WO2020044538A1 - ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地 - Google Patents

ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地 Download PDF

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WO2020044538A1
WO2020044538A1 PCT/JP2018/032359 JP2018032359W WO2020044538A1 WO 2020044538 A1 WO2020044538 A1 WO 2020044538A1 JP 2018032359 W JP2018032359 W JP 2018032359W WO 2020044538 A1 WO2020044538 A1 WO 2020044538A1
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medium
cells
human
serum
culture
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PCT/JP2018/032359
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English (en)
French (fr)
Inventor
伸介 今松
崇 小坂
Original Assignee
株式会社Ｇｃリンフォテック
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a serum-free medium for culturing human lymphocyte cells (that is, “serum-free medium for culturing human lymphocyte cells”), a method for culturing human lymphocyte cells using such a serum-free medium, and the like.
  • immunotherapy uses the immunity inherent in humans, it has extremely few side effects as compared with other therapies. In addition, since immunotherapy has a completely different mechanism of action from the three major treatments, it can be used in combination with the three major treatments.
  • a therapy using immune cells responsible for the immune system is called immune cell therapy.
  • an immune cell therapy monocytes collected from the patient's blood are induced in vitro into dendritic cells, and the dendritic cells are sensitized with cancer cells or cancer peptides and then administered to the patient.
  • Dendritic cell vaccine therapy cancer peptide vaccine administration to patients, cancer peptide vaccine therapy, small amount of gamma-delta T cells collected from the patient's blood are expanded and activated in vitro, and then administered to patients
  • Gamma delta T cell therapy natural killer T cells (NKT cells) collected from the patient's blood are activated in vitro, and then administered to the patient.
  • NKT cell therapy lymphocytes collected from the patient's blood and from the patient.
  • the collected cancer cells are co-cultured in vitro to induce cytotoxic T cells (CTLs) against the cancer cells, and the CTLs are administered to the patient.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • Immune cells used for immune cell therapy especially those that can exert a high effect on cancer treatment, are generally obtained only in small amounts, so it is important to be able to greatly expand immune cells in culture. It is an important factor
  • Peripheral blood lymphocyte cells (hereinafter, also simply referred to as “lymphocyte cells”) have recently attracted much attention as important means for supporting the immune system for host defense.
  • An antigen type called a differentiation antigen is expressed on the surface of the lymphocyte, and the lymphocyte is classified into various subsets according to the antigen type.
  • T lymphocyte cells involved in cell-mediated immunity (CD3 +, also referred to as CD3 +) are detected by detecting the presence or absence of CD3 (CD stands for cluster of differentiation) by detecting the reactivity of the monoclonal antibody.
  • CD3-positive T lymphocyte cells also referred to as T cells
  • T cells CD4-positive T cells that express CD4 and CD8-positive T cells that express CD8.
  • helper T cells which are involved in assisting antibody production and inducing various immune responses, and are classified into Th1 and Th2 types, which differ in the types of cytokines produced by antigen stimulation. Is done.
  • Most of the peripheral CD8-positive T cells are cytotoxic T cells (cytotoxic T lymphocytes: CTL) that exhibit cytotoxic activity when activated by antigen stimulation.
  • the method is a method of selectively stimulating the proliferation of an activated T lymphocyte cell group to obtain a proliferated activated T lymphocyte cell group, and more specifically, a human peripheral blood lymphocyte cell (PBMC : Peripheral Blood Blood Mononuclear Cell) was first-stage cultured in a culture flask in which an OKT3 antibody, one of anti-CD3 antibodies, was immobilized, and the cells cultured in this manner were second-stage cultured in the absence of the OKT3 antibody.
  • PBMC Peripheral Blood Blood Mononuclear Cell
  • the activated lymphocyte cell group obtained by this method is further cultured in the presence of interleukin 2 (IL-2), and then administered to a patient from whom the peripheral blood has been collected as adoptive immunotherapy for cancer.
  • IL-2 interleukin 2
  • Patent Document 2 discloses that peripheral blood lymphocyte cells derived from a donor are cultured in a culture vessel in which an OKT3 antibody is immobilized in the presence of IL-2, and CD4 positive cells are obtained from the activated lymphocyte cell group obtained.
  • TIL tumor-infiltrating lymphocyte cells
  • cord blood cord blood
  • bone marrow and the like
  • ⁇ ⁇ ⁇ Lymphocytes may be classified into na ⁇ ⁇ ve lymphocytes and memory lymphocytes from another functional point of view.
  • Naive lymphocyte cells are CD45RA antigen-expressing lymphocytes that have not yet been stimulated with antigen, and are activated when they are stimulated by encountering an antigen at a local lymph node or the like. I have.
  • Memory lymphocyte cells are lymphocyte cells that have already been stimulated with an antigen to express the CD45RO antigen.
  • T lymphocytes and B lymphocytes can also be divided into naive T cells and memory T cells, or naive B cells and memory B cells, according to their respective states.
  • Memory T cells can be further divided into effector memory (EM) T cells and central memory (CM) T cells.
  • Central memory T cells have the function of homing the lymph nodes and catching foreign substances and antigens that enter the body, and effector memory T cells have the function of belonging to the site where they should be and catching foreign substances and antigens . Therefore, it was expected that a preparation containing a memory T cell group as a main component would obtain a high therapeutic effect in adoptive immunotherapy.
  • the effector memory T cells contained in the activated lymphocyte cell group exhibited cytotoxic activity against cancer cells 24 hours after the start of co-culture with tumor cells, whereas the central memory T cells 48 hours after the co-culture with the cancer cells was started and the tumor antigen was recognized, the cells exhibited cytotoxic activity against the cancer cells, and it was revealed that they had differentiated into effector memory T cells at that time ( Non-Patent Document 1).
  • lymphocyte cells are cryopreserved after activation culture when preparing lymphocyte cells from patient blood in consideration of the patient's stool (see Non-Patent Document 2).
  • the occupancy rate of CD4 lymphocyte cells and CD8 lymphocyte cells in activated lymphocytes obtained by activating and culturing the frozen and thawed lymphocytes again is calculated, and almost all populations are almost parallel. Concluded that it was proliferating.
  • Non-Patent Document 3 discloses the results of separating lymphocyte cells derived from umbilical cord blood and peripheral blood, temporarily storing the cells in a frozen state, and tracing subset changes during activation culture after thawing during the culture period. Both lymphocyte cells derived from umbilical cord blood and peripheral blood show that central memory T cells, a subset of memory T cells, proliferate immediately after the start of culture, reach a peak of proliferation in 6 to 7 days, and then decrease. It has been reported that effector memory T cells proliferate late in culture. In addition, Sekine et al.
  • a method for producing an administration preparation (see Patent Document 4) is disclosed.
  • Patent Document 5 discloses that (A) activating and culturing the collected lymphocyte cells in the presence of IL-2 and immobilized anti-CD3 antibody; (B) An increase in the occupancy of the memory T cell group is detected based on the cell density of the lymphocytes floating in the medium during the activation culture in step (a), and the cell density is 4 ⁇ 10 5 cells / harvesting and cryopreserving the lymphocyte cells of step (a) with an index of at least (C) a step of thawing and activating the frozen lymphocyte cells; A method for producing a lymphocyte cell group mainly composed of memory T cells by a high-proliferation culture method sequentially comprising By using such a production method, memory T cells that can be subjected to adoptive immunotherapy can be expanded simply and quickly and efficiently without using an antibody or the like. As a result, a large amount of memory T cells can be obtained. Can be manufactured.
  • Patent Document 6 discloses that the total concentration of serum and plasma in a medium is 0% by volume to 5% by volume. Performing at least one selected from induction, maintenance, and expansion of cytotoxic lymphocytes in the presence of fibronectin, a fragment thereof, or a mixture thereof, using a medium that is less than A method for producing cytotoxic lymphocytes is disclosed.
  • Patent Document 7 discloses a method for rapidly expanding an initial T lymphocyte population in a medium in vitro, Adding an initial population of T lymphocytes to the medium in vitro; Adding a non-dividing mammalian cell line expressing at least one T cell stimulatory component to the medium, wherein the cell line is an EBV-transformed lymphoblast cell line (LCL) Not the process; and A method is disclosed that includes incubating a culture.
  • LCL EBV-transformed lymphoblast cell line
  • Patent Document 8 discloses a method for preparing a cell culture medium suitable for the growth and proliferation of lymphocyte cells, a) providing at least a first blood product from a first donor; b) measuring the concentration of at least one quality factor in said first blood product; c) comparing the measured concentration of the quality factor with a concentration range predetermined for said quality factor; d) selecting the first blood product for a cell culture medium if the measured concentration for the quality factor is within the predetermined range, wherein the first blood product is further selected. May be converted to a first processed blood product, and in the case other than the above, including a step of not selecting the first blood product, Disclosed is a method of making a cell fluid comprising a mixture of blood products from two or more donors.
  • Patent Document 9 discloses a general animal cell culture medium containing insulin, transferrin, sodium selenite, ethanolamine, Pluronic F68, iron sulfate, putrescine and sodium pyruvate.
  • a serum-free medium for cell culture is disclosed, and as a medium for mesenchymal stem cells, Patent Document 10 discloses a chemically defined serum-free cell medium, a) a serum-free basal medium; b) a basal medium supplement, i) insulin; ii) one or more phospholipid growth factors; and iii) one or more WNT signaling pathway activators;
  • a chemically defined serum-free cell culture medium is disclosed that includes a basal medium supplement.
  • Patent Document 10 discloses, as a basal medium in such a serum-free cell culture medium, sodium pyruvate, HEPES, transferrin, an electron transfer activator (such as selenite), an antioxidant ( ⁇ -tocopherol acetate, ascorbic acid-2-). Phosphoric acid, etc.), human serum albumin and the like may be contained, and it is described that insulin and the like may be contained as a basal medium supplement.
  • Patent Documents 9 and 10 only disclose the composition of a medium for general animal cells or mesenchymal stem cells.
  • the culture of lymphocytes is performed using an AIM-V (registered trademark) medium (a serum-free synthetic medium for lymphocytes)
  • a medium is used in which human serum and rIL-2 (recombinant human interleukin-2) are added to Invitrogen Corporation.
  • Serum has a component variation depending on the lot, and there is a risk of pathogen contamination. Therefore, a serum-free medium is required.
  • a serum-free medium is required.
  • the cell growth rate is often considerably lower than when a serum medium is used, and it is not easy to obtain a serum-free medium having a high cell growth rate. Absent.
  • An object of the present invention is to provide a serum-free medium capable of obtaining a high cell growth rate when used for culturing human lymphocyte cells, and to provide a method for culturing human lymphocyte cells using such a serum-free medium. It is in.
  • the present inventors have conducted intensive studies on various combinations of medium components for the purpose of increasing the proliferation efficiency of human lymphocyte cells.
  • a basal medium for animal cell culture without serum 0.2 to 5 g / L of human albumin, 0.2 to 15 mg / L of human transferrin, 0.3 to 5 mg / L of human insulin, 0.3 to 15 mg / L of glutathione, 9 to 54 mg / L of ascorbic acid phosphate or a salt thereof
  • a serum-free medium containing salt and 3-37 mg / L monoethanolamine is used for culturing human lymphocyte cells, there is almost no difference between medium lots, high safety, and high growth efficiency can be obtained. And found that the present invention was completed.
  • the present invention (1) serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g / L human albumin, 0.2-15 mg / L human transferrin, 0.3-5 mg / L human insulin, 0.3
  • a serum-free medium for human lymphocyte cell culture containing ⁇ 15 mg / L glutathione, 9-54 mg / L ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and 3-37 mg / L ethanolamine;
  • Serum medium (4) the serum-free medium for culturing human lymphocyte cells according to any of (1) to (3) above, wherein the antibiotics are kanamycin and streptomycin; (5)
  • the basal medium for animal cell culture is DMEM / F-12, DMEM, EMEM, IMDM, GMEM, RPMI-1640, ⁇ -MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham 's Medium F-12K, ATCC-CRCM30, BME (Basal Medium Eagle), Fisher's medium, McCoy's 5A medium, Leibovitz's L-15 medium, RITC80-7 medium, MCDB105 medium, MCDB medium medium.
  • MCDB201 medium, NCTC109 medium, NCTC135 medium, Waymouth's MB 752/1 medium, Williams' medium E, and ReproFF2 is a kind of medium or a mixture of two or more media selected from the group consisting of cell culture medium, the (1) serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to any one of the - (4); and, (6) a method for culturing human lymphocyte cells, comprising a step of culturing human lymphocyte cells using the serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to any of (1) to (5) above; (7) A kit for preparing a serum-free medium for culturing human lymphocyte cells, The kit contains a serum-free animal cell culture basal medium, human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and ethanolamine, The serum-free medium for human lymphocyte cell culture, Basal medium for animal cell culture without serum, 0.2-5 g / L human albumin, 0.2-15 mg /
  • the serum-free medium for culturing human lymphocyte cells further comprises pyruvate at 0.02-0.6 g / L, selenite compound at 1.3-34 ⁇ g / L, and L at 0.1-2.5 g / L.
  • a serum-free medium capable of obtaining a high cell growth rate when used for culturing human lymphocyte cells (preferably human T-lymphocyte cells), and human lymphocytes using such a serum-free medium.
  • a method for culturing cells (preferably human T lymphocyte cells) and the like can be provided.
  • the serum-free medium of the present invention is serum-free, there is almost no difference between lots of the medium, and highly safe human lymphocyte cells can be obtained.
  • the horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of the culture, and the vertical axis represents the number of living cells (cells). It is a figure which shows transition of the number of viable cells when a lymphocyte cell is culture
  • the horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of the culture, and the vertical axis represents the number of living cells (cells).
  • the vertical axis represents the number of living cells (cells). It is a figure which shows the number of viable cells when lymphocyte cells are cultured for 14 days using an existing serum-free medium (medium X, medium Y) or a suitable serum-free medium of the present invention. The vertical axis represents the number of living cells (cells).
  • the present invention [1] A serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2 to 5 g / L human albumin, 0.2 to 15 mg / L human transferrin, 0.3 to 5 mg / L human insulin, 0.3 A serum-free medium for human lymphocyte cell culture containing 15 to 15 mg / L of glutathione, 9 to 54 mg / L of ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and 3 to 37 mg / L of ethanolamine (hereinafter referred to as "the present invention").
  • serum-free medium also referred to as “serum-free medium.”
  • a method for culturing human lymphocyte cells comprising a step of culturing human lymphocyte cells using the serum-free medium of the present invention (hereinafter, also referred to as “the culture method of the present invention”);
  • a kit for preparing a serum-free medium for human lymphocyte cell culture contains human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and ethanolamine, The serum-free medium for human lymphocyte cell culture, Basal medium for animal cell culture without serum, 0.2-5 g / L human albumin, 0.2-15 mg / L human transferrin, 0.3-5 mg / L human insulin, 0.3-15 mg / L
  • the kit containing L glutathione, 9 to 54 mg / L ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and 3 to 37 mg / L ethanolamine hereinafter also referred to as “kit of the present invention”
  • the serum-free medium for human lymphocyte cell culture of the present invention includes: Basal medium for animal cell culture without serum, 0.2-5 g / L human albumin, 0.2-15 mg / L human transferrin, 0.3-5 mg / L human insulin, 0.3-15 mg / L A medium containing L glutathione, 9 to 54 mg / L ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and 3 to 37 mg / L ethanolamine (these are also collectively indicated as “essential components”). Is mentioned.
  • the serum-free medium of the present invention 0.2 to 5 g / L human albumin, 0.2 to 15 mg / L human transferrin, 0.3 to 5 mg / L human insulin, 0.3 to 15 mg in a serum-free animal cell culture basal medium / L glutathione, 9-54 mg / L ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and a medium comprising 3-37 mg / L ethanolamine.
  • human lymphocyte cells refers to human lymphocyte cells, such as lymphocyte cells collected from humans, lymphocyte cells grown from lymphocyte cells collected from humans, iPS cells, and the like. Examples include human lymphocyte cells that have been induced to differentiate from stem cells. As the human lymphocyte cell, a human T lymphocyte cell is preferable, and a CD3-positive T lymphocyte cell is more preferable. In addition, human lymphocyte cells include peripheral blood-derived lymphocyte cells, cord blood-derived lymphocyte cells, bone marrow-derived lymphocyte cells, and the like, and peripheral blood-derived lymphocyte cells are preferably used because of collection opportunities and ease of collection.
  • human lymphocyte cells may be human lymphocyte cells obtained by thawing cryopreserved human lymphocyte cells.
  • the human lymphocyte cells of the present invention include peripheral blood-derived human T lymphocyte cells (preferably, peripheral blood-derived human T lymphocyte cells, which are thawed after cryopreservation. Human T lymphocyte cells), and among them, CD3-positive human T lymphocyte cells derived from peripheral blood (preferably, CD3-positive human T lymphocyte cells derived from peripheral blood and cryopreserved) And then thawed human T lymphocyte cells).
  • Human albumin examples of the human albumin used in the present invention include naturally-occurring albumins such as human-derived albumin, human-type recombinant albumin (recombinant human albumin (rHSA)), and commercially available ones. Or may be prepared by oneself.
  • naturally-occurring albumins such as human-derived albumin, human-type recombinant albumin (recombinant human albumin (rHSA)), and commercially available ones. Or may be prepared by oneself.
  • rHSAs include A9731 (model number) from sigma aldrich, OsrHSA-10 (model number) from Science Research Laboratory, HY01E-10g (model number) from Healthgen Biotechnology, HSA-1r (model number) from eEnzyme (registered trademark), Products derived from recombinant rice such as BioVerde's IBK-A1-10 (model number); sigma aldrich's A7223 (model number), A6608 (model number), A7736 (model number), and novozymes' Albucult (registered trademark) (product name) ), Recombumin alpha (registered trademark) (product name), AlbIX (registered trademark) (product name), and other products derived from recombinant yeast.
  • albumin derived from human plasma examples include CSL Behring's “Albumina-20% IV” (product name) and “Albumina-25% IV” (product name) and sigma aldrich A1887 (model number). , A1653 (model number), A9511 (model number), A3782 (model number), A8763 (model number), A4327 (model number), Bio-Pure HSA 10% Solution (product name) from Biological Industries, and the like.
  • the content of human albumin in the serum-free medium of the present invention or the amount of human albumin added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.2 to 5 g / L. From the viewpoint of manufacturing cost balance, preferably 0.3 to 4 g / L, more preferably 1 to 4 g / L, still more preferably 1 to 3 g / L, more preferably 1.5 to 2.5 g / L, It is preferably from 1.7 to 2.3 g / L, more preferably from 1.8 to 2.2 g / L, particularly preferably 2 g / L.
  • Human transferrin examples of the human transferrin used in the present invention include naturally occurring transferrin such as human-derived transferrin, and human-type recombinant transferrin (recombinant human transferrin). It may be prepared by itself.
  • Commercially available recombinant human transferrin includes Fujifilm Wako Pure Chemical Industries “Transferrin, Human, Recombinant” 205-18084 (model number), sigma aldrich T3705 (model number), PROSPEC PRO-747 (model number), etc. Examples include products derived from recombinant rice.
  • transferrin derived from human plasma examples include “Transferrin (Holo), derived from human blood” 208-18971 (model number) by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Inc., and 90190 (model number) from sigma aldrich.
  • the human transferrin content in the serum-free medium of the present invention or the amount of human transferrin added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.2 to 15 mg / L. From the viewpoint of manufacturing cost balance, preferably 0.3 to 6 mg / L, more preferably 0.3 to 4 mg / L, still more preferably 0.3 to 3 mg / L, and more preferably 0.5 to 2 mg / L. More preferably, 0.7 to 1.5 mg / L, more preferably 0.7 to 1.3 mg / L, further preferably 0.8 to 1.2 mg / L, and particularly preferably 1 mg.
  • human insulin examples of human insulin used in the present invention include human recombinant insulin (recombinant human insulin) and the like, and may be commercially available or prepared by oneself.
  • Commercially available recombinant human insulins include recombinant yeast-derived products such as Fujifilm Wako Pure Chemical Industries 094-06484 (model number) and sigma aldrich I9278 (model number); and Cell Prime (registered trademark) r. Insulin and other products derived from recombinant Escherichia coli.
  • the content of human insulin in the serum-free medium of the present invention or the amount of human insulin added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.3 to 5 mg / L. From the viewpoint of manufacturing cost balance, preferably 0.3 to 8 mg / L, more preferably 0.3 to 5 mg / L, further preferably 0.3 to 3 mg / L, and more preferably 0.5 to 2 mg / L. More preferably, 0.7 to 1.5 mg / L, more preferably 0.7 to 1.3 mg / L, further preferably 0.8 to 1.2 mg / L, and particularly preferably 1 mg.
  • Glutathione used in the present invention may be a commercially available product or a product prepared by oneself.
  • Examples of commercially available glutathione include Fuji Film Wako Pure Chemical Co., Ltd. 073-02013 (model number) and sigma aldrich G4251 (model number).
  • the glutathione content in the serum-free medium of the present invention or the amount of glutathione added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.3 to 15 mg / L. From the viewpoint of the balance between the two, preferably 0.3 to 8 mg / L, more preferably 0.3 to 6 mg / L, further preferably 0.5 to 4.5 mg / L, more preferably 0.7 to 4.5 mg. / L, more preferably 1 to 4.5 mg / L, more preferably 2 to 4 mg / L, still more preferably 2.5 to 3.5 mg, particularly preferably 3 mg.
  • Ascorbic acid phosphate or salt thereof examples of the ascorbic acid phosphate or a salt thereof in the salt thereof include a magnesium salt, a sodium salt, a calcium salt, and a potassium salt of the ascorbic acid phosphate.
  • Ascorbic acid phosphate or a salt thereof one or more selected from the group consisting of ascorbic acid phosphate and a salt thereof may be used.
  • Ascorbic acid phosphate or a salt thereof may be a commercially available product or a product prepared by oneself.
  • magnesium salts of ascorbic acid phosphates include Fujifilm Wako Pure Chemical Industries 013-19641 (model number) (L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate), sigma aldrich company A8960 (model number) (L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate) and the like, and examples of the sodium salt include sigma aldrich 49975 (model number) (2-phospho-L-ascorbic acid trisodium salt) and the like. .
  • the content of ascorbic acid phosphate or a salt thereof in the serum-free medium of the present invention or the amount of ascorbic acid phosphate or a salt thereof added to the serum-free medium of the present invention may be ascorbic acid phosphate in the serum-free medium.
  • the total concentration or the total amount of the ester and its salt is 9 to 54 mg / L, but preferably 13 to 45 mg / L, more preferably, from the viewpoint of the balance between the growth efficiency of human lymphocyte cells and the production cost.
  • Ethanolamine used in the present invention includes monoethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine, and among them, monoethanolamine is preferable.
  • ethanolamine one or more selected from the group consisting of monoethanolamine, diethanolamine and triethanolamine may be used.
  • Ethanolamine used in the present invention may be a commercially available product or a product prepared by oneself.
  • Commercially available monoethanolamines include FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries 016-12453 (model number) and sigma aldrich E9508 (model number).
  • Commercially available diethanolamines are Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. S0376 (model number).
  • commercially available triethanolamine includes Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. S0377 (model number).
  • the total concentration or the total added amount of the three ethanolamines is 3 to 37 mg / L.
  • it is preferably 3 to 18.5 mg / L, more preferably 4 to 18.5 mg / L, and still more preferably 5 to 18.5 mg, from the viewpoint of the balance between the growth efficiency of human lymphocyte cells and the production cost.
  • / L more preferably 6 to 16 mg / L, 9 to 16 mg / L, more preferably 11 to 14 mg / L, and particularly preferably 12.3 mg / L.
  • the content of monoethanolamine in the serum-free medium of the present invention or the amount of monoethanolamine added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 3 to 37 mg / L, preferably 3 to 37 mg / L. 1818.5 mg / L, more preferably 4-18.5 mg / L, still more preferably 5-18.5 mg / L, more preferably 6-16 mg / L, 9-16 mg / L, more preferably 11-14 mg. / L, particularly preferably 12.3 mg / L.
  • basal medium for animal cell culture without serum is not particularly limited as long as it is a basal medium for culturing animal cells without serum (hereinafter, also simply referred to as “basal medium”).
  • basal medium examples include DMEM / F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle's minimal essential medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's Minimum Essential Medium), RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium), ⁇ -MEM (Alpha modification of Eagle's minimal essential medium), Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham 's Medium F-12K, ATCC-CRCM30, BME (Basal Medium Eagle), Fisher's medium, McCoy's 5A medium, Leibovitz's L-15 medium, RITC80-7 medium, MCDB105 medium.
  • DMEM / F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • ReproFF2 cell a cell selected from the group of ReproFF2 cell.
  • a mixed medium of two or more types is exemplified. Further, a medium modified for stem cell culture, or a mixture of the above-described basal medium and another medium may be used.
  • the serum-free medium of the present invention may contain optional components in addition to the above-mentioned essential components, or may contain optional components. Suitable optional components include one or more selected from pyruvate, selenite, L-alanyl-L-glutamine, antibiotics, buffers, and acetic acid or acetate (hereinafter, referred to as “ Also referred to as "specific optional component”).
  • pyruvate pyruvate
  • selenite L-alanyl-L-glutamine
  • antibiotics antibiotics
  • buffers acetic acid or acetate
  • specific optional component acetic acid or acetate
  • the composition of the present invention containing the basal medium may be used. It is preferable to adjust the content of one or more specific optional components in the serum medium to the content of each specific optional component exemplified later.
  • pyruvate examples include sodium pyruvate, potassium pyruvate, magnesium pyruvate, calcium pyruvate and the like.
  • the content of pyruvate in the serum-free medium of the present invention or the amount of pyruvate added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 0.02 to 0.6 g / L, preferably 0.05 to 0. 25 g / L, more preferably 0.07 to 0.2 g / L.
  • Examples of the selenite compound include selenite and / or selenite.
  • Examples of the selenite include sodium selenite, potassium selenite, magnesium selenite, and calcium selenite. And the like.
  • the content of the selenite compound in the serum-free medium of the present invention or the amount of the selenite compound added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 1.3 to 34 ⁇ g / L, preferably 3 to 15 ⁇ g / L. More preferably, it is 4 to 10 ⁇ g / L.
  • the content of L-alanyl-L-glutamine in the serum-free medium of the present invention or the amount of L-alanyl-L-glutamine added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 0.1 to 2.5 g / L, Preferably 0.2 to 1.5 g / L, more preferably 0.3 to 1 g / L.
  • antibiotics examples include aminoglycoside antibiotics such as kanamycin, streptomycin, gentamicin, tobramycin, and amikacin; ⁇ -lactam antibiotics such as penicillin (eg, penicillin G), ampicillin, and bacampicillin; polyenes such as amphotericin B. Antibiotics; and a combination of kanamycin and streptomycin and a combination of pecillin and streptomycin are preferred.
  • the total content of the antibiotic in the serum-free medium of the present invention or the total amount of the antibiotic added to the serum-free medium of the present invention depends on the kind of the antibiotic and the like. L, preferably 0.03 to 0.4 g / L, more preferably 0.05 to 0.25 g / L.
  • the total content or total amount of kanamycin and streptomycin is, for example, 0.02 to 0.5 g / L, preferably 0.03 to 0.4 g / L, more preferably 0 to 0.4 g / L. 0.05 to 0.25 g / L.
  • the content or amount of kanamycin is, for example, 0.02 to 0.3 g / L, preferably 0.04 to 0.16 g / L, and more preferably 0.06 to 0.12 g / L
  • the content of streptomycin is, for example, 0.01 to 0.9 g / L, preferably 0.015 to 0.7 g / L, and more preferably 0.02 to 0.1 g / L. 035 g / L.
  • a buffer can be prepared by adding the buffer to water, and as long as the buffer does not interfere with the culture of human lymphocyte cells, the type and concentration of the buffer may vary.
  • sodium hydrogencarbonate, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) and the like can be mentioned, and it is preferable to use sodium hydrogencarbonate and HEPES in combination.
  • the content of the buffer in the serum-free medium of the present invention or the amount of the buffer added to the serum-free medium of the present invention cannot be specified unconditionally because it depends on the type of the buffer and the like.
  • the total content or the total amount of the agent is, for example, 1 to 15 g / L, preferably 2 to 12 g / L, and more preferably 4 to 10 g / L.
  • the content or amount thereof is, for example, 0.5 to 10 g / L, preferably 0.8 to 7 g / L, and more preferably 1 to 4 g / L.
  • L of sodium hydrogen carbonate and HEPES of, for example, 1 to 7 g / L, preferably 2 to 6 g / L, more preferably 3 to 5 g / L.
  • acetate examples include sodium acetate, magnesium acetate, calcium acetate and the like.
  • the content of acetic acid or its salt in the serum-free medium of the present invention or the amount of acetic acid or its salt added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 2 to 50 ⁇ g of the total concentration of acetic acid and its salt in the serum-free medium. / L, preferably 3 to 40 ⁇ g / L, more preferably 5 to 20 ⁇ g / L.
  • the serum-free medium of the present invention can be prepared by mixing water and essential components, preferably by mixing water, essential components and optional components.
  • the amount of water to be added can be appropriately determined by those skilled in the art according to the composition of the serum-free medium.
  • the serum-free medium of the present invention is preferably contained in a container from the viewpoint of distribution and storage.
  • a container a normal container or the like used for a commercially available medium can be used.
  • the method for culturing human lymphocyte cells of the present invention (the culture method of the present invention) is not particularly limited as long as it includes a step of culturing human lymphocyte cells using the serum-free medium of the present invention.
  • human T lymphocyte cells in the present invention are preferably human T lymphocyte cells, and more preferably CD3-positive T lymphocyte cells. Further, human T lymphocyte cells derived from peripheral blood are preferred, and CD3 positive T lymphocyte cells derived from peripheral blood are more preferred.
  • peripheral blood includes peripheral blood derived from others and autologous peripheral blood. When human lymphocyte cells obtained by culturing are used for adoptive immunotherapy, autologous peripheral blood is advantageously used. From the viewpoint of prevention and treatment of tumors and their recurrence, and viral infections and autoimmune diseases, in the case of patients who have undergone organ or bone marrow transplantation, peripheral blood from donors such as transplanted organs or bone marrow preferable.
  • human lymphocyte cells it is preferable to use isolated human lymphocyte cells, and such isolated human lymphocyte cells are collected from peripheral blood collected by blood collection or pheresis, preferably from vein. It can be obtained by processing peripheral blood by a general technique. Separation of lymphocyte cells from peripheral blood can be obtained by a well-known lymphocyte cell separation method such as discontinuous density gradient centrifugation using sucrose or a commercially available lymphocyte cell separation agent. Peripheral blood for isolation of lymphocyte cells to which heparin or citrate has been added can be used so that blood coagulation does not occur.
  • the amount of such peripheral blood is not particularly limited, and can be appropriately set based on the burden of the donor, the time required for blood collection, the operation of separating lymphocyte cells, and the like, and the amount of blood collected at one time is about 0.01 mL to 100 mL, More preferably, it can be about 5 mL to 50 mL, and still more preferably 10 mL to 20 mL.
  • the human lymphocyte cells of the present invention include peripheral blood-derived human T lymphocyte cells (preferably, peripheral blood-derived human T lymphocyte cells, which are thawed after being cryopreserved and stored.
  • Human T lymphocyte cells preferably, peripheral blood-derived human T lymphocyte cells, which are thawed after being cryopreserved and stored.
  • Human T lymphocyte cells and among them, CD3-positive human T lymphocyte cells derived from peripheral blood (preferably, CD3-positive human T lymphocyte cells derived from peripheral blood and cryopreserved) And then thawed human T lymphocyte cells).
  • the method of cryopreservation of human lymphocyte cells and the method of thawing thereof are as described below.
  • the step of culturing human lymphocyte cells using the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as the human lymphocyte cells are cultured using the serum-free medium of the present invention.
  • a culture including activation with a substance (hereinafter, also referred to as “activation culture”) may be used, or a culture in which human lymphocyte cells are proliferated without stimulation with a human lymphocyte cell stimulating substance (hereinafter, referred to as “activation culture”). Also referred to as “proliferation culture”).
  • activation culture a culture in which human lymphocyte cells are proliferated without stimulation with a human lymphocyte cell stimulating substance
  • proliferation culture include substances that stimulate human T lymphocyte cells, such as mitogens, cytokines, antigens, and antibodies. Among them, substances that stimulate human T lymphocyte cells (human T lymphocyte cell stimulating substances) Substance).
  • the human T lymphocyte cell stimulating substance include IL-2, anti-CD3 antibody and the like.
  • the above-mentioned activated culture is not particularly limited as long as the culture includes activating human lymphocyte cells (preferably, human T lymphocyte cells) with a human lymphocyte stimulating substance. And a method of culturing human lymphocyte cells in the presence of an anti-CD3 antibody.
  • culturing human lymphocyte cells in the serum-free medium of the present invention in the presence of IL-2 (interleukin 2) and an anti-CD3 antibody A preferred method is to use
  • a method of activating lymphocyte cells using an anti-CD3 antibody or IL-2 in order to activate human lymphocyte cells has been conventionally known (for example, JP-A-3-80076). Can also refer to that method.
  • a preferred example is a method in which a serum-free medium of the present invention to which IL-2 is added is placed in a culture vessel in which an anti-CD3 antibody is immobilized, and human lymphocyte cells are suspended and cultured in the serum-free medium.
  • human lymphocyte cells can be activated using various mitogens such as an anti-CD3 antibody.
  • an anti-CD3 antibody any antibody can be used as long as it can recognize the CD3 surface antigen on the surface of human lymphocyte cells and promote proliferation and activation.
  • An anti-CD3 antibody used for stimulating lymphocyte activation can be produced in an animal or a cell by using a purified CD3 molecule.
  • OKT-3 antibody excellent in stability and easiness
  • the culture period of the activated culture is not particularly limited, but may be, for example, 1 to 10 days, preferably 2 to 8 days, more preferably 3 to 7 days, and further preferably 4 to 6 days.
  • the frequency of medium exchange during this culture period is not particularly limited, but is preferably performed once every 1 to 7 days to prevent deterioration of the medium and decrease in IL-2 activity. It is preferable to add a new medium in an amount of about 0.1 to 5 times the amount of the medium before the addition.
  • the culture conditions for the above activation culture are not particularly limited as long as human lymphocyte cells can be activated.
  • the culture conditions are 36 to 38 ° C. (preferably 36.5 to 37.5 ° C.), and the humidity is 90 to 98%. (Preferably 93 to 97%, more preferably 94 to 96%), and a CO 2 concentration of 2 to 13% (preferably 3 to 10%, more preferably 5 to 10%).
  • the activated culture some of the human lymphocyte cells adhere to the bottom of the flask and proliferate, and some cells that proliferate while being suspended in a medium after being activated are activated. Cells that grow by attaching to the bottom of the flask are living cells, like floating cells.
  • a method in which the activation culture is performed without increasing the volume of the medium from the start of the activation culture can also be adopted. However, the medium is further added during the activation culture, and then for several days (for example, 1 to 2 days). Days), the activated culture can be continued to further expand human lymphocyte cells.
  • the amount of the medium to be added is preferably 0.5 to 2 times the amount of the medium at the start of the activation culture, and particularly, the same amount as the amount of the medium at the start of the activation culture. The amount is more preferably mentioned.
  • the activation culture is continued by further adding a medium during the activation culture, only the human lymphocyte cells floating in the medium can be subcultured, but the floating human lymphocyte cells and the human lymphocytes adhered to the culture vessel can be transferred. Both of the cells can be inherited.
  • the number of human lymphocyte cells used at the start of culture is not particularly limited, but if the number of cells at the start of culture is too small in cell culture, the period until the cell growth curve rises is prolonged. On the other hand, if the amount is too large, on the other hand, the time at which the proliferation of human lymphocyte cells reaches a plateau becomes too early, and it becomes difficult to adopt a method of adding a medium to increase the culture scale, so that a sufficient amount of There is a disadvantage that cells cannot be obtained.
  • the number of human lymphocyte cells used at the start of activation culture is, for example, 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL, preferably 1.5 ⁇ 10 5 to 6 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL, more preferably 4.0 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the volume of the culture vessel and the volume of the culture solution can be appropriately selected in consideration of operability.
  • 20 to 200 mL (preferably 30 to 100 mL, more preferably 30 to 70 mL, and still more preferably, 225 cm 2 flask)
  • Examples of using a medium of 50 mL and examples of using a medium of 2 to 20 mL (preferably 3 to 10 mL, more preferably 3 to 7 mL, and still more preferably 5 mL) in a 25 cm 2 flask can be given.
  • the anti-CD3 antibody immobilized As described above, in the activation culture in the present invention, it is preferable to use the anti-CD3 antibody immobilized from the viewpoint of the proliferation efficiency of human lymphocyte cells and the ease of operation.
  • various flasks, dishes, plates, and bags made of materials such as glass, polyurethane, polyolefin, and polystyrene can be used. Since it is easily available, commercially available instruments such as sterilized cell culture flasks made of plastic can also be used, and the size thereof can be appropriately selected.
  • the method of immobilizing the antibody may be any method as long as lymphocyte cells can be stimulated by the immobilized anti-CD3 antibody. Method.
  • a diluent of the anti-CD3 antibody is dispensed into a device for immobilization, and the mixture is allowed to stand at 4 to 37 ° C. for 2 to 24 hours.
  • the diluent for the anti-CD3 antibody it is preferable to dilute the anti-CD3 antibody to a concentration of 1 to 30 ⁇ g / mL in a physiological buffer such as a sterilized Dulbecco's phosphate buffer and use it as a diluent.
  • the immobilized device can be stored in a cold room or refrigerator (4 ° C.) until use, and the diluent is removed at the time of use, and the solution is diluted with a physiological buffer such as Dulbecco's phosphate buffer at room temperature. Washing is preferred.
  • a physiological buffer such as Dulbecco's phosphate buffer at room temperature. Washing is preferred.
  • IL-2 interleukin 2
  • IL-2 can be used by dissolving it in a widely used basic medium for animal cell culture such as water, physiological saline, Dulbecco's phosphate buffer, RPMI-1640, DMEM, IMDA, AIM-V and the like. . Once dissolved, it is preferable to store it in a refrigerator in order to prevent a decrease in activity.
  • a widely used basic medium for animal cell culture such as water, physiological saline, Dulbecco's phosphate buffer, RPMI-1640, DMEM, IMDA, AIM-V and the like.
  • the culture method of the present invention has the above-described step of activating culture, after the step of activating culture, a step of cryopreserving human lymphocyte cells, a step of expanding and culturing human lymphocyte cells, or both.
  • the method may further include a step.
  • cryopreservation processing As a cryopreservation method in the above-mentioned “step of cryopreserving human lymphocyte cells”, a general method of cell freezing can be used.
  • human lymphocyte cells are suspended in cell cryopreservation liquid products such as Bambunker (registered trademark) (manufactured by Lymphotec), CP-1 (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) and KM bunker (manufactured by Kojin Bio Inc.)
  • Bambunker registered trademark
  • CP-1 manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.
  • KM bunker manufactured by Kojin Bio Inc.
  • the container was stored in a cryopreservation container, and the container was placed in BICELL (registered trademark) (manufactured by Nippon Freezer Co., Ltd.) and temporarily stored in an ultra-low temperature freezer at ⁇ 80 ° C.
  • cryopreserved cells are stored in liquid nitrogen as cryopreserved cells. Further, from the viewpoint of adjusting the speed of the rise of proliferation in the activated culture after freezing and thawing, it is desirable to adjust the number of lymphocyte cells to be stored in one cryopreservation container, and it is preferable to adjust the number of lymphocyte cells per cryopreservation container to 1 It is preferable to store ⁇ 10 7 to 5.0 ⁇ 10 7 cells. Cells stored in a plurality of cryopreservation containers may be combined and used for culture after freezing and thawing, but from the viewpoint of ease of operation and quality control, one or more lymphocyte cells in one cryopreservation container are used. It is preferable to transfer to a culture vessel and culture.
  • the cryopreservation period of the cryopreserved human lymphocyte cells is not particularly limited, and may be, for example, 30 minutes to 2 years or 1 hour to 1 year.
  • the cryopreserved human lymphocyte cells As a method for thawing the cryopreserved human lymphocyte cells, a general method for thawing frozen cells can be used.
  • the frozen human lymphocyte cells can be thawed by heat treatment for 4 minutes using a 37 ° C. dry thermo unit (manufactured by Taitec). After that, it is preferable to remove the cell cryopreservation solution by removing the supernatant by removing the supernatant after transferring the thawed human lymphocyte cells to an appropriate amount of medium and then performing centrifugation at room temperature.
  • the human lymphocyte cells after thawing may be used as they are for adoptive immunotherapy, but from the viewpoint of obtaining a higher therapeutic effect, activation culture is preferably performed, and more preferably, activation culture and expansion culture are performed.
  • the activation culture is as described above, and the growth culture is as described later.
  • the above-mentioned proliferation culture is not particularly limited as long as it is a culture in which human lymphocyte cells (preferably human T lymphocyte cells) are proliferated without being stimulated with human lymphocyte cell stimulating substances (preferably human T lymphocyte cell stimulating substances).
  • human lymphocyte cell stimulating substances preferably human T lymphocyte cell stimulating substances.
  • a method of culturing a human lymphocyte cell (preferably a human T lymphocyte cell) in the absence is preferably mentioned.
  • the culture period of the above-mentioned growth culture is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 days, preferably 1 to 15 days, more preferably 1 to 10 days, still more preferably 2 to 8 days, and more preferably 3 to 7 days. Days, more preferably 4 to 6 days.
  • the frequency of medium exchange during this culture period is not particularly limited, but is preferably performed once every 1 to 7 days in order to prevent deterioration of the medium, and the like. It is preferable to add a fresh medium in an amount of about 0.1 to 5 times the amount of the fresh medium.
  • the culture conditions for the above-mentioned expansion culture are not particularly limited as long as human lymphocyte cells can be expanded.
  • 36 to 38 ° C. preferably 36.5 to 37.5 ° C.
  • humidity 90 to 98% preferably Is 93 to 97%, more preferably 94 to 96%)
  • the CO 2 concentration is 2 to 13% (preferably 3 to 10%, more preferably 5 to 10%).
  • the number of human lymphocyte cells used at the start of culture is not particularly limited. However, if the number of cells at the start of culture in cell culture is too small, the period until the cell growth curve rises is prolonged. On the other hand, if the amount is too large, the proliferation of human lymphocyte cells reaches a plateau too early, and it becomes difficult to adopt a method such as adding a medium to increase the culture scale, and a sufficient amount is required. There is a disadvantage that it is not possible to obtain cells. Considering these facts, the number of human lymphocyte cells used at the start of the growth culture is, for example, 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 10 cells / mL, preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 5.
  • the volume of the culture vessel and the volume of the culture solution can be appropriately selected in consideration of operability.
  • 50 to 200 mL (preferably 80 to 180 mL, more preferably 100 to 180 mL) of a medium is placed in a 225 cm 2 flask.
  • Examples of using a culture medium, and examples of using a culture bag of 50 to 1000 mL (preferably 100 to 1000 mL, more preferably 200 to 1000 mL) in a 1000 mL culture bag can be given.
  • the kit of the present invention is a kit for preparing the serum-free medium of the present invention. That is, the kit of the present invention comprises: A kit for preparing a serum-free medium for human lymphocyte cell culture, The kit contains human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and ethanolamine, The serum-free medium for human lymphocyte cell culture, Basal medium for animal cell culture without serum, 0.2-5 g / L human albumin, 0.2-15 mg / L human transferrin, 0.3-5 mg / L human insulin, 0.3-15 mg / L The above kit comprising L glutathione, 10 to 60 mg / L ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and 3 to 37 mg / L ethanolamine.
  • the “serum-free medium of the present invention” in the kit of the present invention is as described above.
  • the kit of the present invention contains at least components of the serum-free medium of the present invention other than the serum-free animal cell culture basal medium.
  • the kit of the present invention is not particularly limited, as long as the serum-free medium of the present invention can be prepared by using such a kit and a basal medium for culturing animal cells without serum.
  • As the serum-free animal cell culture basal medium a medium separately prepared by the user of the kit of the present invention can be used.
  • Examples of the method for preparing the serum-free medium of the present invention include a method of adding the components of the kit to a serum-free, liquid animal cell culture basal medium, and a method of adding a serum-free, solid animal cell culture. A method of adding the components of the kit and water to the basal medium and the like can be mentioned.
  • the kit of the present invention includes one or two or more selected from the group consisting of pyruvate, selenite, L-alanyl-L-glutamine, antibiotics, buffers, and acetic acid or a salt thereof.
  • the composition further contains one or more selected from the group consisting of salts and a serum-free animal cell culture basal medium.
  • kits of the present invention may be liquid or solid such as powder or granule. Further, whether it is a liquid or a solid may be different for each component.
  • the kit of the present invention is preferably contained in a container from the viewpoint of distribution and storage.
  • each component may be contained in one container, one container may contain two or more components, or all components of the kit may be one component. It may be in one container.
  • a usual container or the like used for a product similar to the kit of the present invention can be used.
  • centrifuge tubes BD Falcon; 352070
  • Ficoll manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • the centrifuge tubes were placed at 1800 rpm for 20 minutes. And centrifuged at room temperature without applying a brake (centrifuge: Kokusan Co .; H-700).
  • the mononuclear cell layer of the intermediate layer was collected in a 50 mL centrifuge tube to which a washing solution was previously dispensed.
  • the lid of the centrifuge tube was closed, mixed by inversion two or three times, and centrifuged at 1800 rpm for 15 minutes at room temperature.
  • the cell number, the viable cell number, and the cell viability of the cell suspension were calculated by the following methods.
  • Method of measuring cell number 40 ⁇ L of Turku's solution (manufactured by Mutoh Chemical Co., Ltd.) was dispensed into a 5 mL round tube (BD Falcon; 352008), 10 ⁇ L of the cell suspension was added and mixed, and 10 ⁇ L of the mixed solution was added to a Neubauer hemocytometer ( It was poured onto an Elmer (9731), and the number of cells (total cell number) was calculated under a microscope (Olympus Optical Industries, Inc .; 21320).
  • OKT3 solid-phase flask A solution of OKT3 (manufacturer: Takara Bio Inc .: Anti-CD3 mAB GMP grade) was prepared to 5 ⁇ g / mL with physiological saline, and 10 mL of the prepared solution was used for culturing a 225 cm 2 bottom area. The solution was dispensed into a flask (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd .; MS-2180R), and the entire bottom surface was covered with an OKT3 solution.
  • OKT3 manufactured by Takara Bio Inc .: Anti-CD3 mAB GMP grade
  • the OKT3 solution in the flask was sucked with a suction device, about 100 mL of physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) was poured in, the flask lid was closed, and the flask was shaken vigorously. The liquid inside was discarded. Again, about 100 mL of a physiological saline solution (manufacturer; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) was poured into the flask, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes with the solid-phased surface down.
  • physiological saline manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the lid of the flask was closed, and the flask was shaken vigorously for 1 minute, after which the liquid in the flask was discarded.
  • the liquid remaining in the flask and on the lid was carefully sucked with a suction machine to obtain an OKT3 solid-phased flask. If the flask was not used on the day of preparation of the OKT3 solid-phased flask, a small amount of physiological saline was left in the flask and stored at 4 ° C. until use.
  • the cells were cultured at 5.0 ⁇ 5.0% and a CO 2 concentration of 5.0 ⁇ 0.2%. Since the number of floating cells exceeded 4 ⁇ 10 5 cells / mL on the third day of the culture, 50 mL of medium A was added and the culture was continued until the next day. On the fourth day from the start of the culture, the activated culture was stopped, and the lymphocyte cells attached to the bottom of the flask were detached by tapping to form floating cells. All the cells were recovered to obtain a cell suspension in medium A. The number of cells in the cell suspension was determined as described in 1. above. It measured by the same procedure as (1).
  • the cryopreservation tube cryopreserved in (4) was removed from the liquid nitrogen tank, and the cryopreservation tube was heated in a dry thermo unit (manufactured by Taitec) set at 37 ° C. for 4 minutes to thaw frozen lymphocyte cells. .
  • Thawed lymphocyte cells were transferred to a 15 mL centrifuge tube while suspended in 10 mL of medium A, and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the pellet was dispersed, and 10 mL of medium A was added to form a cell suspension.
  • the number of cells was measured by the same method as described.
  • Thawed lymphocyte cells have different numbers of cells for each tube. Therefore, if the cells are suspended and seeded with the same amount of medium as they are, the difference in the number of seeded cells may affect proliferation. In order to eliminate this possibility, in the step of seeding and culturing the thawed cells, the number of lymphocytes was counted before seeding and at each step, and not only the cell density at the time of seeding, but also the amount of medium to be added was adjusted. To keep the cell density almost constant (6 ⁇ 10 5 cells / mL).
  • thawed cell suspension 40 mL of the cell suspension was seeded in a 24-well multiwell plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at a rate of 2 mL per well.
  • the cells were cultured for 2 days in a carbon dioxide incubator having a CO 2 concentration of 5.0%.
  • Each flask was placed in a Teher-type CO 2 incubator (manufactured by Hirasawa) and expanded lymphocyte cells were cultured at a temperature of 37.0 ⁇ 0.5 ° C., a humidity of 95%, and a CO 2 concentration of 5.0%.
  • a Teher-type CO 2 incubator manufactured by Hirasawa
  • expanded lymphocyte cells were cultured at a temperature of 37.0 ⁇ 0.5 ° C., a humidity of 95%, and a CO 2 concentration of 5.0%.
  • a part of the medium in the flask was sampled, and the total number of cells and the number of viable cells were counted.
  • the albumin concentration is preferably 0.3 g / L or more, more preferably 1 g / L or more, and further preferably 2 g / L or more.
  • the growth efficiency was not so different at albumin concentrations of 2 g / L, 3 g / L and 4 g / L, and the growth efficiency was lower at 10 g / L. Therefore, from the viewpoint of the balance between the growth efficiency and the production cost, about 2 g was obtained.
  • / L was shown to be particularly preferred. Therefore, the albumin concentration was set to 2 g / L in the medium for the subsequent culture test.
  • step (6) Culture of lymphocyte cells using transferrin study test medium Using either transferrin study test medium or control medium as medium A, (3) "Activated culture of lymphocyte cells”, (4) “Cryopreservation of lymphocyte cells”, (5) “Thaw of frozen lymphocyte cells”, and (6) "After thaw treatment” Expansion of lymphocyte cells ".
  • FIG. 2 shows the transition of the number of living cells when each medium is used, among the results in Table 3.
  • the transferrin concentration was preferably 0.3 mg / L or more, and more preferably 1 mg / L or more. Moreover, since there was no significant difference in the growth efficiency between transferrin at 1 mg / L, 3.0 mg / L, and 10.0 mg / L, about 1.0 mg / L is preferable from the viewpoint of the balance between the growth efficiency and the production cost. Indicated. Therefore, the transferrin concentration was set to 1 mg / L in the medium for the subsequent culture test.
  • the insulin concentration is preferably 0.3 mg / L or more, and particularly preferably about 1 mg / L. At 3.0 mg / L, the growth efficiency was lower than 1 mg / L, and at 10.0 mg / L, the growth efficiency was about the same as 0 mg / L. From the viewpoint of the balance between growth efficiency and production cost, it was shown that insulin is preferably about 1.0 mg / L. Therefore, in the culture medium for the subsequent culture tests, the insulin concentration was set to 1 mg / L.
  • step (6) Culture of Lymphocyte Cells Using Glutathione Study Test Medium Using either the glutathione study test medium or the control medium as the medium A, (3) "Activated culture of lymphocyte cells”, (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells”, (5) “Thaw of frozen lymphocyte cells”, and (6) "After thaw treatment” Expansion of lymphocyte cells ".
  • FIG. 4 shows the transition of the number of viable cells when each medium is used among the results in Table 5.
  • the concentration of glutathione was set to 3 mg / L in the culture medium for the subsequent culture tests.
  • basic medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione magnesium ascorbate phosphate (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Co., Ltd .: 013-19641 (model number)) L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Medium: content of 90% by weight) and 10.0 mg / L, 30.0 mg / L or 50.0 mg / L.
  • a medium to which Mg ascorbate phosphate was not added (“basal medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione”) was used as a control medium (Mg ascorbate phosphate 0 mg / L).
  • step (6) Culture of Lymphocyte Cells Using Mg Ascorbate Phosphate Study Test Medium The above-described 1.A. (3) "Activated culture of lymphocyte cells”, (4) “Cryopreservation of lymphocyte cells”, (5) “Thaw of frozen lymphocyte cells”, and (6) "After thaw treatment” Expansion of lymphocyte cells ".
  • step (6) expansion culture was started with 1.3 ⁇ 10 6 lymphocyte cells per flask.
  • the medium in the flask was sampled, and the total number of cells and the number of viable cells were counted.
  • FIG. 5 shows the change in the number of viable cells when each medium was used among the results in Table 6.
  • Mg ascorbate phosphate is preferably 9.0 mg / L or more, more preferably 27.0 mg / L or more, and still more preferably 45.0 mg / L or more. At 45.0 mg / L, the growth efficiency was higher than 27.0 mg / L, but from the viewpoint of the balance between growth efficiency and production cost, Mg ascorbate phosphate is preferably about 27.0 mg / L. Was. Therefore, the concentration of Mg ascorbate phosphate was set to 27.0 mg / L in the medium for the subsequent culture test.
  • step (6) Culture of lymphocyte cells using monoethanolamine study test medium Using either monoethanolamine study test medium or control medium as medium A, (3) "Activated culture of lymphocyte cells”, (4) “Cryopreservation of lymphocyte cells”, (5) “Thaw of frozen lymphocyte cells”, and (6) "After thaw treatment” Expansion of lymphocyte cells ".
  • FIG. 6 shows the change in the number of living cells when each medium was used, among the results in Table 7.
  • the concentration of monoethanolamine is preferably 50 ⁇ M (3.075 mg / L) or more, more preferably 100 ⁇ M (6.15 mg / L) or more, and still more preferably 200 ⁇ M (12.3 mg / L).
  • the growth efficiency was lower than the growth efficiency than 200 ⁇ M. Therefore, from the viewpoint of the balance between the growth efficiency and the production cost, about 200 ⁇ M monoethanolamine was used. It has been shown to be favorable.
  • compositions of the serum-free medium for culturing human lymphocyte cells of the present invention include the compositions shown in Table 8 below.
  • suitable serum-free medium of the present invention the medium having the composition shown in Table 8 is referred to as “suitable serum-free medium of the present invention”.
  • the AIM-V (registered trademark) medium in Table 10 is a serum-free synthetic medium for lymphocytes manufactured by Invitrogen, and the CP-4 medium is a serum-free synthetic medium for lymphocytes manufactured by Lymphotec. .
  • An OKT3 solid-phased flask was prepared by the method described in (2).
  • a cell suspension was prepared by suspending 3 ⁇ 10 7 peripheral blood lymphocyte cells in 50 mL of serum medium S1.
  • the cell suspension was dispensed into the aforementioned OKT3 solid-phased flask.
  • 50 mL of serum medium S1 was added to the OKT3 solid-phased flask.
  • the flask was placed in a Teher-type CO 2 incubator (manufactured by Hirasawa), and the temperature was adjusted to 37.0 ⁇ 0.5 ° C., the humidity was adjusted to 95.0 ⁇ 5.0%, and the CO 2 concentration was adjusted to 5.0 ⁇ 0.2%. And cultivated.
  • the cell suspension in the flask was transferred to a gas-permeable culture bag.
  • This culture bag is returned to the above-mentioned Teher type CO 2 incubator, and cultured at a temperature of 37.0 ⁇ 0.5 ° C., a humidity of 95.0 ⁇ 5.0%, and a CO 2 concentration of 5.0 ⁇ 0.2%. It continued for another 14 days.
  • Such a culture test was performed in nine replicates. The number of viable cells and the total number of cells in the cell suspension after culturing were calculated. In addition, the total cell number and the viable cell number were calculated.
  • FIG. 7 shows the results of the number of living cells.
  • the flask was placed in a Teher-type CO 2 incubator (manufactured by Hirasawa), and the temperature was adjusted to 37.0 ⁇ 0.5 ° C., the humidity was adjusted to 95.0 ⁇ 5.0%, and the CO 2 concentration was adjusted to 5.0 ⁇ 0.2%. And cultivated. Five days after the start of the culture, the cell suspension in the flask was transferred to a gas-permeable culture bag. After washing the flask with the suitable serum-free medium of the present invention in a flask, the medium was also transferred to the culture bag.
  • This culture bag is returned to the above-mentioned Teher type CO 2 incubator, and cultured at a temperature of 37.0 ⁇ 0.5 ° C., a humidity of 95.0 ⁇ 5.0%, and a CO 2 concentration of 5.0 ⁇ 0.2%. It continued for another 14 days.
  • Such a culture test was performed in nine replicates. The number of viable cells and the total number of cells in the cell suspension after culturing were calculated. In addition, the total cell number and the viable cell number were calculated.
  • FIG. 7 shows the results of the number of living cells.
  • An OKT3 solid-phased flask was prepared by the method described in (2).
  • a cell suspension was prepared by suspending 3 ⁇ 10 7 peripheral blood lymphocyte cells in 50 mL of medium. The cell suspension was dispensed into the aforementioned OKT3 solid-phased flask. 50 mL of each medium was added to the OKT3 solid-phased flask. The added medium was the same type of medium as the medium used for the cell suspension.
  • Each flask was placed in a Teher-type CO 2 incubator (manufactured by Hirasawa), and the temperature was 37.0 ⁇ 0.5 ° C., the humidity was 95.0 ⁇ 5.0%, and the CO 2 concentration was 5.0 ⁇ 0.2%. Was cultured.
  • the cell suspension in each flask was transferred to a gas-permeable culture bag. Return each culture bag to the aforementioned Teher-type CO 2 incubator, and culture at a temperature of 37.0 ⁇ 0.5 ° C., a humidity of 95.0 ⁇ 5.0%, and a CO 2 concentration of 5.0 ⁇ 0.2%. It continued for another 14 days. Culture tests were performed in triplicate on each of the various media. The number of viable cells and the total number of cells in the cell suspension after culturing were calculated. The survival rate was calculated from the total cell number and the viable cell number. These results are shown in Table 12 below, and the number of living cells is shown in FIG.
  • the preferred serum-free medium of the present invention is better than the existing two serum-free culture media for lymphocyte cell culture (medium X and medium Y).
  • the cell proliferation efficiency and the lymphocyte cell viability were shown to be high.
  • the ratio of CD3-positive cells was higher when the preferred serum-free medium of the present invention was used than when the medium X or the medium Y was used.
  • CD3 is known as a marker for T lymphocyte cells. From these results, it was shown that the use of the suitable serum-free medium of the present invention not only increased the proliferation efficiency of T lymphocyte cells, but also increased the occupancy rate of T lymphocyte cells. That is, it was shown that the suitable serum-free medium of the present invention can grow T lymphocyte cells with higher selectivity.
  • a serum-free medium capable of obtaining a high cell growth rate when used for culturing human lymphocyte cells (preferably human T-lymphocyte cells), and human lymphocytes using such a serum-free medium.
  • a method for culturing cells (preferably, human T lymphocyte cells) and the like can be provided.

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Abstract

本発明は、ヒトリンパ球細胞の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することを目的とする。

Description

ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地
　本発明は、ヒトリンパ球細胞を培養するための無血清培地（すなわち、「ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地」）や、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞の培養方法等に関する。
　がんの三大治療法は、外科手術、化学療法、放射線療法であるが、がんの第四の治療法として、免疫治療への注目が近年高まりつつある。免疫療法はヒトが本来有する免疫力を利用するため、他の治療法と比較して副作用がきわめて少ない。また、免疫療法は三大治療法とは作用機序が全く異なるため、三大治療法と併用することもできる。免疫療法のうち、免疫システムを担当する免疫細胞を使用する治療法は免疫細胞療法と呼ばれている。免疫細胞療法としては、患者の血液から採取した単球をin vitroで樹状細胞へ誘導し、次いで、その樹状細胞をがん細胞又はがんペプチドで感作した後、それを患者に投与する樹状細胞ワクチン療法、がんペプチドを患者に投与するがんペプチドワクチン療法、患者の血液から採取した少量のガンマデルタＴ細胞をin vitroで増殖及び活性化した後、それを患者に投与するガンマデルタＴ細胞療法、患者の血液から採取したナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）をin vitroで活性化した後、それを患者に投与するＮＫＴ細胞療法、患者の血液から採取したリンパ球と患者から採取したがん細胞とをin vitroで共培養してがん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、そのＣＴＬを患者に投与するＣＴＬ療法、患者の血液から採取したリンパ球をin vitroで増殖及び活性化した後、それを患者に投与する活性化自己リンパ球療法などが知られている。免疫細胞療法に用いる免疫細胞、中でも、がん治療に高い効果を発揮し得る免疫細胞は、一般的に少量しか得られないことも多いため、免疫細胞を培養で大幅に増殖できるかが、治療効果を得るために重要な要素となる。
　末梢血リンパ球細胞（以下、単に「リンパ球細胞」とも表示する。）は、生体防御のための免疫系を担う重要な手段として近時大いに注目されている。リンパ球細胞の表面には分化抗原と称される抗原型が発現しており、リンパ球細胞はこの抗原型により様々なサブセットに分類されている。例えば、リンパ球細胞は、ＣＤ３（ＣＤはcluster of differentiationの略）発現の有無をモノクローナル抗体の反応性により検出することにより、細胞性免疫に関与するＴリンパ球細胞（ＣＤ３陽性、ＣＤ３＋とも表す；以下陽性を＋、陰性を－と記載することもある）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ１６１陽性、ＣＤ１６１＋とも表す）と、液性免疫に関与するＢリンパ球細胞等（ＣＤ３陰性、ＣＤ３－とも表す）とに区別される。そしてこれらのリンパ球細胞はその機能も異なる。さらに、細胞性免疫に関与するＣＤ３陽性Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞ともいう）は、ＣＤ４を発現するＣＤ４陽性Ｔ細胞と、ＣＤ８を発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞とに分類される。末梢におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型とＴｈ２型に分類される。末梢におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により活性化すると細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）である。
　前述の活性化自己リンパ球療法に関して、最初に活性化Ｔリンパ球細胞の製造方法を報告したのは関根らである。その方法は、活性化Ｔリンパ球細胞群の増殖を選択的に刺激し、増殖した活性化Ｔリンパ球細胞群を得る方法であり、より具体的には、ヒトの末梢血リンパ球細胞（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cell）を、抗ＣＤ３抗体のひとつであるＯＫＴ３抗体の固相化された培養フラスコ中で第一期培養し、そのように培養した細胞をＯＫＴ３抗体非存在下で第二期培養する方法である。この方法で得られた活性化リンパ球細胞群は、さらにインターロイキン２（ＩＬ－２）存在下での培養を経て、がんの養子免疫療法として、当該末梢血を採取した患者に投与することができる（特許文献１参照）。また、特許文献２には、ドナー由来の末梢血リンパ球細胞をＯＫＴ３抗体が固相化された培養容器でＩＬ－２存在下に培養し、得られた活性化リンパ球細胞群からＣＤ４陽性細胞を分離し、分離したＣＤ４陽性細胞が総細胞に対して９０％以上含有する製剤を、感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物として患者に投与することができることが記載されている（特許文献２参照）。これらのリンパ球細胞源としては、腫瘍浸潤リンパ球細胞（ＴＩＬ：Tumor Infiltrating Lymphocyte）、臍帯血、骨髄等が使用可能である（特許文献２参照）。
　別の機能的観点から、リンパ球細胞をナイーブリンパ球細胞とメモリーリンパ球細胞とに分類することがある。ナイーブリンパ球細胞は、未だ抗原刺激を受けていない、ＣＤ４５ＲＡ抗原を細胞表面に発現しているリンパ球細胞であり、局所リンパ節等で抗原と出会い刺激を受ける中で活性化されるとされている。メモリーリンパ球細胞は、特異的刺激か非特異的刺激かを問わず、既に抗原刺激を受けてＣＤ４５ＲＯ抗原を発現しているリンパ球細胞である。Ｔリンパ球細胞やＢリンパ球細胞もそれぞれの状態に応じてナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞や、ナイーブＢ細胞とメモリーＢ細胞とに分けることができる。メモリーＴ細胞はさらにエフェクターメモリー（effector memory；ＥＭ）Ｔ細胞とセントラルメモリー（central memory；ＣＭ）Ｔ細胞に分けることができる。セントラルメモリーＴ細胞には、リンパ節にホーミングして体内に侵入してくる異物や抗原を迎え撃つ機能があり、エフェクターメモリーＴ細胞には本来あるべき部位に所属して異物や抗原を捕らえる作用がある。したがって、メモリーＴ細胞群を主成分として含有する製剤は、養子免疫療法において高い治療効果が得られることが予想された。そこで、大隅らは、養子免疫療法に使用される活性化リンパ球細胞の作用メカニズムを解明するために、メモリーＴ細胞サブセットに着目して、活性化増殖培養して得られた活性化リンパ球細胞群の機能を解析した。その結果、活性化リンパ球細胞群に含まれるエフェクターメモリーＴ細胞が、腫瘍細胞との共培養開始２４時間後にはがん細胞に対する細胞障害活性を発現していたこと、一方、セントラルメモリーＴ細胞はがん細胞と共培養を開始して腫瘍抗原を認識した４８時間後にがん細胞に対する細胞障害活性を発現したもので、そのときエフェクターメモリーＴ細胞へと分化していたことが明らかとなった（非特許文献１参照）。
　メモリーＴ細胞を採取したという報告は、関根らによる２０００年の文献に遡り（特許文献３参照）、これは臍帯血由来のリンパ球細胞を抗ＣＤ３抗体とＩＬ－２との存在下に活性化培養し、７日間活性化増殖させた結果、ＣＤ３陽性細胞の割合が９８％、さらにＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の割合が７３％の細胞集団を採取したものである。しかしながら、この時期の細胞は増殖が十分ではなく細胞数が少ないという問題があった。
　上記の活性化リンパ球細胞は、増殖培養後速やかに患者に投与する必要があり、病状に即した迅速な投与や安定した品質管理が困難であった。そこで、患者の便を考慮して、患者血よりリンパ球細胞を調製するに際し、活性化培養後にリンパ球細胞を凍結保存した報告がある（非特許文献２参照）。ここでは凍結解凍したリンパ球細胞を再度活性化培養して得られる活性化リンパ球細胞中のＣＤ４リンパ球細胞及びＣＤ８リンパ球細胞の占有率が算出されており、ほとんど全てのポピュレーションがほぼ並行的に増殖していると結論付けている。非特許文献３では、臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞を分離した後、一旦凍結保存し、解凍後に活性化培養した際のサブセット変化を培養期間中追跡した結果が開示されている。臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞はいずれも、メモリーＴ細胞のサブセットであるセントラルメモリーＴ細胞が培養開始後速やかに増殖し６日から７日で増殖のピークに達してその後減少すること、エフェクターメモリーＴ細胞が培養後期に増殖することが報告されている。また、関根らは、患者のリンパ球細胞をインビトロで増殖・活性化培養させた後に超低温フリーザー内で凍結・保存し、使用時に凍結状態から解凍した直後に、生理食塩液を加えて懸濁して投与用製剤とする投与用製剤の製造方法（特許文献４参照）を開示している。
　また、特許文献５には、
（ａ）採取されたリンパ球細胞を、ＩＬ－２及び固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で活性化培養する工程；
（ｂ）メモリーＴ細胞群の占有率上昇を、工程（ａ）の活性化培養中の培地中に浮遊するリンパ球細胞の細胞密度に基づいて検知し、前記細胞密度が４×１０５細胞／ｍＬ以上となることを指標として工程（ａ）のリンパ球細胞を収穫し、凍結保存する工程；及び、
（ｃ）凍結されたリンパ球細胞を解凍し、活性化培養する工程；
を順次備えた高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法が記載されている。
かかる製造方法を用いると、養子免疫療法に供することができるメモリーＴ細胞を、抗体等を使用することなく、簡便かつ迅速により効率的に増殖することができ、その結果、メモリーＴ細胞を大量に製造することができる。
　また、メモリーＴ細胞に特に限定せず、細胞傷害性リンパ球を効率的に増殖する方法として、例えば特許文献６には、培地中における血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養から選択される少なくとも１つを行う工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法が開示されている。また、特許文献７には、インビトロで培地中の最初のＴリンパ球集団を迅速に拡大するための方法であって、
インビトロで培地に最初のＴリンパ球集団を添加する工程；
少なくとも１つのＴ細胞刺激成分を発現する、分裂していない哺乳動物細胞株を培地に添加する工程であって、ここで、該細胞株はＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）でない、工程；及び、
培養物をインキュベートする工程を包含する、方法が開示されている。
また、特許文献８には、リンパ球細胞の成長及び増殖に適した細胞培地を作製する方法であって、
ａ）第１のドナーに由来する第１の血液製剤を少なくとも提供する工程、
ｂ）前記第１の血液製剤中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定する工程、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、
ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、細胞培地用に前記第１の血液製剤を選択し、ここでさらに前記第１の選択された血液製剤を第１の加工血液製剤に変換してもよく、前記場合以外の場合には、前記第１の血液製剤を選択しない工程
を含む、
２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含む細胞液を作製する方法が開示されている。
　また、一般的な動物細胞用の培地として、特許文献９には、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とする、動物細胞培養用の無血清培地が開示されており、間葉系幹細胞用の培地として、特許文献１０には、化学的に定められている無血清細胞培地であって、
ａ）無血清の基礎培地と、
ｂ）基礎培地補充物質であって、
　ｉ）インスリン；
　ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
　ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、化学的に定められている無血清細胞培地が開示されている。特許文献１０には、かかる無血清細胞培地における基礎培地として、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、トランスフェリン、電子伝達活性化因子（亜セレン酸など）、抗酸化剤（酢酸α－トコフェロール、アスコルビン酸－２－リン酸など）、ヒト血清アルブミンなどを含んでよいことが記載されており、基礎培地補充物質として、インスリンなどを含んでよいことが記載されている。しかし、特許文献９及び１０は、一般的な動物細胞や間葉系幹細胞用の培地の組成を開示しているに過ぎない。
　前述の特許文献５のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法において、リンパ球細胞の培養には、リンパ球用の無血清合成培地であるＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地（インビトロジェン社製）にヒト血清及びｒＩＬ－２（組換えヒトインターロイキン－２）を添加した培地が用いられている。血清は、ロットにより成分の変動があり、また病原体混入のリスクもあるため、無血清培地が求められている。しかし、一般に、無血清培地を用いた場合は血清培地を用いた場合と比較して、細胞増殖率がかなり低くなることも多く、細胞増殖率の高い無血清培地を得ることは容易なことではない。
特開平３－８００７６号公報 特許第４３８９０３９号公報 特開２００２－１７１９６６号公報 特許第４３９５６４４号公報 特許第６１４２１４２号公報 国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット 特表２００２－５１６５６２号公報 特表２０１７－５２２９０２号公報 特開２０１７－１６３８７６号公報 特表２０１３－５２９９１７号公報
第３２回癌免疫外科研究会 プログラム・抄録集 １０３ページ 平成２３年４月 Sekine T., Human Cell, 5(3) 243-245 (1992) Shikamura M., et al., Biotherapy 23(3) 257-262 (2009)
　本発明の課題は、ヒトリンパ球細胞の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞の培養方法等を提供することにある。
発明を解決するための手段
　本発明者らは、ヒトリンパ球細胞の増殖効率を上昇させることを目的として培地成分の様々な組合せについて鋭意検討を重ねた結果、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのモノエタノールアミンを含有する無血清培地をヒトリンパ球細胞の培養に用いると、培地のロット間差がほとんどなく、安全性が高く、かつ、高い増殖効率が得られることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
（１）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（２）さらに、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、上記（１）に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（３）１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤が、１～７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び、０．５～１０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムである、上記（２）に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（４）抗生物質が、カナマイシン及びストレプトマイシンである、上記（１）～（３）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（５）動物細胞培養用基礎培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２Ｋ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０－７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含む、ヒトリンパ球細胞の培養方法；や、
（７）ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
　前記キットは、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
　前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット；や、
（８）キットがさらに、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有し、
　ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、さらに、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、上記（７）に記載のキット；や、
（９）キットがさらに、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を含有する、上記（７）又は（８）に記載のキット；
に関する。
　本発明によれば、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することができる。また、本発明の無血清培地は無血清であるので、培地のロット間差がほとんどなく、また、安全性の高いヒトリンパ球細胞を得ることができる。
ヒトアルブミン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表２参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。 ヒトトランスフェリン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表３参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。 ヒトインスリン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表４参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。 グルタチオン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表５参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。 アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表６参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。 エタノールアミン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表７参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。 従来の血清培地又は本発明の好適な無血清培地を用いて、リンパ球細胞を１４日間培養した場合の生細胞数を示す図である。縦軸は生細胞数（個）を表す。 既存の無血清培地（培地Ｘ、培地Ｙ）又は本発明の好適な無血清培地を用いて、リンパ球細胞を１４日間培養した場合の生細胞数を示す図である。縦軸は生細胞数（個）を表す。
　本発明は、
［１］血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地（以下、「本発明の無血清培地」とも表示する。）；や、
［２］本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含むヒトリンパ球細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」とも表示する。）；や、
［３］ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
　前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
　前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット（以下、「本発明のキット」とも表示する。）；
等を含む。
本発明において「培地」とは、「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。
１．［本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地］
　本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地（本発明の無血清培地）としては、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミン（これらを総称して「必須成分」とも表示する。）を含有している培地が挙げられる。また、本発明の無血清培地には、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを添加してなる培地が含まれる。
（ヒトリンパ球細胞）
　本発明において「ヒトリンパ球細胞」とは、ヒトのリンパ球細胞を意味し、ヒトから採取されたリンパ球細胞や、ヒトから採取されたリンパ球細胞から増殖したリンパ球細胞や、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化誘導したヒトのリンパ球細胞等が挙げられる。ヒトリンパ球細胞としては、ヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、ＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。また、ヒトリンパ球細胞は、末梢血由来リンパ球細胞、臍帯血由来リンパ球細胞、骨髄由来リンパ球細胞等が挙げられるが、採取の機会や採取の容易さから末梢血由来リンパ球細胞が好ましく挙げられる。また、本発明において「ヒトリンパ球細胞」は、凍結保存されたヒトリンパ球細胞を解凍したヒトリンパ球細胞であってもよい。これらのことから、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が好ましく挙げられ、中でも、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が特に好ましく挙げられる。
（ヒトアルブミン）
　本発明において用いられるヒトアルブミンとしては、ヒト由来アルブミン等の天然由来のアルブミンや、ヒト型の遺伝子組換え体のアルブミン（リコンビナントヒトアルブミン（ｒＨＳＡ））などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているｒＨＳＡとしては、sigma aldrich社A9731（型番）、Science Research Laboratory社OsrHSA-10（型番）、Healthgen Biotechnology社HY01E-10g（型番）、eEnzyme（登録商標）社HSA-1r（型番）、BioVerde社IBK-A1-10（型番）等の組換えイネ由来の製品；や、sigma aldrich社A7223（型番）、A6608（型番）、A7736（型番）、novozymes社のAlbucult（登録商標）（製品名）、Recombumin alpha（登録商標）（製品名）、AlbIX（登録商標）（製品名）等の組換え酵母由来の製品；が挙げられる。また、市販されているヒト血漿由来アルブミンとしては、CSLベーリング社の「アルブミナ－２０％静注」（製品名）や「アルブミナ－２５％静注」（製品名）、sigma aldrich社A1887（型番）、A1653（型番）、A9511（型番）、A3782（型番）、A8763（型番）、A4327（型番）、Biological Industries社Bio-Pure HSA 10% Solution（製品名）等の製品が挙げられる。
　本発明の無血清培地中のヒトアルブミン含量又は本発明の無血清培地へのヒトアルブミンの添加量としては、０．２～５ｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～４ｇ／Ｌ、より好ましくは１～４ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５～２．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．７～２．３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．８～２．２ｇ／Ｌ、特に好ましくは２ｇ／Ｌが挙げられる。
（ヒトトランスフェリン）
　本発明において用いられるヒトトランスフェリンとしては、ヒト由来トランスフェリン等の天然由来のトランスフェリンや、ヒト型の遺伝子組換え体のトランスフェリン（リコンビナントヒトトランスフェリン）などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているリコンビナントヒトトランスフェリンとしては、富士フィルム和光純薬社「トランスフェリン，ヒト，組換え体」205-18084（型番）、sigma aldrich社T3705（型番）、PROSPEC社PRO-747（型番）等の組換えイネ由来の製品が挙げられる。また、市販されているヒト血漿由来トランスフェリンとしては、富士フィルム和光純薬社「トランスフェリン（ホロ），ヒト血液由来」208-18971（型番）、sigma aldrich社90190（型番）等が挙げられる。
　本発明の無血清培地中のヒトトランスフェリン含量又は本発明の無血清培地へのヒトトランスフェリンの添加量としては、０．２～１５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～４ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３～３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．７～１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．３ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８～１．２ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇが挙げられる。
（ヒトインスリン）
　本発明において用いられるヒトインスリンとしては、ヒト型の遺伝子組換え体のインスリン（リコンビナントヒトインスリン）などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているリコンビナントヒトインスリンとしては、富士フィルム和光純薬社094-06484（型番）、sigma aldrich社I9278（型番）等の組換え酵母由来の製品；や、Cell Prime（登録商標）社のr Insulin等の組換え大腸菌由来の製品；が挙げられる。
　本発明の無血清培地中のヒトインスリン含量又は本発明の無血清培地へのヒトインスリンの添加量としては、０．３～５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３～３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．７～１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．３ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８～１．２ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇが挙げられる。
（グルタチオン）
　本発明において用いられるグルタチオンとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているグルタチオンとしては、富士フィルム和光純薬社073-02013（型番）、sigma aldrich社G4251（型番）等が挙げられる。
　本発明の無血清培地中のグルタチオン含量又は本発明の無血清培地へのグルタチオンの添加量としては、０．３～１５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～６ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５～４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７～４．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２～４ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５～３．５ｍｇ、特に好ましくは３ｍｇが挙げられる。
（アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩）
　アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩におけるその塩としては、アスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩として、アスコルビン酸リン酸エステル及びその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を用いてもよい。アスコルビン酸リン酸エステルやその塩としては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているアスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩としては、富士フィルム和光純薬社013-19641（型番）（Ｌ－アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物）、sigma aldrich社A8960（型番）（L-アスコルビン酸 2-リン酸 セスキマグネシウム塩 水和物）等が挙げられ、ナトリウム塩としては、sigma aldrich社49752（型番）（2-ホスホ-L-アスコルビン酸 三ナトリウム塩）等が挙げられる。
　本発明の無血清培地中のアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩の含量あるいは本発明の無血清培地へのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩の添加量としては、無血清培地中のアスコルビン酸リン酸エステルとその塩の合計濃度又は合計添加量が９～５４ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは１３～４５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１８～４０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１９～３６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２２～３２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２４～３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２５～２９ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２７ｍｇが挙げられる。
（エタノールアミン）
　本発明において用いられるエタノールアミンとしては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンが挙げられ、中でも、モノエタノールアミンが好ましく挙げられる。エタノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択される１種又は２種以上を用いてもよい。本発明において用いられるエタノールアミンとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているモノエタノールアミンとしては、富士フィルム和光純薬社016-12453（型番）、sigma aldrich社E9508（型番）が挙げられ、市販されているジエタノールアミンとしては、東京化成工業株式会社S0376（型番）が挙げられ、市販されているトリエタノールアミンとしては、東京化成工業株式会社S0377（型番）が挙げられる。
　本発明の無血清培地中のエタノールアミンの含量又は本発明の無血清培地へのエタノールアミンの添加量としては、前記３種のエタノールアミンの合計濃度又は合計添加量が３～３７ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは３～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４～１８．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは５～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６～１６ｍｇ／Ｌ、９～１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１～１４ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１２．３ｍｇ／Ｌが挙げられる。また、本発明の好適な態様として、本発明の無血清培地中のモノエタノールアミンの含量又は本発明の無血清培地へのモノエタノールアミンの添加量が、例えば３～３７ｍｇ／Ｌ、好ましくは３～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４～１８．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは５～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６～１６ｍｇ／Ｌ、９～１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１～１４ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１２．３ｍｇ／Ｌである場合が挙げられる。
（血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地）
　本明細書において「血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地」としては、血清を含有しない、動物細胞培養用基礎培地（以下、単に「基礎培地」とも表示する。）である限り特に制限されない。かかる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12）、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle’s minimal essential medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、ＧＭＥＭ（Glasgow’s Minimum Essential Medium）、ＲＰＭＩ－１６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、α－ＭＥＭ（Alpha modification of Eagle’s minimal essential medium）、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２Ｋ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０－７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社）からなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地等が挙げられる。また、幹細胞培養用に改変された培地や、上記基礎培地と他の培地との混合物等を用いてもよい
（任意成分）
　本発明の無血清培地は、上記の必須成分の他に、任意成分を含有してもよく、又は、任意成分を添加してなっていてもよい。好適な任意成分としては、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸若しくは酢酸塩から選択される１種又は２種以上（以下、「特定の任意成分」とも表示する。）が挙げられる。また、本発明の無血清培地で用いる動物細胞培養用基礎培地の組成に、前述の１種又は２種以上の特定の任意成分が含まれている場合は、その基礎培地を含む本発明の無血清培地におけるその１種又は２種以上の特定の任意成分の含量を、後に例示するそれぞれの特定の任意成分の含量に調整することが好ましい。
　上記のピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中のピルビン酸塩の含量又は本発明の無血清培地へのピルビン酸塩の添加量としては、例えば０．０２～０．６ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５～０．２５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０７～０．２ｇ／Ｌが挙げられる。
　上記の亜セレン酸化合物としては、亜セレン酸及び／又は亜セレン酸塩が挙げられ、かかる亜セレン酸塩としては、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム、亜セレン酸マグネシウム、亜セレン酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中の亜セレン酸化合物の含量又は本発明の無血清培地への亜セレン酸化合物の添加量としては、例えば１．３～３４μｇ／Ｌ、好ましくは３～１５μｇ／Ｌ、より好ましくは４～１０μｇ／Ｌが挙げられる。
　本発明の無血清培地中のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの含量又は本発明の無血清培地へのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの添加量としては、例えば０．１～２．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．２～１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～１ｇ／Ｌが挙げられる。
　上記の抗生物質の種類としては、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン等のアミノグリコシド系抗生物質；ペニシリン（例えばペニシリンＧ）、アンピシリン、バカンピシリン等のβ－ラクタム系抗生物質；アムホテリシンＢ等のポリエン系抗生物質；などが挙げられ、カナマイシンとストレプトマイシンの組合せや、ペイシリンとストレプトマイシンの組合せが好ましく挙げられる。本発明の無血清培地中の抗生物質の合計含量又は本発明の無血清培地への抗生物質の合計添加量としては、抗生物質の種類等にもよるが、例えば０．０２～０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０３～０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５～０．２５ｇ／Ｌが挙げられる。本発明の無血清培地の好適な態様として、カナマイシンとストレプトマイシンの合計含量又は合計添加量が例えば０．０２～０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０３～０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５～０．２５ｇ／Ｌであることが挙げられ、中でも、カナマイシンの含量又は添加量が例えば０．０２～０．３ｇ／Ｌ、好ましくは０．０４～０．１６ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０６～０．１２ｇ／Ｌであり、かつ、ストレプトマイシンの含量が例えば０．０１～０．９ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．７ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０２～０．０３５ｇ／Ｌであることが挙げられる。
　上記の緩衝剤としては、その緩衝剤を水に添加することによって緩衝液を作製することができ、かつ、その緩衝液がヒトリンパ球細胞の培養を妨げない限り、緩衝剤の種類や濃度等は特に制限されないが、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等が挙げられ、炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳを併用することが好ましく挙げられる。本発明の無血清培地中の緩衝剤の含量又は本発明の無血清培地への緩衝剤の添加量としては、緩衝剤の種類等にも左右されるため一概に規定することはできないが、緩衝剤の合計含量又は合計添加量として、例えば１～１５ｇ／Ｌ、好ましくは２～１２ｇ／Ｌ、より好ましくは４～１０ｇ／Ｌが挙げられる。また、本発明において炭酸水素ナトリウムとＨＥＰＥＳを併用する場合のそれぞれの含量又は添加量としては、例えば０．５～１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．８～７ｇ／Ｌ、より好ましくは１～４ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、例えば１～７ｇ／Ｌ、好ましくは２～６ｇ／Ｌ、より好ましくは３～５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳが挙げられる。
　上記の酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中の酢酸又はその塩の含量あるいは本発明の無血清培地への酢酸又はその塩の添加量としては、無血清培地中の酢酸とその塩の合計濃度が例えば２～５０μｇ／Ｌ、好ましくは３～４０μｇ／Ｌ、より好ましくは５～２０μｇ／Ｌが挙げられる。
　本発明の無血清培地は、水と必須成分を混合すること、好ましくは、水と必須成分と任意成分を混合することにより調製することができる。添加する水の量は、当業者であれば、無血清培地の組成にしたがって適宜決定することができる。
　本発明の無血清培地は、流通や保存の観点から、容器入りであることが好ましい。かかる容器としては、市販の培地に用いられる通常の容器等を用いることができる。
２．［本発明のヒトリンパ球細胞の培養方法］
　本発明のヒトリンパ球細胞の培養方法（本発明の培養方法）としては、本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含んでいる限り特に制限されない。
（ヒトリンパ球細胞）
　前述したように、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、ヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、ＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。また、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、末梢血由来でＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。かかる末梢血としては、他者由来末梢血や自己由来末梢血があげられるが、培養して得られるヒトリンパ球細胞を養子免疫療法に用いる場合には自己由来末梢血が有利に用いられる。腫瘍及びその再発、ならびにウイルス感染症や自己免疫疾患に対する予防及び治療の観点から、臓器又は骨髄移植等を受けた患者の場合は、移植臓器又は骨髄等の提供者由来の末梢血であることが好ましい。
　ヒトリンパ球細胞としては、単離されたヒトリンパ球細胞を用いることが好ましく、かかる単離されたヒトリンパ球細胞は、血管からの採血やフェレーシス等により採取された末梢血、好ましくは静脈から採取された末梢血を一般的手法で処理することにより得ることができる。末梢血からのリンパ球細胞の分離は、ショ糖や市販のリンパ球細胞分離剤等を用いた不連続密度勾配遠心法などの周知のリンパ球細胞分離法によって取得できる。リンパ球細胞単離用の末梢血は、血液の凝固が起こらないように、ヘパリンやクエン酸を加えたものを使用することができる。かかる末梢血の量は特に制限されず、ドナーの負担、採血の手間、リンパ球細胞の分離操作等に基づいて適宜設定することができ、１回に採血する量を０．０１ｍＬから１００ｍＬ程度、より好ましくは５ｍＬから５０ｍＬ程度、さらに好ましくは１０ｍＬから２０ｍＬとすることができる。
　前述したように、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が好ましく挙げられ、中でも、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が特に好ましく挙げられる。ヒトリンパ球細胞の凍結保存処理の方法やその解凍処理の方法等は、後述するとおりである。
（本発明の無血清培地を用いてヒト末梢血リンパ球細胞を培養する工程）
　本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程としては、本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する限り特に制限されず、例えば、ヒトリンパ球細胞をヒトリンパ球細胞刺激物質で活性化することを含む培養（以下、「活性化培養」とも表示する。）であってもよいし、ヒトリンパ球細胞をヒトリンパ球細胞刺激物質で刺激せずに増殖する培養（以下、「増殖培養」とも表示する。）等であってもよい。上記のヒトリンパ球細胞刺激物質としては、マイトジェン、サイトカイン、抗原、抗体等の、ヒトＴリンパ球細胞を刺激する物質が挙げられ、中でもヒトＴリンパ球細胞を刺激する物質（ヒトＴリンパ球細胞刺激物質）が好ましく挙げられる。ヒトＴリンパ球細胞刺激物質としては、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体等が挙げられる。
（活性化培養）
　上記の活性化培養としては、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）をヒトリンパ球刺激物質で活性化することを含む培養である限り特に制限されず、例えば、本発明の無血清培地中、抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトリンパ球細胞を培養する方法が挙げられ、中でも、本発明の無血清培地中、ＩＬ－２（インターロイキン２）及び抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトリンパ球細胞を培養する方法が好ましく挙げられる。ヒトリンパ球細胞を活性化するために、抗ＣＤ３抗体やＩＬ－２を用いてリンパ球細胞を方法は、従来から知られている（例えば特開平３－８００７６号公報）ため、本発明の培養方法においてもその方法を参照することができる。例えば、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器中に、ＩＬ－２を添加した本発明の無血清培地を入れ、かかる無血清培地にヒトリンパ球細胞を浮遊させて培養する方法を好適に例示することができる。さらに、必要により、抗ＣＤ３抗体等の各種マイトジェンを使用してヒトリンパ球細胞の活性化を行うことができる。かかる抗ＣＤ３抗体としては、ヒトリンパ球細胞表面のＣＤ３表面抗原を認識して増殖・活性化を促進できる抗体であれば、どのようなものでも使用できる。リンパ球細胞の活性化刺激に使用する抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を使用して動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、容易性に優れた市販品のＯＫＴ－３抗体（製造元：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社や、タカラバイオ社等）を有利に使用することができる。
　上記の活性化培養の培養期間としては特に制限されないが、例えば１～１０日間、好ましくは２～８日間、より好ましくは３～７日間、さらに好ましくは４～６日間を挙げることができる。この培養期間中の培地の交換頻度としては特に制限されないが、培地の劣化及びＩＬ－２活性の低下を防ぐ等のために、１～７日に１回行うことが好ましく、新たな培地を添加する前の培地の液量に対して０．１～５倍程度の量の新たな培地を添加することが好ましい。
　上記の活性化培養の培養条件としては、ヒトリンパ球細胞を活性化することができる限り特に制限されないが、例えば３６～３８℃（好ましくは３６．５～３７．５℃）、湿度９０～９８％（好ましくは９３～９７％、より好ましくは９４～９６％）、ＣＯ２濃度２～１３％（好ましくは３～１０％、より好ましくは５～１０％）等が挙げられる。
　上記の活性化培養において、ヒトリンパ球細胞には、フラスコ底面に付着して増殖する細胞もあるし、活性化を受けた後、培地中に浮遊しながら増殖していく細胞もある。フラスコ底面に付着して増殖する細胞は、浮遊細胞と同様に生細胞である。活性化培養開始時から培地の液量を増加させずに活性化培養を行う方法を採用することもできるが、活性化培養の途中でさらに培地を添加し、その後、数日間（例えば１～２日間）、活性化培養を継続してヒトリンパ球細胞をさらに増殖する方法を採用することもできる。かかる培地の添加量としては、活性化培養開始時の培地の液量に対して０．５～２倍の液量が好ましく、中でも、活性化培養開始時の培地の液量と同量の液量がより好ましく挙げられる。活性化培養の途中でさらに培地を添加して活性化培養を継続する場合、培地中に浮遊するヒトリンパ球細胞のみを植え継ぐこともできるが、浮遊ヒトリンパ球細胞と、培養容器に接着したヒトリンパ球細胞の両方を植え継ぐこともできる。
　上記の活性化培養において、培養開始時に用いるヒトリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延してしまうというデメリットがあり、一方、逆に多すぎるとヒトリンパ球細胞の増殖がプラトーに達する時期が早くなり過ぎて、培地を添加して培養スケールを大きくする方法を採用することが難しくなり、十分な量の細胞を得ることができないというデメリットがある。これらのことを考慮すると、活性化培養の開始時に用いるヒトリンパ球細胞数としては、例えば、１．０×１０５～１．０×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは１．５×１０５～６．０×１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは４．０×１０５～６．０×１０５細胞／ｍＬが挙げられる。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ２フラスコに２０～２００ｍＬ（好ましくは３０～１００ｍＬ、より好ましくは３０～７０ｍＬ、さらに好ましくは５０ｍＬ）の培地を使用する例や、２５ｃｍ２フラスコに２～２０ｍＬ（好ましくは３～１０ｍＬ、より好ましくは３～７ｍＬ、さらに好ましくは５ｍＬ）の培地を使用する例を挙げることができる。
　上記のように、本発明における活性化培養では、抗ＣＤ３抗体は、ヒトリンパ球細胞の増殖効率や操作の容易性の観点から、固相化して使用することが好ましい。抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としてはガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質からなる各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。入手が容易であるため、市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養用フラスコ等の器具を使用することもでき、その大きさは適宜選択することができる。前記抗体の固相化方法は、固相化した抗ＣＤ３抗体によりリンパ球細胞が刺激できる固相化方法であればいずれの方法であってもよく、例えば、非特異的吸着による方法や化学結合による方法が挙げられる。より具体的な固相化方法としては、固相化する器具に抗ＣＤ３抗体の希釈液を分注し、例えば４～３７℃で２～２４時間静置する方法を挙げることができる。前記抗ＣＤ３抗体の希釈液は、抗ＣＤ３抗体を、滅菌したダルベッコリン酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に１～３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈して希釈液として用いることが好ましい。固相化した器具は、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができ、使用時に前記希釈液を除去して、常温のダルベッコリン酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄することが好ましい。また上記のように、本発明における活性化培養では、培養用培地液中にインターロイキン２（ＩＬ－２）を使用することがリンパ球細胞の増殖効率の観点から望ましい。ＩＬ－２は、培養用培地液の濃度が１～２０００Ｕ／ｍＬとなるように希釈して使用することが好ましい。かかるＩＬ－２としては市販品を用いることができる。ＩＬ－２は、水、生理食塩液、ダルベッコリン酸緩衝液、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＡ、ＡＩＭ－Ｖ等の一般に広く用いられる動物細胞培養用基礎培地等に溶解して使用することができる。また一旦溶解したものは、活性の低下を防ぐために冷蔵保存することが好ましい。
　本発明の培養方法が上記の活性化培養する工程を有する場合、かかる活性化培養する工程の後に、ヒトリンパ球細胞を凍結保存処理する工程、ヒトリンパ球細胞を増殖培養する工程、又は、その両方の工程をさらに有していてもよい。
（凍結保存処理）
　上記の「ヒトリンパ球細胞を凍結保存処理する工程」における凍結保存処理する方法としては、細胞凍結の一般的な方法を用いることができる。例えば、ヒトリンパ球細胞をバンバンカー（登録商標）（リンフォテック社製）、ＣＰ－１（極東製薬工業社製）、ＫＭバンカー（コージンバイオ社製）等の細胞凍結保存液製品に懸濁して凍結保存容器に格納し、その容器をＢＩＣＥＬＬ（登録商標）（日本フリーザー社製）に入れ、－８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で一時保管して２日後に、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として液体窒素中で保存することができる。また、凍結及び解凍した後の活性化培養における増殖の立ち上がりの早さを調整する観点から、１つの凍結保存容器に格納するリンパ球細胞数を調整することが望ましく、１つの凍結保存容器あたり１×１０７～５．０×１０７個を保存することが好ましい。複数の凍結保存容器に保存した細胞を合わせて凍結解凍後の培養に用いてもよいが、操作の容易性及び品質管理の観点から１つの凍結保存容器のリンパ球細胞を１つ又は２つ以上の培養容器に移して培養することが好ましい。
　凍結保存処理したヒトリンパ球細胞の凍結保存期間としては、特に制限されず、例えば３０分間～２年間や１時間～１年間などが挙げられる。
　凍結保存処理したヒトリンパ球細胞を解凍する方法としては、凍結細胞の一般的な解凍方法を用いることができる。例えば、３７℃のドライサーモユニット（タイテック社製）等を用いて、凍結したヒトリンパ球細胞を４分間加熱処理することにより解凍することができる。その後、かかる解凍したヒトリンパ球細胞を適量の培地に移しいれた後に室温にて遠心操作を行い、上清を除去することにより細胞凍結保存液を除去することが好ましい。
　解凍後のヒトリンパ球細胞はそのまま養子免疫療法に用いてもよいが、より高い治療効果を得る観点から、活性化培養を行うことが好ましく、活性化培養及び増殖培養を行うことがより好ましい。活性化培養については前述したとおりであり、増殖培養については後述するとおりである。
（増殖培養）
　上記の増殖培養としては、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）をヒトリンパ球細胞刺激物質（好ましくはヒトＴリンパ球細胞刺激物質）で刺激せずに増殖する培養である限り特に制限されず、例えば、本発明の無血清培地中でヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）を培養する方法が挙げられ、中でも、本発明の無血清培地中、ＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体の不存在下でヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）を培養する方法が好ましく挙げられる。
　上記の増殖培養の培養期間としては特に制限されないが、例えば、１～２０日間、好ましくは１～１５日間、より好ましくは１～１０日間、さらに好ましくは２～８日間、より好ましくは３～７日間、さらに好ましくは４～６日間を挙げることができる。この培養期間中の培地の交換頻度としては特に制限されないが、培地の劣化を防ぐ等のために、１～７日に１回行うことが好ましく、新たな培地を添加する前の培地の液量に対して０．１～５倍程度の量の新たな培地を添加することが好ましい。
　上記の増殖培養の培養条件としては、ヒトリンパ球細胞を増殖することができる限り特に制限されないが、例えば３６～３８℃（好ましくは３６．５～３７．５℃）、湿度９０～９８％（好ましくは９３～９７％、より好ましくは９４～９６％）、ＣＯ２濃度２～１３％（好ましくは３～１０％、より好ましくは５～１０％）等が挙げられる。
　上記の増殖培養において、培養開始時に用いるヒトリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延してしまうというデメリットがあり、一方、逆に多すぎるとヒトリンパ球細胞の増殖がプラトーに達する時期が早くなり過ぎて、培地を添加して培養スケールを大きくするなどの方法を採用することが難しくなり、十分な量の細胞を得ることができないというデメリットがある。これらのことを考慮すると、増殖培養の開始時に用いるヒトリンパ球細胞数としては、例えば、１．０×１０５～１．０×１０１０細胞／ｍＬ、好ましくは１．０×１０６～５．０×１０９細胞／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０７～１．０×１０９細胞／ｍＬが挙げられる。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ２フラスコに５０～２００ｍＬ（好ましくは８０～１８０ｍＬ、より好ましくは１００～１８０ｍＬ）の培地を使用する例や、１０００ｍＬ容の培養バッグに５０～１０００ｍＬ（好ましくは１００～１０００ｍＬ、より好ましくは２００～１０００ｍＬ）の培地を使用する例を挙げることができる。
３．［ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキット］
　本発明のキットは、本発明の無血清培地を調製するためのキットである。すなわち、本発明のキットは、
　ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
　前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
　前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、１０～６０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キットである。本発明のキットにおける「本発明の無血清培地」は、前述したとおりである。
　本発明のキットは、本発明の無血清培地のうち、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地以外の成分を少なくとも含有している。本発明のキットとしては、かかるキットと、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を用いることによって、本発明の無血清培地を調製することができる限り、特に制限はない。血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地は、本発明のキットの使用者が別途用意したものを使用することができる。本発明の無血清培地を調製する方法としては、血清を含有しない、液体の動物細胞培養用基礎培地に、かかるキットの成分を添加等する方法や、血清を含有しない、固体の動物細胞培養用基礎培地に、かかるキットの成分及び水を添加等する方法などが挙げられる。
　本発明のキットとしては、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上、又は、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地をさらに含有することが好ましく挙げられ、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上と、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地とをさらに含有することがより好ましく挙げられる。
　本発明のキットの各成分は、液体であってもよいし、粉状、粒状等の固体であってもよい。また、液体か固体かは、各成分毎に異なっていてもよい。本発明のキットは、流通や保存の観点から、容器入りであることが好ましい。本発明のキットにおいて、各成分毎にそれぞれ１つの容器に入っていてもよいし、１つの容器に２種又は２種以上の成分が入っていてもよいし、かかるキットのすべての成分が１つの容器に入っていてもよい。かかる容器としては、本発明のキットに類する製品に用いられる通常の容器等を用いることができる。
　以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定されるものではない。
１．リンパ球細胞の調製及び培養の方法
（１）末梢血リンパ球細胞の調製
　同意を得た健常者３名の末梢血各５０ｍＬを静脈からヘパリンを加えて採血した。各採血検体を２５０ｍＬの遠沈管（コーニング；４３０７７６）に移し、検体毎に洗浄用液（０．１％ヒトアルブミン添加生理食塩水：生理食塩液５００ｍＬ　製造元；大塚製薬株式会社、アルブミナ－２０％静注　製造元；ＣＳＬベーリング株式会社）１００ｍＬを加え静かに混和して３倍に希釈した。本操作を含む以下の操作は無菌的に行った。１検体あたり、１５ｍＬのフィコール（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を分注した５０ｍＬ遠沈管（ＢＤファルコン；352070）４本に、３倍希釈した血液を重層し、その遠沈管を１８００ｒｐｍで２０分間、室温でブレーキをかけずに遠心した（遠心機：株式会社コクサン製；H-700）。中間層の単核球層を、予め洗浄用液を分注した５０ｍＬ遠沈管に回収した。遠沈管の蓋を閉めて、２～３回、転倒混和して１８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心後に上清を除去し、ペレットを分散させた後に洗浄用液を添加し、総量５０ｍＬの細胞懸濁液とした。前記懸濁液を１８００ｒｐｍ、１０分間、常温にて遠心し、得られたペレットに５０ｍＬの培地Ａを加えて懸濁して細胞懸濁液とした。なお、培地Ａとして、後述の２．（２）に記載の各アルブミン検討試験用培地又はコントロール培地を用いて培養を行った。
　かかる細胞懸濁液の細胞数、生細胞数、及び、細胞の生存率は以下の方法により算出した。
（細胞数の測定法）
　４０μＬのチュルク氏液（武藤化学薬品社製）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを加えて混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤（エルマー社製；9731）上に流し込み、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製；211320）下に細胞数（総細胞数）を算出した。
（生細胞数、及び、細胞の生存率の測定法）
　２０μＬのトリパンブルー染色液（SIGMA社製；93595）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤に流し込み、顕微鏡下に染色されていない生細胞数を計測した。かかる生細胞数と、前述の細胞数（総細胞数）から、生存率を算出した。
（２）ＯＫＴ３固相化フラスコの調製
　ＯＫＴ３（製造元：タカラバイオ株式会社：Ａｎｔｉ－ＣＤ３　ｍＡＢ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ）溶液を生理食塩液で５μｇ／ｍＬに調製し、調製液１０ｍＬを底面積２２５ｃｍ２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）に分注し、その底面全面がＯＫＴ３溶液で覆われるようにした。フラスコを３時間以上静置した後、フラスコ内のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬株式会社）を注ぎ込み、フラスコの蓋を閉めて激しく振蕩した後に、フラスコ内の液体を捨てた。再度、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬株式会社）をフラスコ内に流し入れ、固相化面を下にして室温で１５分間静置した。その後、フラスコの蓋を閉めて、フラスコを１分間激しく振蕩した後、フラスコ内の液体を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取り、ＯＫＴ３固相化フラスコを得た。ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した当日に該フラスコを使用しない場合は、少量の生理食塩液をフラスコ内に残して使用時まで４℃で保存した。
（３）リンパ球細胞の活性化培養
　上記１．（１）で調製した細胞懸濁液を８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心して得られたリンパ球細胞に、リンパ球細胞の細胞密度が６×１０５個／ｍＬとなるように培地Ａを添加して細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液５０ｍＬを、上記１．（２）で作製した２２５ｃｍ２ＯＫＴ３固相化フラスコに分注し播種し、培地Ａを用いてテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養開始３日目に浮遊細胞数が４×１０５個／ｍＬを超えていたことから、５０ｍＬの培地Ａを添加して翌日まで培養を継続した。培養開始４日目に活性化培養を中止して、フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて浮遊細胞とし、全細胞を回収して培地Ａによる細胞懸濁液を得た。前記細胞懸濁液中の細胞数を上記１．（１）と同様の手順で計測した。
（４）リンパ球細胞の凍結保存
　上記１．（３）で計測した細胞密度をもとに、３検体について、凍結保存チューブ（コーニング社製）１本あたりのリンパ球細胞数を３×１０７個となるように、培地Ａを加えて調製し、１５ｍＬ遠沈管に分注して１２００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心した。遠心後、各遠沈管中の上清を除去し、得られたペレットを分散させ、凍結保存チューブ１本あたり１．８ｍＬの液量となるように細胞凍結保存液（ＣＰ－１：極東製薬工業株式会社製）を添加して細胞を懸濁して凍結保存チューブに分注し、その凍結保存チューブをバイセル（日本フリーザー社製）に入れ、－８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で２日間一時保管した後、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として保存した。
（５）凍結リンパ球細胞の解凍
　上記１．（４）で凍結保存した凍結保存チューブを液体窒素タンクより取り出し、３７℃に設定したドライサーモユニット（タイテック社製）中で凍結保存チューブを４分間加温して、凍結リンパ球細胞を解凍した。解凍したリンパ球細胞を、１０ｍＬの培地Ａで懸濁しながら１５ｍＬ遠沈管に移し入れ、１２００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを分散させ１０ｍＬの培地Ａを添加して細胞懸濁液とし、上記１．（１）記載の方法と同じ方法で細胞数を計測した。解凍したリンパ球細胞は、チューブ毎に細胞数が異なるため、そのまま同量の培地で懸濁播種すると、播種細胞数の差が増殖に影響する可能性がある。この可能性を排除するために、解凍した細胞を播種して培養する工程では、播種前及び工程毎にリンパ球細胞数を計測し、播種時の細胞密度はもとより、添加する培地量を調製して細胞密度をほぼ一定とした（６×１０５個／ｍＬ）。
　解凍した細胞懸濁液のうち、４０ｍＬの細胞懸濁液を２４穴マルチウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ウェル当たり２ｍＬずつ播種し、播種日を第１日として３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内で２日間培養した。
（６）解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養
　ＯＫＴ３の固相化処理をしていない、底面積２２５ｃｍ２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）を用意した。上記１．（５）で解凍処理後に２日間培養したリンパ球細胞懸濁液（４０ｍＬ）を、３日目に２４穴マルチウェルプレートからそれぞれ前述のフラスコに移した。別途、５０ｍＬの培地Ａを用意し、その培地Ａで２４穴マルチウェルプレートのウェル内を洗浄して、ウェル内に残った細胞を回収し、各フラスコ内に移した。各フラスコ内の液量は、９０ｍＬとなった。
　各フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％にてリンパ球細胞の拡大培養を行った。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地の一部をサンプリングし、総細胞数及び生細胞数を計測した。
２．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトアルブミンの影響］
　培地中のヒトアルブミン（以下、単に「アルブミン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
（１）基本培地の調製
　基本培地として、以下の表１に記載の組成の培地を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）アルブミン検討試験用培地の調製
　上記基本培地にヒトアルブミン（CSLベーリング社製：「アルブミナ－２５％静注１２．５ｇ/５０ｍＬ」）を、０．３ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ又は１０．０ｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトアルブミンを添加しない基本培地を、コントロール培地（アルブミン０ｇ／Ｌ）とした。
（３）アルブミン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
　アルブミン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表２に示す。また、表２の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２及び図１の結果から、培地にアルブミンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、アルブミン濃度は、０．３ｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｇ／Ｌ以上がより好ましく、２ｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。ただ、アルブミン濃度２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌでは増殖効率にあまり差はなく、１０ｇ／Ｌではそれよりも増殖効率が低下したため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、約２ｇ／Ｌが特に好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、アルブミン濃度を２ｇ／Ｌとした。
３．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトトランスフェリンの影響］
　培地中のヒトトランスフェリン（以下、単に「トランスフェリン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
（１）トランスフェリン検討試験用培地の調製
　上記２．（１）の基本培地にアルブミンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン」）にヒトトランスフェリン（組換え体）（富士フィルム和光純薬社製：205-18084（型番））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトトランスフェリンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン」）を、コントロール培地（トランスフェリン０ｍｇ／Ｌ）とした。
（２）トランスフェリン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
　トランスフェリン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表３に示す。また、表３の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３及び図２の結果から、培地にトランスフェリンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、トランスフェリン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｍｇ／Ｌ以上がより好ましいことが示された。また、トランスフェリンが１ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌでは増殖効率に大きな差はなかったため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、約１．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌとした。
４．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトインスリンの影響］
　培地中のヒトインスリン（以下、単に「インスリン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
（１）インスリン検討試験用培地の調製
　上記２．（１）の基本培地にアルブミン及びトランスフェリンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、及び、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）にヒトインスリン（組換え体）（富士フィルム和光純薬社製：094-06484（型番）））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトインスリンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）を、コントロール培地（インスリン０ｍｇ／Ｌ）とした。
（２）インスリン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
　インスリン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表４に示す。また、表４の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４及び図３の結果から、培地にインスリンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、インスリン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、約１ｍｇ／Ｌが特に好ましいことが示された。３．０ｍｇ／Ｌでは１ｍｇ／Ｌよりも増殖効率が低く、１０．０ｍｇ／Ｌでは、０ｍｇ／Ｌと同程度の増殖効率であった。増殖効率と製造コストのバランスの観点から、インスリンは約１．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌとした。
５．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のグルタチオンの影響］
　培地中のグルタチオンの有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
（１）グルタチオン検討試験用培地の調製
　上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン及びインスリンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）にグルタチオン（富士フィルム和光純薬社製：073-02013（型番））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、グルタチオンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）を、コントロール培地（グルタチオン０ｍｇ／Ｌ）とした。
（２）グルタチオン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
　グルタチオン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表５に示す。また、表５の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５及び図４の結果から、培地にグルタチオンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、グルタチオン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、３．０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。１０．０ｍｇ／Ｌでは、３．０ｍｇ／Ｌと同程度の増殖効率であった。増殖効率と製造コストのバランスの観点から、グルタチオンは約３．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌとした。
６．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のアスコルビン酸リン酸マグネシウムの影響］
　培地中のアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
（１）アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地の調製
　上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン、インスリン及びグルタチオンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）にアスコルビン酸リン酸Ｍｇ（富士フィルム和光純薬社製：013-19641（型番））L-アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩n水和物：含量９０重量％）を、１０．０ｍｇ／Ｌ、３０．０ｍｇ／Ｌ又は５０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）を、コントロール培地（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ０ｍｇ／Ｌ）とした。
（２）アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
　アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表６に示す。また、表６の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６及び図５の結果から、培地にアスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度は、９．０ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２７．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、４５．０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。４５．０ｍｇ／Ｌでは、２７．０ｍｇ／Ｌよりも増殖効率が高かったが、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、アスコルビン酸リン酸Ｍｇは約２７．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度を２７．０ｍｇ／Ｌとした。
７．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のモノエタノールアミンの影響］
　培地中のモノエタノールアミン（２－アミノエタノール）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
（１）モノエタノールアミン検討試験用培地の調製
　上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン、インスリン、グルタチオン及びアスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌに、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを２７ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン＋アスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン＋アスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）にモノエタノールアミン（富士フィルム和光純薬社製：016-12453（型番））を添加した培地をそれぞれ調製した。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオンアスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）を、コントロール培地（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ０ｍｇ／Ｌ）とした。
（２）モノエタノールアミン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
　モノエタノールアミン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表７に示す。また、表７の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７及び図６の結果から、培地にモノエタノールアミンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、モノエタノールアミン濃度は、５０μＭ（３．０７５ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、１００μＭ（６．１５ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましく、２００μＭ（１２．３ｍｇ／Ｌ）がさらに好ましいことが示された。３００μＭ（１８．４５ｍｇ／Ｌ）や４００μＭ（２４．６ｍｇ／Ｌ）では、２００μＭよりも増殖効率よりも増殖効率が低かったため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、モノエタノールアミンは約２００μＭが好ましいことが示された。
８．［本発明の特に好適な培地の組成］
　実施例の上記２．～７．の結果から、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地の特に好適な組成として以下の表８に記載の組成が挙げられる。以下、かかる表８記載の組成の培地を、「本発明の好適な無血清培地」と表示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
９．［本発明の好適な無血清培地と、従来の血清培地との比較試験］
　本発明の好適な無血清培地と、従来の血清培地との比較試験を以下の方法で行った。
（１）従来の血清培地を用いた培養方法
　従来の血清培地を用いた培養方法に用いる３種類の培地（Ｓ１（表９）、Ｓ２（表１０）、Ｓ３（表１１））を調製した。なお、表１０のＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地は、インビトロジェン社製のリンパ球用無血清合成培地であり、ＣＰ－４培地は、リンフォテック社製のリンパ球用無血清合成培地である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの血清培地Ｓ１に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに血清培地Ｓ１を５０ｍＬ追加した。フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグに移した。この培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。かかる培養試験は９連で行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数を算出した。生細胞数の結果を図７に示す。
（２）本発明の好適な無血清培地を用いた培養方法
　上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの本発明の好適な無血清培地に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに本発明の好適な無血清培地を５０ｍＬ追加した。フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグに移した。本発明の好適な無血清培地をフラスコに入れてフラスコを洗浄した後、その培地も培養バッグに移した。この培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。かかる培養試験は９連で行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数を算出した。生細胞数の結果を図７に示す。
（３）比較試験の結果
　図７から、本発明の好適な無血清培地は、従来の血清培地よりも、増殖効率が割合として約３０％程度も高いことが示された。このことから、本発明の好適な無血清培地を末梢血リンパ球細胞の培養に用いると、顕著な増殖効率が得られることが示された。
１０．［本発明の好適な無血清培地と、既存の無血清培地との比較試験］
　本発明の好適な無血清培地と、既存のリンパ球細胞培養用の無血清培地との比較試験を以下の方法で行った。
（１）増殖効率及び生存率の比較
　市販されている既存のリンパ球細胞培養用の無血清培地を２種類用意し、既存の無血清培地Ｘ、Ｙとそれぞれ命名した。以下の比較試験では、培地として、本発明の好適な無血清培地、培地Ｘ又は培地Ｙを用いた。
　上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの培地に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに各培地を５０ｍＬずつ追加した。追加した培地は、細胞懸濁液に用いた培地と同じ種類の培地とした。各フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、各フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグにそれぞれ移した。各培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。各種の培地について、それぞれ３連で培養試験を行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数から生存率を算出した。これらの結果を以下の表１２に示し、生細胞数を図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２及び図８の結果から、本発明の好適な無血清培地は、市販されている既存の、２種類のリンパ球細胞培養用の無血清培地（培地Ｘ、培地Ｙ）よりも、リンパ球細胞の増殖効率及びリンパ球細胞の生存率が高いことが示された。
（２）リンパ球細胞の表面抗原の比較
　上記１０．（１）の各培養で得られたリンパ球細胞の各集団について、ＣＤ３、ＴＣＲ－ＧＤ（ＴＣＲγδ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面抗原マーカーの解析をフローサイトメーターで行った。その解析結果を以下の表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３の結果から、本発明の好適な無血清培地を用いた場合、培地Ｘや培地Ｙを用いた場合と比べて、ＣＤ３陽性細胞の割合が高かった。ＣＤ３はＴリンパ球細胞のマーカーとして知られている。これらのことから、本発明の好適な無血清培地を用いると、Ｔリンパ球細胞の増殖効率がより高いだけでなく、Ｔリンパ球細胞の占有割合がより高いことが示された。すなわち、本発明の好適な無血清培地は、Ｔリンパ球細胞をより高い選択性で増殖することができることが示された。
　本発明によれば、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
  2. 　さらに、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、請求項１に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
  3. 　１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤が、１～７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び、０．５～１０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムである、請求項２に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
  4. 　抗生物質が、カナマイシン及びストレプトマイシンである、請求項１～３のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
  5. 　動物細胞培養用基礎培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２Ｋ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０－７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地である、請求項１～４のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含む、ヒトリンパ球細胞の培養方法。
  7. 　ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
    　前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
    　前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
    血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット。
  8. 　キットがさらに、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有し、
    　ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、さらに、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、請求項７に記載のキット。
  9. 　キットがさらに、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を含有する、請求項７又は８に記載のキット。
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