JP6494958B2 - シート状細胞培養物回収システムおよび方法 - Google Patents
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Description
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
〔1〕シート状細胞培養物を接着培養面から剥離する方法であって、接着培養面に接着したシート状細胞培養物が容器内の液体中に浸漬した状態で、該液体を振動させること(容器を回転または円振動させることによって振動させることを除く)を含む、前記方法。
〔2〕シート状細胞培養物が、脆弱なシート状細胞培養物である、〔1〕の方法。
〔3〕液体の振動が、容器を往復振動することによって生じるものであり、該往復振動の振動数が一定であり、振幅がシート状細胞培養物と接着培養面との接着面積の減少に従って増大する、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕振動数が、200rpm以下である、〔3〕の方法。
〔5〕液体の往復振動が、容器を往復振動することによって生じるものであり、該振動の振幅が一定であり、振動数がシート状細胞培養物と接着培養面との接着面積の減少に従って増大する、〔1〕または〔2〕の方法。
〔6〕液体が、シート状細胞培養物がちょうど浸漬する量の液体である、〔1〕〜〔5〕の方法。
〔7〕液体がハンクス平衡塩溶液である、〔6〕の方法。
〔8〕接着培養面が、周辺環境に依存して性状が変化するものである、〔1〕〜〔7〕の方法。
〔10〕シート状細胞培養物が、脆弱なシート状細胞培養物である、〔9〕の方法。
〔11〕容器内の液体の回転が、容器を回転振動させることにより生じるものである、〔9〕または〔10〕の方法。
〔12〕液体が、ハンクス平衡塩液である、〔9〕〜〔11〕の方法。
以下、本発明の好適な実施態様に基づき、本発明を説明する。
(1)剥離方法
本発明のシート状細胞培養物の回収方法は、シート状細胞培養物を接着培養面から剥離する工程を包含する。したがって本発明は、1つの側面において、接着培養面に接着したシート状細胞培養物が容器内の液体中に浸漬した状態で、該液体に接着培養面に並行に単一軸の往復振動をさせることを含む、シート状細胞培養物を接着培養面から剥離する方法に関する。
かかる態様において、振動数が一定である場合、振幅の大きさを変更することにより、シート状細胞培養物に作用する剥離力を変更することができる。また逆に、振幅が一定である場合、振動数を変更することにより、シート状細胞培養物に作用する剥離力を変更することができる。ここで本明細書において「剥離力」とは、シート状細胞培養物に作用する、接着培養面からシート状細胞培養物を剥がそうとする力を意味する。シート状細胞培養物に剥離力を作用させた場合、シート状細胞培養物と接着培養面との接着力が抵抗力となり、その結果シート状細胞培養物に剪断力が生じる、すなわち破断荷重がかかることとなる。
振幅の大きさは、振動する容器の形状や種類、シート状細胞培養物の脆弱さ、液体の量や種類などにより変化し得、当業者であれば適切な数値を適宜決定できる。例えば、シート状細胞培養物が骨格筋芽細胞である場合、およそ0.1cm〜10cm程度の振幅が適切である。
本発明のシート状細胞培養物の回収方法は、接着培養面から剥離したシート状細胞培養物にしわやよれが生じていた場合、シート状細胞培養物を伸展してしわやよれを解消する工程を包含する。したがって本発明は、1つの側面において、シート状細胞培養物が容器内の液体中に浸漬した状態で、前記容器内の液体を回転させることを含む、シート状細胞培養物を伸展する方法に関する。
本発明の伸展方法は、シート状細胞培養物を浸漬した液体を容器内で回転させることにより、液体中に遠心力を生じさせ、かかる遠心力およびシート状細胞培養物と液体との間の摩擦力によりシート状細胞培養物が外側に牽引され、結果として伸展できるものと考えられる。したがって容器内の液体は、容器の中央を中心として回転することが好ましい。
なお、本発明の回収方法に係る好適な態様として本発明の剥離方法および伸展方法を説明してきたが、当然ながらこれらの剥離方法および伸展方法は、それぞれ独立した方法として用いることも可能である。したがって本発明の剥離方法および伸展方法は、それぞれ単独で用いられても良いし、別の方法と組み合わせて用いられてもよい。
本発明は、一側面において、上記回収方法を実行するためのシステムに関する。
本発明のシステムは、少なくとも
(i)シート状細胞培養物を培養している培養容器を収納する収納部
(ii)収納部内の培養容器に振動を与えて、シート状細胞培養物を剥離および/または伸展させる振動部
を有している。
シートの損傷の軽減という観点から、振動は必要以上に与えないことが好ましい。したがって振動部は、一定時間後に振動が停止するような機構を備えていてもよいし、前記制御部によって振動および/または振動時間を制御されていてもよい。
(1)シート状細胞培養物の調製
シート状骨格筋芽細胞培養物は以下の通りに作製した。
骨格筋芽細胞としては、ヒト骨格筋試料より単離したヒト骨格筋芽細胞を、FBSを含むMCDB131培地(GIBCO製)で増殖させた後、回収し、DMSOを含む凍結保存液内で凍結保存したものを用いた。
凍結保存したヒト骨格筋芽細胞を約37℃に設定したウォーターバス内で解凍し、ヒト血清アルブミンを含む緩衝液で洗浄した。その後、細胞を、ヒト血清を含有するDMEM/F12培地(GIBCO製)を入れた温度応答性培養皿(UpCell(R)3.5cmディッシュ、セルシード製)に6×107個/cm2の密度で播種し、37℃、5%CO2で24時間培養し、単層のシートを形成させた
(1)で調製したシート状細胞培養物の培養培地を廃棄し、4℃に冷却したハンクス平衡塩液(HBSS)1.55mLを添加した。恒温機(EYELA LTI-600SD)を25℃に設定し、その中で、TAITEC社製ダブルシェーカーNR-3を用いて100rpm、振幅4cmで横方向に水平往復振動させた。比較例として、振動を74rpmの回転振動にしたもの、振動をさせなかったもの、200rpm、振幅4cmの横方向水平往復振動にしたもの、培地をHBSSに置換せず、74rpmの回転振動にしたもの、液量を2.5mLとし、100rpm、振幅4cmの回転振動にしたものについても観察した。結果を表1および図1に示す。
以上のことから、水平横方向の往復振動により、シートの剥離時間が大幅に短縮でき、破損も生じないことが分かった。
(1)で調製したシート状細胞培養物の培養培地を廃棄し、4℃に冷却したハンクス平衡塩液(HBSS)1.55mLを添加した。恒温機(EYELA LTI-600SD)を4℃に設定し、その中で、TAITEC社製ダブルシェーカーNR-3を用いて30rpm、振幅4cmで横方向に水平往復振動させた。他の例として、アズワン社製Hot Rocking Mixerを用いて2.8秒/往復の速度で揺動させたもの、バイオサン社製PST-60HL Plusを用いて250rpmで水平偏芯震動させたものについても観察した。結果を表2および図2に示す。
例1と同様にシート状細胞培養物を調製し、剥離した。剥離の際によれ、しわが生じたシート状細胞培養物を伸展実験に用いた。
恒温機(EYELA LTI-600SD)を25℃に設定し、その中でTAITEC社製ダブルシェーカーNR-3の中心に容器を設置し、70rpmで回転振動させた。比較例として、同一の条件で回転振とう機の端に容器を設置したもの、および100rpm、振幅4cmの水平横方向の往復振動を与えたものについても観察を行った。結果を図3に示す。
振とう機の中心に設置した場合、2分間の振動でシートの伸展が完了した(図3a)。振とう機の端に設置した場合は、シートが片側に寄ってしまった(図3b)。水平横方向の往復振動の場合は、伸展しなかった。
Claims (4)
- 接着培養面から剥離したシート状細胞培養物を伸展させる方法であって、シート状細胞培養物が容器内の液体中に浸漬した状態で、前記容器内の液体を、容器の中央を中心として回転させることを含む、前記方法。
- シート状細胞培養物が、引張試験において10N未満の破断荷重を示すシート状細胞培養物である、請求項1に記載の方法。
- 容器内の液体の回転が、容器を回転振動させることにより生じるものである、請求項1または2に記載の方法。
- 液体が、ハンクス平衡塩液である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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