WO2021177279A1 - 高活性ｎｋ細胞の処理方法 - Google Patents

高活性ｎｋ細胞の処理方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021177279A1
WO2021177279A1 PCT/JP2021/007863 JP2021007863W WO2021177279A1 WO 2021177279 A1 WO2021177279 A1 WO 2021177279A1 JP 2021007863 W JP2021007863 W JP 2021007863W WO 2021177279 A1 WO2021177279 A1 WO 2021177279A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
highly active
thawing
hours
medium
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/007863
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
結 原田
米満　吉和
Original Assignee
株式会社ガイアバイオメディシン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ガイアバイオメディシン filed Critical 株式会社ガイアバイオメディシン
Priority to EP21765044.9A priority Critical patent/EP4151717A4/en
Priority to KR1020227033295A priority patent/KR20220148233A/ko
Priority to AU2021230860A priority patent/AU2021230860A1/en
Priority to CN202180018428.7A priority patent/CN115279887A/zh
Priority to US17/908,472 priority patent/US20230109717A1/en
Publication of WO2021177279A1 publication Critical patent/WO2021177279A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for cryopreserving cells having high cytotoxic activity.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Patent Document 1 As a method for preserving cells, a method of storing cells in a suspended state without freezing is known in the case of short-term storage (for example, Patent Document 1), and in the case of long-term storage, storage is performed by freezing.
  • the method is known (for example, Patent Document 2).
  • Patent Document 3 For freezing containing sodium salts, potassium salts, sugars, frost protection agents, and bicarbonates and / or carbonates, as cells are further frozen to give cells that maintain high viability even after thawing.
  • Patent Document 3 The use of a solution has been studied.
  • An object of the present invention is to provide a method for cryopreserving and thawing while maintaining high viability and high activity, which can be applied to highly active NK cells.
  • the present invention provides: [1] Cell treatment method including the following steps: (1) Cells activated in vitro are collected in a medium for cell culture; (2) Suspend the collected cells in a solution for cryopreservation; (3) Freeze the suspended cells. [2] The method according to [1], wherein step (1) comprises treatment with a medium supplemented with any one selected from the group consisting of bile acids and phenylbutyric acid. [3] The method according to [1] or [2], which further comprises the following steps: (4) The cryopreserved cells are thawed and suspended in the thaw solvent I.
  • thawing solvent I is an aqueous solution containing the following: ⁇ Sodium chloride 9.00-108 mM, ⁇ Sodium gluconate 2.30-27.7 mM, ⁇ Sodium acetate 2.70-32.5 mM, -Potassium chloride 0.496-5.96 mM, and-Magnesium chloride 0.148-1.78 mM.
  • the thawing solvent I satisfies at least one of the following: ⁇ Does not contain calcium ions at a concentration of 0.423 mM or higher.
  • -Glucose is not contained at a concentration of 5.55 mM or more, and lactate is not contained at a concentration of 27.7 mM or more.
  • Liquid for suspending highly active NK cells including: ⁇ Sodium chloride 9.00-108 mM, ⁇ Sodium gluconate 2.30-27.7 mM, ⁇ Sodium acetate 2.70-32.5 mM, -Potassium chloride 0.496-5.96 mM, and-Magnesium chloride 0.148-1.78 mM.
  • the solution according to [6] which is for suspending frozen highly active NK cells by suspending them in a solution for cryopreservation.
  • a pharmaceutical composition comprising highly active NK cells, a solution for cryopreservation, and the solution described in [6].
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing cells which comprises the following steps: (1) Cells activated in vitro are collected in a medium for cell culture; (2) Suspend the collected cells in a solution for cryopreservation; (3) Freeze the suspended cells.
  • step (1) comprises treatment with a medium supplemented with any one selected from the group consisting of bile acid and phenylbutyric acid.
  • Flow cytometer analysis results of various cells after Mito-Ferro Green reaction are highly active NK cells have a high iron content, and it is suspected that Ferroptosis induction may occur.
  • Lacto lactolin gel Continuation of Figure 1-3 Viability when thawing highly active NK cells. Viability improved when diluted with Plasma-Lyte A at the time of thawing, but Viability deteriorated when diluted with Plasma-Lyte A containing 40% Serum (human AB type serum). Viable cell number and viability (right) and cytotoxic activity (left) of highly active NK cells after standing for a certain period of time.
  • Plasma Plasma-Lyte A Effect of prefreezing treatment of highly active NK cells. Treatment with KBM501 with 4-PBA added before freezing improved Viability during thawing. Recovery rate of highly active NK cells frozen and thawed after 2 hours pretreatment.
  • Highly active NK cells after washing and freezing with KBM501 medium or PBS are thawed at room temperature, allowed to stand at room temperature for each hour without dilution operation, and then diluted 10-fold with KBM501 medium or Plasma-Lyte A, 7- Staining with AAD was performed and analyzed with FlowJo software (left).
  • Highly active NK cells after washing and freezing with KBM501 medium or PBS are thawed at 37 ° C, allowed to stand at room temperature for each hour without dilution operation, and then diluted 10-fold with KBM501 medium or Plasma-Lyte A, 7 -Stained with AAD and analyzed with FlowJo software (right).
  • Viability transition Highly active NK cells after washing and freezing with KBM501 medium or PBS are thawed at 37 ° C, diluted 10-fold with KBM501 medium or Plasma-Lyte A, allowed to stand at room temperature for 0 to 6 hours, and then with 7-AAD. Staining was performed and analyzed with FlowJo software. Viability transition. Effects of dilution with Plasma-Lyte A serially diluted with sterile distilled water and standing at 37 ° C. The cells after each treatment were stained with 7-AAD and analyzed with FlowJo software (same in the figure below). Continuation of Figure 12-1 Viability transition.
  • mM is used in the same meaning as mmol / L unless otherwise specified.
  • a numerical range is represented by x to y, the range includes the values x and y at both ends.
  • the present invention relates to a method for cryopreserving cells having high cytotoxic activity.
  • Applicable cells The present invention can be applied to various cells.
  • One of the cells to which the present invention can be preferably applied is a cell that has undergone an activation operation by using some cytokine in vitro, and such cells include NK cells having high cytotoxic activity (highly active NK cells) and the like. Is included.
  • the activation procedure typically relies on incubating cells with medium containing interleukin (IL) -2.
  • IL interleukin
  • NK cells are large granular lymphocytes that do not express the T cell receptor (TCR), the T cell universal marker CD3, and the membrane immunoglobulin B cell receptor, usually humans. Is CD16 positive and CD56 positive. Those skilled in the art can easily determine whether or not they are NK cells based on the expression pattern of cell surface markers and the like. NK cells have cytotoxic activity, and the presence or absence and degree of this cytotoxic activity can be measured by various known methods. NK cells can include peripheral blood NK cells, cord blood NK cells, primary NK cells, cultured NK cells, and highly active NK cells.
  • Raw materials such as highly active NK cells to which the present invention can be preferably applied may be peripheral blood, cord blood, bone marrow and / or lymph nodes, and blood collected by the apheresis method (apheresis blood).
  • the raw materials are hematopoietic stem cells derived from any stem cell selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells and artificial pluripotent stem (iPS) cells, cord blood-derived hematopoietic stem cells, peripheral blood-derived hematopoietic stem cells, and the like.
  • the donor of the raw material may be the patient who receives immunotherapy with highly active NK cells or the like, a close relative of the patient, or a healthy person who has no blood relationship with the patient. There may be multiple donors.
  • the medium used for culturing highly active NK cells is KBM501 medium (Kojin Bio Co., Ltd. containing 1,750 JRU / mL of IL-2) and Cosmedium 008 (Cosmo Bio. IL-2 of 1,750 JRU / mL).
  • Preferred examples are KBM501 medium, FKCM101 or Cosmedium 008.
  • cells when cells are cultured, unless otherwise specified, for any purpose selected from the group consisting of cell survival maintenance, cell amplification, and cell activation. It means to maintain cells in a medium or a similar solution for a certain period of time. When the treatment is performed at a specific temperature for a certain period of time, it is sometimes called incubation.
  • IL-2 may be added to the medium at a concentration that can achieve the object of the present invention.
  • concentration of IL-2 may range from 2500 IU / mL to 2813 IU / mL.
  • IL-2 preferably has a human amino acid sequence and is preferably produced by recombinant DNA technology for safety reasons.
  • IL-2 concentrations may be expressed in national standard units (JRU) and international units (IU). Since 1 IU is about 0.622 JRU, 1750 JRU / mL of existing medium corresponds to about 2813 IU / mL.
  • IL-12 When any one selected from the group consisting of IL-12, IL-15, and IL-18 is added at the same time as or in place of IL-2 described above at a concentration that can achieve the object of the present invention.
  • Non-Patent Document 2 Leong JW et al. Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 463-473. Each concentration may range from 1 pg / mL to 1 ⁇ g / mL, regardless of the presence or concentration of other cytokines.
  • IL-2 preferably has a human amino acid sequence and is preferably produced by recombinant DNA technology for safety reasons.
  • the subject's autologous serum, human ABO blood group available from BioWhittaker and others, and blood donated human serum albumin available from the Japanese Red Cross Society may be added to the medium.
  • Autologous serum and human ABO blood group serum are preferably added at a concentration of 1 to 10%
  • blood donated human serum albumin is preferably added at a concentration of 1 to 10%.
  • Human platelet lysate (HPL) may be added with or in place of serum.
  • HPL is commercially available, and the UltraGROTM series (AventaCell BioMedical) and others are on sale. When HPL is used, heparin sodium may be further added to the medium.
  • the medium may contain appropriate proteins, cytokines, antibodies, compounds and other components, provided that the NK cell culture effect is not impaired.
  • Cytokines include IL-2, IL-12, IL-15, and IL-18 mentioned above, as well as IL-3, IL-7, IL-21, stem cell factor (SCF), and / or FMS-like tyrosine kinases. May be 3 ligands (Flt3L). All of these preferably have a human amino acid sequence and are preferably produced by recombinant DNA technology for safety reasons.
  • the medium is preferably a serum-free medium.
  • the serum-free medium preferably contains serum albumin, transferrin, and insulin.
  • Serum-free media for culturing lymphocytes have been developed and marketed, and they can be utilized in the present invention.
  • One of the preferred examples of the serum-free medium is a basal medium supplemented with CTS Immuno Cell SR (Thermo Fisher Scientific), which is commercially available as a composition that supports the growth of human T cells.
  • the medium may be replaced or replenished at any time after the start of culturing, provided that the desired culturing effect is obtained, but it is preferably every 3 to 5 days.
  • Culture vessels used for culturing include, but are not limited to, commercially available dishes, flasks, plates, multi-well plates.
  • the culturing conditions are not particularly limited as long as the culturing effect of NK cells is not impaired, but culturing conditions at 37 ° C., 5% CO 2 and a saturated steam atmosphere are common.
  • the culturing period is not particularly limited as long as the desired culturing effect can be obtained.
  • Highly active NK cells and the like to which the present invention can be preferably applied include the following [1], [2], [3] and [4].
  • NK cells having the following characteristics (1) and (2): (1) CD16 positive, CD56 highly expressed, and CD57 negative. (2) NKG2C positive, NKG2A negative to low expression, and CD94 positive.
  • the highly active NK cells of [1] may be highly expressed in CD16. Further, the highly active NK cells of [1] may further have the following characteristics regardless of whether or not they are highly expressed in CD16. (3)
  • the cytotoxic activity is 50% or more when the NK cells are used as effector cells (E) and K562 cells are used as target cells (T) and co-cultured at a mixing ratio (E: T) of 1: 1.
  • the highly active NK cells in [1] can also be expressed as: From healthy human-derived peripheral blood mononuclear cells, CD3 beads (eg, CliniMACS CD3, Miltenyi Biotec, Catalog No. 130-017-601), LD columns (eg, Miltenyi Biotec, Catalog No. 130-042-901) and Cell populations from which CD3-positive cells have been removed using a separation buffer (eg, 0.5% human AB serum (deactivated), PBS containing 2 mM EDTA) are cultivated in a suitable medium (eg, 5% human AB serum).
  • a separation buffer eg, 0.5% human AB serum (deactivated)
  • PBS containing 2 mM EDTA eg, 5% human AB serum
  • NK cells obtained by culturing in Cosmedium 008) supplemented with (inactivated) for 14 days and having the following characteristics (1) and (3): (1) CD16 positive, CD56 highly expressed, and CD57 negative. (3) The cytotoxic activity is 50% or more when the NK cells are used as effector cells (E) and K562 cells are used as target cells (T) and co-cultured at a mixing ratio (E: T) of 1: 1.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-193303 can be referred to.
  • the cells of [2] may be further highly expressive of CD11c.
  • the cells in [2] can also be represented as: Cells that are CCR5 positive, CCR6 positive, CXCR3 positive, Integrin ⁇ 1 positive, Integrin ⁇ 3 positive and Integrin ⁇ 3 negative and CD3 negative.
  • Cells that are CCR5 positive, CCR6 positive, CXCR3 positive, CD11a high expression and CD11c high expression and CD3 negative, high expression of substantially uncultured NK cells obtained from peripheral blood. Cells, as determined by comparison with expression in the population.
  • the cells of [2] show extremely high cytotoxic activity against solid cancers that have formed tumor masses.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-170176 can be referred to for details of the cell characteristics of [2] and a more specific production method.
  • CD3 beads eg, CliniMACS CD3, Miltenyi Biotec, 130-017-601 ( 5 ⁇ L per 1x10 7 cells)
  • frozen apheresis blood on mononuclear cells from fresh peripheral blood or from frozen apheresis blood.
  • a separation buffer eg, 0.5% human.
  • Add type AB serum inactivated at 56 ° C.
  • an appropriate medium for example , 5x10 5 cells / mL when using peripheral blood and 1x10 6 cells / mL when using frozen aferesis blood
  • an appropriate medium for example , 5x10 5 cells / mL when using peripheral blood and 1x10 6 cells / mL when using frozen aferesis blood
  • 5% human AB serum inactivated at 56 ° C for 30 minutes
  • 5% UltraGRO AventaCell, HPCPLCRL10
  • the cells are suspended and cultured until the 14th day while changing the medium as appropriate.
  • the present invention may be described by using highly active NK cells as an example, but those skilled in the art may use some other cytokine in vitro according to the description. It is also possible to understand the case of using cells that have undergone the activation operation by.
  • the term “active or cytotoxic activity” with respect to highly active NK cells and the like refers to the lytic ability of a target cell (effector cell, E) to a target cell (T) unless otherwise specified.
  • the cytotoxic activity can be expressed as a percentage (%) of the target cells that have died by the effector cells, and is calculated by the following formula.
  • the mixing ratio of effector cells and target cells (E: T) and the co-culture time of effector cells and target cells are determined according to the degree of cytotoxic activity of effector cells. , It can be appropriately adjusted according to the type of cells used and the strength of activity.
  • the target cells may be, but are not limited to, K562 cells, acute myelogenous leukemia cells, and chronic myelogenous leukemia cells. Effector cells and target cells, live cells and dead cells can be distinguished and quantified by reagents such as antibodies labeled with radioactive substances and fluorescent dyes.
  • T 2: 1 for 1 to 3 hours, more specifically 2 hours.
  • the activity is preferably 60% or more, more preferably 70% or more.
  • highly active NK cells and the like to be frozen are recovered from the culture system prior to the freezing step described later. Recovery can be performed by centrifuging to separate the medium and cells. If necessary, EDTA at an appropriate concentration may be added to the culture system, and the adhered cells may be exfoliated from the surface of the culture vessel. Alternatively, the surface of the culture vessel after the medium may be washed with an appropriate solution to obtain the remaining cells. The resulting cells are washed with a suitable solution and suspended in a suitable solution, if necessary.
  • a solution such as a medium, an isotonic solution, or a buffer solution can be used for exfoliation and washing of cells.
  • media that can be used are KBM501 medium, Cosmedium 008, FKCM101, CellGro SCGM medium, X-VIVO15 medium, Gibco (registered trademark) CTS (registered trademark) AIM V (registered trademark) Medium, CTS OpTmizer T Cell Expansion Basal. Examples include Medium, IMDM, MEM, DMEM and RPMI-1640.
  • the isotonic liquid is a liquid having an osmotic pressure substantially equal to the osmotic pressure (285 ⁇ 5 mOsm / L) of the body fluid (plasma), and in the present invention, it is a liquid having an osmotic pressure of 285 ⁇ 13 mOsm / L.
  • the osmotic pressure of Plasma-Lyte A is 294 mOsm / L
  • the osmotic pressure of PBS (-) is 280 ⁇ 4 mOsm / L (freezing point drop method).
  • Examples of usable isotonic solutions include Plasma-Lyte A (Baxter), physiological saline, Ringer's solution (Lactated Ringer's solution, Ringer's acetate solution, Ringer's bicarbonate solution, etc.), and 5% aqueous glucose solution.
  • Examples of buffers that can be used include Phosphate-buffered saline (PBS), Tris hydrochloride buffer, Tris acetate buffer, and HEPES buffer.
  • the medium for culturing human lymphocytes may contain human serum albumin, human transferrin, recombinant human insulin, and recombinant human IL-2.
  • Preferred examples of such media are KBM501 medium, FKCM101 or Cosmedium 008.
  • KBM501 medium contains human serum albumin, human transferrin, recombinant human insulin, recombinant human IL-2, and no other proteins.
  • the KBM501 medium also contains an antibiotic (kanamycin), LVDS 3 , L-Glutamine, and a pH regulator.
  • PBS (-) typically contains sodium chloride 136.9 mM, potassium chloride 2.68 mM, disodium hydrogen phosphate 8.1 mM, and potassium hydrogen phosphate 1.47 mM.
  • Pretreatment In the present invention, highly active NK cells or the like to be frozen may be pretreated prior to the freezing step described later. Pretreatment is the suspension of the recovered cells in a solution containing the additive. Pretreatment involves recovery with a solution containing additives.
  • any one selected from the group consisting of bile acid and phenylbutyric acid can be used.
  • bile acids are tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), kenodeoxycholic acid, cholic acid, hyodeoxycholic acid, deoxycholic acid, 7-oxolithocholic acid, lithocholic acid, iododeoxycholic acid. Acids, iocholic acid, taurokenodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, glycoursodeoxycholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid or its analogs and derivatives.
  • TDCA tauroursodeoxycholic acid
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • kenodeoxycholic acid cholic acid
  • hyodeoxycholic acid deoxycholic acid
  • 7-oxolithocholic acid lithocholic acid
  • phenylbutyric acid examples include 4-phenylbutyric acid (4-PBA), gluceryl (tri-4-PBA), phenylacetic acid, 2-POAA-OMe, 2-POAA-NO2, 2-NOAA or pharmaceutically acceptable thereof. , Salt, analog, derivative or prodrug.
  • a particularly preferred example of the additive used in the pretreatment is one selected from the group consisting of TUDCA and 4-PBA.
  • the concentration may be appropriate, but it is preferably 100 to 5000 ⁇ M, more preferably 200 to 2500 ⁇ M, and further preferably 400 to 1000 ⁇ M. Such a range is particularly suitable when using TUDCA.
  • the concentration may be appropriate, but is preferably 1 to 1000 ⁇ M, more preferably 5 to 500 ⁇ M, and even more preferably 10 to 100 ⁇ M. Such a range is particularly suitable when using 4-PBA.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • concentration can be adjusted as appropriate, but is preferably 0.5 to 15%, more preferably 1 to 12.5%, and even more preferably 2 to 10%.
  • the solution for pretreatment can be a solution such as a medium, an isotonic solution, or a buffer solution, similar to the solution used for recovery.
  • One of the preferred examples of the solution used in the pretreatment is a medium, more preferably a medium for culturing human lymphocytes, and even more preferably KBM501 medium, FKCM101 or Cosmedium 008.
  • the medium used for pretreatment may also contain human serum albumin, human transferrin, recombinant human insulin, and recombinant human IL-2, antibiotics (kanamycin), LVDS 3 , L-Glutamine, pH. It may contain a regulator.
  • the time for pretreatment is not particularly limited.
  • the suspension may be allowed to stand for minutes to hours, for example 5 minutes to 4 hours, more preferably 30 minutes to 3 hours after suspending the cells for pretreatment.
  • Standing may be performed at ambient temperature (eg 1-30 ° C, typically 15-25 ° C) or in a CO 2 incubator (eg 36-42 ° C, typically 37 ° C). ..
  • the cell density at the time of pretreatment can be appropriately set, but it is preferable that the cell density is suitable for maintaining cells. Specifically, it is 1x10 5 to 1x10 7 cells / mL, preferably 2x10 5 to 5x10 6 cells / mL, and more preferably 5x10 5 to 2x10 6 cells / mL.
  • pretreatment TUDCA the 400 ⁇ 1000 [mu] M or 4-PBA the KBM501 medium added 10 ⁇ 100 [mu] M, the FKCM101 or Cosmedium 008, as cell density is 5x10 5 ⁇ 2x10 6 cells / mL To suspend. At this time, it is advisable to incubate at 37 ° C. under 5% CO 2 for 30 minutes to 3 hours.
  • pretreatment is not essential in the present invention, by pretreating highly active NK cells and the like with KBM501 medium supplemented with 4-PBA or TUDCA before freezing, the cells can be treated as compared with the case where no pretreatment is performed.
  • the survival rate (which can also be called the recovery rate) when thawed can be improved.
  • the recovered, preferably pretreated cells are frozen by conventional procedures. Specifically, if necessary, the number of cells and the viability are confirmed, and after centrifugation to remove the supernatant, the cells are suspended in a cryopreservation solution so as to have an appropriate cell density. After dispensing the cell suspension into a container for cryopreservation, freeze it in a deep freezer at -80 ° C and store it. If necessary, freeze in a liquid nitrogen tank.
  • the cryopreservation solution that can be used in the present invention may contain a sodium salt, a potassium salt, a sugar, a hydrogen carbonate, a carbonate, and a frost damage protective agent.
  • the sodium salt that can be used is not particularly limited as long as it produces sodium ions when dissolved in a solvent, and may be an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like. ..
  • the sodium salt may be used alone or in combination of two or more.
  • sodium chloride is preferably used as one type, and sodium chloride and sodium citrate are preferably used as a plurality of types.
  • the sodium salt content is not particularly limited, but the final concentration of all sodium ions contained in the cryopreservation solution is preferably 0.01 to 5000 mM, more preferably 0.1 to 1000 mM, and even more preferably 1 to 300 mM.
  • the potassium salt that can be used is not particularly limited as long as it produces potassium ions when dissolved in a solvent, and may be an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like. ..
  • the potassium salt may be used alone or in combination of two or more. Potassium chloride is preferably used in the present invention.
  • the potassium salt content is not particularly limited, but the final concentration of total potassium ions contained in the cryopreservation solution is preferably 0.01 to 5000 mM, more preferably 0.1 to 1000 mM, and even more preferably 1 to 100 mM.
  • the usable hydrogen carbonate is not particularly limited as long as it produces hydrogen carbonate ions when dissolved in a solvent, and salts with various cations can be used.
  • ammonium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, calcium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, magnesium hydrogen carbonate and the like can be mentioned.
  • the carbonates that can be used are not particularly limited as long as they generate carbonate ions when dissolved in a solvent, and salts with various cations can be used.
  • ammonium carbonate, potassium carbonate, calcium carbonate, sodium carbonate, barium carbonate, magnesium carbonate and the like can be mentioned.
  • These hydrogen carbonates and / or carbonates may be used alone or in combination of two or more.
  • Sodium hydrogen carbonate is preferably used in the present invention.
  • the content of bicarbonate and / or carbonate is not particularly limited, but the total final concentration of hydrogen carbonate ion and carbonate ion contained in the cryopreservation solution is preferably 0.01 to 1000 mM, more preferably 0.1 to 500 mM. It is more preferably 1 to 100 mM.
  • the concentration ratio of sodium ions to potassium ions (sodium ion / potassium ion) in the cryopreservation solution is preferably 1/1000 to 1000/1, more preferably 1/100 to 100/1, and even more preferably 1/10 to 100. It is / 1, more preferably 1/1 to 100/1, and even more preferably 10/1 to 50/1.
  • Usable sugars are monosaccharides, oligosaccharides or sugar alcohols, for example glucose, galactose, fructose, mannose, xylose, arabinose as monosaccharides, trehalose, sucrose, maltose, lactose, cellobiose, sugars as oligosaccharides.
  • the alcohol include xylitol, sorbitol and the like.
  • These saccharides may be used alone or in combination of two or more, but in the present invention, they are preferably at least one saccharide selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose, mannose, xylose, and arabinose. , More preferably glucose.
  • the content of saccharides in the cryopreservation solution is preferably 0.01 to 100 g / L, more preferably 0.1 to 100 g / L, and even more preferably 0.25 to 50 g / L.
  • frost damage protective agents examples include dimethyl sulfoxide (DMSO), hydroxyethyl starch (HES), ethylene glycol, glycerol and the like.
  • the frost damage protective agent may be used alone or in combination of two or more.
  • any one selected from the group consisting of DMSO and hydroxyethyl starch is preferably used.
  • the total content is preferably within the above range, and the respective concentrations are such that the DMSO concentration is preferably 0.01 to 50%, more preferably 1 to 1. It is 30%, more preferably 2 to 15%, and the hydroxyethyl starch concentration is preferably 0.01 to 50%, more preferably 1 to 30%, still more preferably 2 to 15%.
  • a component selected from the group consisting of protein, magnesium salt and calcium salt is further contained.
  • proteins that can be used include serum albumin and serum globulin.
  • serum albumin examples include human serum albumin and bovine serum albumin.
  • human serum albumin is suitable.
  • the protein content is preferably 0.01 to 50%, more preferably 1 to 30%, still more preferably 2 to 15% in the cryopreservation solution.
  • the magnesium salt that can be used is not particularly limited as long as it produces magnesium ions when dissolved in a solvent, and an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like may be used. Can be done.
  • the magnesium salt may be used alone or in combination of two or more.
  • Magnesium chloride is preferably used in the present invention.
  • the magnesium salt content is not particularly limited, but the final concentration of all magnesium ions contained in the cryopreservation solution is preferably 0.01 to 10 mM, more preferably 0.1 to 5 mM.
  • the calcium salt that can be used is not particularly limited as long as it produces calcium ions when dissolved in a solvent, and an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like is used. Can be done.
  • the calcium salt may be used alone or in combination of two or more. Calcium chloride is preferably used in the present invention.
  • the calcium salt content is not particularly limited, but the final concentration of all calcium ions contained in the cryopreservation solution is preferably 0.01 to 10 mM, more preferably 0.1 to 5 mM.
  • the cryopreservation solution may further contain substances that are not damaging to cells, such as vitamins and amino acids.
  • the cryopreservation solution may contain phosphate ions from the viewpoint of exerting pH adjustment and buffering action.
  • the osmotic pressure of the cryopreservation solution is preferably in the range that does not damage the cells during freezing, and from the viewpoint of increasing the permeability of the components into the cells during freezing and inhibiting ice crystal formation, for example, 500 to 8000 mOsm. It may be / L, 1000 to 7500 mOsm / L, 1500 to 7000 mOsm / L, or 1800 to 5000 mOsm / L.
  • the pH of the cryopreservation solution is preferably in the range that does not damage the cells, for example, 3.0 to 10.0, and more preferably 4.5 to 9.0.
  • cryopreservation liquid may be used.
  • products that can be used include the cell / tissue cryopreservation solution cell bunker series (STEM-CELLBANKER (registered trademark)), and more specifically, STEM-CELLBANKER (ZENOAQ, CB045).
  • the cells at the time of freezing are in the logarithmic growth phase.
  • the cell density at the time of freezing can be appropriately adjusted, but specifically, it is 1x10 6 to 2x10 8 cells / mL, preferably 2x10 6 to 1x10 8 cells / mL, and more preferably 1x10 7 to. 5x10 7 cells / mL.
  • cells are stored at 4x10 7 cells / mL in a 5 mL volume container. Freezing of highly active NK cells The ability to freeze at high density when shipping contributes to making the product more compact and reducing transportation costs.
  • cryopreserved cells can be thawed by various procedures.
  • a container for cryopreservation containing cells can be quickly thawed in a warm bath at 37 ° C while shaking as necessary.
  • it can be naturally thawed by leaving it at room temperature without actively heating it after taking it out of the freezer.
  • the thawed cells are mixed with the appropriate thawing solvent I. If necessary, the supernatant can be removed by centrifugation and suspended in an appropriate amount of thawing solvent II for culturing or activation treatment.
  • thawing solvent I the solution used for thawing the frozen cells suspended in the cryopreservation solution and diluting them together with the cryopreservation solution.
  • thawing solvent I Various solvents can be used as the thawing solvent I for the cells collected according to the present invention, pretreated as necessary, and cryopreserved.
  • the thawing solvent I may contain a sodium salt, a potassium salt, a gluconate salt, and an acetate salt. It may also contain magnesium salts.
  • the sodium salt that can be used as the thawing solvent I can be an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like.
  • the sodium salt may be used alone or in combination of two or more.
  • the thawing solvent I preferably contains any one selected from the group consisting of sodium chloride, sodium gluconate, and sodium acetate, and more preferably contains sodium chloride, sodium gluconate, and sodium acetate.
  • the content of the sodium salt of the solvent I at the time of thawing is preferably 14.0 to 200 mM, more preferably 28.0 to 182 mM, and further preferably 70.0 to 168 mM as the final concentration of all sodium ions. Alternatively, it is preferable to contain 9.00 to 108 mM as sodium chloride, 2.30 to 27.7 mM as sodium gluconate, and 2.70 to 32.5 mM as sodium acetate.
  • the potassium salt that can be used in the thawing solvent I can be an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like.
  • the potassium salt may be used alone or in combination of two or more.
  • the thawing solvent I preferably contains any one selected from the group consisting of potassium chloride, potassium gluconate, and potassium acetate, and more preferably contains potassium chloride.
  • the content of the potassium salt of the solvent I at the time of thawing is preferably 0.50 to 8.0 mM, more preferably 1.0 to 7.0 mM, and further preferably 2.5 to 6.0 mM as the final concentration of total potassium ions.
  • potassium chloride preferably contains 0.496 to 5.96 mM.
  • the gluconate salt that can be used as the solvent I at the time of thawing is not particularly limited as long as it produces gluconate ions when dissolved in the solvent, and salts with various cations can be used.
  • the thawing solvent I preferably contains sodium gluconate.
  • the content of gluconate in solvent I at the time of thawing is preferably 2.3 to 32.3 mM, more preferably 4.6 to 29.9 mM, and further preferably 12.5 to 27.7 mM as the final concentration of total gluconate ions. ..
  • the acetate salt that can be used in the solvent I at the time of thawing is not particularly limited as long as it produces acetate ions when dissolved in the solvent, and salts with various cations can be used.
  • salts with various cations can be used.
  • sodium acetate, potassium acetate and the like can be mentioned.
  • the thawing solvent I preferably contains sodium acetate.
  • the content of the acetate of Solvent I at the time of thawing is preferably 2.7 to 37.8 mM, more preferably 5.4 to 35.1 mM, and further preferably 13.5 to 32.5 mM as the final concentration of total acetate ions.
  • a commercially available isotonic solution may be used as the thawing solvent I.
  • examples of products that can be used include Plasma-Lyte A, and a solution obtained by diluting it with water. Specifically, it is a liquid containing the following. ⁇ Sodium chloride 9.00-108mM ⁇ Sodium gluconate 2.30-27.7 mM ⁇ Sodium acetate 2.70-32.5 mM ⁇ Potassium chloride 0.496-5.96 mM ⁇ Magnesium chloride 0.148-1.78mM
  • the thawing solvent I may contain only sodium salts.
  • the sodium salt that can be used in the thawing solvent I may be an oxo acid salt, a halide, an oxide, a hydroxide, an inorganic salt, an organic acid salt, or the like.
  • the sodium salt may be used alone or in combination of two or more.
  • the thawing solvent I preferably contains only sodium chloride.
  • the content of the sodium salt of the solvent I at the time of thawing is preferably 15.4 to 216 mM, more preferably 30.8 to 200 mM, and further preferably 70.0 to 185 mM as the final concentration of all sodium ions.
  • physiological saline or a solution obtained by diluting it with water may be used.
  • the cells suspended in the solvent I at the time of thawing together with the solution for cryopreservation can be used as they are for administration.
  • the mixed solution becomes isotonic after mixing the solution for cryopreservation and the solvent I at the time of thawing (having an osmotic pressure almost equal to that of the body fluid, specifically 285 ⁇ ). 13mOsm / L) is preferable.
  • the liquid for cryopreservation is a hypertonic liquid (for example, 1500 to 7000 mOsm / L) in a preferred embodiment, the solvent I at the time of thawing may be a liquid having a low osmotic pressure.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the component concentration of the solvent I during thawing in consideration of the dilution ratio of the solution for cryopreservation with the solvent I during thawing.
  • the solvent I at the time of thawing is specifically a liquid containing the following. ⁇ Sodium chloride 85.5-94.5 mM ⁇ Sodium gluconate 21.8-24.2 mM ⁇ Sodium acetate 25.6-28.5 mM ⁇ Potassium chloride 4.71-5.21 mM ⁇ Magnesium chloride 1.40 ⁇ 1.55mM Alternatively, the thawing solvent I is specifically a liquid containing the following. ⁇ Sodium chloride 146.3 to 161.7 mM
  • the solvent I at the time of thawing does not contain calcium ions at a concentration of 0.423 mM or more. Further, in any composition, it is preferable that the solvent I at the time of thawing does not contain glucose at a concentration of 5.55 mM or more. Further, in any composition, it is preferable that the solvent I at the time of thawing does not contain lactate at a concentration of 27.7 mM or more. This is because the viability or cytotoxic activity of thawed cells may decrease. In this sense, RPMI medium, Hanks'Balanced Salt Solution (HBSS) (+), and Ringer's lactate solution may not be suitable for use as solvent I during thawing.
  • HBSS Hanks'Balanced Salt Solution
  • the solvent I at the time of thawing preferably contains no serum at a concentration of 40% or more, and more preferably does not contain any serum. This is because the inclusion of serum may reduce the viability of cells.
  • the cell density when suspended in the solvent I at the time of thawing can be appropriately set, but it is preferable that the cell density is suitable for maintaining the cells or is suitable for administration. Specifically, it is 1x10 5 to 1x10 7 cells / mL, preferably 2x10 5 to 5x10 6 cells / mL, and more preferably 5x10 5 to 2x10 6 cells / mL.
  • Cells can be maintained for a relatively long time in solvent I upon thawing.
  • the suspension may be allowed to stand for several minutes to several hours, for example, 5 minutes to 6 hours, more preferably 30 minutes to 4 hours.
  • Standing may be performed at ambient temperature (eg 1-30 ° C, typically 15-25 ° C) or in a CO 2 incubator (eg 36-42 ° C, typically 37 ° C). ..
  • solvent II during thawing
  • the cells after thawing the frozen cells with the thawing solvent I, the cells can be further cultured or activated using the thawing solvent II.
  • the solution used for recovering the cells suspended in the thawing solvent I and resuspending them for culturing or activation is referred to as thawing solvent II.
  • thawing solvent II various solvents can be used depending on the purpose.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising highly active NK cells, etc., which have been recovered by an appropriate method, pretreated as necessary, and cryopreserved.
  • the pharmaceutical composition provided by the present invention can be applied to the treatment and / or prevention of various diseases sensitive to highly active NK cells and the like.
  • diseases are cancer or infectious diseases, specifically skin cancer, oral cancer, bile sac cancer, bile duct cancer, lung cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, It includes, but is not limited to, pancreatic cancer, kidney cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, neuroblastoma, leukemia, and infections caused by viruses, bacteria, and the like.
  • the present inventors have confirmed the effect on colorectal cancer model animals that die within 30 days without treatment using cells frozen and thawed by the method of the present application.
  • the cell therapy with the pharmaceutical composition of the present invention may be carried out alone or in combination with surgical therapy, chemotherapy, radiotherapy, antibody drug and the like.
  • Constituent cells Highly active NK cells, etc. Content: 6 x 10 6 to 4.8 x 10 9 cells / 60 kg
  • the shelf life after thawing is 6 hours, preferably 4 hours when stored at room temperature.
  • KBM501 medium so that the final volume on day 9 of culture is 6 mL per well for a 6-well plate, 50 mL per flask for a T-75 flask, and 500 mL per bag for a bag. It was added and incubated until day 14.
  • cells obtained from PBMCs through this culture step will be referred to as "Highly activated NK cell-like CD3-negative cells” or simply “highly activated NK cells”. ..
  • Recovery method 2 Method of the present application The culture solution was recovered on the 14th day of culture, 1 mM EDTA was added to the culture vessel to exfoliate the adhered cells, and the culture vessel after collecting the detached cells was washed with KBM501 medium. All cell recovery solutions were centrifuged, washed with KBM501 medium, and resuspended.
  • Highly active NK cells PBMC, K562 (human chronic myelogenous leukemia cell line), THP-1 (human acute monocytic leukemia cell line) obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells 1.
  • PBMC, K562 human chronic myelogenous leukemia cell line
  • THP-1 human acute monocytic leukemia cell line
  • NK cells have a high iron content. From the morphological observation results and the time to death, it was assumed that the Viability of highly active NK cells significantly decreased by freezing and thawing in five morphologies: Ferroptosis (oxidative stress), Apoptosis, Autophagy, Necrosis and Necroptosis. .. Inhibitors for each form are shown below.
  • NK cells The number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells was counted, and 1x10 7 cells were suspended in 1 mL of STEM-CELLBANKER (ZENOAQ, CB045). Frozen at -80 ° C. NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C., diluted 10-fold with the following solvent, allowed to stand at each temperature and time, and then observed and photographed with an optical microscope. ..
  • Fig. 1-2 The results are shown in Fig. 1-2. It was confirmed that the Viability of highly active NK cells was significantly reduced by freezing and thawing. This was also not improved by the addition of Methylprednisolone, Dexamethasone, or Z-Vad after freeze-thaw.
  • the highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells 1 were recovered and then frozen and thawed by the method as described.
  • Example 1 (1-1) The number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method of culturing and recovering highly active NK cells from each of two healthy volunteers was counted, and 1x10 7 cells and 8x10, respectively. 6 cells were suspended in 1 mL of STEM-CELLBANKER (ZENOAQ, CB045) and frozen at -80 ° C. NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C., and immediately after thawing, 1x10 5 cells were separated into 96-well plates (IWAKI).
  • STEM-CELLBANKER ZENOAQ, CB0405
  • NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C., and immediately after thawing, 1x10 5 cells were separated into 96-well plates (IWAKI).
  • KBM501 medium 3500 units / mL IL-2 (Seroiku® injection 40, Takeda Yakuhin Kogyo), lactolinger containing 139.9 mM maltose (Fuso Yakuhin Kogyo), Plasma containing 3500 units / mL IL-2.
  • KBM501 medium 3500 units / mL IL-2 (Seroiku® injection 40, Takeda Yakuhin Kogyo), lactolinger containing 139.9 mM maltose (Fuso Yakuhin Kogyo), Plasma containing 3500 units / mL IL-2.
  • KBM501 medium containing Lyte A (Baxter)
  • 5.02 mg / mL sodium gluconate Nacalai, 16720-22
  • Example 2 The viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells are counted, and 5x10 6 cells and 1x10 7 cells are suspended in 1 mL of STEM-CELL BANKER at -80 ° C. Frozen. NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C., and immediately after thawing, 1x10 5 cells were separated into 96-well plates.
  • Example 3 The number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells was counted, and 1x10 7 cells were suspended in 1 mL of STEM-CELL BANKER and frozen at -80 ° C. After thawing NK cells frozen for 48 hours or more in a water bath at 37 ° C, Plasma-Lyte A (solvent (1)) containing 3500 units / mL IL-2 (Immnes, Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.), or Diluted with KBM501 medium (solvent (2)), the number of viable cells, viable cell rate, and cytotoxic activity rate (% Lysis) after dilution were calculated for each of the following groups.
  • ⁇ 4> Dilute 10-fold with solvent (1), leave at 37 ° C for 1 hour, add lactoline gel containing an equal amount of IL-2, and incubate at 37 ° C overnight.
  • ⁇ 5> Dilute 10-fold with solvent (1) and leave at 37 ° C for 3 hours.
  • ⁇ 6> Dilute 10-fold with solvent (2) and leave at 37 ° C for 3 hours.
  • ⁇ 7> Dilute 10-fold with solvent (2) and leave overnight at 37 ° C.
  • cytotoxic activity rate For the measurement of cytotoxic activity, a group in which NK cells and K562 cells were reacted, a group in which only K562 cells were used as a negative control, and a group in which K562 cells were fixed with 10% formalin were prepared as a positive control.
  • ⁇ NK cells After incubating for the time described in each group, cells were harvested and adjusted to a concentration of 2x10 6 cells / mL with 10% FBS / RPMI 1640.
  • K562 cells K562 cells in which K562 cells (human chronic myelogenous leukemia cell line) were suspended in RPMI1640 medium containing no serum component were stained with PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26GL-1KT), and finally 10 It was prepared to be 2x10 6 cells / mL with% FBS / RPMI1640.
  • Fig. 3 For frozen and thawed highly active NK cells, the number of viable cells and Viability were correlated. In addition, the number of viable cells or Viability and cytotoxic activity tended to be inversely correlated. Furthermore, when the treatment solution for frozen and thawed cells was switched from Plasma-Lyte A to another solution, Viability decreased.
  • Example 4 The number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells is counted and suspended in the following 6 kinds of solvents so as to be 1x10 6 cells / mL. , Pre-freezing treatment was performed by seeding on a low-adsorption 6-well plate (IWAKI, 4810-800SP).
  • the pretreatment solvent includes (1) KBM501 medium containing 10 ⁇ M 4-phenylbutyric acid (4-PBA, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., P0643), (2) KBM501 medium containing 100 ⁇ M 4-phenylbutyric acid, and (3) Plasma- Lyte A, (4) Plasma-Lyte A containing 3000 units / mL IL-2 (Immnes, Shionogi Co., Ltd.), (5) Plasma-Lyte A containing 10 ⁇ M Salubrinal (TOCRIS, 2347), (6) 23 mM Using PBS containing sodium gluconate, cells suspended in each solvent were placed at 37 ° C for groups (1) and (2) under 5% CO 2 , and for 2 hours at room temperature for groups (3) to (6).
  • NK cells were suspended in STEM-CELLBANKER so as to have 1x10 7 cells / mL based on the number of cells at the time of treatment, and cryopreserved at -80 ° C.
  • Pretreated NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C. and diluted as follows. Dilution and incubation after thawing were all carried out in a low adsorption 6-well plate.
  • KBM501 medium containing 10 ⁇ M 4-phenylbutyric acid Dilute 11-fold each in Plasma-Lyte A containing 1000 units / mL IL-2 or Plasma-Lyte A containing 1000 units / mL IL-2 and 100 ⁇ M 4-PBS, incubate at room temperature for 1 hour, and then in KBM501 medium 5 It was diluted 2-fold.
  • KBM501 medium containing 100 ⁇ M 4-phenylbutyric acid >> It was diluted 11-fold with Plasma-Lyte A, incubated at room temperature for 1 hour, and then diluted 5-fold with RPMI medium * 6 or RPMI medium containing 2400 units / mL IL-2.
  • Plasma-Lyte A Dilute 11-fold each in Plasma-Lyte A containing 1000 units / mL IL-2 or Plasma-Lyte A containing 1000 units / mL IL-2 and 100 ⁇ M 4-PBA, incubate at room temperature for 1 hour, and then in KBM501 medium 5 It was diluted 2-fold.
  • Plasma-Lyte A containing 10 ⁇ M Salubrinal ⁇ Dilute 11-fold each in Plasma-Lyte A containing 1000 units / mL IL-2 and Plasma-Lyte A containing 1000 units / mL IL-2 and 100 ⁇ M 4-PBA, incubate at room temperature for 1 hour, and then in KBM501 medium 5 It was diluted 2-fold.
  • the cells of each group diluted in the medium were incubated overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 , and then the number of viable cells was counted.
  • the experimental conditions are summarized below.
  • Example 5 The number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedures described in the culture method, recovery method 1 and recovery method 2 of highly active NK cells was counted and suspended in various solvents so as to be 1x10 6 cells / mL. Pre-freezing treatment was performed by seeding in a low-adsorption 6-well plate. The NK cells obtained by the recovery method 1 were suspended in PBS and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the NK cells obtained by the recovery method 2 are (1) KBM501 medium, (2) KBM501 medium containing 30 ⁇ M 4-phenylbutyric acid, and (3) KBM501 containing 30 ⁇ M Tauroursodeoxycholic Acid Dihydrate (TUDCA, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., T1567). Cells suspended in medium, (4) KBM501 medium containing 30 ⁇ M 4-phenylbutyric acid and 30 ⁇ M TUDCA were incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours.
  • TDCA Tauroursodeoxycholic Acid Dihydrate
  • the cells were suspended in STEM-CELLBANKER so as to have 1x10 7 cells / mL based on the number of cells at the time of treatment, and cryopreserved at -80 ° C.
  • Pretreated highly active NK cells frozen for 48 hours or longer were thawed in a water bath at 37 ° C., diluted 11-fold with Plasma-Lyte A in each group, and incubated at room temperature for 1 hour. After 1 hour, the cells were gently suspended and the number of viable cells was counted. Further, the cells were diluted 5-fold in KBM501 medium and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours, and then the number of viable cells was counted and calculated as the recovery rate with respect to the number of cells at the time of freezing.
  • Example 6 Count the number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells, and use only KBM501 medium or TUDCA (10 ⁇ M, 30 ⁇ M) so as to be 1x10 6 cells / mL. , 90 ⁇ M, 270 ⁇ M, 810 ⁇ M) were suspended in KBM501 medium, seeded on a low-adsorption 6-well plate, incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours, and pre-frozen treatment was performed.
  • the cells were suspended in STEM-CELLBANKER so as to have 1x10 7 cells / mL based on the number of cells at the time of treatment, and cryopreserved at -80 ° C.
  • Pretreated NK cells frozen for 48 hours or longer were thawed in a water bath at 37 ° C., 10-fold amount of Plasma-Lyte A was added to each group, and the cells were incubated at room temperature for up to 3 hours. After 1 hour and 3 hours, the cells were loosely suspended and the number of viable cells was counted. After 1 hour, the cells were diluted 5-fold in KBM501 medium and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours, and the number of viable cells was counted. It was calculated from the number of viable cells at each point after thawing as the recovery rate with respect to the number of cells at the time of freezing. In addition, the cytotoxic activity of highly active NK cells was measured at each time point.
  • cytotoxic activity rate For the measurement of cytotoxic activity, a group in which NK cells and K562 cells were reacted, a group in which only K562 cells were used as a negative control, and a group in which K562 cells were fixed with 10% formalin were prepared as a positive control.
  • ⁇ NK cells The cells thawed and diluted by the method described were collected in the required amount based on the number of viable cells at the time of freezing, and then adjusted to a concentration of 2x10 6 cells / mL with 10% FBS / RPMI1640.
  • K562 cells were suspended in serum-free RPMI1640 medium, stained with PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit, and then prepared to 2x10 6 cells / mL with 10% FBS / RPMI1640.
  • NK cells and K562 cells were added to a 96-well plate (IWAKI, 4870-800SP) so as to have a cell ratio of 2: 1 and mixed, and reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours. After the reaction, the mixture was centrifuged (500 x g, 5 minutes), the supernatant was removed, a 7-AAD solution diluted with PBS was added and suspended, and the mixture was incubated at room temperature for 20 minutes. Measurements were performed using a flow cytometer and analyzed with FlowJo software to calculate the cytotoxic activity rate (% Lysis).
  • the table below shows the recovery rate obtained together with the pretreatment conditions and thawing conditions.
  • Pretreatment of highly active NK cells with KBM501 medium supplemented with TUDCA at various concentrations improved the recovery rate after thawing.
  • Example 7 The number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells is counted so that the number of viable cells is 1x10 6 cells / mL.
  • KBM501 medium only, 266 ⁇ M, 810 ⁇ M, 2400 ⁇ M TUDCA Suspended in KBM501 medium containing KBM501 medium, 2.4% DMSO (Nakalitesk, 13445-74), seeded in low-adsorption 6-well plates, incubated for 2 hours under 37 ° C., 5% CO 2 for prefreezing. went.
  • the cells were suspended in STEM-CELLBANKER so as to have 1x10 7 cells / mL based on the number of cells at the time of treatment, and cryopreserved at -80 ° C.
  • Pretreated NK cells frozen for 48 hours or longer were thawed in a water bath at 37 ° C., diluted 11-fold with Plasma-Lyte A or Plasma-Lyte A containing 3000 units / mL IL-2 in each group at room temperature. Incubated for up to 3 hours. After 1 hour and 3 hours, the cells were loosely suspended and the number of viable cells was counted. After 1 hour, the cells were diluted 5-fold in KBM501 medium and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours, and the number of viable cells was counted. It was calculated from the number of viable cells at each point after thawing as the recovery rate with respect to the number of cells at the time of freezing.
  • cytotoxic activity of highly active NK cells against K562 cells was measured at each time point of thawing and dilution by the method described in Example 6.
  • highly active NK cells 1 hour and 3 hours after thawing were evaluated using a solid tumor model (3D killing assay).
  • highly active NK cells were prepared in KBM501 medium so as to be 1x10 6 cells / mL based on the number of cells at the time of freezing. 50 ⁇ L of prepared NK cells were added to one SKOV3 sphere seeded in advance in a 384-well plate, and the cells were reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 days. Then, the cells were detached and collected by Accutase, and expanded and cultured in RPMI medium on a 24-well plate.
  • ⁇ SKOV3 sphere ⁇ SKOV3 cells (human ovarian cancer cell line) were prepared so as to 3x10 4 cells / mL in 10% FBS / RPMI1640, were seeded 3x10 3/100 [mu] L per well of 96-well plates.
  • a sphere was prepared by culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days.
  • the table below shows the recovery rate obtained together with the pretreatment conditions and thawing conditions.
  • Pretreatment of highly active NK cells with KBM501 medium supplemented with TUDCA at various concentrations improved recovery after thawing.
  • Fig. 7-1 The measurement results of cytotoxic activity are shown in Fig. 7-1, and the results of evaluation using a solid tumor model (3D killing assay) are shown in Fig. 7-2.
  • Fig. 7-1 the SKOV3 sphere to which NK cells were not added was indicated as nega.
  • TUDCA concentration range of TUDCA was widened and the evaluation in the solid tumor model was added, it was preferable to use TUDCA added before freezing at a concentration between 2,400 ⁇ M and 267 ⁇ M, and the recovery rate was high and the recovery rate was particularly high when used at 800 ⁇ M.
  • the injury activity for the solid tumor model was high.
  • Example 8 (8-1) Count the number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells, and suspend them with STEM-CELL BANKER so as to be 1x10 7 cells / mL. It became turbid and was cryopreserved at -80 ° C.
  • the highly active NK cells were frozen for more than 48 hours 37 ° C., was thawed in a water bath, including (1) Plasma-Lyte A, (2) 1.48mM MgCl 2 ⁇ 6H 2 O ( Nacalai Tesque, 20909-55) PBS (-), (3) PBS (-), (4) KBM501 medium, (5) 62.2mg / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O ( Nacalai Tesque, 08895-15) Plasma-Lyte a containing, (6) Plasma-Lyte A with 0.1% glucose (50% glucose, Termo), (7) glucose, (8) RPMI medium without serum components (Nacalai Tesque, 09892-15), (9) RPMI medium with glucose (9) It was diluted 10-fold in Nacalai Tesque, 30264-85), and (1) to (4) were incubated at room temperature for 2 hours, and (1) and (5) to (9) were incubated at 37 ° C for 3 hours. After that, the measurement was performed by
  • lactic acid was added according to the lactic acid concentration of the lacto Ringer's solution, and it was confirmed on the Lithomas test paper that it was neutral.
  • DDL 4 was added according to the DDL 4 concentration of HBSS. After that, the measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and the analysis was performed with FlowJo software.
  • Plasma-Lyte A (2) saline solution, (3) RPMI1640 medium, (4) lactolin gel, (5) 0.423 mM CaCl 2 , prepared with Plasma-Lyte A, (6) Diluted 10-fold with 1.36 mM CaCl 2 and allowed to stand at 37 ° C for 3 hours.
  • CaCl 2 of (5) was added to RPMI1640 medium, and CaCl 2 of (6) was added according to Lacto Ringer's solution. After that, the measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and the analysis was performed with FlowJo software.
  • Example 9 (9-1) Count the number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells, and suspend them with STEM-CELL BANKER so as to be 4x10 7 cells / mL. It became turbid and was cryopreserved at -80 ° C. Highly active NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C., diluted 10-fold with Plasma-Lyte A containing 3000 units / mL IL-2, and allowed to stand at room temperature for up to 6 hours. Cytotoxic activity was analyzed at points 2 hours, 5 hours, and 6 hours after thawing.
  • NK cells and K562 cells were added to a 96-well plate (IWAKI, 4870-800SP) so that the cell ratio was 1: 1 by the method described in Example 9-1 (b), and then mixed.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours.
  • the number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells was counted, suspended in STEM-CELLBANKER so as to be 4x10 7 cells / mL, and -80 ° C. It was cryopreserved in.
  • Highly active NK cells frozen for 48 hours or more were thawed in a water bath at 37 ° C., diluted 10-fold with Plasma-Lyte A containing 3000 units / mL IL-2, and allowed to stand at room temperature for up to 4 hours.
  • Viability transition Thawed cells were mixed well at each point , 1x10 5 cells were separated, measured by the method described in the staining method with 7-AAD, and analyzed with FlowJo software.
  • cytotoxic activity a group in which NK cells and K562 cells were reacted, a group in which only K562 cells were used as a negative control, and a group in which K562 cells were fixed with 10% formalin were prepared as a positive control.
  • NK cells The required amount of NK cells was collected based on the number of viable cells at the time of freezing, and then adjusted to a concentration of 1x10 6 cells / mL with 10% FBS / RPMI1640.
  • K562 cells were suspended in serum-free RPMI1640 medium, stained with PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit, and then prepared to 2x10 6 cells / mL with 10% FBS / RPMI1640.
  • NK cells and K562 cells were added to and mixed in a 96-well plate (IWAKI, 4870-800SP) so that the cell ratio was 1: 2, 1: 1, 2: 1, 4: 1, 37 ° C, 5%. Reacted under CO 2 for 2 hours. After completion of the reaction, measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and analysis was performed with FlowJo software to calculate the cytotoxic activity rate (% Lysis).
  • NK cells and K562 cells were prepared by the method described in b).
  • Cell damage activity (1), and 96-well plates (IWAKI, 4870-800SP) were prepared so that the cell ratio of NK cells and K562 cells was 1: 1.
  • the cells were reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours, 4 hours, 6 hours and 8 hours.
  • measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and analysis was performed with FlowJo software to calculate the cytotoxic activity rate (% Lysis).
  • cytotoxic activity was measured. Specifically, NK cells and K562 cells were added to a 96-well plate (IWAKI, 4870-800SP) so as to have a cell ratio of 1: 1 and mixed, and then reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours. rice field. After completion of the reaction, measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and analysis was performed with FlowJo software to calculate the cytotoxic activity rate (% Lysis).
  • Example 10 (10-1) Culturing method of highly active NK cells, counting the number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedures described in recovery method 1 and recovery method 2, 1x10 7 cells / mL (1.5 mL tube). Suspend in STEM-CELLBANKER to obtain recovery method 1, i.e. wash with PBS at the time of recovery), 4x10 7 cells / mL (5 mL vial; recovery method 2, i.e. wash with KBM501 medium at the time of recovery), -80 It was cryopreserved at ° C. Highly active NK cells frozen for 48 hours or longer were thawed at room temperature.
  • Plasma-Lyte A or KBM501 medium Immediately after the thawed cells are completely dissolved, 10 times in Plasma-Lyte A or KBM501 medium at 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 25 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes. It was diluted and allowed to stand at room temperature for up to 180 minutes. After diluting to 180 minutes, the measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and the analysis was performed with FlowJo software.
  • Plasma-Lyte A or KBM501 medium Immediately after the thawed cells are completely dissolved, 10 times in Plasma-Lyte A or KBM501 medium at 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 25 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes. It was diluted and allowed to stand at room temperature for up to 180 minutes. After diluting to 180 minutes, the measurement was performed by the method described in the staining method using 7-AAD, and the analysis was performed with FlowJo software.
  • Example 11 1x10 7 cells / mL (1.5 mL tube), 4x10 7 cells / The cells were suspended in STEM-CELLBANKER so as to be mL (5 mL vial), and cryopreserved at -80 ° C. Highly active NK cells frozen for 48 hours or longer were thawed in a water bath at 37 ° C. Immediately after it was completely dissolved, it was diluted 10-fold in Plasma-Lyte A or KBM501 medium and allowed to stand at room temperature for up to 6 hours. Immediately after dilution, 1x10 5 cells were fractionated at points of 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 6 hours, measured by the method described in the staining method with 7-AAD, and analyzed with FlowJo software.
  • Example 12 (12-1) Count the number of viable cells of highly active NK cells obtained by the procedure described in the method for culturing and recovering highly active NK cells, and suspend them with STEM-CELL BANKER so as to be 4x10 7 cells / mL. It became turbid and was cryopreserved at -80 ° C. Highly active NK cells frozen for 48 hours or longer were thawed in a water bath at 37 ° C. Immediately after complete dissolution, Plasma-Lyte A was diluted 10-fold with 80%, 50% and 10% Plasma-Lyte A diluted with Ultra Pure Distilled Water (invitrogen, 10977-015) at room temperature and 37 ° C, respectively.
  • Ultra Pure Distilled Water invitrogen, 10977-015
  • Plasma-Lyte A was diluted with physiological saline and diluted 10-fold with 80%, 50%, 10% Plasma-Lyte A, 3 at room temperature and 37 ° C, respectively. It was left to stand for hours.
  • Plasma-Lyte A was diluted with physiological saline or diluted 10-fold with physiological saline, and allowed to stand at room temperature and 37 ° C for up to 3 hours, respectively.
  • (12-7) The cells were treated and analyzed in the same manner as in (12-6). However, the cells were diluted 10-fold with each solution and allowed to stand at 37 ° C. for up to 3 hours.
  • Viability could be maintained with the NaCl solution regardless of whether the solution used for thawing was hypotonic or hypertonic. Further, even with an isotonic solution using a monosaccharide or a polysaccharide, Viability could be maintained at room temperature or for a short period of time. On the other hand, 100 mM MgCl 2 was inferior in Viability.

Abstract

高活性NK細胞に適用可能な、高い生存率と高い活性を維持したまま、凍結保存し、融解する方法を提供することを課題とする。以下の工程を含む、細胞の処理方法：（1）体外で活性化した細胞を、細胞培養用の培地で回収し；（2）回収した細胞を凍結保存のための液に懸濁し；（3）懸濁した細胞を、凍結する。工程（1）は、好ましくは、胆汁酸およびフェニル酪酸からなる群より選択されるいずれかを添加した培地による処理を含む。

Description

高活性ＮＫ細胞の処理方法
　本発明は、高い細胞傷害活性を有する細胞の凍結保存方法に関する。
　NK細胞は腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶において重要である。2017年8月には米国において、小児および若年成人の再発・難治性B細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）を適応症として、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法が承認されたが、近年ではCAR-Tに代わりCAR-NKの臨床応用が拡大しつつある（非特許文献1）。
　患者に細胞を投与しようとするときには、拒絶反応が起こらないように、患者自身から採取した細胞を用いることがまず検討される。しかし、患者の状態によっては治療に必要な量の細胞の採取が難しいことがある。また体外で活性化し、増殖できる程度には個人差があり、増殖活性化が困難なケースが存在する。加えて、細胞の活性化・増殖には一定期間を要するため、直ちに治療が開始できないという問題がある。この点、前もって細胞を活性化しておき、投与に備えて保存しておくことができれば望ましい。
　細胞を保存する方法としては、短時間保存の場合は凍結を行わずに懸濁状態で保存する方法が知られており（例えば、特許文献1）、また長時間保存の場合は凍結を行う保存方法が知られている（例えば、特許文献2）。さらに細胞を凍結し、融解後においても高い生存率を維持した細胞が得られるとして、ナトリウム塩、カリウム塩、糖、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩および/または炭酸塩を含有する凍結のための溶液を用いることが検討されている（特許文献3）。
特開2006-230396号公報 特開2002-233356号公報 WO2011/021618
Liu E, et al. N Engl J Med. 2020;382:545-53
　しかしながら、従来のジメチルスルホキシドのような保護剤を用いる凍結方法では、T細胞系や初代NK細胞の保存は可能だが、細胞傷害活性の高いNK細胞には十分でなく、凍結融解操作によって、その活性と生存率が著しく低下する。これは、プログラムフリーザー、細胞密度調整、デキストラン、アルブミン、またはカルボキシル化ポリ-L-リジン等の添加等では解決不可能であった。そして一定量の細胞が死ぬことを前提に投与用細胞のパッケージングを行うと、解凍後には再活性化培養のための工程が必要となり、得られた細胞はさらに洗浄することが必須となる。そのため、凍結され、ストックされた高活性NK細胞は、臨床用の細胞を扱う細胞培養加工施設（CPC）の基準を満たす施設でなければ利用できない現状がある。
　本発明の課題は、高活性NK細胞に適用可能な、高い生存率と高い活性を維持したまま、凍結保存し、解凍する方法を提供することにある。
　本発明は、以下を提供する。
［1］以下の工程を含む、細胞の処理方法：
（1）体外で活性化した細胞を、細胞培養用の培地で回収し；
（2）回収した細胞を凍結保存のための液に懸濁し；
（3）懸濁した細胞を、凍結する。
［2］工程（1）が、胆汁酸およびフェニル酪酸からなる群より選択されるいずれかを添加した培地による処理を含む、［1］に記載の方法。
［3］さらに以下の工程を含む、［1］または［2］に記載の方法：
（4）凍結保存した細胞を、解凍し、解凍溶媒Iに懸濁する。
［4］　解凍溶媒Iが、以下を含む水溶液である、［1］～［3］のいずれか1項に記載の方法：
・塩化ナトリウム　9.00 ～108mM、　
・グルコン酸ナトリウム　2.30～27.7mM、
・酢酸ナトリウム　2.70～32.5mM、
・塩化カリウム　0.496～5.96mM、および
・塩化マグネシウム　0.148～1.78mM。
［5］　解凍溶媒Iが、以下の少なくとも1つを満たす、［1］～［4］のいずれか1項に記載の方法：
・カルシウムイオンを0.423mM以上の濃度で含まない、
・グルコースを5.55mM以上の濃度で含まない、および
・乳酸塩を27.7mM以上の濃度で含まない。
［6］　以下を含む、高活性NK細胞を懸濁するための液： 
・塩化ナトリウム　9.00 ～108mM、　
・グルコン酸ナトリウム　2.30～27.7mM、
・酢酸ナトリウム　2.70～32.5mM、
・塩化カリウム　0.496～5.96mM、および
・塩化マグネシウム　0.148～1.78mM。
［7］　凍結保存のための液に懸濁して凍結された高活性NK細胞を懸濁するためのものである、［6］に記載の液。
［8］　高活性NK細胞、凍結保存のための液、および［6］に記載された液を含む、医薬組成物。
［9］　以下の工程を含む、細胞を含む医薬組成物の製造方法：
（1）体外で活性化した細胞を、細胞培養用の培地で回収し；
（2）回収した細胞を凍結保存のための液に懸濁し；
（3）懸濁した細胞を、凍結する。
［10］　工程（1）が、胆汁酸およびフェニル酪酸からなる群より選択されるいずれかを添加した培地による処理を含む、［9］に記載の製造方法。
Mito-FerroGreen反応後の各種細胞のフローサイトメーター解析結果。高活性NK細胞は鉄の含有量が多く、Ferroptosis誘導が起こる可能性が疑われる。 高活性NK細胞の、凍結解凍時の光学顕微鏡写真。MP：　Methylprednisolone、Dex：　Dexamethasone。高活性NK細胞の凍結融解でViabilityが顕著に低下することが確認された。 高活性NK細胞の解凍時のViability。解凍時にPlasma-Lyte　Aで希釈するとViabilityが改善した。ただし、KBM501培地にグルコン酸を添加した場合は、改善は見られなかった。Lacto＝ラクトリンゲル 図1-3の続き 高活性NK細胞の解凍時のViability。解凍時にPlasma-Lyte　Aで希釈するとViabilityが改善するが、40％　Serum（ヒトAB型血清）を含むPlasma-Lyte　Aで希釈するとViabilityは悪化した。 高活性NK細胞の一定時間静置後の生細胞数およびViability（右）と細胞傷害活性（左）。Plasma＝Plasma-Lyte　A 高活性NK細胞の凍結前処理の影響。凍結前に4-PBAを添加したKBM501で処理することにより、解凍時のViabilityが改善された。 2時間前処理後、凍結、解凍した高活性NK細胞の回収率。凍結前に4-PBAまたはTUDCAを添加したKBM501培地で処理することにより、解凍時のViabilityが改善された。 2時間前処理後、凍結、解凍した高活性NK細胞の細胞傷害活性。解凍後の細胞を懸濁する液をPlasma-Lyte　Aとした場合、1時間および3時間の双方の時点でTUDCA濃度依存的に細胞傷害活性の改善がみられた。 図6-1の続き 2時間前処理後、凍結、解凍した高活性NK細胞の細胞傷害活性。前処理時のTUDCAの濃度幅を広げて行った。TargetはK562細胞であり、E：T＝2：1、2時間の条件で行った。NK細胞の細胞数は凍結前カウントに基づいて算出した。各グラフとも、1.解凍直後、2.Plasma-Lyte　A　1時間、3.Plasma-Lyte　A　3時間、4.Plasma-Lyte　A　1時間　+　KBM501　2時間 解凍後の高活性NK細胞を用いた固形腫瘍モデルでの評価（3D　killing　assay）の結果。 7-ADD染色後の細胞のフローサイトメーター解析。解凍後、所定の溶媒で10倍希釈し、室温で2時間（右）、または37℃で3時間（左）インキュベートした。 7-ADD染色後の細胞のフローサイトメーター解析。回収時はPBSで洗浄するか（左）、またはKBM501培地で洗浄し（右）、解凍後、所定の溶媒で10倍希釈し、37℃で3時間インキュベートした。 7-ADD染色後の細胞のフローサイトメーター解析。解凍後、様々な溶媒で10倍希釈し、37℃で3時間インキュベートした。 7-ADD染色後の細胞のフローサイトメーター解析。回収時はPBSで洗浄するか（左）、またはKBM501培地で洗浄し（右）、解凍後、所定の溶媒で10倍希釈し、37℃で3時間インキュベートした。 7-ADD染色後の細胞のフローサイトメーター解析。回収時はPBSで洗浄するか（左）、またはKBM501培地で洗浄し（右）、解凍後、所定の溶媒で10倍希釈し、37℃で3時間インキュベートした。 洗浄・凍結・融解後の高活性NK細胞を、投与形態にて室温で0～4時間静置した際のViability推移（A）、細胞傷害活性（B）：　Target＝K562，　E：T＝1：2～4：1，　2時間、細胞傷害活性（C）：　Target＝K562，　E：T＝1：1，　2～8時間。 図9-1の続き 洗浄・凍結・融解後の高活性NK細胞の細胞傷害活性。投与形態にて各時間、室温で静置した。Target＝K562、E：T＝1：1、2時間 Viability推移。KBM501培地またはPBS洗浄・凍結後の高活性NK細胞を、室温で解凍し、希釈操作を行わずに各時間室温で静置し、その後KBM501培地またはPlasma-Lyte　Aで10倍希釈し、7-AADによる染色を行い、FlowJoソフトウェアで解析した（左）。KBM501培地またはPBS洗浄・凍結後の高活性NK細胞を、37℃で解凍後、希釈操作を行わずに各時間室温で静置し、その後KBM501培地またはPlasma-Lyte　Aで10倍希釈し、7-AADによる染色を行い、FlowJoソフトウェアで解析した（右）。 Viability推移。KBM501培地またはPBS洗浄・凍結後の高活性NK細胞を、37℃で解凍し、KBM501培地またはPlasma-Lyte　Aで10倍希釈した後、室温で0～6時間静置し、その後7-AADによる染色を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。 Viability推移。滅菌蒸留水で段階希釈したPlasma-Lyte　Aでの希釈、および37℃での静置による影響。各処理後の細胞を、7-AADによる染色を行い、FlowJoソフトウェアで解析した（以下の図において同じ）。 図12-1の続き Viability推移。生理食塩水で段階希釈したPlasma-Lyte　Aでの希釈、および室温または37℃での静置による影響。 図12-3の続き Viability推移。生理食塩水で段階希釈したPlasma-Lyte　A、または生理食塩水での希釈、および室温または37℃での静置による影響。 図12-5の続き Viability推移。各溶媒での希釈、および室温での静置による影響。 Viability推移。各溶媒での希釈、および37℃での静置による影響。 Viability推移。回収時にPBSで洗浄した場合の、各溶媒での希釈、および室温での静置による影響。 Viability推移。回収時にPBSで洗浄した場合の、各溶媒での希釈、および37℃での静置による影響。
　本発明に関し、mMは、特に記載した場合を除き、mmol/Lと同じ意味で用いている。数値範囲をx～yで表すとき、その範囲は両端の値xおよびyを含む。
　本発明は、高い細胞傷害活性を有する細胞の凍結保存方法に関する。
［適用できる細胞］
　本発明は、種々の細胞に適用することができる。本発明が好ましく適用できる細胞の一つは、体外で何らかのサイトカインを用いることによる活性化操作を経た細胞であり、このような細胞には、細胞傷害活性の高いNK細胞（高活性NK細胞）等が含まれる。活性化操作は、典型的にはインターロイキン（IL）-2を含む培地を用いて細胞をインキュベートすることに拠る。
　一般に、NK細胞とは、T細胞受容体（TCR）、T細胞普遍的マーカーであるCD3、および膜免疫グロブリンであるB細胞受容体を発現していない大型の顆粒性リンパ球であり、通常ヒトではCD16陽性であり、かつCD56陽性である。NK細胞であるか否かは、当業者であれば、細胞表面マーカーの発現パターン等に基づき容易に判断することができる。NK細胞は、細胞傷害活性を有し、この細胞傷害活性の有無や程度は、公知の種々の方法で測定することができる。NK細胞は、末梢血NK細胞、臍帯血NK細胞、初代NK細胞、培養NK細胞、高活性NK細胞を包含しうる。
（原材料）
　本発明が好ましく適用できる高活性NK細胞等の原材料は、末梢血、臍帯血、骨髄および/またはリンパ節、アフェレーシス法により採取された血液（アフェレーシス血液）であってよい。また原材料は、胚性幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹（iPS）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞、臍帯血由来の造血幹細胞、末梢血由来の造血幹細胞、骨髄血由来の造血幹細胞、臍帯血単核球、末梢血単核球からなる群から選択される少なくとも1種類の細胞から調製されたものであってもよい。原材料のドナーは、高活性NK細胞等による免疫治療を受ける患者自身、該患者の近縁者、または患者とは血縁関係のない健常者である場合がある。ドナーは複数であってもよい。
（培地）
　高活性NK細胞等を培養するために用いる培地は、KBM501培地（コージンバイオ株式会社。IL-2を1，750JRU/ mL含む。）、コスメディウム008（コスモバイオ。IL-2を1，750JRU/ mL含む。）、FKCM101（フコク。IL-2不含、またはIL-2を175IU/mL含む。）、CellGro　SCGM培地（セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）、X-VIVO15培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）、Gibco（登録商標）　CTS（登録商標）　AIM　V（登録商標）　Medium（サーモフィッシャーサイエンティフィック。T細胞および樹状細胞を増殖・操作するための既知組成の無血清培地）、CTS　OpTmizer　T　Cell　Expansion　Basal　Medium（サーモフィッシャーサイエンティフィック。ヒトTリンパ球の成長および増殖用）、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640等を含むが、これらに限定されない。好ましい例は、KBM501培地、FKCM101またはコスメディウム008である。なお、本発明に関し、細胞について培養（する）というときは、特に記載した場合を除き、細胞の生存維持、細胞の増幅、および細胞の活性化からなる群より選択されるいずれかの目的のために細胞を一定時間、培地またはそれに準じた液の中で維持することをいう。処理を特定の温度で一定時間行う場合に、インキュベート（する）ということがある。
　培地には、IL-2が、本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある。IL-2の濃度は、2500IU/mL～2813IU/mLの場合がある。IL-2は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えDNA技術で生産されることが好ましい。IL-2の濃度は、国内標準単位（JRU）および国際単位（IU）で示される場合がある。1IUが約0.622JRUであるから、既存の培地の1750JRU/mLは、約2813IU/mLに相当する。
　上述したIL-2と同時にまたはIL-2に代えて、IL-12、IL-15、およびIL-18からなる群より選択されるいずれかが本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある（非特許文献2：Leong JW et al. Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 463-473）。各々の濃度は、他のサイトカインの有無や濃度に関わらず、1pg/mL～1μg/mLの場合がある。IL-2は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えDNA技術で生産されることが好ましい。
　培地には、被験者の自家血清、BioWhittaker社その他から入手可能なヒトAB型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。自家血清およびヒトAB型血清は1ないし10％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは1ないし10％の濃度で添加されることが好ましい。血清とともに、または血清の代わりに、ヒト血小板溶解物（Human　platelet　lysate：HPL）を添加してもよい。HPLは市販されており、UltraGROTMシリーズ（AventaCell　BioMedical社）等が販売されている。HPLを用いる場合には培地にはさらにヘパリンナトリウムを添加してもよい。
　培地には、NK細胞の培養効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。サイトカインは、上述したIL-2、IL-12、IL-15、およびIL-18のほか、IL-3、IL-7、IL-21、幹細胞因子（SCF）、および/または、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド（Flt3L）の場合がある。これらはいずれも、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えDNA技術で生産されることが好ましい。
　培地は、無血清培地であることが好ましい。無血清培地は、血清アルブミン、トランスフェリン、およびインスリンを含んでいることが好ましい。リンパ球を培養するための無血清培地が開発、市販されており、本発明においてそれらを利用することができる。無血清培地の好ましい例の一つは、基礎培地に、ヒトT細胞の増殖をサポートする組成として市販されているCTS　Immune　Cell　SR（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したものである。
　培地の交換または補充は、目的とする培養効果が得られることを条件として、培養開始後いつ行われてもかまわないが、3～5日毎が好ましい。
　培養の際に用いる培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。培養条件は、NK細胞の培養効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、37℃、5％CO2および飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。培養期間は、目的とする培養効果が得られることを条件として、特に限定されない。
　本発明が好ましく適用できる高活性NK細胞等には、下記の［1］、［2］、［3］および［4］が含まれる。
［1］　下記（1）および（2）の特徴を備えるNK細胞：
（1）CD16陽性、CD56高発現性、かつCD57陰性である。
（2）NKG2C陽性、NKG2A陰性～低発現性、およびCD94陽性である。
　［1］の高活性NK細胞は、CD16高発現性であってもよい。また［1］の高活性NK細胞は、CD16高発現性であるか否かにかかわらず、さらに下記の特徴を備えていてもよい。
（3）該NK細胞をエフェクター細胞（E）とし、K562細胞を標的細胞（T）として混合比（E：T）1：1で共培養した場合の細胞傷害活性が50％以上である。
　［1］の高活性NK細胞は、下記のように表すこともできる：
　健常人由来末梢血単核球から、CD3ビーズ（例えば、CliniMACS　CD3，　ミルテニーバイオテク社，　カタログ番号130-017-601）、LDカラム（例えば、ミルテニーバイオテク，カタログ番号130-042-901）および分離バッファー（例えば、0.5％ヒトAB型血清　（非働化処理したもの）、2mM　EDTAを含むPBS）を用いてCD3陽性細胞を除去した細胞集団を、適切な培地（例えば、5％ヒトAB型血清（非働化処理したもの）を添加したコスメディウム008）で14日間培養して得られ、下記（1）および（3）の特徴を備えるNK細胞：
（1）CD16陽性、CD56高発現性、かつCD57陰性である。
（3）該NK細胞をエフェクター細胞（E）とし、K562細胞を標的細胞（T）として混合比（E：T）1：1で共培養した場合の細胞傷害活性が50％以上である。
［1］の高活性NK細胞の特徴の詳細や、より具体的な製造方法は、特開2018-193303を参照することができる。
［2］　下記の細胞：
　CCR5陽性、CCR6陽性およびCXCR3陽性であり且つCD3陰性である細胞。
　［2］の細胞は、更にCD11c高発現性であってもよい。
　［2］の細胞は、下記のように表すこともできる：
　CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性、Integrin　α1陽性、Integrin　α3陽性およびIntegrin　β3陰性であり且つCD3陰性である細胞。あるいは、CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性、CD11a高発現性およびCD11c高発現性であり且つCD3陰性であり、高発現性は、末梢血から得た、実質的な培養を行なっていないNK細胞の集団における発現との比較により判断される、細胞。
　［2］の細胞は、本発明者らの検討によると、腫瘍塊を形成した固形がんに対し、極めて高い細胞傷害活性を示す。［2］の細胞の特徴の詳細や、より具体的な製造方法は、特開2019-170176を参照することができる。
［3］　下記の方法で得られうる、高活性NK細胞：
　新鮮末梢血から、または凍結アフェレーシス血液から得た単核球にCD3　beads　（例えば、CliniMACS　CD3，　ミルテニーバイオテク，　130-017-601（1x107細胞あたり5μL））、および凍結アフェレーシス血液を使用した場合はさらにCD34　beads（例えば、CliniMACS　CD34，　ミルテニーバイオテク，　130-017-501（1x107細胞あたり2.5μL））を添加・懸濁し、4℃，　15分間インキュベート後、分離バッファー（例えば、0.5％ヒトAB型血清　（56℃で30分の非働化処理したもの）、2　mM　EDTAを含むPBS）を加えてよく懸濁し、遠心する。上清を除去し、LDカラム（例えば、ミルテニーバイオテク，　130-042-901）1カラムあたり最大1x108　cellsまでの細胞数となるように0.5　mLの分離バッファーに懸濁する。分離バッファー　2　mLをあらかじめ添加したのち、LDカラムに細胞懸濁液を添加して、LDカラムからの溶出液を回収した。さらに分離バッファー　1　mLをLDカラムに添加し、溶出液を回収する。回収した液の遠心分離を行い、上清を除去後、末梢血を使用した場合は5x105　cells/mL、凍結アフェレーシス血液を使用した場合は1x106　cells/mLとなるように適切な培地（例えば、5％ヒトAB型血清（56℃で30分の非働化処理したもの）あるいは5％UltraGRO　（AventaCell、HPCPLCRL10）　に2U/mL　ヘパリンナトリウムを添加したもの、のいずれか一方を含むKBM501培地）に細胞を懸濁し、適宜培地交換しながら、14日目まで培養する。
　［3］の高活性NK細胞の、具体的な製造方法は、本明細書の実施例の項を参照することができる。
［4］　［1］～［3］の細胞を得るに際し、IL-2と同時にまたはIL-2に代えて、IL-12、IL-15、およびIL-18からなる群より選択されるいずれかを本発明の目的を達成できる濃度で添加し、培養することにより得られる細胞。このような細胞の具体的な製造方法は、前掲非特許文献2を参照することができる。
　なお以下では、本発明を、高活性NK細胞を用いる場合を例に説明することがあるが、当業者であればその説明に準じて、本発明を、他の、体外で何らかのサイトカインを用いることによる活性化操作を経た細胞を用いる場合についても理解できる。
（細胞傷害活性）
　本発明に関し、高活性NK細胞等について、活性または細胞傷害活性というときは、特に記載した場合を除き、対象細胞（エフェクター細胞、E）の標的細胞（T）に対する溶解能を指す。細胞傷害活性は、エフェクター細胞により死に至った標的細胞の百分率（％）で表すことができ、次式により求められる。
（エフェクター細胞と共培養した場合の細胞死-自然細胞死(陰性コントロール)）/（最大細胞死(陽性コントロール)-自然細胞死(陰性コントロール)）×100
　細胞傷害活性の測定に際しては、一般的には、エフェクター細胞の細胞傷害活性の程度等に応じ、エフェクター細胞と標的細胞の混合比（E：T）、エフェクター細胞と標的細胞の共培養の時間は、用いる細胞の種類や活性の強さに応じて適宜とすることができる。NK細胞をエフェクター細胞とするとき、標的細胞は、K562細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。エフェクター細胞と標的細胞、生細胞と死細胞は、放射性物質、蛍光色素等で標識した抗体等の試薬により、区別し、また定量することができる。NK細胞をエフェクター細胞とするときの細胞傷害活性は、例えばK562細胞を標的細胞とし、E：T＝1：0.05～10、好ましくは1：0.1～5とし、インキュベート時間を0.5～18時間、好ましくは1～12時間の条件で測定することができる。
　本発明に関し、NK細胞等の活性が高いというときは、特に記載した場合を除き、標的細胞をK562細胞とし、E：T＝2：1で混合し、1～3時間、より特定すると2時間、共培養した場合の細胞傷害活性が50％以上であることをいう。活性は、60％以上であることが好ましく、70％以上であることがより好ましい。
［回収］
　本発明においては、後述する凍結工程に先立ち、凍結すべき高活性NK細胞等を培養系から回収する。回収は、遠心分離して培地と細胞を分離することにより行うことができる。必要に応じ、培養系に適切な濃度のEDTAを加え、接着した細胞を培養容器表面から剥離してもよい。また、培地をしたあとの培養容器表面を適切な溶液で洗浄して、残った細胞を得てもよい。得られた細胞は、必要に応じ、適切な溶液で洗浄し、適切な溶液に懸濁する。
　回収工程においては、細胞の剥離や洗浄のために、培地、等張液、緩衝液等の溶液を用いることができる。使用可能な培地の例として、KBM501培地、コスメディウム008、FKCM101、CellGro　SCGM培地、X-VIVO15培地、Gibco（登録商標）　CTS（登録商標）　AIM　V（登録商標）　Medium、CTS　OpTmizer　T　Cell　Expansion　Basal　Medium、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640が挙げられる。等張液とは、体液（血漿）の浸透圧（285±5mOsm/L）とほぼ等しい浸透圧をもつ液をいい、本発明に関しては、浸透圧が285±13mOsm/Lである液をいう。例えば、Plasma-Lyte　Aの浸透圧は、294mOsm/Lであり、PBS（-）の浸透圧は、280±4mOsm/L（氷点降下法）である。使用可能な等張液の例として、Plasma-Lyte　A（Baxter）、生理食塩水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、　酢酸リンゲル液　、重炭酸リンゲル液等）、5％グルコース水溶液が挙げられる。使用可能な緩衝液の例として、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate-buffered　saline：　PBS）、Tris塩酸緩衝液、Tris酢酸緩衝液、HEPES緩衝液が挙げられる。
　回収工程において用いる溶液の好ましい例の一つは培地であり、より好ましくはヒトリンパ球培養用培地である。ヒトリンパ球培養用培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、組換え型ヒトインスリン、および組換え型ヒトIL-2を含んでいてもよい。このような培地の好ましい例は、KBM501培地、FKCM101またはコスメディウム008である。KBM501培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、組換え型ヒトインスリン、組換え型ヒトIL-2を含み、それ以外のタンパク質は含まない。また、KBM501培地は、抗生物質（カナマイシン）、NaHCO3、L-Glutamine、pH調整剤を含む。
　回収工程において、PBS（-）を用いると、解凍時の細胞の生存率が低下し、好ましくない場合がある。PBS（-）は、典型的には、塩化ナトリウム136.9mM、塩化カリウム2.68　mM、リン酸水素二ナトリウム8.1mM、リン酸水素カリウム1.47mMを含む。
［前処理］
　本発明においては、後述する凍結工程に先立ち、凍結すべき高活性NK細胞等を前処理してもよい。前処理とは、回収した細胞を添加剤を含む溶液に懸濁することである。前処理は、添加剤を含む溶液で回収することを含む。
　前処理に用いる添加剤としては、胆汁酸およびフェニル酪酸からなる群より選択されるいずれかを用いることができる。胆汁酸の例は、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）、ウルソデオキシコール酸（UDCA）、ケノデオキシコール酸、コール酸、ヒオデオキシコール酸、デオキシコール酸、7-オキソリトコール酸、リトコール酸、ヨードデオキシコール酸、イオコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸またはその類似体、誘導体である。フェニル酪酸の例は、4-フェニル酪酸（4-PBA）、グルセリル（トリ-4-PBA）、フェニル酢酸、2-POAA-OMe、2-POAA-NO2、2-NOAAまたはその薬学的に許容される、塩、類似体、誘導体もしくはプロドラッグである。前処理に用いる添加剤の特に好ましい例は、TUDCAおよび4-PBAからなる群より選択されるいずれかである。
　前処理のための添加剤として胆汁酸を用いる場合は、濃度は適宜としうるが、好ましくは100～5000μMであり、より好ましくは200～2500μMであり、さらに好ましくは400～1000μMである。このような範囲は、TUDCAを用いる場合に特に適している。前処理のための添加剤としてフェニル酪酸を用いる場合、濃度は適宜としうるが、好ましくは1～1000μMであり、より好ましくは5～500μMであり、さらに好ましくは10～100μMである。このような範囲は4-PBAを用いる場合に特に適している。
　前処理のための添加剤の他の例は、ジメチルスルホキシド（DMSO）である。濃度は適宜としうるが、好ましくは0.5～15％であり、より好ましくは1～12.5％であり、さらに好ましくは2～10％である。
　前処理のための溶液は、回収の際に用いる溶液と同様、培地、等張液、緩衝液等の溶液であり得る。前処理において用いる溶液の好ましい例の一つは培地であり、より好ましくはヒトリンパ球培養用培地であり、さらに好ましくはKBM501培地、FKCM101またはコスメディウム008である。前処理に用いる培地はまた、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、組換え型ヒトインスリン、および組換え型ヒトIL-2を含んでいてもよく、抗生物質（カナマイシン）、NaHCO3、L-Glutamine、pH調整剤を含んでいてもよい。
　前処理のための時間は、特に限定されない。前処理のために細胞を懸濁した後数分～数時間、例えば5分～4時間、より好ましくは30分～3時間、懸濁液を静置してもよい。静置は環境温度（例えば1～30℃、典型的には15～25℃）で行ってもよく、CO2インキュベーター中（例えば36～42℃、典型的には37℃）で行ってもよい。
　前処理の際の細胞密度は適宜とすることができるが、細胞の維持に適した細胞密度とするとよい。具体的には、1x105～1x107　cells/mLであり、好ましくは2x105～5x106　cells/mLであり、より好ましくは5x105～2x106　cells/mLである。
　特に好ましい態様において、前処理は、TUDCAを400～1000μM、または4-PBAを10～100μM添加したKBM501培地、FKCM101またはコスメディウム008に、細胞密度が5x105～2x106cells/mLとなるように懸濁することである。このとき、37℃、5％　CO2下で30分～3時間インキュベートするとよい。
　本発明において前処理は必須ではないが、高活性NK細胞等を凍結前に4-PBAまたはTUDCAを添加したKBM501培地で前処理することにより、前処理しなかった場合に比較して、細胞を解凍した際の生存率（回収率ということもできる）が改善され得る。
［凍結］
　本発明においては、回収され、好ましくは前処理された細胞は、通常の手順によって、凍結される。具体的には、必要に応じ細胞数や生存率を確認し、遠心分離して上清を除去した後、適切な細胞密度になるように凍結保存液に細胞を懸濁する。細胞懸濁液を凍結保存用の容器に分注した後、-80℃のディープフリーザーで凍結し、保存する。必要に応じ、液体窒素タンクで凍結保存する。
　本発明において用いることのできる凍結保存液は、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、炭酸水素塩、炭酸塩、および凍害保護剤を含有しうる。
　使用可能なナトリウム塩は、溶媒に溶解した際にナトリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等であり得る。ナトリウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、1種類としては塩化ナトリウムが、複数種類としては塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが好適に使用される。ナトリウム塩含有量は特に限定されないが、凍結保存液に含まれる全ナトリウムイオンの終濃度として、好ましくは0.01～5000mMであり、より好ましくは0.1～1000mMであり、さらに好ましくは1～300mMである。
　使用可能なカリウム塩は、溶媒に溶解した際にカリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等であり得る。カリウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化カリウムが好適に使用される。カリウム塩含有量は特に限定されないが、凍結保存液に含まれる全カリウムイオンの終濃度として、好ましくは0.01～5000mMであり、より好ましくは0.1～1000mMであり、さらに好ましくは1～100mMである。
　使用可能な炭酸水素塩は、溶媒に溶解した際に炭酸水素イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。使用可能な炭酸塩は、溶媒に溶解した際に炭酸イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。これら炭酸水素塩および/または炭酸塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、炭酸水素ナトリウムが好適に使用される。炭酸水素塩および/または炭酸塩の含有量は特に限定されないが、凍結保存液に含まれる炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度として、好ましくは0.01～1000mMであり、より好ましくは0.1～500mMであり、さらに好ましくは1～100mMである。
　凍結保存液におけるナトリウムイオンとカリウムイオンの濃度比（ナトリウムイオン/カリウムイオン）は、好ましくは1/1000～1000/1、より好ましくは1/100～100/1、さらに好ましくは1/10～100/1、さらに好ましくは1/1～100/1、さらに好ましくは10/1～50/1である。
　使用可能な糖類は、単糖、オリゴ糖または糖アルコールであり、例えば、単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、オリゴ糖としてはトレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、糖アルコールとしてはキシリトール、ソルビトール等が挙げられる。これらの糖類は、1種類または複数種類を組み合わせてもよいが、本発明においては好ましくは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、およびアラビノースからなる群より選択される少なくとも1種類の糖類であり、より好ましくはグルコースである。糖類の含有量は、凍結保存液中、好ましくは0.01～100g/L、より好ましくは0.1～100g/L、さらに好ましくは0.25～50g/Lである。
　使用可能な凍害保護剤の例として、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ハイドロキシエチルスターチ（HES）、エチレングリコール、グリセロール等が挙げられる。凍害保護剤は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、DMSOおよびハイドロキシエチルスターチからなる群より選択されるいずれかが好適に使用される。凍害保護剤としてDMSOおよびハイドロキシエチルスターチを併用する場合、総含有量は前記範囲内に含まれることが好ましく、かつそれぞれの濃度が、DMSO濃度は、好ましくは0.01～50％、より好ましくは1～30％、さらに好ましくは2～15％であり、ハイドロキシエチルスターチ濃度は、好ましくは0.01～50％、より好ましくは1～30％、さらに好ましくは2～15％である。
　本発明の好適な態様においては、上記の本発明の細胞の凍結保存方法に使用される溶液の必須の成分に加えて、タンパク質、マグネシウム塩およびカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに含有させてもよい。使用可能なタンパク質は、具体的には、血清アルブミン、血清グロブリン等が挙げられる。また血清アルブミンとしては、ヒト血清アルブミン、またはウシ血清アルブミンが挙げられる。本発明において、ヒト血清アルブミンが好適である。タンパク質の含有量は、凍結保存液中、好ましくは0.01～50％、より好ましくは1～30％、さらに好ましくは2～15％である。使用可能なマグネシウム塩は、溶媒に溶解した際にマグネシウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等を用いることができる。マグネシウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化マグネシウムが好適に使用される。マグネシウム塩含有量は特に限定されないが、凍結保存液に含まれる全マグネシウムイオンの終濃度として、好ましくは0.01～10mMであり、より好ましくは0.1～5mMである。使用可能なカルシウム塩は、溶媒に溶解した際にカルシウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等を用いることができる。カルシウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化カルシウムが好適に使用される。カルシウム塩含有量は特に限定されないが、凍結保存液に含まれる全カルシウムイオンの終濃度として、好ましくは0.01～10mMであり、より好ましくは0.1～5mMである。また、凍結保存液には、上記の成分以外に、細胞への傷害性のない物質、例えば、ビタミン類、アミノ酸類等をさらに含有させてもよい。また凍結保存液は、上記の成分以外に、pH調整や緩衝作用を発揮する観点から、リン酸イオンを含有してもよい。
　凍結保存液の浸透圧は凍結時に細胞に対して損傷を与えない範囲であることが望ましく、凍結時に細胞への成分の浸透性を高めること、および氷晶形成阻害の観点から、例えば500～8000mOsm/Lであり、1000～7500mOsm/Lであってもよく、1500～7000mOsm/Lであってもよく、1800～5000mOsm/Lであってもよい。凍結保存液のpHは、細胞に対して損傷を与えない範囲であることが望ましく、例えば、3.0～10.0であり、4.5～9.0であることがより好ましい。
　本発明においては、市販の凍結保存用液を用いてもよい。使用可能な製品の例として、細胞・組織用凍結保存液セルバンカーシリーズ（STEM-CELLBANKER（登録商標））、より特定するとSTEM-CELLBANKER（ZENOAQ、CB045）を挙げることができる。
　凍結の際の細胞は、対数増殖期にあるものであることが好ましい。
　凍結の際の細胞密度は適宜とすることができるが、具体的には、1x106～2x108cells/mLであり、好ましくは2x106～1x108cells/mLであり、より好ましくは1x107～5x107cells/mLである。好ましい態様の一つにおいては、細胞は、5mLの容量の容器に、4x107cells/mLで保存される。高活性NK細胞の凍結出荷に際して高密度凍結が可能であることは、製品をよりコンパクトにし、輸送コストの低減に資する。
［解凍］
　本発明においては、凍結保存された細胞は、種々の手順によって解凍できる。例えば、細胞の入った凍結保存用の容器を37℃の温浴などで、必要に応じ振りながら迅速に解凍できる。あるいは、冷凍庫から取り出した後に積極的な加温をせず、室温に放置して自然解凍できる。解凍後の細胞は適切な解凍時溶媒Iに混和する。必要に応じ、遠心分離を行って上清を除去し、適量の解凍時溶媒IIに懸濁し、培養や活性化処理を行うことができる。
（解凍時溶媒I）
　本発明においては、凍結保存のための液に懸濁して凍結した細胞を、解凍し、凍結保存のための液とともに希釈する際に用いる溶液を、解凍時溶媒Iという。本発明により回収し、必要に応じ前処理を行って凍結保存された細胞に対しては、解凍時溶媒Iとして種々のものを用いうる。
　好ましい態様の一つにおいて、解凍時溶媒Iは、ナトリウム塩、カリウム塩、グルコン酸塩、および酢酸塩を含有しうる。さらにマグネシウム塩を含んでいてもよい。
　解凍時溶媒Iに使用可能なナトリウム塩は、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等であり得る。ナトリウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。解凍時溶媒Iは、好ましくは、塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムからなる群より選択されるいずれかを含み、より好ましくは、塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムを含む。解凍時溶媒Iのナトリウム塩の含有量は、全ナトリウムイオンの終濃度として、好ましくは14.0～200mMであり、より好ましくは28.0～182mMであり、さらに好ましくは70.0～168mMである。あるいは、塩化ナトリウムとして、9.00 ～108mM、グルコン酸ナトリウムとして2.30～27.7mM、酢酸ナトリウムとして、2.70～32.5mM含むことが好ましい。
　解凍時溶媒Iに使用可能なカリウム塩は、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等であり得る。カリウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。解凍時溶媒Iは、好ましくは、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、および酢酸カリウムからなる群より選択されるいずれかを含み、より好ましくは、塩化カリウムを含む。解凍時溶媒Iのカリウム塩の含有量は、全カリウムイオンの終濃度として、好ましくは0.50～8.0mMであり、より好ましくは1.0～7.0mMであり、さらに好ましくは2.5～6.0mMである。あるいは、塩化カリウムとして、0.496～5.96mM含むことが好ましい。
　解凍時溶媒Iに使用可能なグルコン酸塩は、溶媒に溶解した際にグルコン酸イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム等が挙げられる。解凍時溶媒Iは、好ましくはグルコン酸ナトリウムを含む。解凍時溶媒Iのグルコン酸塩の含有量は、全グルコン酸イオンの終濃度として、好ましくは2.3～32.3mMであり、より好ましくは4.6～29.9mMであり、さらに好ましくは12.5～27.7mMである。
　解凍時溶媒Iに使用可能な酢酸塩は、溶媒に溶解した際に酢酸イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。解凍時溶媒Iは、好ましくは酢酸ナトリウムを含む。解凍時溶媒Iの酢酸塩の含有量は、全酢酸イオンの終濃度として、好ましくは2.7～37.8mMであり、より好ましくは5.4～35.1mMであり、さらに好ましくは13.5～32.5mMである。
　このような解凍時溶媒Iとして、市販の等張液を用いてもよい。使用可能な製品の例として、Plasma-Lyte　A、およびそれを水で希釈した液を挙げることができる。具体的には以下を含む液である。
・塩化ナトリウム　9.00 ～108mM　
・グルコン酸ナトリウム　2.30～27.7mM
・酢酸ナトリウム　2.70～32.5mM
・塩化カリウム　0.496～5.96mM
・塩化マグネシウム　0.148～1.78mM
　別の好ましい態様において、解凍時溶媒Iは、ナトリウム塩のみを含有しうる。このような解凍時溶媒Iに使用可能なナトリウム塩は、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩または有機酸塩等であり得る。ナトリウム塩は、1種類または複数種類を組み合わせてもよい。解凍時溶媒Iは、好ましくは、塩化ナトリウムのみを含む。解凍時溶媒Iのナトリウム塩の含有量は、全ナトリウムイオンの終濃度として、好ましくは15.4～216mMであり、より好ましくは30.8～200mMであり、さらに好ましくは70.0～185mMである。
　このような解凍時溶媒Iとして、生理食塩水またはそれを水で希釈した液を用いてもよい。
　凍結保存のための液とともに解凍時溶媒Iに懸濁された細胞は、そのまま投与に用いることができる。投与に用いるとの観点からは、凍結保存のための液と解凍時溶媒Iとを混合した後の、混合液が等張となる（体液とほぼ等しい浸透圧をもつ、具体的には285±13mOsm/Lである）ことが好ましい。凍結保存のための液は、好ましい態様においては高張液（例えば、1500～7000mOsm/L）であるため、解凍時溶媒Iは浸透圧の低い液であってもよい。当業者であれば、凍結保存のための液の解凍時溶媒Iによる希釈倍率を考慮し、解凍時溶媒Iの成分濃度を適宜決定できる。
　またここでの希釈倍率が高い（例えば15倍以上）場合は、凍結保存のための液の組成が混合液の浸透圧に与える影響が少ないといえるため、解凍時溶媒Iとしては、等張の液を用いることが好ましい。このような観点からは、解凍時溶媒Iは、具体的には以下を含む液である。
・塩化ナトリウム　85.5 ～94.5mM　
・グルコン酸ナトリウム　21.8～24.2mM
・酢酸ナトリウム　25.6～28.5mM
・塩化カリウム　4.71～5.21mM
・塩化マグネシウム　1.40～1.55mM
　あるいは、解凍時溶媒Iは、具体的には以下を含む液である。
・塩化ナトリウム　146.3 ～161.7mM　
　いずれの組成であっても、解凍時溶媒Iは、カルシウムイオンを0.423mM以上の濃度で含まないことが好ましい。またいずれの組成であっても、解凍時溶媒Iは、グルコースを5.55mM以上の濃度で含まないことが好ましい。さらにいずれの組成であっても、解凍時溶媒Iは、乳酸塩を27.7mM以上の濃度で含まないことが好ましい。解凍した細胞の生存率または細胞傷害活性が下がる場合があるからである。このような意味で、RPMI培地、Hanks’Balanced　Salt　Solution（HBSS）（+）、および乳酸リンゲル液は、解凍時溶媒Iとして用いるには適さない場合がある。
　いずれの組成であっても、解凍時溶媒Iは、40％以上の濃度では血清を含まないことが好ましく、血清を一切含まないことがより好ましい。血清を含むと、細胞の生存率が低下する場合があるからである。
　解凍時溶媒Iに懸濁する際の細胞密度は適宜とすることができるが、細胞の維持に適した細胞密度とするか、または投与に適した細胞密度とするとよい。具体的には、1x105～1x107　cells/mLであり、好ましくは2x105～5x106　cells/mLであり、より好ましくは5x105～2x106　cells/mLである。
　解凍時溶媒I中で、細胞は比較的長時間維持できる。解凍時溶媒Iに細胞を懸濁した後数分～数時間、例えば5分～6時間、より好ましくは30分～4時間、懸濁液を静置してもよい。静置は環境温度（例えば1～30℃、典型的には15～25℃）で行ってもよく、CO2インキュベーター中（例えば36～42℃、典型的には37℃）で行ってもよい。
（解凍時溶媒II）
　本発明においては、凍結した細胞を解凍時溶媒Iを用いて解凍した後、さらに解凍時溶媒IIを用いて、細胞を培養し、または活性化することができる。本発明においては、解凍時溶媒Iに懸濁した細胞を回収し、培養または活性化等のために再度懸濁するために用いる溶液を、解凍時溶媒IIという。解凍時溶媒IIとしては、目的に応じ、種々のものを用いることができる。
［医薬組成物への利用］
　本発明は、適切な方法で回収され、必要に応じ前処理され、凍結保存された高活性NK細胞等を含む、医薬組成物を提供する。
　本発明により提供される医薬組成物は、高活性NK細胞等に感受性を有するさまざまな疾患の治療および/または予防に適用することができる。このような疾患の例は、がん、または感染症であり、具体的には、皮膚がん、口腔がん、胆嚢がん、胆管がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、神経芽腫、白血病や、ウイルス、細菌等による感染症を含むが、これらに限定されない。なお、本発明者らは、本願の方法で凍結・解凍された細胞を用いて、無治療では30日以内に死滅する大腸がんモデル動物に対する効果を確認している。
　本発明の医薬組成物による細胞療法は、単独か、あるいは外科療法、化学療法、放射線療法、抗体医薬品等と組み合わせて実施される場合がある。
　本発明により提供される医薬組成物の一態様の特長を下記に示す。
（剤形）
　注射剤（細胞懸濁液）
（成分・含量）
　構成細胞：高活性NK細胞等
　含量：6×106個～4.8×109cells/60kg
（副成分）
　複合電解質液　　10～45％
　塩化ナトリウム液　10～45％
　20～30％ヒト血清アルブミン液　5～30％
　ジメチルスルホキシド　2～15％
　その他
あるいは、
　医薬添加物として許容できる凍結保存液　　100％
（調製法）
　凍結された組成物が完全に解凍するまで、37℃の恒温水槽等で解凍する。解凍後速やかに無菌的に、別途準備した医薬添加物として許容できる等張液に懸濁する。
（解凍後の安定性）
　解凍後の有効期間は、室温で保存するとき、6時間、好ましくは4時間である。
［参考例および実施例で共通の方法］
A) 高活性NK細胞の培養方法
原材料1: 末梢血利用の場合
　健常人ボランティアより末梢血を採取し、Ficoll（GEヘルスケア、17144002）を用いた密度勾配遠心により末梢血単核球（PBMCs: Peripheral blood mononuclear cells）を単離した。
原材料2: 凍結アフェレーシス血液の場合
　凍結アフェレーシス血液（HemaCare, PB001CLP）を解凍し、Lovo Cell Processing System（FRESENIUS KABI）を使用して洗浄と濃縮を行い、PBMCsを得た。
　得られたPBMCsにCD3 beads※1、CD34 beads※2（凍結アフェレーシス血液を使用した場合）を添加・懸濁し、4℃, 15分間インキュベート後、分離バッファー※3を加えてよく懸濁し、300 x g、10分間、遠心分離を行った。上清を除去し、LDカラム（ミルテニーバイオテク, 130-042-901）1カラムあたり最大1x108 cellsまでの細胞数となるように0.5 mLの分離バッファーに懸濁した。分離バッファー 2 mLをあらかじめ添加したのち、LDカラムに細胞懸濁液を添加して、LDカラムからの溶出液を回収した。さらに分離バッファー 1 mLをLDカラムに添加し、溶出液を回収した。その後、分離バッファー1 mLでカラムをwashし、回収された液中の細胞数をカウントし、総細胞数を算出した。500 x g、5分間、遠心分離を行い、上清を除去後、原材料1: 末梢血を使用した場合は5x105 cells/mL、原材料2: 凍結アフェレーシス血液を使用した場合は1x106 cells/mLとなるようにKBM501培地※4に懸濁した。培養は、6ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 140675）、T-75フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 156499）または接着培養用バッグ（ニプロ）を使用し、CO2インキュベーターで行った（37℃, 5% CO2）。培養9日目に最終液量が、6ウェルプレートの場合は1ウェルあたり6 mL、T-75フラスコの場合は1フラスコあたり50 mL、バッグの場合は1バッグあたり500mLになるようにKBM501培地を添加し、14日目までインキュベートした。
　以下では、PBMCsからこの培養工程を経ることにより得た細胞を、「高活性化NK細胞様CD3陰性細胞（Highly activated NK cell-like CD3-negative cells）」または単に「高活性NK細胞」と称する。
※1:CliniMACS CD3, ミルテニーバイオテク, 130-017-601(1x107細胞あたり5μL)
※2:CliniMACS CD34, ミルテニーバイオテク, 130-017-501(1x107細胞あたり2.5μL)
※3: 0.5%ヒトAB型血清 (コスモバイオ, 12181301, 56℃で30分の非働化処理したもの)、2 mM EDTA（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 15575-020）を含むPBS（ナカライテスク、14249-24）
※4: 5%ヒトAB型血清（コスモバイオ, 12181301, 56℃で30分の非働化処理したもの)あるいは5%UltraGRO (AventaCell、HPCPLCRL10) に2U/mL ヘパリンナトリウム（ニプロ）を添加したもの、のいずれか一方を含むKBM501（コージンバイオ,16025015）
B) 高活性NK細胞の回収方法
回収方法1: 従来の方法
　培養14日目に培養液を回収、さらに培養容器に1mM EDTAを加え接着した細胞を剥離し、剥離細胞を回収したあとの培養容器をPBS (ナカライテスク、14249-24)で洗浄した。すべての細胞回収液を遠心後、PBSで洗浄、再懸濁した。
回収方法2: 本願の方法
　培養14日目に培養液を回収、さらに培養容器に1mM EDTAを加え接着した細胞を剥離し、剥離細胞を回収したあとの培養容器をKBM501培地で洗浄した。すべての細胞回収液を遠心後、KBM501培地で洗浄、再懸濁した。
C) 7-AADによる染色方法
　各条件下で解凍した高活性NK細胞　1x105cells/wellを96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）にて遠心分離し、上清を除去後、PBSで希釈した7-Amino-Actinomycin D（7-AAD）溶液（Beckman Coulter, A07704）を添加、懸濁し、室温（15～25℃をいう。以下の実験において同じ。）で20分間インキュベートした。染色後の細胞をフローサイトメーター（BD LSR Fortessa、BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。
［参考例］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞、PBMC、K562（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）、THP-1（ヒト急性単球性白血病細胞株）をMito-FerroGreen(同仁化学研究所、M489)にて反応させ、フローサイトメーター（BD LSR Fortessa、BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。
　図1-1に示したように高活性NK細胞は鉄の含有量が多い。形態学的な観察結果、および死ぬまでの時間から、凍結融解で高活性NK細胞のViabilityが顕著に低下するのは、Ferroptosis (酸化ストレス)、Apoptosis、Autophagy、NecrosisおよびNecroptosisの5形態を想定した。それぞれの形態に対する阻害剤を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし、1x107cellsを1mLのSTEM-CELLBANKER (ZENOAQ、CB045)で懸濁し、-80℃で凍結した。48時間以上凍結させたNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍したのち、次に記載する溶媒にて10倍希釈し、各温度と時間で静置した後、光学顕微鏡にて観察、撮影した。
<1> KBM501培地に希釈、37℃で3時間
<2> Z-Vadを含むKBM501培地に希釈、37℃で3時間
<3> Methylprednisoloneを含むKBM501培地に希釈、37℃で3時間
<4> Dexamethasoneを含むKBM501 培地に希釈、37℃で3時間
<5> KBM501培地に希釈、4℃で3時間
<6> Methylprednisoloneを含むKBM501培地に希釈、4℃で3時間静置後、37℃で3時間
<7> Dexamethasoneを含むKBM501培地に希釈、4℃で3時間静置後、37℃で3時間
　結果を図1-2に示した。高活性NK細胞は凍結融解でViabilityが顕著に低下することが確認された。また、これは凍結融解後にMethylprednisolone、Dexamethasone、またはZ-Vadの添加によっても改善されなかった。
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞について、回収後、表記のとおりの方法で凍結融解を行なった。
　凍結融解の条件とその結果を下記の表にまとめた。実験した条件では、PBSで洗浄した後に凍結した場合、あらゆるviability改善方法に不応答であった。一般に知られる細胞保護方法では目的の効果は得られ難いと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例1］
(1-1)　健常人ボランティア2名それぞれから高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし、それぞれ1x107cells, 8x106cellsを1mLのSTEM-CELLBANKER (ZENOAQ、CB045)で懸濁し、-80℃で凍結した。48時間以上凍結させたNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍したのち、解凍直後として1x105cellsを96ウェルプレート(IWAKI)に分取した。また、KBM501培地、3500単位/mL IL-2（セロイク（登録商標）注射用40, 武田薬品工業)、139.9mMマルトースを含むラクトリンゲル（扶桑薬品工業）、3500単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte A(Baxter)、 5.02mg/mL グルコン酸ナトリウム（ナカライ、16720-22）を含むKBM501培地で10倍希釈となるようにそれぞれ懸濁し、37℃、5% CO2下で3時間インキュベートした。解凍直後の細胞は分取後速やかに、そのほか4群は3時間インキュベート後に遠心分離し、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェア(FLOWJO, LLC)で解析し、生細胞率を算出した。
(1-2)　また、健常人ボランティア1名から、高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞5x106cellsについて同様に凍結、解凍を行い、同様に処理し、測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、生細胞率を算出した。
　結果を図1-3、1-4に示した。凍結した高活性NK細胞は、解凍時にPlasma-Lyte Aで希釈するとviabilityが改善した。解凍時、KBM501培地による希釈では、グルコン酸（グルコン酸ナトリウムは、Plasma-Lyte Aに含まれる成分の一つである。）を添加した場合にも改善は見られなかった。
［実施例2］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞をカウントし5x106cells、1x107cellsを1mLのSTEM-CELLBANKERで懸濁し-80℃で凍結した。48時間以上凍結させたNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍したのち、解凍直後として1x105cellsを96ウェルプレートに分取した。また、KBM501培地、3500単位/mL IL-2を含むラクトリンゲル、3500単位/mL を含むPlasma-Lyte A、40% Serum（ヒトAB型血清)を含むPlasma-Lyte Aで10倍希釈となるようにそれぞれ懸濁し、37℃、5% CO2下で3時間インキュベートした。解凍直後の細胞は分取後速やかに、そのほか4群は3時間インキュベート後に遠心分離し、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、生細胞率を算出した。
　結果を図2に示した。凍結した高活性NK細胞は、解凍時にPlasma-Lyte Aで希釈するとViabilityが改善するが、40% Serum（ヒトAB型血清)を含むPlasma-Lyte Aで希釈するとViabilityは悪化した。
［実施例3］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107cellsを1mLのSTEM-CELLBANKERで懸濁し-80℃で凍結した。48時間以上凍結させたNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍したのち、3500単位/mL IL-2 (イムネース、塩野義製薬株式会社)を含むPlasma-Lyte A（溶媒(1)）、またはKBM501培地（溶媒(2)）にて希釈し、次に記載する群ごとに希釈後の生細胞数および生細胞率、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した。
<0> 解凍直後としてSTEM-CELLBANKERから分取
<1> 溶媒(1)にて10倍希釈、37℃で1時間静置後、等量のKBM501培地を添加し37℃で3時間インキュベート
<2> 溶媒(1)にて10倍希釈、37℃で1時間静置後、等量のIL-2を含むラクトリンゲルを添加し37℃で3時間インキュベート
<3> 溶媒(1)にて10倍希釈、37℃で1時間静置後、等量のKBM501培地を添加し37℃で一晩インキュベート
<4> 溶媒(1)にて10倍希釈、37℃で1時間静置後、等量のIL-2を含むラクトリンゲルを添加し37℃で一晩インキュベート
<5> 溶媒(1)にて10倍希釈、37℃で3時間静置
<6> 溶媒(2)にて10倍希釈、37℃で3時間静置
<7> 溶媒(2)にて10倍希釈、37℃で一晩静置
（細胞傷害活性率の算出）
　細胞傷害活性の測定には、NK細胞とK562細胞を反応させた群、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群を用意した。
　《NK細胞》
　各群記載した時間インキュベートしたあと、細胞を回収し、10%FBS/RPMI1640にて2x106cells/mLの濃度に調製した。
　《K562細胞》
　K562細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）を血清成分を含まないRPMI1640培地にて懸濁したK562細胞をPKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26GL-1KT) を用いて染色し、最終的に10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mLとなるように調製した。
　NK細胞とK562細胞は、細胞比で1:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合し、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。反応後、遠心分離（500 x g, 5分間）し、上清を除去後、PBSで希釈した7-AAD溶液を添加、懸濁し、室温で20分間インキュベートした。フローサイトメーターを用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した※5。
※5:  細胞傷害活性率=（SKOV3細胞死細胞率-陰性コントロール死細胞率）/（陽性コントロール死細胞率-陰性コントロール死細胞率）×100
　結果を図3に示した。高活性NK細胞を凍結・融解したものは、生細胞数とViabilityが相関した。また、生細胞数またはViabilityと細胞傷害活性は逆相関の傾向が見られた。さらに凍結・融解した細胞の処理液をPlasma-Lyte Aから他の溶液に切り替えるとViabilityが低下した。
［実施例4］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x106 cells/mLとなるように以下に挙げる6種の溶媒で懸濁し、低吸着の6ウェルプレート(IWAKI、4810-800SP)に播種することにより凍結前処理を行った。前処理の溶媒には(1)10μM 4-フェニル酪酸(4-PBA、東京化成工業株式会社、P0643)を含むKBM501培地、(2)100μM 4-フェニル酪酸を含むKBM501培地、(3)Plasma-Lyte A、(4)3000単位/mL IL-2 (イムネース、塩野義製薬株式会社)を含むPlasma-Lyte A、(5)10μM Salubrinal (TOCRIS、 2347)を含むPlasma-Lyte A、(6)23mM グルコン酸ナトリウムを含むPBSを使用し、各溶媒で懸濁した細胞を(1)、(2)群は37℃、5% CO2下、(3)～(6)群は室温にて2時間インキュベートした。前処理後、処理時の細胞数をもとに1x107cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた前処理済みのNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、下記の通り希釈した。解凍後の希釈、インキュベートはすべて低吸着の6ウェルプレートにて行った。
《前処理(1) 10μM 4-フェニル酪酸を含むKBM501培地》
　1000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte Aまたは1000単位/mL IL-2および100μM 4-PBSを含むPlasma-Lyte Aにそれぞれ11倍希釈し、室温で1時間インキュベート後、KBM501培地に5倍希釈した。
《前処理(2) 100μM 4-フェニル酪酸を含むKBM501培地》
　Plasma-Lyte Aに11倍希釈し、室温で1時間インキュベート後、RPMI培地*6または2400単位/mL IL-2を含むRPMI培地にそれぞれ5倍希釈した。
※6:  10％FBS（シグマ、172012-500ML、56℃で30分の非働化処理したもの)を添加したRPMI培地（ナカライテスク、 30264-56）
《前処理(3) Plasma-Lyte A》
　1000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte Aまたは1000単位/mL IL-2および100μM 4-PBAを含むPlasma-Lyte Aにそれぞれ11倍希釈し、室温で1時間インキュベート後、KBM501培地に5倍希釈した。
《前処理(4) 3000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte A》
　Plasma-Lyte Aに11倍希釈し、室温あるいは37℃、5% CO2下で1時間インキュベート後、それぞれ RPMI培地、2400単位/mL IL-2を含むRPMI培地に5倍希釈した。
《前処理(5) 10μM Salubrinal を含むPlasma-Lyte A》
　1000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte A、1000単位/mL IL-2および100μM 4-PBAを含むPlasma-Lyte Aにそれぞれ11倍希釈し、室温で1時間インキュベート後、KBM501培地に5倍希釈した。
《前処理(6) 23mM グルコン酸を含むPBS》
　Plasma-Lyte Aに11倍希釈し、室温あるいは37℃、5% CO2下で1時間インキュベート後、それぞれRPMI培地、2400単位/mL IL-2を含むRPMI培地に5倍希釈した。
　培地に希釈した各群の細胞を37℃、5% CO2下で一晩インキュベートした後、生細胞数をカウントした。実験条件を下記にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　結果を図4に示した。高活性NK細胞は、凍結前に4-PBAを添加したKBM501で処理すると解凍時のViabilityが改善された。
［実施例5］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1と回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x106 cells/mLとなるように各種溶媒で懸濁し、低吸着の6ウェルプレートに播種することにより凍結前処理を行った。回収方法1で得られたNK細胞はPBSにて懸濁し、室温で1時間インキュベートした。回収方法2で得られたNK細胞は(1)KBM501培地、(2)30μM 4-フェニル酪酸を含むKBM501培地、(3)30μM Tauroursodeoxycholic Acid Dihydrate (TUDCA、東京化成工業株式会社、T1567)を含むKBM501培地、(4)30μM 4-フェニル酪酸および30μM TUDCAを含むKBM501培地で懸濁した細胞を37℃、5% CO2下で2時間インキュベートした。前処理後、処理時の細胞数をもとに1x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた前処理済みの高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、各群それぞれPlasma-Lyte Aに11倍希釈、室温で1時間インキュベートした。1時間後、緩やかに懸濁し生細胞数をカウントした。さらにKBM501培地に5倍希釈し37℃、5% CO2下で2時間インキュベート後、生細胞数をカウントし凍結時の細胞数に対する回収率として算出した。
　結果を下表および図5に示した。高活性NK細胞を凍結前に4-PBAまたはTUDCAを添加したKBM501培地で前処理することにより、解凍時の回収率が改善された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例6］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x106 cells/mLとなるようにKBM501培地のみ、或いはTUDCA（10μM, 30μM, 90μM, 270μM, 810μM）を含むKBM501培地で懸濁し、低吸着の6ウェルプレートに播種、37℃、5% CO2下で2時間インキュベートし凍結前処理を行った。前処理後、処理時の細胞数をもとに1x107cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた前処理済みのNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、各群それぞれPlasma-Lyte Aを10倍量加え、室温で3時間までインキュベートした。1時間後と3時間後、緩やかに懸濁し生細胞数をカウントした。また、1時間後にはKBM501培地に5倍希釈し37℃、5% CO2下で2時間インキュベート後、生細胞数をカウントした。解凍後各ポイントでの生細胞数から凍結時の細胞数に対する回収率として算出した。また、各タイムポイントで高活性NK細胞の細胞傷害活性の測定を行った。
（細胞傷害活性率の算出）
　細胞傷害活性の測定には、NK細胞とK562細胞を反応させた群、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群を用意した。
　《NK細胞》
　記載の方法で解凍、希釈した細胞を凍結時の生細胞数をもとに必要量分取した後、10%FBS/RPMI1640にて2x106cells/ mLの濃度に調製した。
　《K562細胞》
　K562細胞を無血清RPMI1640培地にて懸濁し、PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kitを用いて染色したのち、10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mLとなるように調製した。
　NK細胞とK562細胞は、細胞比で2:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合し、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。反応後、遠心分離（500 x g, 5分間）し、上清を除去後、PBSで希釈した7-AAD溶液を添加、懸濁し、室温で20分間インキュベートした。フローサイトメーターを用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した。
　前処理条件、および解凍条件とともに得られた回収率を下表に示した。高活性NK細胞を種々の濃度でTUDCAを添加したKBM501培地で前処理することにより、解凍後の回収率が改善された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　細胞傷害活性の測定結果を図6-1、6-2に示した。前処理におけるTUDCA濃度依存的に細胞傷害活性改善がみられた。
［実施例7］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x106 cells/mLとなるようにKBM501培地のみ、266μM, 810μM, 2400μM TUDCAを含むKBM501培地、2.4% DMSO(ナカライテスク、13445-74) を含むKBM501培地で懸濁、低吸着の6ウェルプレートに播種、37℃、5% CO2下で2時間インキュベートし凍結前処理を行った。前処理後、処理時の細胞数をもとに1x107cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた前処理済みのNK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、各群それぞれPlasma-Lyte Aまたは3000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte Aに11倍希釈、室温で3時間までインキュベートした。1時間後と3時間後、緩やかに懸濁し生細胞数をカウントした。また、1時間後にはKBM501培地に5倍希釈し37℃、5% CO2下で2時間インキュベート後、生細胞数をカウントした。解凍後各ポイントでの生細胞数から凍結時の細胞数に対する回収率として算出した。
　また、解凍、希釈した各タイムポイントで高活性NK細胞のK562細胞に対する細胞傷害活性の測定を、実施例6に記載した方法で行った。
　さらに解凍後1時間目および3時間目の高活性NK細胞について、固形腫瘍モデルでの評価（3D killing assay）を行った。詳細には、凍結時の細胞数をもとに高活性NK細胞を1x106cells/mLとなるようにKBM501培地で調製した。384ウェルプレートにあらかじめ播種したSKOV3　sphere　1個に対し調製したNK細胞を50μL加え、37℃、5% CO2下で4日間反応させた。その後、細胞をAccutaseにて剥離回収し、24ウェルプレートでRPMI培地にて拡大培養した。37℃、5% CO2下で拡大培養した17日後の細胞を4% PFAで固定し、DAPIにて染色し蛍光顕微鏡(BZ-9000、KEYENCE)、BZ-II観察アプリケーションを使用してNKによる傷害を受けなかったSKOV3の面積定量を行った。
　《SKOV3 sphere》
　SKOV3細胞（ヒト卵巣がん細胞株）を10%FBS/RPMI1640にて3x104 cells/mLとなるように調製し、96ウェルプレートの1ウェルあたり3x103/100μLを播種した。 37℃、5% CO2下で3日間培養しsphereを作成した。
　前処理条件、および解凍条件とともに得られた回収率を下表に示した。高活性NK細胞を種々の濃度でTUDCAを添加したKBM501培地で前処理することにより、解凍後の回収率が改善された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　また細胞傷害活性の測定結果を図7-1に、固形腫瘍モデルでの評価（3D killing assay） の結果を図7-2に示した。図7-1においてNK細胞を添加していないSKOV3　sphereはnegaと表記した。
　TUDCAの濃度幅を広げ、固形腫瘍モデルでの評価を追加したところ、凍結前に添加するTUDCAは2,400μMと267μMの間の濃度で用いることが好ましく、特に800μMで用いると回収率が高く、かつ固形腫瘍モデルに対する傷害活性が高かった。
［実施例8］
 (8-1)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、(1)Plasma-Lyte A、(2)1.48mM MgCl2・6H2O（ナカライテスク、20909-55）を含むPBS(-)、(3)PBS(-)、(4)KBM501培地、(5)62.2mg/L CaCl2・2H2O（ナカライテスク、08895-15）を含むPlasma-Lyte A、(6)0.1%グルコース（50%ブドウ糖、テルモ）を含むPlasma-Lyte A、(7)グルコース、(8)血清成分を含まないRPMI培地（ナカライテスク、09892-15）、(9)グルコースを含むRPMI培地（ナカライテスク、30264-85）に10倍希釈し、(1)～(4)は室温で2時間、(1)と(5)～(9)は37℃で3時間インキュベートした。その後7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
 (8-2)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1または回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させたそれぞれの高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、(1)Plasma-Lyte A、(2)1.48mM MgCl2（ナカライテスク、95812-85）を含むPBS(-)、(3)PBS(-)、(4)KBM501培地、(5)ラクトリンゲル、(6)HBSS(+)（ナカライテスク、09735-75）に10倍希釈し、37℃で3時間インキュベートした。その後7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
(8-3)　(8-1)と同様に、ただし解凍後の細胞を希釈する溶媒としては(1)PBS、(2)Plasma-Lyte A、(3)27.7mEq/L 乳酸（ナカライテスク、20006-62）を含むPlasma-Lyte A、(4)48.84mg/L MgSO4・7H2O（ナカライテスク、21002-85）を含むPlasma-Lyte A、(5)ラクトリンゲル、(6)ヴィーンF (扶桑薬品工業)、(7)ソリタ-T1(エイワイファーマ)、(8)ソリタ-T3（エイワイファーマ）、(9) 5% ブドウ糖注射液（テルモ）、(10)RPMI培地を用い、37℃で3時間インキュベートした。なお、(3)に関し、乳酸はラクトリンゲル液の乳酸濃度に合わせて添加し、リトマス試験紙で中性であることを確認した。(4)に関し、MgSO4はHBSSのMgSO4濃度に合わせて添加した。その後7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
(8-4)　(8-2)と同様に、ただし解凍後の細胞を希釈する溶媒としては(1)PBS、(2)Plasma-Lyte A、(3)生理食塩液（大塚製薬）、(4)ビカネート（大塚製薬）、(5)ソルアセト-F（テルモ）を用いて、処理した。その後7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
(8-5)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1と回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスで解凍した。完全に溶けた直後に、(1)Plasma-Lyte A、(2)生理食塩液、(3)RPMI1640培地、(4)ラクトリンゲル、(5)Plasma-Lyte Aにて調製した0.423mM CaCl2、(6)1.36mM CaCl2で10倍希釈し、それぞれ37℃で3時間静置した。なお、(5)のCaCl2はRPMI1640培地に、(6)のCaCl2はラクトリンゲル液に合わせて添加したものである。その後7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
(結果)　FlowJoソフトウェアで解析した結果を、図8-1～8-5に示した。凍結前の溶媒を培地にすること、解凍後にはPlasma-Lyte Aを使うことでViabilityが改善できた。解凍し、希釈した後は、室温で維持できた（8-1）。
［実施例9］
(9-1)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし4x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、3000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte Aに10倍希釈、室温で6時間まで静置した。解凍2時間後、5時間後、6時間後のポイントで細胞傷害活性についてそれぞれ解析を行った。細胞傷害活性は実施例9-1 (b)に記載した方法にてNK細胞とK562細胞を細胞比で1:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合したのち、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし4x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスにて解凍し、3000単位/mL IL-2を含むPlasma-Lyte Aに10倍希釈、室温で4時間まで静置した。解凍直後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後のポイントで、Viabilityの推移、細胞傷害活性（2時間反応固定、またはE:T=1:1固定）についてそれぞれ解析を行った。
a) Viability推移
　各ポイントで解凍細胞をよく混和し、1x105cellsを分取、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
b) 細胞傷害活性(1)
　細胞傷害活性の測定には、NK細胞とK562細胞を反応させた群、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群を用意した。
　《NK細胞》
　NK細胞を凍結時の生細胞数をもとに必要量分取した後、10%FBS/RPMI1640にて1x106cells/mLの濃度に調製した。
　《K562細胞》
　K562細胞を無血清RPMI1640培地にて懸濁し、PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kitを用いて染色したのち、10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mLとなるように調製した。
　NK細胞とK562細胞は、細胞比で1:2、1:1、2:1、4:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合し、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。反応終了後、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した。
c) 細胞傷害活性(2)
　上記b). 細胞傷害活性(1)に記載した方法でNK細胞とK562細胞を調製し、NK細胞とK562細胞を細胞比で1:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合したのち、37℃、5% CO2下で2時間、4時間、6時間、8時間反応させた。反応終了後、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した。
(9-2)　(9-1)と同様に、ただし解凍、希釈後は6時間まで静置し、2時間後、5時間後、6時間後のポイントで、上記 b)に記載した方法にて細胞傷害活性を測定した。詳細には、NK細胞とK562細胞を細胞比で1:1となるように96ウェルプレート（IWAKI, 4870-800SP）に添加、混合したのち、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。反応終了後、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、細胞傷害活性率（%Lysis）を算出した。
　結果を図9-1、9-2、9-3に示した。適切な方法で高活性NK細胞を前処理し、凍結し、解凍し、希釈を行えば、投与形態で室温に静置しておいてもViabilityや活性は4時間維持可能であった。さらに活性は6時間まで維持可能なことを確認した。例えばCAR-T細胞製剤キムリアは投与形態（解凍後）で30分しかそのViability・活性を維持出来ないことが知られている。本発明は、免疫治療に用いる細胞のハンドリング性を大幅に向上するものである。
［実施例10］
(10-1)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1と回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mL（1.5mL tube。回収方法1、すなわち回収時にPBSで洗浄する場合）、4x107 cells/mL（5mL vial。回収方法2、すなわち回収時にKBM501培地で洗浄する場合）となるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を室温で解凍した。解凍した細胞を、完全に溶けた直後、5分、10分、15分、20分、25分、30分、60分、120分、180分のポイントでPlasma-Lyte AまたはKBM501培地に10倍希釈し、180分まで室温で静置した。180分まで希釈したあと7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
 (10-2)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1と回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mL（1.5mL tube。回収方法1、すなわち回収時にPBSで洗浄する場合）、4x107 cells/mL（5mL vial。回収方法2、すなわち回収時にKBM501培地で洗浄する場合）となるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスで解凍した。解凍した細胞を、完全に溶けた直後、5分、10分、15分、20分、25分、30分、60分、120分、180分のポイントでPlasma-Lyte AまたはKBM501培地に10倍希釈し180分まで室温で静置した。180分まで希釈したあと7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
　結果を図10に示した。凍結前の回収時、PBSで洗浄した場合、容量が小さいため、室温での解凍に要する時間が短い（約15分）ものの、Viabilityは著しく低かった。一方KBM501培地で洗浄した場合は室温で自然解凍させた（約27分）後、2～3時間程度室温にそのまま静置しておいてもなお、そのviabilityが保たれていた。この方法は、解凍操作の許容範囲が極めて広く、製剤としてのハンドリング性が極めて良いといえる。
　また、解凍を37℃で行った場合も、回収時にKBM501培地で洗浄した場合に、解凍後2～3時間程度室温に静置しておいてもそのviabilityが保たれた。
［実施例11］
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1と回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mL（1.5mL tube）、4x107 cells/mL（5mL vial）となるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスで解凍した。完全に溶けた直後にPlasma-Lyte AまたはKBM501培地に10倍希釈し、室温で6時間まで静置した。希釈直後、1時間、2時間、3時間、6時間のポイントで1x105cellsを分取し、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
　回収時にKBM501培地で洗浄したものは、解凍後、Plasma-Lyte Aで希釈するとViabilityを高く保てる場合があることが分かった。加えて、凍結時の条件は、5mL vialであっても1.5mL tubeであっても良いが、5mL vial (4x107cells/mL)のほうがより良いことが分かった。高活性NK細胞の凍結出荷に際して高密度凍結が可能であることは、製品をよりコンパクトにし、輸送コストの低減に資する。
［実施例12］
(12-1)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法2に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし4x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスで解凍した。完全に溶けた直後に、Plasma-Lyte AをUltraPure Distilled Water (invitrogen、10977-015)にて希釈した80% , 50%, 10% Plasma-Lyte Aで10倍希釈し、それぞれ室温と37℃で3時間まで静置した。希釈直後、1時間、2時間、3時間のポイントで1x105cellsを分取し、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
(12-2)　(12-1)と同様に細胞を処理し、解析した。ただしUltraPure Distilled Water (invitrogen、10977-015)の代わりに生理食塩液でPlasma-Lyte Aを希釈した80% , 50%, 10% Plasma-Lyte Aで10倍希釈し、それぞれ室温と37℃で3時間まで静置した。
(12-3)　(12-1)と同様に細胞を処理し、解析した。ただしUltraPure Distilled Water (invitrogen、10977-015)の代わりに生理食塩液でPlasma-Lyte Aを希釈したもの、または生理食塩液で10倍希釈し、それぞれ室温と37℃で3時間まで静置した。
(12-4)　 (12-1)と同様に細胞を処理し、解析した。ただし細胞は完全に溶けた直後に、Plasma-Lyte A、生理食塩液、UltraPure Distilled Water にて調製した230mM NaCl2、150mM KCl、100mM MgCl2、11%トレハロース、10%スクロース、5%スクロース、Plasma-Lyte Aにて調製した10%、20% UltraGROで10倍希釈し、それぞれ室温で3時間まで静置した。
(12-5)　(12-4)と同様に細胞を処理し、解析した。ただし細胞をそれぞれの溶液で10倍希釈し、それぞれ37℃で3時間まで静置した。
(12-6)　高活性NK細胞の培養方法、回収方法1に記載した手順にて得られた高活性NK細胞の生細胞数をカウントし1x107 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKERで懸濁し、-80℃で凍結保存した。48時間以上凍結させた高活性NK細胞を37℃、ウォーターバスで解凍した。完全に溶けた直後に、Plasma-Lyte A、生理食塩液、UltraPure Distilled Water にて調製した230mM NaCl2、150mM KCl、100mM MgCl2、100mM CaCl2、11%トレハロース、10%スクロース、5%スクロース、Plasma-Lyte Aにて調製した10%、20% UltraGRO、10%、20%、30%、40% AB Serum（CELLect、2938249）で10倍希釈し、それぞれ室温で3時間まで静置した。希釈直後、1時間、2時間、3時間のポイントで1x105cellsを分取し、7-AADによる染色方法に記載した方法で測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
(12-7)　(12-6)と同様に細胞を処理し、解析した。ただし細胞をそれぞれの溶液で10倍希釈し、それぞれ37℃で3時間まで静置した。
(結果)　 FlowJoソフトウェアで解析した結果を、図12-1～12-10に示した。
　12-1～3の条件では、解凍時に用いるPlasma-Lyte Aの成分はその1/10まで希釈することができ、その希釈に用いる液は生理食塩水でも蒸留水でもよかった。すなわち、解凍時に用いる液は、低張液や生理食塩水であっても良いことが分かった。
　12-4および5の条件では、回収時にKBM501培地で洗浄すると、解凍時に用いる液が低張であるか高張であるかを問わず、NaCl溶液であればViabilityが維持できた。また、単糖類または多糖類を用いた等張液でも、室温であれば、あるいは短期間であれば、Viabilityが維持できた。一方、100mM MgCl2ではViabilityが劣った。
　12-6および7の条件では、回収時にPBSで洗浄した場合はViabilityを維持することが困難なことが分かった。
［解凍時の溶液の組成一覧（単位は、mM）］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 ［実施例1～12まとめ］
　以上について、一覧表にまとめた。なお、下表中、時間に関し、「xx時間」と記載した場合を除き、単位は分である。また、温度に関し、「R.T.」は室温を表し、それ以外の場合は37℃である。Viabilityに関し、Aは70%以上、Bは50%以上70%未満、Cは50%未満を表し、-は評価していないことを表す。活性に関し、Aは70%以上、Bは50%以上70%未満、Cは50%未満を表し、-は評価していないことを表す。評価がAまたはBであれば目的が達成されたといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015

Claims (10)

  1. 以下の工程を含む、細胞の処理方法：
    （1）体外で活性化した細胞を、細胞培養用の培地で回収し；
    （2）回収した細胞を凍結保存のための液に懸濁し；
    （3）懸濁した細胞を、凍結する。
  2. 工程（1）が、胆汁酸およびフェニル酪酸からなる群より選択されるいずれかを添加した培地による処理を含む、請求項1に記載の方法。
  3. さらに以下の工程を含む、請求項1または2に記載の方法：
    （4）凍結保存した細胞を解凍し、解凍した細胞を解凍溶媒Iに懸濁する。
  4. 　解凍溶媒Iが、以下を含む水溶液である、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法：
    ・塩化ナトリウム　　　　　9.00～108mM、　
    ・グルコン酸ナトリウム　　2.30～27.7mM、
    ・酢酸ナトリウム　　　　　2.70～32.5mM、
    ・塩化カリウム　　　　　　0.496～5.96mM、および
    ・塩化マグネシウム　　　　0.148～1.78mM。
  5. 　解凍溶媒Iが、以下の少なくとも1つを満たす、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法：
    ・カルシウムイオンを0.423mM以上の濃度で含まない、
    ・グルコースを5.55mM以上の濃度で含まない、および
    ・乳酸塩を27.7mM以上の濃度で含まない。
  6. 　以下を含む、高活性NK細胞を懸濁するための液： 
    ・塩化ナトリウム　　　　　9.00～108mM
    ・グルコン酸ナトリウム　　2.30～27.7mM
    ・酢酸ナトリウム　　　　　2.70～32.5mM
    ・塩化カリウム　　　　　　0.496～5.96mM
    ・塩化マグネシウム　　　　0.148～1.78mM
  7. 　凍結保存のための液に懸濁して凍結された高活性NK細胞を懸濁するためのものである、請求項6に記載の液。
  8. 高活性NK細胞、
    凍結保存のための液、および
    請求項6に記載された液
    を含む、医薬組成物。
  9. 以下の工程を含む、細胞を含む医薬組成物の製造方法：
    （1）体外で活性化した細胞を、細胞培養用の培地で回収し；
    （2）回収した細胞を凍結保存のための液に懸濁し；
    （3）懸濁した細胞を、凍結する。
  10. 工程（1）が、胆汁酸およびフェニル酪酸からなる群より選択されるいずれかを添加した培地による処理を含む、請求項9に記載の製造方法。
PCT/JP2021/007863 2020-03-02 2021-03-02 高活性ｎｋ細胞の処理方法 WO2021177279A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21765044.9A EP4151717A4 (en) 2020-03-02 2021-03-02 METHOD FOR TREATING HIGHLY ACTIVE NK CELLS
KR1020227033295A KR20220148233A (ko) 2020-03-02 2021-03-02 고활성 nk 세포의 처리 방법
AU2021230860A AU2021230860A1 (en) 2020-03-02 2021-03-02 Method for treating highly active NK cells
CN202180018428.7A CN115279887A (zh) 2020-03-02 2021-03-02 高活性nk细胞的处理方法
US17/908,472 US20230109717A1 (en) 2020-03-02 2021-03-02 Method for treating highly active nk cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020035297A JP2021136883A (ja) 2020-03-02 2020-03-02 高活性ｎｋ細胞の処理方法
JP2020-035297 2020-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021177279A1 true WO2021177279A1 (ja) 2021-09-10

Family

ID=77614337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/007863 WO2021177279A1 (ja) 2020-03-02 2021-03-02 高活性ｎｋ細胞の処理方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230109717A1 (ja)
EP (1) EP4151717A4 (ja)
JP (2) JP2021136883A (ja)
KR (1) KR20220148233A (ja)
CN (1) CN115279887A (ja)
AU (1) AU2021230860A1 (ja)
TW (1) TW202140770A (ja)
WO (1) WO2021177279A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023038037A1 (ja) 2021-09-08 2023-03-16 株式会社ガイアバイオメディシン 細胞の処理方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002233356A (ja) 2000-12-04 2002-08-20 Human Tekku:Kk 細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法
JP2006230396A (ja) 2004-10-12 2006-09-07 Nipro Corp 細胞保存液
WO2011021618A1 (ja) 2009-08-19 2011-02-24 タカラバイオ株式会社 細胞の保存方法
JP2018193303A (ja) 2017-05-12 2018-12-06 米満　吉和 高活性ｎｋ細胞、およびその利用
JP2019170176A (ja) 2018-03-27 2019-10-10 株式会社ガイアバイオメディシン ケモカインレセプターと細胞接着分子を発現するｃｄ３陰性細胞の集団、およびその利用
JP2020518260A (ja) * 2017-05-04 2020-06-25 メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル 向上した免疫抑制作用を有する間葉系前駆または幹細胞

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103097520B (zh) * 2010-07-13 2017-12-05 人类起源公司 产生自然杀伤细胞的方法
WO2014083133A1 (en) * 2012-11-29 2014-06-05 Cellectis Sa Improved methods for producing mammalian pluripotent stem cell-derived endodermal cells
WO2016122014A1 (ko) * 2015-01-27 2016-08-04 한국생명공학연구원 자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살해세포의 항암제로서의 용도
US20180346877A1 (en) * 2015-10-15 2018-12-06 Celularity, Inc. Natural killer cells and ilc3 cells and uses thereof
CA3070739A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Tissue Testing Technologies Llc Enhancement of cell cryopreservation with glycolipids
JP2019024418A (ja) * 2017-07-31 2019-02-21 公立大学法人大阪府立大学 選択分離用培地

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002233356A (ja) 2000-12-04 2002-08-20 Human Tekku:Kk 細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法
JP2006230396A (ja) 2004-10-12 2006-09-07 Nipro Corp 細胞保存液
WO2011021618A1 (ja) 2009-08-19 2011-02-24 タカラバイオ株式会社 細胞の保存方法
JP2020518260A (ja) * 2017-05-04 2020-06-25 メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル 向上した免疫抑制作用を有する間葉系前駆または幹細胞
JP2018193303A (ja) 2017-05-12 2018-12-06 米満　吉和 高活性ｎｋ細胞、およびその利用
JP2019170176A (ja) 2018-03-27 2019-10-10 株式会社ガイアバイオメディシン ケモカインレセプターと細胞接着分子を発現するｃｄ３陰性細胞の集団、およびその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEONG JW ET AL., BIOL. BLOOD MARROW TRANSPLANT, vol. 20, 2014, pages 463 - 473
LIU E. ET AL., N. ENGL. J. MED., vol. 382, 2020, pages 545 - 53
See also references of EP4151717A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023038037A1 (ja) 2021-09-08 2023-03-16 株式会社ガイアバイオメディシン 細胞の処理方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021136883A (ja) 2021-09-16
US20230109717A1 (en) 2023-04-13
KR20220148233A (ko) 2022-11-04
EP4151717A1 (en) 2023-03-22
CN115279887A (zh) 2022-11-01
JP2023126695A (ja) 2023-09-07
TW202140770A (zh) 2021-11-01
EP4151717A4 (en) 2024-04-17
AU2021230860A1 (en) 2022-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3027738B1 (en) Mscs in the treatment of inflammatory pulmonary diseases
RU2756561C2 (ru) Среда для формирования колоний и её применение
JP7144872B2 (ja) ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地
US9956249B2 (en) Compositions and methods for expansion of embryonic hematopoietic stem cells
JP2013523823A (ja) 胎盤幹細胞を用いるサルコイドーシスの治療
JP2022088551A (ja) 増殖造血幹細胞／前駆細胞集団の利用
Finkielsztein et al. Human megakaryocyte progenitors derived from hematopoietic stem cells of normal individuals are MHC class II-expressing professional APC that enhance Th17 and Th1/Th17 responses
KR20220038450A (ko) 면역치료를 위한 nk 세포 조성물 및 제제 및 이의 생산 방법
AU2022204899A1 (en) Methods and compositions for stem cell transplantation
JP2023126695A (ja) 高活性ｎｋ細胞の処理方法
Buchanan et al. Cryopreservation of human hematopoietic stem and progenitor cells loaded with trehalose: transient permeabilization via the adenosine triphosphate-dependent P2Z receptor channel
US20230141224A1 (en) Fibroblast mediated expansion and augmentation of immune regulatory cells for treatment of acute respiratory distress syndrome (ards)
WO2020251046A1 (ja) 医薬組成物
WO2023038037A1 (ja) 細胞の処理方法
KR100569609B1 (ko) 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법
US20220218759A1 (en) Compositions and methods for improving treatment outcomes for patients having hematological malignancies using an expanded stem cell product
Landum Targeting a bicarbonate transporter in pancreatic cancer overcomes immunosuppression
Delgado et al. Uses of mesenchymal stem cells
Zhou et al. Hetrombopag, a Thrombopoietin Receptor Agonist, Protects Cardiomyocyte Survival from Oxidative Stress Damage as an Enhancer of Stem Cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21765044

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021230860

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210302

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20227033295

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021765044

Country of ref document: EP

Effective date: 20221004