JP6426327B2 - 接着状態の細胞培養物の改変方法 - Google Patents
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Description
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
<1>接着状態の細胞培養物を改変する方法であって、少なくとも2種の細胞を含む接着状態の細胞培養物を、低栄養等張液に浸漬することを含み、それにより前記接着状態の細胞培養物を構成する細胞種の含有比率を変化させることを特徴とする、前記方法。
<2>シート状細胞培養物が、骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む、<1>の方法。
<3>改変が、線維芽細胞の含有率を低減させることである、<2>の方法。
<4>接着状態の細胞培養物が、シート状細胞培養物である、<1>〜<3>の方法。
<5>シート状細胞培養物が、培養基材から剥離されたものである、<4>の方法。
<6>シート状細胞培養物が、剥離時に収縮するものである、<5>の方法。
<7>シート状細胞培養物が、剥離後に6cm2以上の面積を有する、<5>または<6>の方法。
<8>シート状細胞培養物が、複数の単層シート状細胞培養物が積層されたものである、<4>〜<7>の方法。
<9>低栄養等張液が、ハンクス平衡塩液である、<1>〜<8>の方法。
<10>浸漬が、24〜150時間行われる、<1>〜<9>の方法。
<11>浸漬が、2〜8℃で行われる、<1>〜<10>の方法。
<12>(a)2種以上の細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
(b)播種した細胞集団をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、および
(c)形成したシート状細胞培養物を、低栄養等張液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
<13>工程(c)の前に
(c’)形成したシート状細胞培養物を剥離すること
を含む、<12>の方法。
<14>工程(c)の後に
(c’)形成したシート状細胞培養物を剥離すること
を含む、<12>の方法。
<15>(c)の工程において、シート状細胞培養物が剥離時に収縮する、<13>または<14>の方法。
<16>剥離したシート状細胞培養物が、6cm2以上の面積を有する、<13>〜<15>の方法。
<17>(c)の後に
(c−2)剥離したシート状細胞培養物を積層すること
をさらに含む、<13>〜<16>の方法。
<18>(a)目的細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
(b)播種した細胞集団をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、
(c)形成したシート状細胞培養物を剥離すること、および
(d)剥離したシート状細胞培養物を、低栄養等張液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
本発明において「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接(接着分子などの細胞要素を介するものを含む)および/または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的(機械的)に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的(機械的)に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、1の細胞層から構成されるもの(単層)であっても、2以上の細胞層から構成されるもの(積層(多層)体、例えば、2層、3層、4層、5層、6層など)であってもよい。
一態様において、低栄養は、低糖である。「低糖」とは糖が含まれてはいるがその割合が低い状態を意味し、したがって低糖には糖フリー状態は含まれない。かかる態様の例としては、具体的には例えば、低糖は低グルコースであり、低グルコースはグルコースフリーではない。低糖としては、典型的には例えば、糖が1000mg/L未満含まれる組成などが挙げられる。別の低糖条件の液としては、例えば、追加の糖類を含まない一般的な培養液における糖類の条件と比較して含有される糖類を1%未満まで低下させた条件などが含まれる。低糖状態の液に含まれる糖の量としては、具体的には例えば1000mg/L未満であり、好ましくは500mg/L未満であり、より好ましくは200mg/L未満であり、さらに好ましくは100mg/mL未満である。
別の一態様において、低栄養は、アミノ酸フリー状態、すなわちアミノ酸を含まない。かかる態様の例としては、具体的には例えば、必須アミノ酸を含まない。
本発明者らにより、2種以上の細胞を含む接着状態の細胞培養物、例えば骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含むシート状細胞培養物、をハンクス平衡塩液などの低栄養等張液に浸漬しておくと、接着状態の細胞培養物を構成する各細胞種の含有比率に変化が生じ、それにより接着状態の細胞培養物を改変することができることが見出された。下記実施例において示されるとおり、含有比率の変化は懸濁液状態の細胞混合物においては生じない現象であり、接着状態の細胞培養物に特有の現象である。
接着状態の細胞培養物は、細胞培養物を含む医薬組成物の製造に使用することができる。かかる医薬組成物は、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、細胞培養物の生存性、生着性および/または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、医薬組成物は、接着状態の細胞培養物の生存性、生着性および/または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。
本発明の方法によれば、接着状態の細胞培養物、特にシート状細胞培養物中の他の構成細胞の数を減少させることにより、目的細胞の純度を高めることができる。したがって本発明の方法により、目的細胞の純度の高い接着状態の細胞培養物を提供することが可能となる。例えば骨格筋芽細胞と繊維芽細胞を含む接着状態の細胞培養物、特にシート状細胞培養物の場合、本発明の方法を用いることで、線維芽細胞の含有量を低減させ、骨格筋芽細胞の純度を高めることができる。
本発明のシート状細胞培養物の製造方法は、以下の工程(a)〜(d)を含む:
(a)目的細胞を含む細胞集団、好ましくは2種以上の細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種する工程、
(b)播種した細胞集団をインキュベートしてシート状細胞培養物を形成する工程、および
(c)形成したシート状細胞培養物を、低栄養等張液に浸漬する工程。
本発明の一態様において、播種される細胞集団は、上記接着状態の細胞培養物を構成する細胞から選択される1種以上の細胞、好ましくは上記接着状態の細胞培養物を構成する細胞から選択される2種以上の細胞を含む、接着状態の細胞培養物または該接着状態の細胞培養物から調製された細胞集団であってよい。すなわち、播種される細胞集団としては、スフェロイド、胚様体そのものの他、これらの細胞凝集体を分散させることにより得られた細胞集団であってもよい。かかる態様においては、後述する(b)のシート化工程とは別に、播種するためのスフェロイドや胚様体を形成するための細胞間接着を形成する工程を含み得る。スフェロイドや胚様体などの接着状態の細胞培養物を形成するための条件としては、当該技術分野において公知の方法を用いることができる。かかる方法の非限定例としては、例えばMiki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015、WO2014/185358、WO2017/038562などに記載の方法などが挙げられる。
また、剥離工程(c)の後、任意に洗浄の工程を加えることができる。かかる洗浄の工程もまた、常温(例えば、37℃付近の温度)で行ってもよいし、冷蔵条件で行ってもよい。
かかる剥離工程の詳細は、上記シート状細胞培養物の改変方法において記載したとおりである。
本発明の処置方法は、シート状細胞培養物またはそれを含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。処置方法の対象となる組織や疾患は、シート状細胞培養物について上記したとおりである。また、かかる処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および/または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、細胞培養物と併用することができる。
(1)シート状細胞培養物の調製
ヒト骨格筋から定法により調製した骨格筋芽細胞(線維芽細胞を含む)を用いてシート状細胞培養物を調製した。温度応答性培養皿(UpCell(R)12穴マルチウェル、セルシード)に、20%ヒト血清含有DMEM/F12培地(Thermo Fisher Scientific Inc.)に懸濁したヒト骨格筋芽細胞およびヒト線維芽細胞の細胞混合物を、3.7×106個/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2下で12〜26時間シート化培養を行った。シート化培養後、培地を除去し、700μLの冷却したHBSS(+)(Thermo Fisher Scientific Inc.)を加えて10分静置し、その後静かにピペッティングしてシート状細胞培養物を完全に剥離させた。
(1)において冷蔵条件で静置したシート状細胞培養物について、24時間ごとに骨格筋芽細胞含有率(以下「純度」という)を測定した。形成したシート状細胞培養物をトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、遠心処理を行い、上清を廃棄した。これに0.5%BSA含PBS液を加え細胞をリンスした後、0.5%BSA含PBS液で10倍希釈した抗ヒトCD56抗体(ベクトン・ディッキンソン)を添加し混和した。対照として0.5%BSA含PBS液で10倍希釈した陰性コントロール用抗体(ベクトン・ディッキンソン)を添加混和したものを用意した。各抗体を混和した後、直ちに冷暗所で約1時間反応させ0.5%BSA含PBS液を加え細胞をリンスした後、0.5%BSA含PBS液を加え解析に供した。解析はフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン)を用い、各抗体を混和した細胞に含まれる抗体陽性細胞の割合を計測した。計測にあたっては、陰性コントロールの陽性率の補正を行い、細胞数5,000〜10,000個を解析した。解析後、各抗体を混和した細胞の陽性細胞率の割合の差から純度を求めた。
シート化しない状態のヒト骨格筋芽細胞およびヒト線維芽細胞の混合物に対し、HBSS(+)を1.55mL加え、2〜8℃の冷蔵条件で静置した。試験開始時と72時間後に上記例1(2)と同様に、骨格筋芽細胞の純度を測定した。
結果を図2に示す。シート化しなかった場合では、骨格筋芽細胞の純度に変化は確認できなかった。
Claims (14)
- 骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含むシート状細胞培養物を改変する方法であって、少なくとも骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含むシート状細胞培養物を、ハンクス平衡塩液に浸漬することを含み、それにより前記接着状態の細胞培養物を構成する細胞種の含有比率を変化させることを特徴とする、前記方法。
- 改変が、線維芽細胞の含有率を低減させることである、請求項1に記載の方法。
- シート状細胞培養物が、培養基材から剥離されたものである、請求項1または2に記載の方法。
- シート状細胞培養物が、剥離時に収縮するものである、請求項3に記載の方法。
- シート状細胞培養物が、剥離後に6cm2以上の面積を有する、請求項3または4に記載の方法。
- シート状細胞培養物が、複数の単層シート状細胞培養物が積層されたものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 浸漬が、24〜150時間行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 浸漬が、2〜8℃で行われる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- (a)骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
(b)播種した細胞集団をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、および
(c)形成したシート状細胞培養物を、ハンクス平衡塩液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。 - 工程(c)の前に
(c’)形成したシート状細胞培養物を剥離すること
を含む、請求項9に記載の方法。 - 工程(c)の後に
(c’)形成したシート状細胞培養物を剥離すること
を含む、請求項9に記載の方法。 - (c’)の工程において、シート状細胞培養物が剥離時に収縮する、請求項10または11に記載の方法。
- 剥離したシート状細胞培養物が、6cm2以上の面積を有する、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- (c’)の後に
(c’’)剥離したシート状細胞培養物を積層すること
をさらに含む、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
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