TWI741263B - 片狀細胞培養物的製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明的目在於形成片狀細胞培養物後，剝離、運送、保存等的操作中，防止片狀細胞培養物的沾黏、黏貼、皺縮等所致的片狀細胞培養物的破損，而提供高品質的片狀細胞培養物。藉由包含將片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液、剝離、洗淨及／或保存的方法，而解決了上述的課題。

Description

片狀細胞培養物的製造方法
本發明係關於在片狀細胞培養物的製造之中，將片狀細胞培養物剝離、運送及保存之際，用於防止片狀細胞培養物的沾黏、黏貼、皺縮等的方法。
近年來，為了受損傷的組織等的修復，進行了移植各種的細胞的嘗試。例如，為了狹心症、心肌梗塞等的冠狀動脈疾病所致損傷的心肌組織的修復，嘗試了胎兒心肌細胞、骨骼肌母細胞、間葉幹細胞、心臟幹細胞、ES細胞及iPS細胞等的利用(非專利文獻1)。
作為如此的嘗試的一環，開發出了利用框架(scaffold)而形成的細胞構造物及將細胞形成為片狀的片狀細胞培養物(專利文獻1)。然而，一般而言，細胞層片係為脆弱，自培養基的單離時或之後的操作中，容易發生皺摺或破裂等，對於運送、保存、移植等的操作必須有相當的熟練。對於如此的問題，開發出了將片狀細胞培養物的皺摺或摺疊等予以抑制的方法及檢測的方法(專利文獻2至5)。然而，如此的皺摺或摺疊皆起因於片狀細胞培養物的剝離操作或運送時的處理等而產生。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕 日本特表2007-528755號公報
〔專利文獻2〕 日本特開2016-052270號公報
〔專利文獻3〕 日本特開2012-029605號公報
〔專利文獻4〕 日本特開2011-115080號公報
〔專利文獻5〕 日本特開2012-152161號公報
〔非專利文獻〕
〔非專利文獻1〕 Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012;1 (2): 136-41
本發明人等發現以下的問題：即使將剝離時或運送時物理性產生的皺褶或摺疊予以抑制，除此之外也會產生起因於構成片狀細胞培養物的細胞的生理活動的皺縮及扭轉，一旦放置如此的皺縮及扭轉，則在該狀態下產生沾黏及黏貼等，片狀細胞培養物的品質會降低。
因此，本發明的目的在於：將以過去方法所無法解決的起因於細胞彼此的細胞的生理活動的片狀細胞培養物的皺縮及扭轉等予以抑制，藉此防止片狀細胞培養物的沾黏、黏貼、破裂、皺摺及破損，因而提供高品質的片狀細胞培養物。
本發明人等，在骨骼肌母細胞的片狀細胞培養物的研究之中找出了以下新的發現：於將形成在培養基上的骨骼肌母細胞的片狀細胞培養物予以剝離、運送及保存之際，浸漬在低營養等張溶液，因而使扭轉及皺縮減少，且 使沾黏及黏貼難以產生。基於如此的發現而進一步持續努力研究的結果，進而完成了本發明。
換言之，本發明係關於以下所記載的內容：
〔1〕一種片狀細胞培養物的製造方法，係在將形成在培養基上的片狀細胞培養物予以剝離之際抑制皺縮，該片狀細胞培養物的製造方法包含下列步驟：(a)將至少一部分黏接在該培養基的該片狀細胞培養物的上表面予以浸漬在低營養等張溶液；以及(b)在該低營養等張溶液中將該片狀細胞培養物予以剝離。
〔2〕如〔1〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基係以血清覆蓋。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基係以感溫材料覆蓋。
〔4〕如〔1〕~〔3〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物含有肌母細胞。
〔5〕如〔1〕~〔4〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液為2至8℃。
〔6〕如〔1〕~〔5〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係為漢克平衡鹽溶液。
〔7〕如〔1〕~〔6〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中藉由浸漬而使殘存於該片狀細胞培養物的製造步驟來源雜質被除去。
〔8〕如〔1〕~〔7〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，更包含：使經剝離的該片狀細胞培養物伸展。
〔9〕如〔8〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物的伸展係藉由將裝有該低營養等張溶液的容器予以振盪而進行，該低營養等張溶液係浸漬有該片狀細胞培養物。
〔10〕一種片狀細胞培養物的製造方法，係在將形成在培養基上的片狀細胞培養物予以剝離之際抑制皺縮，該片狀細胞培養物的製造方法包含：藉由低營養等張溶液將經剝離的該片狀細胞培養物予以灌流。
〔11〕如〔10〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該灌流係對經剝離的片狀細胞培養物的雙面進行。
〔12〕如〔10〕或〔11〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該灌流係藉由使經剝離的片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液而進行。
〔13〕如〔12〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中至少進行一次：將經浸漬片狀細胞培養物的低營養等張溶液予以除去，裝入新的低營養等張溶液而再次使片狀細胞培養物浸漬。
〔14〕如〔10〕~〔13〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該灌流係於自片狀細胞培養物的剝離後當下至剝離後6小時之間進行。
〔15〕如〔10〕~〔13〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，進一步包含：使片狀細胞培養物伸展。
〔16〕如〔15〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物的伸展係藉由將裝有該低營養等張溶液的容器予以振盪而進行，該低營養等張溶液係浸漬有該片狀細胞培養物。
〔17〕如〔10〕~〔16〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，進一步包含：將片狀細胞培養物予以浸漬於低營養等張溶液狀態下保存。
〔18〕如〔10〕~〔17〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物含有肌母細胞。
〔19〕如〔10〕~〔18〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液為2至8℃。
〔20〕如〔10〕~〔19〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係為漢克平衡鹽溶液。
〔21〕一種片狀細胞培養物的製造方法，係在將形成在培養基上的片狀細胞培養物予以剝離之際抑制皺縮，該片狀細胞培養物的製造方法包含：將該片狀細胞培養物予以浸漬於低營養等張溶液。
〔22〕如〔21〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該浸漬係於該片狀細胞培養物的剝離後6小時以後進行。
〔23〕如〔21〕或〔22〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，更包含：使該片狀細胞培養物伸展。
〔24〕如〔23〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物的伸展係藉由將裝有該低營養等張溶液的容器予以振盪而進行，該低營養等張溶液係浸漬有該片狀細胞培養物。
〔25〕如〔21〕~〔24〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物含有肌母細胞。
〔26〕如〔21〕~〔25〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液為常溫。
〔27〕如〔21〕~〔26〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係於浸漬開始時為2至8℃。
〔28〕如〔21〕~〔27〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係為漢克平衡鹽溶液。
〔29〕一種片狀細胞培養物的製造方法，係在將形成在培養基上的片狀細胞培養物予以剝離之際抑制皺縮，該片狀細胞培養物的製造方法包含：藉由低營養等張溶液將經剝離的該片狀細胞培養物予以灌流。
〔30〕如〔29〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該灌流係對經剝離的片狀細胞培養物的雙面進行。
〔31〕如〔29〕或〔30〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該灌流係藉由使經剝離的片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液而進行。
〔32〕如〔31〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中至少進行一次：將經浸漬片狀細胞培養物的低營養等張溶液予以除去，裝入新的低營養等張溶液而再次使片狀細胞培養物浸漬。
〔33〕如〔29〕~〔32〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該灌流係於自片狀細胞培養物的剝離後當下至剝離後6小時之間進行。
〔34〕如〔29〕~〔33〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，進一步包含：使片狀細胞培養物伸展。
〔35〕如〔34〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物的伸展係藉由將裝有該低營養等張溶液的容器予以振盪而進行，該低營養等張溶液係浸漬有該片狀細胞培養物。
〔36〕如〔29〕~〔35〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，進一步包含：將片狀細胞培養物予以浸漬於低營養等張溶液狀態下保存。
〔37〕如〔29〕~〔36〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物含有肌母細胞。
〔38〕如〔29〕~〔37〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液為2至8℃
〔39〕如〔29〕~〔38〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係為漢克平衡鹽溶液。
〔40〕一種片狀細胞培養物的製造方法，係在將形成在培養基上的片狀細胞培養物予以剝離之際抑制皺縮，該片狀細胞培養物的製造方法包含：將該片狀細胞培養物予以浸漬於低營養等張溶液。
〔41〕如〔40〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該浸漬係於該片狀細胞培養物的剝離後6小時以後進行。
〔42〕如〔40〕或〔41〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，更包含：使該片狀細胞培養物伸展。
〔43〕如〔42〕所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物的伸展係藉由將裝有該低營養等張溶液的容器予以振盪而進行，該低營養等張溶液係浸漬有該片狀細胞培養物。
〔44〕如〔40〕~〔43〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物含有肌母細胞。
〔45〕如〔40〕~〔44〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液為常溫。
〔46〕如〔40〕~〔45〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係於浸漬開始時為2至8℃。
〔47〕如〔40〕~〔46〕中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係為漢克平衡鹽溶液。
根據本發明的方法，能夠回避：形成片狀細胞培養物後的剝離、運送、保存及移植等的操作所致的發生在片狀細胞培養物的沾黏、黏貼及皺縮 等的風險，藉此能夠防止片狀細胞培養物的破裂、皺摺及被損，而能夠簡便地操作。因此，作為結果，能夠簡便地製造保有高品質的片狀細胞培養物。
〔第1圖〕係表示範例一的以有切換培養基及以無切換培養基來保存的片狀細胞培養物的照片圖。其中，以無切換培養基來保存的場合，發現片狀細胞培養物的扭轉、皺縮及起因於此的沾黏。
〔第2圖〕係表示範例二的培養基的以有灌流及無灌流來保存的場合的片狀細胞培養物的照片圖。其中，以無灌流來保存的場合，發現片狀細胞培養物的皺縮及起因於此的沾黏。
〔第3圖〕係表示範例三的以常溫保存及非常溫保存來保存的場合的片狀細胞培養物的照片圖。其中，以非常溫保存來保存的場合，發現片狀細胞培養物的皺縮及起因於此的沾黏。
以下，詳細說明本發明。
在本說明書之中，只要沒有另外定義，在本說明書中所使用的全部的技術用語及科學用語，具有與本技術領域具有通常知識者所理解的用語為相同的意思。在本說明書中所參照的全部的專利、申請、公開的申請案及其他的出版物，其整體係藉由參照而引用於本說明書。再者，本說明書中所參照的出版物與本說明書的記載發生矛盾的場合，以本說明書的記載為優先。
本發明中「片狀細胞培養物」係指細胞相互連結而成為片狀之物。細胞彼此亦可直接(包含透過黏接分子等的細胞元素之物)及/或透過介 質而相互連結。作為介質，只要是將細胞彼此得以至少物理性(機械性)連結的物質則無特別限定，能舉出例如細胞外基質等。介質以細胞來源為佳，特別是來自構成細胞培養物的細胞之物。細胞至少是物理性(機械性)連結，亦可是進一步功能性，例如化學性、電性連結。片狀細胞培養物，由單一的細胞層所構成(單層)，亦可由二以上的細胞層所構成(積層(多層)體，例如二層、三層、四層、五層、六層等)。再者，片狀細胞培養物，細胞並未表示明確的層構造，而具有超過一個細胞量的厚度的三次元構造亦可。例如，在片狀細胞培養物的垂直截面之中，細胞並未在水平方向均一地整齊排列，而在不均一地(例如馬賽克狀)配置的狀態下存在亦可。
片狀細胞培養物不含框架(支承體)為佳。框架係於其表面上及/或於其內部讓細胞附著，為了維持片狀細胞培養物的物理的一體性而有用於所屬技術領域之中，例如，聚偏二氟乙烯(PVDF)製的膜等係為人所知，但是本發明的片狀細胞培養物不須如此的框架就能夠維持其物理的一體性。再者，本發明的片狀細胞培養物，僅由構成片狀細胞培養物的細胞來源的物質所構成且不含那些以外的物質為佳。
構成片狀細胞培養物的細胞，只要能夠形成片狀細胞培養物則沒有特別限定，包含例如黏細胞(附著性細胞)。黏細胞包含：例如黏性的體細胞(例如，心肌細胞、成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、肝細胞、胰腺細胞、腎細胞、腎上腺細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等)及幹細胞(例如，成肌細胞、心臟幹細胞等的組織幹細胞、iPS(induced pluripotent stem)細胞等的多能幹細胞、間葉系幹細胞)等。體細胞亦可由幹細胞，特別是由iPS細胞所分化者(iPS細胞來源黏細胞)。作為構成片狀細胞培養物的細胞的非限定例，能舉出有例如：肌母細胞(例如，骨骼肌母細胞等)、間葉系幹細胞(例如，骨髓、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、 肌組織、子宮內膜、胎盤、臍帶血來源者等)、心肌細胞、成纖維細胞、心臟幹細胞、胚胎幹細胞、iPS細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞(例如，口腔黏膜上皮細胞；視網膜色素上皮細胞、鼻黏膜上皮細胞等)、內皮細胞(例如，血管內皮細胞等)、肝細胞(例如，肝實質細胞等)、胰細胞(例如，胰島細胞等)、腎細胞、腎上腺細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等。作為iPS細胞來源黏細胞的非限定例，能舉出有例如：iPS細胞來源的心肌細胞、成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、肝細胞、胰細胞、腎細胞、腎上腺細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等。
本發明之中的「肌母細胞」係橫紋肌細胞的前驅細胞，包含骨骼肌母細胞及心肌母細胞。
本發明之中的「骨骼肌母細胞」係指存在於骨骼肌的肌母細胞。骨骼肌母細胞在所屬技術領域中為人所知，能夠藉由任意的已知方法(例如，日本特開2007-89442號公報所記載的方法等)自骨骼肌調製，亦能夠以商業的方式入手(例如，Lonza、Cat# CC-2580)。骨骼肌母細胞能夠根據CD56、α 7整合素、肌球蛋白重鏈IIa、肌球蛋白重鏈IIb、肌球蛋白重鏈IId(IIx)、MyoD、Myf5、Myf6、肌細胞生成素、結蛋白、PAX3等的標記來識別，沒有限定。在特定的樣貌之中，骨骼肌母細胞為CD56陽性。進一步在特定的樣貌之中，骨骼肌母細胞為CD56陽性及結蛋白陽性。骨骼肌母細胞可為來自具有骨骼肌的任意的生物，例如：人類、非人靈長類、嚙齒類(小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等)、兔、犬、貓、豬、馬、牛、山羊及綿羊等的哺乳動物，沒有限定。在一個樣貌之中，骨骼肌母細胞為哺乳動物的骨骼肌母細胞。在特定的樣貌之中，骨骼肌母細胞為人類骨骼肌母細胞。
本發明之中的「心肌母細胞」係指存在於心肌的肌母細胞。心肌母細胞在所屬技術領域中為人所知，能夠藉由Isl1等的標記所識別。心肌母細胞可為來自具有心肌的任意的生物，例如：人類、非人靈長類、嚙齒類(小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等)、兔、犬、貓、豬、馬、牛、山羊及綿羊等的哺乳動物，沒有限定。在一個樣貌之中，心肌母細胞為哺乳動物的心肌母細胞。在特定的樣貌之中，心肌母細胞為人類心肌母細胞。
本發明之中的「心肌細胞」係指具有心肌細胞的特徵的細胞，作為心肌細胞的特徵沒有限定，能舉出例如：心肌細胞的標記的發現、自律節拍的存在等。作為心肌細胞標記的非限定例，能舉出例如：c-TNT(cardiac troponin T)、CD172a(別名SIRPA或SHPS-1)、KDR(別名CD309、FLK1或VEGFR2)、PDGFRA、EMILIN2、VCAM等。作為心肌細胞，以iPS細胞來源的心肌細胞為範例來表示為佳。
構成片狀細胞培養物的細胞能夠來自得以藉由片狀細胞培養物治療的任意的生物。如此的生物，例如：人類、非人靈長類、犬、貓、豬、馬、牛、山羊、綿羊、嚙齒類(小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠)及兔等，沒有限定。再者，構成片狀細胞培養物的細胞的種類的數量沒有特別限定，能夠僅以一種細胞構成，亦能夠使用二種以上的細胞。形成片狀細胞培養物的細胞有二種以上的場合，最多的細胞的含有比率(純度)，在片狀細胞培養物的形成完成時，為50%以上，60%以上為佳，70%以上較佳，75%以上更佳。
細胞可為異種來源細胞，亦可為同種來源細胞。在此的「異種來源細胞」係指：片狀細胞培養物用於移植的場合，與其接受者為相異物種的生物來源的細胞。例如，接受者為人類的場合，猴子或豬來源的細胞等即是異種來源細胞。再者，「同種來源細胞」係指：與接受者為相同物種的生物來源的細胞。例如，接受者為人類的場合，人類來源的細胞等即是同種來源細胞。同 種來源細胞包含：自己來源細胞(亦稱自己細胞或自家細胞)，換言之接受者來源的細胞，以及同種非自己來源細胞(亦稱他家細胞)。由於自己來源細胞進行移植也不會發生排斥反應，在本發明中為佳。但是，亦可利用異種來源細胞及同種非自己來源細胞。利用異種來源細胞及同種非自己來源細胞的場合，為了抑制排斥反應，必須有免疫抑制處置。另外，在本說明書中，亦有將自己來源以外的細胞，換言之異種來源細胞及同種非自己來源細胞總稱為非自己來源細胞。在本發明的一樣貌之中，細胞為自家細胞或他家細胞。在本發明的一樣貌之中，細胞為自家細胞。在本發明的另一樣貌之中，細胞為他家細胞。
片狀細胞培養物能夠以已知的任意的方法(參考例如：專利文獻1、專利文獻2、日本特開2010-081829、日本特開2011-110368等)製造。片狀細胞培養物的製造方法，典型而言，包含：將細胞接種於培養基上的步驟、將接種的細胞予以層片化的步驟及將形成的片狀細胞培養物自培養基剝離的步驟，但是沒有限定於此。於將細胞接種於培養基上的步驟之前，亦可進行凍結細胞的步驟及解凍細胞的步驟。進一步，於凍結細胞的步驟之後亦可進行洗淨細胞的步驟。這些各步驟，能夠以適用於片狀細胞培養物的製造的已知的任意的手法來進行。本發明的製造方法，亦可包含製造片狀細胞培養物的步驟，該場合，製造片狀細胞培養物的步驟亦可包含上述相關於片狀細胞培養物的製造方法的一個步驟或二個以上作為子步驟。在一個樣貌之中，解凍細胞的步驟之後，且將細胞接種於培養基上的步驟之前，不包含將細胞增殖的步驟。
培養基只要是細胞得以在其之上形成細胞培養物就沒有特別限定，包含：例如各種材質的容器及容器中的固形或半固形的表面等。容器以不讓培養液等的液體透過的構造及材料為佳。作為如此的材料，能舉出例如：聚乙烯、聚丙烯、鐵氟龍®、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龍6,6、聚乙烯醇、纖維素、矽、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基、金屬、(例 如，鐵、不鏽鋼、鋁、銅、黃銅)。再者，容器具有至少一個平坦的面為佳。作為如此的容器的範例沒有限定，能夠舉出例如：具有以細胞培養物的形成為可能的培養基所構成的底面及液體不透過性的側面的培養容器。作為如此的培養容器的特定的範例沒有限定，能夠舉出細胞培養皿、細胞培養罐等。容器的底面可為透明亦可為不透明。一旦容器的底面為透明，則能夠自容器的裏側進行細胞的觀察、計數等。再者，容器亦可於其內部具有固形或半固形的表面。作為固形的表面，能舉出如同上述的各種的材料的培養盤或容器等，作為半固形的表面，能舉出凝膠、軟質的聚合物基質等。培養基，可使用上述材料製作，亦可以用市售之物。作為較佳的培養基沒有限定，能舉出：例如適用於片狀細胞培養物的形成的具有黏性的表面的基材。具體而言，具有親水性的表面的基材，能舉出：例如將經電暈放電處理的聚苯乙烯，膠原蛋白凝膠或親水性聚合物等的親水性化合物予以於該表面鍍層的基材；進一步，將膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、蛋白多醣、糖胺聚醣等的細胞外基質、以及鈣粘蛋白家族、選擇素家族、整合素家族等的細胞粘附因子予以鍍層於表面的基材。再者，市售有如此的基材(例如，Corning® TC-Treated Culture Dish、Corning等)。培養基的整體或部分可透明亦可不透明。
培養基亦能以對刺激，例如對溫度或光反應而有物性變化的材料覆蓋表面。作為如此的材料沒有限定，能使用例如：由(甲基)丙烯醯胺化合物；N-烷基取代的(甲基)丙烯醯胺衍生物(例如，N-乙基丙烯醯胺、N-n-丙基丙烯醯胺、N-n-正丙基甲基丙烯醯胺、N-異丙基丙烯醯胺、N-異丙基甲基丙烯醯胺、N-環丙基丙烯醯胺、N-環丙基甲基丙烯醯胺、N-乙氧基乙基丙烯醯胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯醯胺、N-四氫糠基丙烯醯胺、N-四氫糠基甲基丙烯醯胺等)；N,N-二烷基取代的(甲基)丙烯醯胺衍生物(例如，N,N-二甲基(甲基)丙烯醯胺、N,N-乙基甲基丙烯醯胺、N,N-二乙基丙烯醯胺等)；具有環狀基團 的(甲基)丙烯醯胺衍生物(例如，1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-嗎啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-嗎啉等)；或乙烯基醚衍生物(例如甲基乙烯基醚)的均聚物或共聚物所構成的溫度反應性材料；具有偶氮苯基團的光吸收聚合物、三苯基甲烷隱色氫氧化物的乙烯基衍生物與丙烯醯胺單體的共聚物及包含螺苯並吡喃的N-異丙基丙烯醯胺凝膠等的光反應性材料等等的已知之物(參考例如：日本特開平2-211862、日本特開2003-33177)。藉由給予這些材料一定的刺激，能夠使其物性，例如親水性或疏水性變化，而促進附著於同材料上的細胞培養物的剝離。市售有以感溫性材料所覆蓋的培養皿(例如，CellSeed Inc.的UpCell®)，能夠於本發明的製造方法使用這些。
培養基可為各種的形狀，以平坦者為佳。再者，該面積沒有特別限定，可為例如約1cm2~約200cm2、約2cm2~約100cm2、約3cm2~約50cm2等。例如，作為培養基，能舉出有直徑10cm的圓形的培養皿。此場合，面積為56.7cm2。
培養基亦能以血清來塗層(覆蓋或鍍層)。藉由使用以血清所塗層的培養基，能夠形成更高密度的片狀細胞培養物。「以血清所塗層」係指培養基的表面附著有血清成分的狀態。如此的狀態沒有限定，例如能夠藉由以血清處理培養基而得到。藉由血清的處理包含：使血清接觸於培養基，以及根據必要而進行規定期間培養。
作為血清，能夠使用異種血清及/或同種血清。異種血清係指：將片狀細胞培養物用於移植的場合，與其接受者為相異物種的生物來源的血清。例如，接受者為人類的場合，牛或馬來源的血清，例如牛胎兒血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、馬血清(HS)等即為異種血清。再者，「同種血清」係指：與接受者為同一種的生物來源的血清。例如，接受者為人類的場合，人 類血清即為同種血清。同種血清包含：自己血清(亦稱自家血清)，換言之接受者來源的血清，以及接受者以外的同種個體來源的同種他家血清。另外，在本說明書中，亦有將自己血清以外的血清，換言之，異種血清及同種他家血清總稱為非自己血清。
將培養基材塗層用的血清，係有市售，或者能夠自期望的生物採取的血液藉由一定的方法而調製。具體而言，能舉出：例如，將採取的血液放置在室溫下約20分~約60分左右而凝固，將此以約1000×g~約1200×g左右予以離心分離，採取上清液的方法。
在培養基上培養的場合，血清可使用原液，亦可稀釋後使用。稀釋能夠以任意的媒介，例如：水、生理食鹽水、各種緩衝液(例如，PBS、HBSS等)、各種培養液(例如，DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等)等進行，沒有限定。稀釋濃度只要能夠讓血清成分附著於培養基上則沒有特別限定，例如為約0.5%~100%(v/v)、約1%~60%(v/v)為佳，約5%~40%(v/v)較佳。
培養時間只要能讓血清成分附著於培養基上亦沒有特別限定，例如為約1小時~約72小時，約2小時~約48小時為佳，約2小時~約24小時較佳，約2小時~約12小時更佳。培養溫度只要能讓血清成分附著於培養基上亦沒有特別限定，例如為約0℃~約60℃，約4℃~約45℃為佳，室温~約40℃較佳。
培養後亦可將血清廢棄。作為血清的廢棄手法，能夠使用藉由吸量管的抽吸及傾析等的慣用的液體廢棄手法。在本發明的較佳樣貌之中，亦可於血清廢棄後，以無血清洗淨液洗淨培養基。作為無血清洗淨液，只要是不含血清且不會對附著於培養基的血清成分造成不良影響的液體媒介則沒有特別限定，例如：能夠以水、生理食鹽水、各種緩衝液(例如，PBS、HBSS等)、各 種培養液(例如，DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等)等進行，沒有限定。作為洗淨手法，能夠使用慣用的培養基洗淨手法，例如於培養基上添加無血清洗淨液並攪拌規定時間(例如，約5秒~約60秒鐘)後廢棄的手法，沒有限定。
本發明之中，亦能以成長因子塗層培養基。在此，「成長因子」係指：與沒有成長因子的場合相比，會促進細胞的增殖的任意的物質，例如，包含：上皮細胞成長因子(EGF)、血管內皮成長因子(VEGF)、成纖維細胞成長因子(FGF)等。藉由成長因子的培養基的塗層手法、廢棄手法及洗淨手法，除了培養時的稀釋濃度為：例如約0.0001μg/mL~約1μg/mL、約0.0005μg/mL~約0.05μg/mL為佳、約0.001μg/mL~約0.01μg/mL較佳以外，基本上與血清相同。
本發明之中，亦能以類固醇塗層培養基。在此，「類固醇」係指：具有類固醇核的化合物之中，會對生物體帶來腎上腺皮質功能障礙、庫欣綜合症等的不良影響之物。作為如此的化合物包含：例如皮質醇、潑尼松龍、曲安奈德、地塞米松、倍他米松等，沒有限定。藉由類固醇的培養基的塗層手法、廢棄手法及洗淨手法，培養時的稀釋濃度，以地塞米松為例，為約0.1μg/mL~約100μg/mL，約0.4μg/mL~約40μg/mL為佳，約1μg/mL~約10μg/mL較佳以外，基本上與血清相同。
培養基能以血清、成長因子及類固醇的任一種塗層，亦能以彼等的任意的組合，換言之，血清及成長因子、血清及類固醇、血清及成長因子及類固醇、或成長因子及類固醇的組合塗層。以複數種成分塗層的場合，能混合這些成分而同時塗層，亦能以各別的步驟塗層。
培養基能在以血清等塗層後立即接種細胞，亦能塗層後先保存，之後進行細胞的接種。經塗層的培養基，能藉由存放於例如約4℃以下、約-20℃以下為佳、約-80℃以下較佳，而長期間保存。
對培養基的細胞的接種，能以已知的任意的手法及條件進行。對培養基的細胞的接種，例如，可藉由將於培養液懸浮有細胞的細胞懸浮液予以注入至培養基(培養容器)而進行。細胞懸浮液的注入，能使用注射器或吸量器等適合於細胞懸浮液的注入操作的器具。
本發明中，將片狀細胞培養物「剝離」係指：將片狀細胞培養物自培養基剝下，或片狀細胞培養物被剝下。換言之，主動地自培養基剝下片狀細胞培養物以外，「剝離」亦包含：例如片狀細胞培養物的細胞間結合力超過片狀細胞培養物與培養表面的結合力而自然地剝下。
本發明之中「浸漬」係指：片狀細胞培養物浸在低營養等張溶液的狀態。換言之，只要是片狀細胞培養物被液體覆蓋的狀態即為「浸漬」的狀態，即使在靜置狀態下細胞片的一部分露出至液體的外部，例如藉由振盪而成為被液體覆蓋的狀態，一部分露出的狀態也是「浸漬」的狀態。
本發明之中，片狀細胞培養物「收縮」係指：自培養基剝離黏接於培養基的片狀細胞培養物時，於剝離後片狀細胞培養物的面積減少。
再者，本發明之中，片狀細胞培養物「皺縮」係指：片狀細胞培養物的外緣部捲起或扭轉。如此的皺縮係細胞間黏接力的作用所致，與剝離作業及運送作業所致的物理性產生的皺摺或摺疊不同。一旦放置皺縮的狀態，片狀細胞培養物會自捲起或扭轉的部分產生沾黏或黏貼。
本發明之中「伸展」係指：將發生於片狀細胞培養物的皺褶、摺疊、皺縮或扭轉等予以攤開而消除。
本發明之中「等張」的用語，係指：二種的液體的滲透壓為同等的狀態，在本發明之中只要沒有在別的段落的記載，即為「生理性等張」，具有與細胞內液或血液等的生理性液體為同等的滲透壓。因此，本發明之中，「等張液」只要沒有另外的記載則與「生理等張液」同義，係指：具有與細胞內液或血液等的生理性液體為同等的滲透壓的液體。作為等張液，能舉出：漢克平衡鹽溶液、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏液及基礎培養基等，但是沒有限定於此。
本發明之中，「低營養」或「低營養狀態」係指：放置在該條件下的細胞集團的細胞數在規定的期間內沒有增殖亦沒有死滅而維持的條件，換言之係為在規定的期間內細胞數沒有實質性的變化的條件。「細胞數沒有實質性的變化」係指：某個時間點的細胞數A與經過規定的期間後的另外的時間點的細胞數B沒有實質性的差異，具體而言，能舉出：例如細胞數A為細胞數B的約70%、約80%、約90%、約95%、約100%、約105%、約110%、約120%、約130%等的場合。二個時間點可任意地選擇，在通常的培養條件下培養的場合，以有能夠確認細胞的增殖的程度的間隔為佳。作為如此的間隔，例如有三天、四天、五天、六天、七天等。
低營養狀態能夠藉由各種的條件來達成，只要是所屬技術領域中具有通常知識者，能夠配合對象的細胞而做出適當的低營養狀態。作為低營養狀態的要件，典型而言，能舉出：例如，得以供給細胞的生命維持所必要的能量，及/或缺乏細胞的分裂所必要的要素等。具體而言，能舉出：例如，得以供給代謝所必要的糖分等的能量的環境，及/或無法供給細胞分裂所必須的胺基酸的環境等。
在一個樣貌之中，低營養為低糖。「低糖」係指雖有含糖但其比例為低的狀態，因此低糖不包含無糖狀態。作為如此的樣貌的範例，具體而言，例如低 糖為低葡萄糖，且低葡萄糖不是無葡萄糖。作為低糖，典型而言，能舉出：例如，糖含量未達1000mg/L的組成等。作為另外的低糖條件的液體，包含：例如，與不含追加的糖類的一般的培養液中的糖類的條件相比，使所含有的糖類降低為未達1%的條件等。作為低糖狀態的液體所含的糖的量，具體而言，例如為未達1000mg/L、未達500mg/L為佳、未達200mg/L較佳、未達100mg/mL更佳。
在另外的樣貌之中，低營養為無胺基酸狀態，亦即不含胺基酸。作為如此的樣貌的範例，具體而言，例如不含必需胺基酸。
本發明之中「低營養等張溶液」係指等張溶液中低營養之物。典型而言，例如，含有規定量的碳水化合物的等張溶液及/或不能供給必需胺基酸的等張溶液，具體而言，能舉出：例如，含有規定量的糖且不含胺基酸(特別是必需胺基酸)的等張溶液、含有規定量的糖且含有必需胺基酸的合成抑制劑的等張溶液等。能含在低營養等張溶液的碳水化合物，典型而言為糖，雖沒有限定於此，但是能舉出：例如，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖等，能根據對象的細胞種類而適當地選擇。糖的規定含量，可根據所含的糖的種類及細胞的必要維持時間(浸漬時間)而不同。例如，葡萄糖的場合，從細胞的生命維持的必要量的觀點來看，能舉出：例如，約100mg/L以上、約500mg/L以上、約1000mg/L以上、約1500mg/L以上、約2000mg/L以上等。再者，從等張性的維持的觀點來看，能舉出：例如，約50000mg/L以下、約40000mg/L以下、約30000mg/L以下、約25000mg/L以下、約20000mg/L以下、約15000mg/L以下、約10000mg/L以下、約5000mg/L以下、約4500mg/L以下等。因此，作為葡萄糖的含量的範圍，能舉出：例如，約100~500000mg/L、約500~25000mg/L、約500~4500mg/L、約1500~4500mg/L、約500~1500mg/L的範圍等。只要是所屬技術領域中具有通常知識者，能夠依照所含的糖的種類而計算出推定的含量。
作為低營養等張溶液，例如漢克平衡鹽溶液、厄爾平衡鹽溶液、葡萄糖等張溶液等，作為含有規定量的糖且不含胺基酸的組成的已知的等張溶液，除此之外，亦可為於例如生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏液等的作為不含碳水化合物及胺基酸的組成的已知的等張溶液，加入規定量的碳水化合物而成之物。作為規定量的碳水化合物，例如，若為漢克平衡鹽溶液或厄爾平衡鹽溶液，一般而言，含有1000~4500mg/L的葡萄糖，若為葡萄糖等張溶液則含有約50000mg/L的葡萄糖。在一樣貌之中，低營養等張溶液不含UW液、Euro-Collins液、Hypothermosol®等習知作為臟器的冷藏保存用溶液的保存液。
本發明的低營養等張溶液亦可含有乳酸。因此，在本發明的一樣貌之中，低營養等張溶液不含乳酸。再者，本發明的低營養等張溶液亦可含有丙酮酸。因此，在本發明的一樣貌之中，低營養等張溶液不含丙酮酸。再者，本發明的低營養等張溶液亦可含有抗壞血酸。因此，在本發明的一樣貌之中，低營養等張溶液不含抗壞血酸。再者，本發明的低營養等張溶液亦可含有脂肪酸。因此，在本發明的一樣貌之中，低營養等張溶液不含脂肪酸。再者，本發明的低營養等張溶液亦可含有鈣。因此，在本發明的一樣貌之中，低營養等張溶液含有鈣，含有約1~2mM為佳，約1.2~1.8mM的濃度的鈣較佳。再者，本發明的低營養等張溶液可含有膽固醇。因此，在本發明的一樣貌之中，低營養等張溶液不含膽固醇。在較佳的樣貌之中，低營養等張溶液不含乳酸、丙酮酸、脂肪酸及膽固醇，而含有壞血酸，且含約1~2mM，較佳為約1.2~1.8mM的濃度的鈣。
本發明之中，「碳水化合物」係以單醣為構成單位的有機化合物的總稱，包含單醣類、寡醣類、多醣類及醣衍生物等。本說明書之中，「糖」或「糖分」的用語係指：碳水化合物之中經細胞代謝而變換成能量之物或成分，典型而言有單醣類作為代表，亦包含在系統中分解而能夠讓細胞代謝之物。
本發明之中，「常溫」為15℃~25℃。
<1>本發明的皺縮抑制方法
本發明的一面向係提供：將形成在培養基上的片狀細胞培養物剝離之際抑制片狀細胞培養物的皺縮的方法(以下記載為本發明的剝離方法)。
本發明的片狀細胞培養物的剝離方法包含以下步驟：
(a)將至少一部分黏接在培養基的片狀細胞培養物的上表面予以浸漬在低營養等張溶液。
在步驟(a)之中，至少一部分接種在培養基的片狀細胞培養物的上表面的對低營養等張溶液的浸漬，典型而言藉由將低營養等張溶液裝入培養容器而達成。浸漬的片狀細胞培養物，只要是至少一部分黏接於培養基的狀態即可，而整體黏接於培養基的狀態為佳。一樣貌之中，片狀細胞培養物的對低營養等張溶液的浸漬係藉由將片狀細胞培養物的形成用的培養基除去，裝入低營養等張溶液，換言之藉由將培養基替換成低營養等張溶液而達成。
在本發明的剝離方法的一樣貌之中，接續上述步驟(a)，任意地包含以下的步驟(b)：
(b)在低營養等張溶液中將片狀細胞培養物予以剝離。
步驟(b)之中，浸漬於低營養等張溶液的黏接於培養基的片狀細胞培養物，可藉由在浸漬在低營養等張溶液的狀態下靜置而自然地剝離，亦可在低營養等張溶液中主動地自培養基剝離。較佳的一樣貌之中，主動地剝離片狀細胞培養物。主動的剝離的方法，只要不使片狀細胞培養物受損傷則沒有特別限定，能舉出：例如，連同基材使低營養等張溶液振盪的方法、藉由對黏接在培養基的片狀細胞培養物的黏接邊緣噴射低營養等張溶液(例如藉由移液等)而進行剝離的方法等。
根據本發明的剝離方法，能夠避免：剝離片狀細胞培養物之際，自基材剝離的片狀細胞培養物，剝離中已經剝離的端部扭轉或皺縮，進而黏貼、 沾黏的情況。可想到這是因為藉由浸漬於低營養等張溶液，讓構成片狀細胞培養物的細胞的生理活動降低，因而讓細胞間黏接力減弱。
在本發明的剝離方法的一樣貌之中，浸漬係如同上述，藉由將片狀細胞培養物的形成用的培養基除去，替換成低營養等張溶液而進行。如此的樣貌之中，能夠藉由進行浸漬，將殘存於片狀細胞培養物的製造步驟來源雜質予以除去。本發明之中「製造步驟來源雜質」，典型而言，包含在片狀細胞培養物的製造階段的來自各步驟的以下列舉之物。換言之，係為：來自細胞基材之物(例如，宿主細胞來源蛋白質、宿主細胞來源DNA等)、來自細胞培養液之物(例如，誘導體、抗生素、培養基成分、異種血清等)、或細胞培養以後的步驟的標的物質的析出、分離、加工、精製步驟來源之物等(例如，參考日本醫藥審發第571號)。
在本發明的剝離方法之中，亦可任意地更包含以下的步驟(c)：
(c)使經剝離的該片狀細胞培養物伸展的步驟。
步驟(c)係使已扭轉折彎的片狀細胞培養物伸展的步驟。伸展步驟(c)能夠在剝離步驟(b)之後進行。伸展步驟(c)可在低營養等張溶液中進行，亦可除去低營養等張溶液後進行，並且之後再次添加低營養等張溶液。於低營養等張溶液除去後進行伸展步驟(c)的場合，能夠藉由例如將低營養等張溶液滴下至片狀細胞培養物有重疊的部分，根據必要而振盪等的手法而進行。在低營養等張溶液中進行伸展步驟(c)的場合，能夠藉由使浸漬在低營養等張溶液中的片狀細胞培養物連同容器振盪等的手法而進行。自簡便性的觀點來看，伸展步驟在低營養等張溶液中，將浸漬有片狀細胞培養物的裝有低營養等張溶液的容器予以振盪而進行為佳。
本發明的伸展方法，只要片狀細胞培養物得以伸展則沒有限定，例如，自得以無偏斜地伸展的觀點來看，旋轉振盪為佳。可想到，旋轉振盪藉 由使浸漬有片狀細胞培養物的液體在容器內旋轉，於液體中產生離心力，並且藉由該離心力及片狀細胞培養物與液體之間的摩擦力而讓片狀細胞培養物被向外側拖拉，達成伸展的結果。因此，旋轉振盪使容器內的液體以容器的中央為中心而旋轉為佳。
作為振盪中使液體旋轉的方法，只要不會使存在於液體中的片狀細胞培養物破損，能夠使用所屬技術領域中已知的任一種方法。具體而言，雖然沒有限定於此，但能舉出：例如，讓裝有液體的容器旋轉或旋轉振盪、讓攪拌器等在液體中旋轉等的方法。從對片狀細胞培養物直接給予損傷的風險少、汙染的風險少等的觀點來看，不直接接觸液體而使容器旋轉或旋轉振盪，藉此使內部的液體旋轉的方法為佳。若考量力量的傳遞效率，使容器旋轉振盪為最佳。另外，本發明中，使容器「旋轉」係指：使容器本身自轉；使容器旋轉振盪係指：使容器進行圓周運動而振盪。
本發明的旋轉振盪，係使於使浸漬有片狀細胞培養物的液體旋轉之際產生的離心力以及該液體與片狀細胞培養物之間的摩擦力成為伸展的力，因此不會使力量極端地增強及偏向對片狀細胞培養物產生負荷。因此，能夠合適地應用於特別是片狀細胞培養物為脆弱的片狀細胞培養物的場合。
振盪力道及振盪時間，例如根據振盪及振幅而決定，但是振盪力道過大的場合，或振盪時間過長的場合，會提高片狀細胞培養物破損的風險，因此能夠根據所用的容器的形狀及種類、片狀細胞培養物的脆弱度、液體的量及種類等而變化，只要是所屬技術領域中具有通常知識者便能夠適當地決定適切的數值。片狀細胞培養物為骨骼肌母細胞的場合，大約5rpm~300rpm左右為適切。例如，為了將剝離之際發生在片狀細胞培養物的邊緣的少數一部分的折彎及皺褶予以消除，30rpm~50rpm左右的伸展為佳，發生扭轉及皺縮的場合，使容器內部的液體充分地旋轉且不使片狀細胞培養物破損的30rpm~90rpm左右的伸 展為佳，作為得以伸展沾黏及黏貼的範圍則是稍微增強的90rpm~130rpm左右為佳。作為振盪時間，舉例而言，30rpm~50rpm的場合為1~15分左右、30rpm~90rpm的場合為1~10分左右、90rpm~130rpm的場合為1~8分左右為佳。
伸展步驟(c)可在常溫下進行，亦可在冷藏條件下，例如在0~10℃或2~8℃等進行。再者，於伸展使用低營養等張溶液的場合，如此的低營養等張溶液可為常溫亦可為冷藏條件，例如為0~10℃或2~8℃。自使細胞的生理活動降低的觀點來看，0~10℃為佳。
作為用於本發明的剝離方法的培養基，能夠使用上述的培養基。在較佳的一樣貌之中，培養基以血清覆蓋。在另外的較佳的一樣貌之中，培養基以感溫材料覆蓋。在更佳的一樣貌之中，培養基以感溫材料及血清覆蓋。
作為用於以本發明的剝離方法剝離的片狀細胞培養物的細胞，能夠使用上述的細胞。在較佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物包含肌母細胞。在另外的較佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物包含心肌細胞。在更佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物所含的心肌細胞係iPS細胞來源的心肌細胞。
作為用於本發明的剝離方法的低營養等張溶液，能夠使用上述的低營養等張溶液。在較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液為漢克平衡鹽溶液(HBSS)，HBSS(+)為特佳。
再者，自使構成片狀細胞培養物的細胞的生理活動降低的觀點來看，低營養等張溶液為室溫以下為佳。再者，自盡量減少對細胞的損傷的觀點來看，低營養等張溶液為0℃以上為佳。在較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液為0~10℃，更佳為2~8℃。
本發明的一個方面係提供：藉由將自培養基剝離的片狀細胞培養物予以灌流，而抑制片狀細胞培養物的皺縮的方法(以下記載為本發明的灌流方法)。
本發明的片狀細胞培養物的灌流方法包含以下步驟：
(A)藉由低營養等張溶液將剝離的片狀細胞培養物予以灌流。
本發明之中，「灌流」係指：於組織或移植片等的表面或內部流有液體而除去血清及培養基成分。
步驟(A)至少進行一次，可重複進行複數次，例如可重複一次、二次、三次、四次、五次、六次。較佳的一樣貌之中，灌流係進行三次。
本發明的灌流方法，藉由低營養等張溶液將剝離後的片狀細胞培養物予以灌流，藉此抑制自培養基剝離的片狀細胞培養物的皺縮。通常，自培養基剝離片狀細胞培養物後，游離狀態的片狀細胞培養物會因為構成的細胞彼此的細胞間黏接力而受到拉扯而發生收縮，在該過程中容易發生扭轉或皺縮。然而，根據本發明的方法，以低營養等張溶液進行灌流而使細胞的生理活動降低，藉此能夠使細胞間黏接力減弱，而有效地抑制扭轉及皺縮。再者，藉由低營養等張溶液中進行灌流，藉此即使因為扭轉或折彎等使片狀細胞培養物發生重疊，亦能夠防止該地方發生沾黏或黏貼，因此能夠提供高品質的片狀細胞培養物。
本發明的片狀細胞培養物的灌流係藉由使低營養等張溶液接觸經剝離的片狀細胞培養物的表面而進行。如此的灌流，可藉由於經剝離的片狀細胞培養物的表面持續流有低營養等張溶液而進行，亦可將經剝離的片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液而進行。在較佳的一樣貌之中，灌流係對經剝離的片狀細胞培養物的雙面，例如對上表面及下表面進行。再者，灌流亦可交互地對經剝離的片狀細胞培養物的上表面及下表面進行。在另一較佳的樣貌之中，灌流係藉由使經剝離的片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液而進行。片狀細胞培養物的對低營養等張溶液的浸漬，可藉由將經剝離的片狀細胞培養物導入至低營養等張溶液中而實施，亦可將低營養等張溶液裝入裝有經剝離的片 狀細胞培養物的容器而實施。自降低直接操作片狀細胞培養物所致的扭轉及破損等的風險的觀點來看，灌流係藉由將低營養等張溶液裝入裝有經剝離的片狀細胞培養物的容器而使片狀細胞培養物浸漬而實施為佳。
藉由將低營養等張溶液裝入裝有經剝離的片狀細胞培養物的容器，而使片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液的場合，將低營養等張溶液裝入形成有片狀細胞培養物的培養容器為佳。換言之，在培養容器中的培養基上形成片狀細胞培養物後，剝離該片狀細胞培養物，之後不移動經剝離的片狀細胞培養物，將低營養等張溶液裝入該培養容器中。在液體中實施片狀細胞培養物的自培養基的剝離的場合，除去用於剝離的液體後裝入低營養等張溶液為佳。
本發明的灌流方法的一樣貌之中，接續上述(A)，任意地包含以下的步驟(B)：
(B)除去低營養等張溶液，並且裝入新的低營養等張溶液而再次使片狀細胞培養物浸漬。
對低營養等張溶液的浸漬可進行複數次。進行複數次的場合，例如，可藉由將片狀細胞培養物依序導入複數個裝有低營養等張溶液的容器而進行，亦可重覆複數次：將低營養等張溶液裝入裝有片狀細胞培養物的容器浸漬後，除去低營養等張溶液，並且裝入新的低營養等張溶液。
步驟(B)至少進行一次，可重複複數次，例如可重複一次、二次、三次、四次、五次、六次。在較佳的一樣貌之中，再浸漬進行三次。
一般而言，片狀細胞培養物形成在培養基上後，會因為細胞間黏接力強力作用而產生收縮力。如此的收縮力超過培養基與片狀細胞培養物之間的黏接力的場合，片狀細胞培養物會自然地剝離。本發明人等發現，如此的收縮力，自細胞片形成開始至約12小時左右之期間會強力作用。因此，於細胞片形成開始後12小時為止前自培養基剝離片狀細胞培養物的場合，強收縮力會作 用，使片狀細胞培養物的面積縮小(換言之，片狀細胞培養物會收縮)。再者，即使於細胞片形成開始後12小時以後剝離的場合，雖然收縮力的作用減弱因而片狀細胞培養物的面積的變化與細胞片形成開始後12小時比較而言為大，但是片狀細胞培養物仍會有某種程度的收縮。如此的收縮會導致片狀細胞培養物發生扭轉及皺縮。藉由本發明的灌流方法，能夠抑制如此的收縮力所致使發生的扭轉及皺縮，以及其結果所產生的沾黏等。因此，本發明的灌流方法，在較佳的一樣貌之中，於細胞片形成開始12小時為止前實施。在另外的較佳的一樣貌之中，本發明的灌流方法係自片狀細胞培養物的自培養基的剝離起至剝離後6小時為止之期間進行。
在本發明的灌流方法的一樣貌之中，亦可任意地包含以下的步驟(C)：
(C)使片狀細胞培養物伸展。
步驟(C)係指：使剝離或液體的除去的步驟中所扭轉折彎的片狀細胞培養物伸展的步驟。伸展步驟(C)能夠在灌流步驟(A)或再灌流步驟(B)之前、灌流步驟(A)或再灌流步驟(B)之後、灌流步驟(A)與再灌流步驟(B)之間、或有複數次再灌流步驟(B)的場合下在各步驟(B)之間進行。伸展步驟(C)可在低營養等張溶液中進行，亦可在除去低營養等張溶液後進行，並且之後再次添加低營養等張溶液。於低營養等張溶液除去後進行伸展步驟(C)的場合，能夠藉由例如將低營養等張溶液滴下至片狀細胞培養物有重疊的部分，根據必要而振盪等的手法而進行。在低營養等張溶液中進行伸展步驟(C)的場合，能夠藉由使浸漬在低營養等張溶液中的片狀細胞培養物連同容器振盪等的手法而進行。自簡便性的觀點來看，伸展步驟(C)在低營養等張溶液中，將浸漬有片狀細胞培養物的裝有低營養等張溶液的容器予以振盪而進行為佳。
伸展步驟(C)可在常溫下進行，亦可在冷藏條件下，例如在0~10℃或2~8℃等進行。再者，於伸展使用低營養等張溶液的場合，如此的低營養等張溶液同樣可在常溫亦可在冷藏條件，例如0~10℃或2~8℃。
在本發明的灌流方法的一樣貌之中，亦可任意地包含以下的步驟(D)：
(D)使片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液，並就此保存。
步驟(D)只要在步驟(A)之後，何時進行皆可，而在其他步驟結束後，最後進行為佳。
作為供本發明的灌流方法的片狀細胞培養物所能夠使用的細胞，能夠使用上述的細胞。在較佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物包含肌母細胞。在另外的較佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物包含心肌細胞。在更佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物所含的心肌細胞係iPS細胞來源的心肌細胞。
作為用於本發明的灌流方法的低營養等張溶液，能夠使用上述的低營養等張溶液。在較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液為漢克平衡鹽溶液(HBSS)，HBSS(+)為特佳。
再者，自使構成片狀細胞培養物的細胞的生理活動降低的觀點來看，低營養等張溶液為室溫以下為佳。再者，自盡量減少對細胞的損傷的觀點來看，低營養等張溶液為0℃以上為佳。在較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液為0~10℃，更佳為2~8℃。
本發明的一個方面之中，亦可僅以步驟(A)、(B)、(D)構成。
本發明的一個方面係提供：將自培養基剝離的片狀細胞培養物予以保存之際抑制皺縮的方法(以下記載為本發明的保存方法)。
本發明的片狀細胞培養物的保存方法包含以下步驟：
(i)將經剝離的片狀細胞培養物予以浸漬於低營養等張溶液。
浸漬步驟(i)可在常溫下進行，亦可在冷藏條件下，例如在0~10℃或2~8℃等進行。再者，用於浸漬的低營養等張溶液，只要不會對構成片狀細胞培養物的細胞產生損傷則沒有特別限制，可為常溫亦可為冷藏條件，例如0~10℃或2~8℃等。在較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液在浸漬開始時的冷藏條件為例如0~10℃或2~8℃。在另外的較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液在浸漬開始時為常溫。再者，於保存期間，低營養等張溶液的溫度亦可變化。
將片狀細胞培養物用於再生醫療等的場合，隨著時間的經過，片狀細胞培養物的品質會降低，故自培養基剝離片狀細胞培養物後儘速地使用為佳，但是實際上有在應用之前先以某種程度的時間保存的必要。本發明的保存方法，藉由將剝離後的片狀細胞培養物浸漬於低營養等張溶液，而能夠在不使片狀細胞培養物的品質降低的狀態下進行某種程度的時間保存。作為品質降低的要因，能舉出：構成片狀細胞培養物的細胞的活性的降低或片狀細胞培養物的物理特性的變化等。例如，片狀細胞培養物自培養基剝離後，藉由構成細胞彼此的細胞間黏接力而容易產生拉扯、皺縮。根據本發明的保存方法，在浸漬於低營養等張溶液的狀態下保存因而讓細胞的生理活動適當地降低，細胞間黏接力減弱，故能夠使皺縮降低。再者，藉由浸漬於低營養等張溶液中，即使扭轉或折彎等導致片狀細胞培養物發生重疊，由於能夠防止該地方發生沾黏及黏貼，故能夠提供高品質的片狀細胞培養物。
本發明之中「浸漬」係指：片狀細胞培養物浸在低營養等張溶液的狀態。換言之，只要是片狀細胞培養物被液體覆蓋的狀態即為「浸漬」的狀態，即使在靜置狀態下細胞片的一部分露出至液體的外部，例如藉由振盪而成為被液體覆蓋的狀態，一部分露出的狀態也是「浸漬」的狀態。
片狀細胞培養物的浸漬，可藉由將經剝離的片狀細胞培養物導入至裝在保存用容器的低營養等張溶液中而實施，亦可將低營養等張溶液裝入裝 有經剝離的片狀細胞培養物的保存用容器而實施，但是自降低直接操作片狀細胞培養物所致的扭轉及破損等的風險的觀點來看，藉由將低營養等張溶液裝入裝有經剝離的片狀細胞培養物的保存用容器而實施為佳。
保存用容器可為有別於培養容器而另外準備的用於保存的容器，亦可直接將培養容器作為保存用來使用。自降低直接操作片狀細胞培養物所致的扭轉及破損等的風險的觀點來看，直接將培養容器作為保存用來使用為佳。換言之，在培養容器中的培養基上形成片狀細胞培養物後，剝離及洗淨該片狀細胞培養物，之後不移動經剝離的片狀細胞培養物，而將低營養等張溶液裝入該培養容器中。
在本發明的保存方法的一樣貌之中，亦可任意地更包含以下的步驟(ii)：
(ii)使片狀細胞培養物伸展。
步驟(ii)係指：使在剝離或洗淨的步驟中已扭轉折彎的片狀細胞培養物伸展的步驟。伸展步驟(ii)能夠在浸漬步驟(i)之前、浸漬步驟(i)之後或浸漬中進行。伸展步驟(ii)可在低營養等張溶液中進行，亦可除去低營養等張溶液後進行，並且之後再次添加低營養等張溶液。於低營養等張溶液除去後進行伸展步驟的場合，能夠藉由例如將低營養等張溶液滴下至片狀細胞培養物有重疊的部分，根據必要而振盪等的手法而進行。在低營養等張溶液中進行伸展步驟(ii)的場合，能夠藉由使浸漬在低營養等張溶液中的片狀細胞培養物連同容器振盪等的手法而進行。自簡便性的觀點來看，伸展步驟(ii)在低營養等張溶液中，將浸漬有片狀細胞培養物的裝有低營養等張溶液的容器予以振盪而進行為佳。
伸展步驟(ii)可在常溫下進行，亦可在冷藏條件下，例如在0~10℃或2~8℃等進行。再者，於伸展使用低營養等張溶液的場合，如此的低營養等張溶液可為常溫亦可為冷藏條件，例如為0~10℃或2~8℃。而常溫下為佳。
作為用於以本發明的保存方法保存的片狀細胞培養物的細胞，能夠使用上述的細胞。在較佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物包含肌母細胞。在另外的較佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物包含心肌細胞。在更佳的一樣貌之中，片狀細胞培養物所含的心肌細胞係iPS細胞來源的心肌細胞。
作為用於本發明的保存方法的低營養等張溶液，能夠使用上述的低營養等張溶液。在較佳的一樣貌之中，低營養等張溶液為漢克平衡鹽溶液(HBSS)，HBSS(+)為特佳。
在本發明的保存方法之中，保存溫度只要不會對構成片狀細胞培養物的細胞產生損傷則沒有特別限制，自保存後的片狀細胞培養物的使用時的簡便性的觀點來看，不是冷凍條件(低營養等張溶液會結凍的溫度)為佳。自保存操作本身的簡便性的觀點來看，常溫為佳。
<2>本發明的製造方法
本發明的一個方面，亦提供：包含全部的上述本發明的剝離方法、灌流方法及保存方法的片狀細胞培養物的製造方法。
本發明的片狀細胞培養物的製造方法包含以下的步驟(I)~(V)：(I)以不實質地增殖而得以形成片狀細胞培養物的密度將在培養基上構成片狀細胞培養物的細胞予以接種；(II)在細胞培養液中將在(I)經接種的細胞予以層片化，而形成細胞培養物；(III)將在(II)所得到的片狀細胞培養物予以浸漬於低營養等張溶液，並且進行剝離；(IV)將浸漬有經剝離的片狀細胞培養物的低營養等張溶液予以除去，並且裝入新的低營養等張溶液；以及 (V)將低營養等張溶液浸漬的片狀細胞培養物予以保存。
本發明的製造方法的培養基、細胞及低營養等張溶液，能夠使用上述之物。
步驟(I)之中，對培養基的細胞的接種，能夠以已知的任意的手法及條件進行。對培養基的細胞的接種，例如，可藉由將於培養液懸浮有細胞的細胞懸浮液予以注入至培養基(培養容器)而進行。細胞懸浮液的注入，能使用注射器或吸量器等適合於細胞懸浮液的注入操作的器具。
在一樣貌之中，接種的細胞集團包含自上述構成片狀細胞培養物細胞選擇的一種以上的細胞，以自形成上述片狀細胞培養物的細胞選擇的二種以上的細胞所構成為佳。形成片狀細胞培養物的二種以上的細胞之中，最多的細胞的含有率(純度)，在片狀細胞培養物的行程結束時，係為50%以上，60%以上為佳，70%以上較佳，75%以上更佳。在一樣貌之中，本發明的製造方法包含：於接種細胞之前，凍結細胞集團的步驟及解凍該結凍細胞集團的步驟。在該樣貌之中，解凍而得到的細胞集團，之後可在使細胞增殖的狀態下接種，在較佳的一樣貌之中，解凍結凍細胞集團的步驟與步驟(I)之間不含使細胞增殖的步驟。在如此的樣貌中製造的片狀細胞培養物，與解凍結凍細胞集團的步驟與步驟(I)之間包含使細胞增殖的步驟的樣貌所製造的片狀細胞培養物相比，例如細胞激素產生能力、生著能力(engraftability)、血管誘導能力及組織再生能力等的活性高。在此，活性高係指：以比較對象的片狀細胞培養物的活性作為基準，例如而不限定於，活性高5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或100%以上。較佳的一樣貌之中，本發明的包含骨骼肌母細胞的片狀細胞培養物，60%~99%含有骨骼肌母細胞。另外的較佳的一樣貌之中，本發明的包含心肌細胞的片狀細胞培養物含有50%~70%的心肌細胞。
藉由本發明的製造方法所製造的片狀細胞培養物係用於心臟疾病的處置的片狀細胞培養物為佳。因此，在本發明的較佳的一樣貌之中，接種的細胞集團包含骨骼肌母細胞及成纖維細胞。在本發明的另外的較佳的一樣貌之中，接種的細胞集團包含心肌細胞及血管內皮細胞。在本發明的另外的較佳的一樣貌之中，接種的細胞集團包含骨骼肌母細胞、成纖維細胞及血管內皮細胞。
「實質上不增殖而得以形成片狀細胞培養物的密度」係指：以實質上不含成長因子的非增殖系的培養液進行培養的場合，能夠形成片狀細胞培養物的細胞密度。此接種密度係較使用含有成長因子的培養液的手法中者更高，細胞達到融合(confluent)的密度以上亦可。作為如此的密度，沒有限定於此，例如為1.0×105個/cm2以上。接種密度的上限，只要不損及細胞培養物的形成並且細胞不會轉移至分化則沒有特別限制，可為例如未達3.4×106個/cm2。在一樣貌之中，「實質上不增殖而得以形成片狀細胞培養物的密度」係細胞達到融合的密度或以上，或者為融合密度以上。
「細胞實質上不增殖而得以形成片狀細胞培養物的密度」，在某一樣貌之中為1.0×105~3.4×106個/cm2，另外的樣貌之中為3.0×105~3.4×106個/cm2，進一步另外的樣貌中為3.5×105~3.4×106個/cm2，進一步另外的樣貌中為1.0×106~3.4×106個/cm2，進一步另外的樣貌中為3.0×105~1.7×106個/cm2，另外的樣貌之中為3.5×105~1.7×106個/cm2，進一步另外的樣貌中為1.0×106~1.7×106個/cm2。上述範圍，只要上限未達3.4×106個/cm2，亦可包含上限及下限兩者，或其中一者。因此，上述密度亦可為：例如，3.0×105個/cm2以上且未達3.4×106個/cm2(包含下限且不含上限)、3.5×105個/cm2以上且未達3.4×106個/cm2(包含下限且不含上限)、1.0×106個/cm2以上且未達3.4×106個/cm2(包含下限且不含上限)、超過1.0 ×106個/cm2且未達3.4×106個/cm2(不含上限及下限)、超過1.0×106個/cm2且為1.7×106個/cm2以下(雖不含下限但是包含上限)。
步驟(II)之中，將經接種的細胞予以層片化的步驟，能夠以已知的任意的手法及條件進行。如此的手法的非限定例，記載於例如專利文獻1 WO 2014/185517等。細胞的層片化，被認為是藉由細胞彼此透過黏接分子或細胞外間質等的細胞間黏接機制而互相黏接而達成。因此，將經接種的細胞予以層片化的步驟，能夠藉由例如在形成細胞間黏接的條件下培養細胞來達成。如此的條件，只要能形成細胞間黏接可為任意的條件，通常只要是與一般的細胞培養條件為同樣的條件就能夠形成細胞間黏接。作為如此的條件，能舉：例如，以約37℃、5% CO2的培養。再者，培養能夠在通常的壓力下(大氣壓下、非加壓下)進行。培養能夠在任意的大小及形狀的容器進行。片狀細胞培養物的大小及形狀，能夠藉由培養容器的細胞附著面的大小、形狀的調整，或於培養容器的細胞附著面設置期望的大小、形狀的模框並在其內部培養細胞等而任意地調節。本發明之中，亦有將用於將經接種的細胞予以層片化的培養稱為「層片化培養」。
在本發明的一樣貌之中，接種細胞中含有肌母細胞的場合，細胞的培養係在規定的期間內，較佳為肌母細胞不轉移至分化的期間內進行。因此，在此樣貌之中，肌母細胞在培養期間中維持未分化的狀態。向肌母細胞的分化的轉移，能夠以所屬技術領域中具有通常知識者所知道的任意的方法進行評估。例如，骨骼肌母細胞的場合，能夠將MHC的發現、肌酸激酶(CK)活性、細胞的多核化、肌肉細胞的形成等定為分化的指標。培養期間能夠定為：例如，約48時間以內、約40時間以內、約36時間以內、約30時間以內、約26時間以內、約12時間以內。在特定的樣貌之中，培養期間可為2時間~約36時間、約2時間~約30時間、約2時間~約26時間、約2時間~約12時間等。
關於步驟(III)，能夠使用上述的本發明的剝離方法。
關於步驟(IV)，能夠使用上述的本發明的洗淨方法。
關於步驟(V)，能夠使用上述的本發明的保存方法。
關於步驟(VI)，能夠使用上述的本發明的振盪方法。
〔實施例〕
參考以下的範例而更詳細地說明本發明，但是此為表示本發明的特定的具體範例，本發明並非限定於此。
<片狀細胞培養物的製造> 範例1 培養基的切換
使用自人類骨骼肌藉由常規方法所調製的骨骼肌母細胞(包含成纖維細胞)而調製了片狀細胞培養物。於感溫性培養皿(UpCell® 12孔multiwell，cell seed)，將懸浮在含有20%人類血清的DMEM/F12培養基(Thermo Fisher Scientific Inc.)的人類骨骼肌母細胞及人類成纖維細胞的細胞混合物，以3.7×106個/well的方式接種，並且在37℃、5%CO2下進行2~12小時的層片化培養。層片化培養後，自培養皿除去培養基，添加700μL的經冷卻的HBSS(+)(Thermo Fisher Scientific Inc.)，並除去。將其重複進行，並在第一次或第二次的緩衝液添加後靜置10分鐘，之後平穩地進行移液而自培養皿使片狀細胞培養物完全地剝離。
經剝離的片狀細胞培養物有扭轉或重疊的場合，進行振盪操作而除去扭轉或重疊。結果得到沒有皺縮及沾黏的片狀細胞培養物。藉由除去培養基而置換成HBSS(+)及振盪操作，而抑制了新的細胞間黏接的進行。沒有除去培養基的場合或放置片狀細胞培養物的扭轉或重疊的場合(沒有振盪操作的場合)，片狀細胞培養物發生了扭轉及皺縮，以及起因於此的沾黏或黏貼。結果表示於第1圖。
範例2 雙面的灌流
自含有在範例1所得到的經剝離的片狀細胞培養物的培養皿，將HBSS(+)除去，添加新的常溫的HBSS(+)而使片狀細胞培養物浸漬，藉此將雙面(頂面及底面)予以灌流。再一次進行如此的除去及添加的步驟。除去HBSS(+)後，加入新的HBSS(+)1mL(合計重複三次除去及添加)後，在室溫下靜置。
經剝離的片狀細胞培養物有扭轉或重疊的場合，進行振盪操作以伸展，而除去扭轉及重疊。結果得到沒有皺縮及沾黏的片狀細胞培養物。藉由灌流片狀細胞培養物的雙面，而抑制了新的細胞間黏接的進行。放置片狀細胞培養物的扭轉或重疊的場合(沒有灌流操作的場合)，片狀細胞培養物發生了皺縮及沾黏。結果表示於第2圖。
範例3 片狀細胞培養物的保存
將範例2所得到的片狀細胞培養物繼續在常溫的HBSS(+)中保存片狀細胞培養物10小時~5天。使用了使片狀細胞培養物充分浸漬在培養皿中的程度的HBSS(+)。
保存的片狀細胞培養物有扭轉或重疊的場合，進行振盪操作以伸展，而除去扭轉及重疊。結果得到沒有皺縮及沾黏的片狀細胞培養物。藉由在常溫下保存片狀細胞培養物，而抑制了新的細胞間黏接的進行。放置片狀細胞培養物的扭轉或重疊的場合(沒有振盪操作的場合)，片狀細胞培養物發生了皺縮及沾黏。結果表示於第3圖。

Claims (12)

  1. 一種片狀細胞培養物的製造方法，係在將形成在培養基上的片狀細胞培養物予以剝離之際抑制皺縮，該片狀細胞培養物的製造方法包含下列步驟：(a)在該培養基上形成該片狀細胞培養物；(b)在形成有該片狀細胞培養物的該培養基上添加低營養等張溶液，而將至少一部分黏接在該培養基的該片狀細胞培養物的上表面予以浸漬在該低營養等張溶液；(c)將添加在形成有該片狀細胞培養物的該培養基上的該低營養等張溶液予以除去；(d)在形成有該片狀細胞培養物的該培養基上進一步添加另一低營養等張溶液；(e)在添加的另一該低營養等張溶液中，將該培養基上的該片狀細胞培養物予以靜置；(f)在另一該低營養等張溶液中將該片狀細胞培養物予以剝離，(g)以另一該低營養等張溶液將該片狀細胞培養物的兩面予以灌流；(h)在該片狀細胞培養物有扭轉或重疊的場合，將已剝離的該片狀細胞培養物予以伸展；以及(i)以常溫保存已剝離的該片狀細胞培養物，從而得到五日內不會皺縮的片狀細胞培養物。
  2. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基係以血清覆蓋。
  3. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基係以感溫材料覆蓋。
  4. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物含有肌母細胞。
  5. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液為2至8℃。
  6. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該低營養等張溶液係選自漢克平衡鹽溶液、厄爾平衡鹽溶液或葡萄糖等張溶液。
  7. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中藉由浸漬而使殘存於該片狀細胞培養物的製造步驟來源雜質被除去。
  8. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中在步驟(e)中，在添加的另一該低營養等張溶液中，將該培養基上的該片狀細胞培養物予以靜置10分鐘以上。
  9. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中在步驟(g)中，以另一該低營養等張溶液將該片狀細胞培養物的雙面予以灌流，重複進行除去及添加總共三次。
  10. 如請求項1所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該片狀細胞培養物的伸展係藉由將裝有該低營養等張溶液的容器予以振盪而進行，該低營養等張溶液係浸漬有該片狀細胞培養物。
  11. 如請求項1至7中任一項所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該皺縮係起因於該片狀細胞培養物之中的細胞間黏接。
  12. 如請求項10所述之片狀細胞培養物的製造方法，其中該伸展係以該容器的中央為中心而旋轉。
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