得るため、希釈することで該細胞毒性成分の影響を低減することができる。本発明の方法は、この希釈の際にヒト由来のアルブミンを含む緩衝液を使用することで融解細胞の回収生細胞数、生残率、回収率および／またはＣＤ５６陽性細胞の比率からなる群から選択される１以上を高めることを特徴とする。希釈に使用し得る緩衝液、アルブミンの種類および濃度は、上述のヒト由来のアルブミンを含む緩衝液で詳述したとおりである。
　本工程において、希釈する方法は、特に限定されないが、緩衝液を添加する際に浸透圧負荷を抑えることが好ましく、例えば緩衝液を細胞懸濁液へ一定の滴下速度による滴下ステップにより行うことができる。一定の速度による滴下は、1または2以上の一定の滴下速度を有する滴下ステップにより行なってもよい。希釈は、融解した細胞懸濁液を凍結保存容器に入れたまま行ってもよいし、別の容器に移して行ってもよい。
　別の容器に移して行う場合、融解細胞の生存率を上げるため、細胞懸濁液を移した後の凍結保存容器をヒト由来のアルブミンを含む緩衝液で洗浄し、この洗浄液を細胞懸濁液に添加する。かかる洗浄液の添加もまた本発明の希釈に該当する。したがって本発明の一態様において、緩衝液は融解した細胞懸濁液を別の容器に移した後の凍結保存容器を洗浄した洗浄液および新たに調製して凍結保存容器を洗浄していない緩衝液を含む。
　細胞の希釈は、既知の任意の手法により行うことができ、細胞を緩衝液に懸濁することにより希釈し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。典型的には、細胞の希釈は、凍結した細胞を融解した直後に行われ、細胞を希釈するステップにおいて、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。
　本発明の回収方法は、凍結保存した細胞を融解し、アルブミン含有緩衝液で希釈して回収した後、かつ、シート状細胞培養物を形成するステップの前に、細胞を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞をヒト血清アルブミンを含むまたは含まない洗浄液（培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本発明の一態様において、細胞を洗浄するステップは、希釈するステップの直後に行われる。
（３）回収生細胞数、生残率、回収率および／またはＣＤ５６陽性細胞の比率を高める方法
　さらに本開示は、凍結保存した細胞の回収生細胞数、生残率、回収率からなる群から選択される1以上の比率を高める方法であって、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法を含む。
　本発明の一態様において、細胞が骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞を含む場合、融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈するステップにより、回収生細胞数、生残率、回収率に加えてＣＤ５６陽性細胞の比率からなる群から選択される1以上を高めることができる。
　本発明者らは、本発明の本発明の方法において使用するヒト由来アルブミン含有緩衝液に含まれる成分へ糖類、ビタミン類および／またはアミノ酸類を添加することにより回収生細胞数、生残率、回収率に加えてＣＤ５６陽性細胞の比率からなる群から選択される1以上を高められることを見出した。
　凍結保存した細胞の回収生細胞数、生残率、回収率および／またはＣＤ５６陽性細胞の比率からなる群から選択される1以上を高める方法であって、ヒト由来アルブミン含有緩衝液へ糖類、ビタミン類、アミノ酸からなる群から選択される１以上の成分を添加するステップ、および、添加した前記緩衝液により凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するステップを含む、前記方法を含む。
　本発明の一態様において、糖類、ビタミン類およびアミノ酸類のいずれかまたは全てを含まないヒト由来アルブミン含有緩衝液へ、ヒト由来アルブミン含有緩衝液に含まれていない糖類、アミノ酸類およびビタミン類のいずれかまたは全てを添加することができる。好ましくは、糖類、アミノ酸類およびビタミン類の全てを含む。例えば、ヒト由来アルブミンを含有するハンクス平衡塩液を希釈用緩衝液として用いる場合、希釈用緩衝液へアミノ酸類およびビタミン類を添加し、それを使って凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈することで回収生細胞数、生残率、回収率および／またはＣＤ５６陽性細胞の比率を高めることができる。糖類、ビタミン類および／またはアミノ酸類の添加は、細胞の希釈時に添加されれば任意のタイミングで添加してよい。したがって、希釈前に予めヒト由来アルブミン緩衝液へ添加してもよいし、別の溶液へ溶解等しヒト由来アルブミン緩衝液で希釈した細胞懸濁液へ加えてもよい。
（４）シート状細胞培養物の製造方法およびキット
　上述のとおり、本発明の回収方法により回収された細胞は、その後増殖培養を経ずに使用する場合において特に好適に用いることができる。したがって本発明は１つの側面において、本発明の回収方法により回収された細胞を用いた移植片を製造する方法に関する。
　本発明において、「移植片」とは、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。好ましい一態様においては、移植片は、細胞および細胞由来の物質以外の構造物（例えばスキャフォールドなど）を含まない移植用構造物である。本開示における移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、スフェロイド、細胞凝集塊などが挙げられ、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。
　本開示において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層体（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。 
　本開示の移植片、特にシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物などの移植片の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示の移植片は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示の移植片は、好ましくは、移植片を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
　培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質および／または形状の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。
　好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材、スフェロイドの形成に適した、低接着性の表面を有する基材および／または均一なウェル状構造を有する基材などが挙げられる。具体的には、シート状細胞培養物の形成の場合であれば、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。またスフェロイドの形成の場合であれば、例えば軟寒天、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で架橋した温度応答性ゲル（市販名：メビオールゲル）、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（ポリＨＥＭＡ）、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーなどのハイドロゲルなどの非細胞接着性化合物を表面にコーティングした基材および／または均一な凹凸構造を表面に有する基材などが挙げられる。かかる基材もまた市販されている（例えば、EZSPHERE(R)など）。培養基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。 
　培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２－２１１８６５、特開２００３－３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。
　培養基材は、種々の形状であってもよい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２～約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２～約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、培養基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。培養表面は平坦であってもよいし、凹凸構造を有していてもよい。凹凸構造を有する場合、均一な凹凸構造であることが好ましい。
　本開示において、「多能性幹細胞」は、当該技術分野で周知の用語であり、三胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に属する全ての系列の細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は遺伝子を導入して誘導された細胞である。通常多能性幹細胞を特定の細胞に分化誘導する際には、まず多能性幹細胞を浮遊培養して、上記三胚葉のいずれかの細胞の凝集体を形成し、その後凝集体を形成する細胞を目的とする特定の細胞に分化誘導させる。
　本開示において、「多能性幹細胞由来の分化誘導細胞」は、多能性幹細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞を意味する。分化誘導細胞の非限定例は、骨格筋芽細胞、筋衛星細胞、心筋細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞などを含む。かかる前駆細胞や体性幹細胞の典型例としては、例えば心筋細胞における間葉系幹細胞、多分化性心臓前駆細胞、単能性心臓前駆細胞、神経系の細胞における神経幹細胞、造血系の細胞や免疫関連の細胞における造血幹細胞およびリンパ系幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞の分化誘導は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８に記載の手法に基づいて行うことができる。所望の細胞として、ｉＰＳ由来心筋細胞等の多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を用いる場合、分化誘導後に未分化細胞の除去処理を行ってもよい。未分化細胞の除去処理は、当該技術分野において知られており、例えばWO2017/038562、WO2016/072519およびWO2007/088874等に記載された方法を用いることができる。
　また分化誘導細胞は、リプログラミングのための遺伝子以外の任意の有用な遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導された細胞であってもよい。かかる細胞の非限定例としては、例えば、Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013に記載のキメラ抗原受容体の遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導されるＴ細胞などが挙げられる。また、多能性幹細胞から分化誘導された後、任意の有用な遺伝子が導入された細胞もまた、本発明の分化誘導細胞に包含される。
　より高密度の移植片、特にシート状細胞培養物を形成するため、培養基材は血液由来成分および／または細胞接着性成分でコーティングされていてもよい。「血液由来成分および／または細胞接着性成分でコーティングされている」とは、培養基材の表面に血清などの血液由来成分および／または細胞接着性成分が付着している状態を意味し、かかる状態は、限定されずに、例えば、培養基材を血液由来成分および／または細胞接着性成分で処理することにより得ることができる。血液由来成分および／または細胞接着性成分による処理は、例えば血清および／または細胞接着性成分を培養基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。コーティングに用いる血清および／または細胞接着性成分は、播種細胞の由来種と同一種の血清（同種血清）であっても異なる種の血清（異種血清）例えばＦＢＳであってもよいが、好ましくは同種血清であり、より好ましくは播種細胞の由来個体から得た血清（自家血清）である。他の血液由来成分としては、アルブミンや血小板溶解物が挙げられる。コーティングに用いる細胞接着性分は、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーが挙げられる。
　培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。細胞の播種密度は、シート状細胞培養物を形成し得る密度で行われ、かかる密度は所望の細胞により異なり得るが、当業者であれば当該技術分野において公知の手法などから適切な密度を選択することができる。例えば骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物である場合、例えば２．０×１０５個／ｃｍ２以上などであり得るが、より高密度で播種してもよい。
より高密度の例としては、例えばコンフルエントに達する密度、すなわち播種した際に細胞が培養容器の接着表面一面を覆うことが想定される程度の密度、例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度あるいはそれ以上であり得る。播種密度の上限は、特に制限されないが、密度が過度に高い場合には、死滅する細胞が多くなり、非効率となる。本開示の一態様において、播種密度は、例えば約１．０×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約１．０×１０７個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約５．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２～約３．０×１０６個／ｃｍ２などであり得る。好ましい一態様において、播種密度は、約１．７６×１０６個／ｃｍ２～約２．３３×１０６個／ｃｍ２である。
　播種される細胞集団は、所望の細胞（例えば骨格筋芽細胞または筋衛星細胞）を含んでいれば、他の細胞を含んでいてもよく、所望の細胞が骨格筋芽細胞である場合は、例えば線維芽細胞や間葉系肝細胞などがさらに含まれていてもよい。細胞集団は、組織（例えば骨格筋組織）から採取した細胞集団をそのまま用いてもよいし、例えば上記Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８に記載の手法などを用いてｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた細胞集団をそのまま用いてもよいし、凍結保存やプレ培養、未分化細胞除去などを実施した後に用いてもよい。好ましい一態様において、播種される細胞集団は、ｉＰＳ細胞から分化誘導後、培養基材上（好ましくは平面状の培養基材上）に播種して接着培養を行い、その後回収された細胞集団である。かかる接着培養の前または後に、凍結保存および解凍を実施してもよい。接着培養を行うことにより、その後の移植片の形成において、高品質な移植片の形成を、高確率で達成することが可能となる。
　かかる接着培養ステップにおいて、培養条件などは、通常の接着培養を行う場合の条件に準じてよい。例えば、市販の接着培養用培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下での培養などであってよい。細胞の播種密度は、細胞同士の接着および／または細胞と培養基材との接着の形成を妨げない密度であればいかなる密度であってもよく、例えばサブコンフルエントな密度であってもよいし、コンフルエントに達する密度またはそれ以上であってもよい。培養時間は、細胞同士の接着および／または細胞と培養基材との接着が形成される程度の時間であればよく、具体的には例えば２～２４時間、２～１２時間、２～６時間、２～４時間程度であればよい。
　本発明の製造方法に用いる培養液は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。しかしながら、本発明の製造方法に用いる場合は、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。
　本発明の別の側面において、上記移植片、特にシート状細胞培養物の製造、とくに増殖培養を経ないシート状細胞培養物の製造に用いる一部またはすべての要素を含む、移植片を製造するためのキットに関する。
　本発明のキットは、限定されずに、例えば、凍結保存細胞の融解後に希釈するためのヒト由来アルブミン含有緩衝液のほか移植片を形成する細胞（例えば、凍結保存細胞、本発明の回収方法により回収された細胞等）、培養液、培養皿、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、シート状細胞培養物の製造方法に関する指示（例えば、使用説明書、製造方法や本発明の凍結保存細胞の回収方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
（５）移植片を用いた処置方法
　本開示の別の側面は、本開示の製造方法により製造された移植片、特にシート状細胞培養物を用いた疾患を処置方法に関する。本発明の一態様において、本開示の製造方法により製造されたシート状細胞培養物は、骨格筋芽細胞および／または衛星細胞を含む。本発明の別の態様において、本開示の製造方法により製造されたシート状細胞培養物は、骨格筋芽細胞、衛星細胞、線維芽細胞および／または間葉系幹細胞を含む。本開示のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患、例えば、組織の異常に関連する種々の疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本開示のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患、特に、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。本開示のシート状細胞培養物は、従来のシート状細胞培養物に比べて高い機械的強度を有する以外は、これと同様の構成細胞固有の性質を有しているため、少なくとも従来の筋芽細胞または線維芽細胞を含むシート状細胞培養物による処置が可能な組織や疾患に適用することができる。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳、骨髄、胃、小腸、十二指腸、大腸などの消化管などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）、骨髄疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、免疫不全疾患など）が挙げられる。本開示のシート状細胞培養物が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献１、非特許文献１、Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013;48(9):1081-9.などに記載されている。本開示のシート状細胞培養物は、注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することで、単細胞懸濁液による注射よりも高い効果を得ることもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008;77(3):515-24）。したがって、本開示のシート状細胞培養物についても、このような利用法が可能である。 
　本開示の別の側面は、本開示の方法により製造された移植片の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、上記したとおりである。
　本開示において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本開示の処置方法においては、移植片の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示の移植片等と併用することができる。
　本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、本開示の移植片を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、移植片を製造するステップの前に、対象から移植片を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の供給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、移植片等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
　本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。　　　
　投与方法としては、例えば、静脈投与、筋肉内投与、骨内投与、髄腔内投与、組織への直接的な適用などが挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明の細胞培養物、組成物、またはシート状細胞培養物等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。
　以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
例１．アルブミン濃度と回収生細胞数の相関
　ヒト成人大腿部から無菌的に採取した骨格筋組織から得られた細胞を培養フラスコに播種し、２０％ＦＢＳを含有するＭＣＤＢ１３１培地中で増殖させた。増殖させた細胞をタンパク質分解酵素液で培養フラスコから剥離させ、回収後、遠心分離により濃縮して、骨格筋芽細胞を含む細胞集団を得た。
　凍結保存細胞の融解および生細胞の回収は次の通りに行った。上記で得られた細胞集団（１．０×１０７個）を凍結保存した４本のクライオチューブを、３７℃に設定したウォーターバスに２～３分間入れ、凍結保存細胞を融解した。融解した細胞懸濁液を、１．８ｍＬクライオチューブから２２５ｍＬコニカルチューブにそれぞれ移した。次に各コニカルチューブに０％、０．５％、１．２５％、および２．５重量％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有させたＤＭＥＭを一定の速度で滴下して、それぞれ３０ｍＬ加え、４℃、２４０×ｇで７分間遠心した後上清を廃棄した。再び各濃度のＨＳＡを含む緩衝液を３０ｍＬ加えて４℃、２４０×ｇで７分間遠心した後上清を廃棄し、各濃度のＨＳＡを含む緩衝液を５ｍＬ加えて細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液の一部を抜き取り、トリパンブルーに混合した後セルカウントを実施し、セルカウント結果から融解後の回収生細胞数を計数した。
　０％ＨＳＡ含有ＤＭＥＭで希釈した際の回収生細胞数を１とした場合の各濃度における回収生細胞数の結果を図１に示す。ヒト血清アルブミン濃度の増加につれて回収生細胞数が高くなり、２．５％以上の濃度で最も高くなった。
例２．緩衝液成分の検討
　凍結融解時の希釈用緩衝液の成分を検討するために、後述する（ｉ）無機塩、（ｉｉ）糖類、（ｉｉｉ）ビタミン類、（ｉｖ）アミノ酸類を

表１のとおりに配合し緩衝液１～５を各１Ｌ作成した。なお緩衝液１～５の全てに、ピルビン酸・Ｎａ：５５ｍｇ、ヒポキサンチンＮａ：２．３９ｍｇ、リノール酸：０．０４２ｍｇ、α－リポ酸：０．１０５ｍｇ、フェノールレッド：８．１ｍｇ、プトレシン２ＨＣＬ：０．０８１ｍｇ、チミジン：０．３６５ｍｇを添加した。例１において緩衝液として４種類の濃度のＨＳＡを含むハンクス平衡塩液を使用した代わりに、２．５重量％ＨＳＡを含む緩衝液１～５を使用した以外は、例１と同様に行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ｉ）無機塩類：
　塩化カルシウム（無水）：１１６．６ｍｇ、硫酸銅（ＩＩ）・５Ｈ２Ｏ：０．００１３ｍｇ、三硝酸鉄（ＩＩＩ）・９Ｈ２Ｏ：０．０５ｍｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７Ｈ２Ｏ：０．４１７ｍｇ、塩化マグネシウム：２８．６４ｍｇ、硫酸マグネシウム（無水）：４８．８４ｍｇ、炭酸水素ナトリウム：２４３８ｍｇ、塩化カリウム：３１１．８ｍｇ、塩化ナトリウム：６９９５．５ｍｇ、りん酸水素二ナトリウム：７１．０２ｍｇ、りん酸水素ナトリウム・Ｈ２Ｏ：６２．５、硫酸亜鉛・７Ｈ２Ｏ：０．４３２ｍｇ
（ｉｉ）糖類
　Ｄ－グルコース：３１５１ｍｇ
（ｉｉｉ）ビタミン類
　ビオチン：０．００３５ｍｇ、塩化コリン：８．９８ｍｇ、Ｄ－パントテン酸カルシウム：２．２４ｍｇ、葉酸：２．６５ｍｇ、ナイアシンアミド２．０２ｍｇ、ピリドキサール・ＨＣｌ、２．０１３ｍｇ、リボフラビン：０．２１９ｍｇ、チアミン・ＨＣｌ：２．１７ｍｇ、ビタミンＢ１２：０．６８ｍｇ、ｉ－イノシトール：１２．６ｍｇ
（ｉｖ）アミノ酸類
　グリシン：１８．７５ｍｇ、Ｌ－アラニン：４．４５ｍｇ、
Ｌ－アルギニン・ＨＣｌ：０．０８４ｍｇ、Ｌ－アスパラギン・Ｈ２Ｏ：７．５ｍｇ、Ｌ－アスパラギン酸：６．６５ｍｇ、L－システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：１７．５６ｍｇ、Ｌ－シスチン・２ＨＣｌ：３１．２９ｍｇ、L－グルタミン酸：７．３５ｍｇ、Ｌ－グルタミン：３６５ｍｇ、Ｌ－ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：３１．４８ｍｇ、Ｌ－イソロイシン：５４．４７ｍｇ、Ｌ－ロイシン：５９．０５ｍｇ、Ｌ－リジン・ＨＣｌ：９１．２５ｍｇ、Ｌ－メチオニン：１７．２４ｍｇ、Ｌ－フェニルアラニン：３５．４８ｍｇ、Ｌ－プロリン：１７．２５ｍｇ、Ｌ－セリン：２６．２５ｍｇ、Ｌ－スレオニン：５３．４５ｍｇ、Ｌ－トリプトファン：９．０２ｍｇ、Ｌ－チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ：５５．７９ｍｇ、Ｌ－バリン：５２．８５ｍｇ
　緩衝液１～５で希釈して得られた細胞懸濁液の一部を抜き取り、トリパンブルーに混合する前後でセルカウントを実施し回収した全細胞数および回収生細胞数を決定し、下記の式にて生残率および回収率を算出した。
生残率（Viability）（％）＝融解後の生細胞数／融解後の全細胞数×１００
回収率(Recovery rate)（％）＝融解後の生細胞数／融解前の生細胞数×１００
　細胞懸濁液の一部を抜き取り抗ＣＤ５６抗体を反応させ、フローサイトメーターを用いて生細胞に対するＣＤ５６陽性細胞率を測定した。
　凍結融解時の希釈用緩衝液として糖類、ビタミン類およびアミノ酸類の３種を組み合わせた緩衝液１の培地が特に好ましいことが分かった。したがって緩衝液のベースとなる無機塩類のほかに、糖類、ビタミン類およびアミノ酸類をアルブミン含有緩衝液へ添加し、これを使って希釈することによって回収生細胞数、生残率、回収率およびＣＤ５６陽性細胞の比率を高められることが明らかとなった。

Claims (17)

  1. 　体細胞を含む凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液を希釈するためのヒト由来アルブミン含有緩衝液。
  2. 　ヒト由来のアルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の緩衝液。
  3. 　ヒト由来のアルブミンの濃度が、１．０％以上である、請求項１または２に記載の緩衝液。
  4. 　緩衝液が、糖類、アミノ酸類およびビタミン類を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の緩衝液。
  5. 　緩衝液が、前記細胞懸濁液へ一定速度で滴下することより前記細胞懸濁液を希釈するための、請求項１～４のいずれか一項に記載の緩衝液。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のヒト由来アルブミン含有緩衝液を含むキット。
  7. 　体細胞を含む凍結保存細胞から生細胞を回収する方法であって、
    凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来のアルブミンを含む緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法。
  8. 　体細胞を含む凍結保存細胞の回収生細胞数、生残率、回収率からなる群から選択される1以上の比率を高める方法であって、凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法。
  9. 　体細胞が骨格筋芽細胞であり、さらにＣＤ５６陽性細胞の比率を高める請求項７または８に記載の方法。
  10. 　希釈するステップが、前記緩衝液を細胞懸濁液へ一定速度により滴下するステップを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　緩衝液が糖類、アミノ酸類およびビタミン類を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法を含む、移植片の製造方法。
  13. 　請求項１２に記載の方法により製造された移植片。
  14. 　請求項１２に記載の方法によって製造された移植片の治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、前記対象における心疾患の治療方法。
  15. 　体細胞を含む凍結保存細胞の回収生細胞数、生残率、回収率からなる群から選択される1以上の比率を高める方法であって、ヒト由来アルブミン含有緩衝液へ糖類、ビタミン類、アミノ酸からなる群から選択される１以上の成分を添加し、添加した前記緩衝液により凍結保存細胞を融解した細胞懸濁液をヒト由来アルブミン含有緩衝液で希釈するステップを含む、前記方法。
  16. 　体細胞が骨格筋芽細胞であり、さらにＣＤ５６陽性細胞の比率を高める請求項１５に記載の方法。
  17. 　希釈するステップが、前記緩衝液を細胞懸濁液へ一定速度により滴下するステップを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
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