TWI745655B - 片狀細胞培養物的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明的目的在於提供一種片狀細胞培養物的製造方法、以該方法製造的片狀細胞培養物、包含該片狀細胞培養物的組成物、移植片及醫療製品、及運用該片狀細胞培養物的疾病的處理方法，該片狀細胞培養物適合用各種疾病，特別是心臟疾病的處理，其中該片狀細胞培養物的製造方法，包含將含有至少一種形成層片的細胞的細胞團接種於一培養基材而形成一片狀細胞培養物，以及將所形成的片狀細胞培養物自培養基材剝離，其中該片狀化係藉由2至12小時的培養以進行。

Description

片狀細胞培養物的製造方法

本發明係關於一種片狀細胞培養物的處理方法，以該方法製造的片狀細胞培養物，含有該片狀細胞培養物的組成物、移植片及醫療製品，以及使用該片狀細胞培養物的疾病的處理方法，該片狀細胞培養物係適用於各種疾病，特別是心臟疾病的處理。

近年來，為了修復損傷的組織等，進行了移植各種細胞的的嘗試，例如為了修復由於狹心症、心肌梗塞等缺血性心臟病而損傷的心肌組織，嘗試有胎兒心肌細胞、骨骼肌肌母細胞、間質幹細胞、心臟幹細胞、ES細胞(Embryonic stem cell)及iPS細胞(Induced pluripotent stem cell)等的利用(非專利文獻1)。

作為此類嘗試的一環，開發出了利用支架所形成的細胞構造物，以及將細胞形成為片狀的片狀細胞培養物(專利文獻1、非專利文獻2)。

關於片狀細胞培養物對治療的運用，有對於燒傷等皮膚損傷的培養表皮層片的利用、對於角膜損傷的角膜上皮片狀細胞培養物的運用及對食道癌內視鏡切除的口腔黏膜片狀細胞培養物的利用等的研討有所進展，其中一部分已進入臨床應用的階段。

〔先前技術文獻〕

〔專利文獻〕

〔專利文獻1〕日本特表2007-528755號公報

〔非專利文獻〕

〔非專利文獻1〕Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41.

〔非專利文獻2〕Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4.

本發明的目的在於提供一種片狀細胞培養物的處理方法，以該方法製造的片狀細胞培養物，含有該片狀細胞培養物的組成物、移植片及醫療製品，以及使用該片狀細胞培養物的疾病的處理方法，該片狀細胞培養物係適用於各種疾病，特別是心臟疾病的處理。

隨著片狀細胞培養物的臨床應用的進展，變得需要提供有高品質、操作容易且能夠簡易地製造的片狀細胞培養物。本發明人，於改良片狀細胞培養物的研究中，發現在使用感溫性培養皿的用以形成片狀細胞培養物的培養中，所形成的片狀細胞培養物會自然地剝離的狀況。此現象之造成在於隨著片狀細胞培養物的形成而構成層片的細胞的細胞間接合力增加進而超越了細胞與培養基材的接合力的結果所引起，基於這個假說而持續進行研究後，面臨了片狀細胞培養物發生自然剝離後，若是於游離狀況下不施以適當的處理而放置，則會有片狀細胞培養物由於細胞間接合力而收縮，蜷縮而黏合，因而難以作為片狀細胞 培養物使用的新的問題。為了解決此問題進一步持續進行研究後，發現藉由細胞接種後約2小時的培養能夠形成具有充分強度的片狀細胞培養物，以及若是片狀細胞培養物形成於培養基材上後，在自然剝離前人為地將片狀細胞培養物自培養基材剝離，則不易產生收縮，能夠防止黏合，進一步進行研究，而使本發明完成。

即本發明係關於如下所述之物：

[1]一種片狀細胞培養物的製造方法，包含：步驟一，將含有至少一種形成層片的細胞的細胞團接種於一培養基材；步驟二，使步驟一中接種的細胞團於一細胞培養液中片狀化，而形成一片狀細胞培養物；以及步驟三，將於步驟二所形成的該片狀細胞培養物自該培養基材剝離，其中，步驟二中的片狀化係藉由2至12小時的培養以進行。

[2]如[1]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該形成層片的細胞為肌母細胞或心肌細胞。

[3]如[1]或[2]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該細胞培養液中包含同種血清。

[4]如[1]至[3]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基材係以血清覆蓋。

[5]如[1]至[4]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基材係以感溫材料覆蓋。

[6]如[1]至[5]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中於步驟一中，將細胞團以7.5×10⁵個/cm²至3.0×10⁶個/cm²的密度接種。

[7]如[1]至[6]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中片狀化係藉由2至12小時、2至11.5小時、2至11小時、2至10小時、2至9小時、2至8小時、2至7小時、2至6小時、2至5小時或2至4小時的培養以進行。

[8]如[7]所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中片狀化係藉由2至6小時的培養以進行。

[9]如[1]至[8]中所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中剝離後的該片狀細胞培養物，具有相對於該培養基材的面積的35%以上的面積。

[10]一種處理方法，係用以處理藉由運用片狀細胞培養物而改善的疾病，其中包含將藉由[1]至[9]所述的製造方法所製造的片狀細胞培養物運用於必要的對象的步驟。

依據本發明，由於能夠縮短在接種細胞後至得到剝離的片狀細胞培養物的時間，而能夠短時間且效率良好地得到片狀細胞培養物。又由於在將片狀細胞培養物在形成層片後且自然剝離前人為地剝離，藉此能夠成為即使在剝離後暫時浸漬於液中亦不易產生收縮及黏合的平坦且無皺摺的片狀細胞培養物，而能夠長時間保存。進一步，由於片狀細胞培養物自培養基材剝離後的收縮受到抑制，即使使用相同培養基材亦能夠得到較習知之物更大面積的片狀細胞培養物。

圖1係顯示經過各個時間的培養，而進行剝離作業後的片狀細胞培養物的狀況的相片，其中(A)為培養30分鐘、(B)為培養1小時、(C)為培養2小時、(D)為培 養4小時、(E)為培養5.5小時、(F)為培養6小時、(G)為培養11.5小時且(H)為培養12小時的相片。

以下，詳細說明關於本發明。

本說明書中除非有另外定義，否則本說明書中所使用的所有技術用語及科學用語，皆與本領域的技術人員所理解之有相同的意義。本案說明書中所參照的所有專利、申請專利、已公開的申請及其他出版品，為參照其全文而引用於本說明書。又本說明書中所參照的出版品與本說明書的記述若有矛盾時，以本說明書的記載為優先。

本發明中的「片狀細胞培養物」，為細胞互相連接而形成片狀之物。細胞彼此能夠直接(包含透過黏著分子等細胞元素之物)及/或透過介質而互相連結。作為介質，雖然只要為能夠將細胞間以至少物理性(機械性)連接的物質則無特別限定，但可列舉例如細胞外基質。介質以源自細胞之物為佳，特別是源自於構成細胞培養物的細胞之物。細胞能夠以至少物理性(機械性)連接，亦能夠以功能性，例如化學性、電性地連接。片狀細胞培養物能夠為以單一細胞層所構成者(單層)，亦能夠由二層以上的細胞層所構成(層積(多層)體，例如二層、三層、四層、五層、六層)。又片狀細胞培養物，亦能夠為細胞不顯示明確的層次構造，而具有超過單一細胞的厚度的三次元構造。例如亦能夠在片狀細胞培養物的垂直剖面中，細胞不於水平方向均勻排列，而以不均勻(例如為馬賽克狀)配置的狀態存在。

片狀細胞培養物，以不包含支架(支承體)為佳。支架係為了使細胞附著於其表面上及/或其內部，以維持片狀細胞培養物的物理上的一體性而被使 用於所屬技術領域，雖已知有例如聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene difluoride,PVDF)製的膜等，但本發明的片狀細胞培養物，即使沒有如此的支架亦能夠維持物理上的一體性。又本發明的片狀細胞培養物，以僅由源自構成片狀細胞培養物的細胞的物質所構成，而不含有除此之外的物質為佳。

構成片狀細胞培養物的細胞，只要是能夠形成片狀細胞培養物之物則無特別限定，包含例如黏著細胞(附著性細胞)。黏著細胞，包含例如黏著性的體細胞(例如心肌細胞、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、肝細胞、胰腺細胞、腎細胞、腎上腺細胞、牙周膜細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞及軟骨細胞等)及幹細胞(例如肌母細胞、心臟幹細胞等組織幹細胞，胚胎幹細胞，誘導性多潛能幹細胞(induced pluripotent stem,iPS)細胞等多能性幹細胞，及間葉系幹細胞等)等。體細胞亦能夠為自幹細胞、特別是自iPS細胞所分化之物(源自iPS細胞的黏著細胞)。作為構成片狀細胞培養物的細胞的非限定例子，可列舉例如肌母細胞(例如骨骼肌母細胞等)，間葉系幹細胞(例如源自骨髓、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、肌肉組織、子宮內膜、胎盤及臍帶血之物等)、心肌細胞、纖維母細胞、心臟幹細胞、胚胎幹細胞、iPS細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞(例如口腔黏膜上皮細胞、視網膜色素上皮細胞、鼻腔黏膜上皮細胞等)、內皮細胞(例如血管內皮細胞等)、肝細胞(例如肝實質細胞等)、胰腺細胞(例如胰島細胞等)、腎細胞、腎上腺細胞、牙周膜細胞、牙齦細胞、骨膜細胞及皮膚細胞等。作為源自iPS細胞的非限定例子，可列舉源自iPS細胞的心肌細胞、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、肝細胞、胰腺細胞、腎細胞、腎上腺細胞、牙周膜細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞及軟骨細胞等。

本發明中的「肌母細胞」，為橫紋肌細胞的前驅細胞，包含骨骼肌母細胞及心肌母細胞。

本發明中的「骨骼肌母細胞」，為存在於骨骼肌的肌母細胞。骨骼肌母細胞在所屬技術領域中為人所知，能夠自骨骼肌藉由任意的已知方法(例如日本特開2007-89442號公報所記載的方法等)調製，亦能夠以商業手段取得(例如Lonza.Cat# CC-2580)。骨骼肌母細胞，不限定地能夠藉由CD56、α7整聯蛋白、肌球蛋白重鏈IIa、肌球蛋白重鏈IIb、肌球蛋白重鏈IId(IIx)、MyoD、Myf5、Myf6、肌細胞生成素、結蛋白及PAX3等標記以辨識。於特定的狀態下，骨骼肌母細胞為CD56陽性。在更加特定的狀態下，骨骼肌母細胞為CD56陽性及結蛋白陽性。骨骼肌母細胞，亦能夠源自於具有骨骼肌的任意生物，不限定地例如人類、非人靈長類、囓齒類(小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等)、兔、犬、貓、豬、馬、牛、山羊及綿羊等哺乳動物。在一狀態下，骨骼肌母細胞為哺乳動物的骨骼肌母細胞。在特定的狀態下，骨骼肌母細胞為人類骨骼肌母細胞。

本發明中的「心肌母細胞」，為存在於心肌的肌母細胞。心肌母細胞在所屬技術領域中為人所知，能夠藉由Isl1等的標記以辨識。心肌母細胞，亦能夠源自於具有心肌的任意生物，不限定地例如人類、非人靈長類、囓齒類(小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等)、兔、犬、貓、豬、馬、牛、山羊及綿羊等哺乳動物。在一狀態下，心肌母細胞為哺乳動物的心肌母細胞。在特定的狀態下，心肌母細胞為人類心肌母細胞。

本發明中的「心肌細胞」，為具有心肌細胞特徵的細胞，作為心肌細胞的特徵，可不限定地列舉例如心肌細胞標記的表現、及存在有自律脈動等。作為心肌細胞標記的非限定例子，可列舉例如c-TNT(cardiac troponin T)、CD172a(別 名SIRPA或SHPS-1)、KDR(別名CD309、FLK1或VEGFR2)、PDGFRA、EMILIN2及VCAM等。作為心肌細胞，以源自iPS細胞的心肌細胞為較佳例示。

構成片狀細胞培養物的細胞，能夠源自於得以進行藉由片狀細胞培養物的治療的任意生物。此類生物不限定地包含例如人類、非人靈長類、犬、貓、豬、馬、山羊、綿羊、囓齒類動物(小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠等)及兔等。又構成片狀細胞培養物的細胞種類的數量雖無特別限定，能夠僅以一種細胞夠成，但亦能夠為使用二種細胞以上之物。當形成片狀細胞培養物的細胞為二種以上時，數量最多的細胞的含有比率(純度)，在片狀細胞培養物的形成結束時為50%以上、以60%以上為佳、以70%以上較佳、以75%以上更佳。

細胞能夠為異種來源細胞亦能夠為同種來源細胞。此處所謂「異種來源細胞」，為於當片狀細胞培養物被用於移植時，源自與接受者為不同種的生物的細胞。例如，接受者為人類時，源自猴或豬的細胞等便屬於異種細胞。又「同種來源細胞」為源自於與接受者為同種的生物的細胞。例如，當接受者為人類時，源自人類的細胞等便屬於同種細胞。同種來源細胞包含自己來源細胞(亦稱為自己細胞或自體細胞)，即源自於接受者的細胞，以及同種非自己來源細胞(亦稱為異體細胞)。由於自己來源細胞進行移植亦不會產生排斥反應，於本發明中較佳。但是，亦能夠使用異種來源細胞或同種非自己來源細胞。使用異種來源細胞或同種非自己來源細胞時，為了抑制排斥反應，免疫抑制處理變得必要。另外，本說明書中，亦將自己來源細胞以外的細胞，即異種來源細胞及同種非自己來源細胞總稱為非自己來源細胞。於本發明的一型態中，細胞為自體細胞或異體細胞。於本發明的一型態中，細胞為自體細胞。於本發明的其他型態，細胞為異體細胞。

片狀細胞培養物，能夠以已知的任意方法(請參照例如專利文獻1、專利文獻2、日本特開2010-081829、日本特開2011-113068等)製造。片狀細胞培養物的製造方法，典型而言，包含將細胞接種於培養基材步驟，將接種的細胞片狀化的步驟，以及將所形成的片狀細胞培養物自培養基材剝離的步驟，但並不限定於此。在將細胞接種於培養基材的步驟之前，亦能夠進行凍結細胞的步驟及解凍細胞的步驟。進一步，亦能夠在解凍細胞的步驟之後進行洗淨細胞的步驟。此些各步驟，能夠以適合於片狀細胞培養物的製造的已知任意方法以進行。本發明的製造方法，亦能夠包含製造片狀細胞培養物的步驟，此狀況下，製造片狀細胞培養物的步驟，作為副步驟亦能夠包含一個或二個以上的上述與片狀細胞培養物的製造方法相關的步驟。在一狀態下，在解凍細胞的步驟後，且在將細胞接種於培養基材的步驟之前不包含使細胞增殖的步驟。

培養基材只要為細胞得以於其上形成細胞培養物之物則無特別限定，包含例如各種材質的容器及容器中的固體或半固體的表面等。容器以不使培養液等的液體穿透的構造、材料為佳。作為如此材料，不限定地可列舉聚乙烯、聚丙烯、鐵氟龍^®、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龍6,6、聚乙烯醇、纖維素、矽膠、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺及金屬(例如鐵、不鏽鋼、鋁、銅及黃銅)等。又容器以具有至少一個平坦表面為佳。作為如此容器的例子，不限定地可列舉具有以能夠形成細胞培養物的培養基材所構成的底面、及無液體穿透性的側面的培養容器。作為如此的培養容器的特定例子，不限定地可列舉細胞培養皿及細胞培養瓶等。容器的底面能夠為透明或不透明。若容器的底面為透明，則能夠自容器的裏側進行細胞的觀察、計數等。又容器內部亦能夠具有固體或是半固體的表面。作為固體的表面，可 列舉如上述的各種材料的平板或容器等，作為半固體的表面，可列舉軟質的聚合物基質。培養基材能夠使用上述材料以製作，亦能夠使用市售之物。作為較佳的培養基材，不限定地可列舉適合於片狀細胞培養物的形成的具有附著性表面的基材。具體而言，具有親水性表面的基材，可列舉例如經過電暈放電處理的聚苯乙烯、於表面包覆有膠原蛋白或親水性聚合物等親水性化合物的基材、以及進一步的於表面包覆有膠原蛋白、纖維接合素、層連結蛋白、玻連蛋白、蛋白多醣及糖胺聚醣等細胞外間質，鈣粘蛋白家族，選滯蛋白家族，整連蛋白家族等細胞附著因子等的基材等。又如此基材有市售之物(例如Corning^® TC-Treated Culture Dish、Corning等)。培養基材的整體或是部分能夠為透明或不透明。

培養基材亦能夠為表面以會受刺激，如感溫或感光而物理性質變化的材料所披覆。作為如此材料，不限定地可使用例如由(甲基)丙烯醯胺化合物、N-烷基取代的(甲基)丙烯醯胺衍生物(例如N-乙基丙烯醯胺、N-n-丙基丙烯醯胺、N-n-正丙基甲基丙烯醯胺、N-異丙基丙烯醯胺、N-異丙基甲基丙烯醯胺、N-環丙基丙烯醯胺、N-環丙基甲基丙烯醯胺、N-乙氧基乙基丙烯醯胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯醯胺、N-四氫糠基丙烯醯胺及N-四氫糠基甲基丙烯醯胺等)、N,N-二烷基取代的(甲基)丙烯醯胺衍生物(例如N,N-二甲基(甲基)丙烯醯胺、N,N-乙基甲基丙烯醯胺、N,N-二乙基丙烯醯胺等)、具有環基的(甲基)丙烯醯胺衍生物(例如1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-嗎啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-嗎啉等)、或是乙烯基醚衍生物(例如甲基乙烯基醚)的均質聚合物或共聚物所構成的感溫材料；具有偶氮苯基的吸光性聚合 物、三苯基甲烷無色氧化氫的乙烯基衍生物與丙烯醯胺單體的共聚物、以及包含螺苯並吡喃的N-異丙基丙烯醯胺凝膠等感光材料等等已知之物(參照例如日本特開平2-211865、日本特開2003-33177)。能夠藉由給予此些的材料指定的刺激而使其例如親水性或疏水性的物理性質改變，而促進附著於該材料上的細胞培養物的剝離。市售有以感溫材料所披覆的培養皿(例如CellSeed Inc.製的UpCell^®)，能夠將此些使用於本發明的製造方法。

培養基材，雖亦能夠為多種形狀，但以平坦為佳。又其面積雖無特別限定，但以例如1cm²至200cm²、約2cm²至100cm²、約3cm²至50cm²即可。例如作為培養基材可列舉直徑10cm的圓形培養皿。此時面積為56.7cm²。

培養基材亦能夠以血清覆蓋(披覆或是包覆)。藉由使用以血清覆蓋的培養基材，能夠形成更加高密度的片狀細胞培養物。「以血清覆蓋」，為於培養基材的表面附著有血清成分的狀態。此狀態能夠不限定地例如藉由將培養基材以血清處理所得。以血清進行的處理，包含使血清接觸培養基材，以及應需求進行指定期間的培養。

作為血清，能夠使用異種血清及/或同種血清。異種血清為當將片狀細胞培養物使用於移植時，源自於與接受者相異物種的生物的血清。例如當接受者為人類時，源自於牛或馬的血清，例如胎牛血清(FBS、FCS)、仔牛血清(CS)、馬血清(HS)等屬於異種血清。又「同種血清」為源自於與接受者相同物種的生物的血清。例如當接受者為人類時，人類血清屬於同種血清。同種血清包含自己血清(亦稱自體血清)，即源自於接受者的血清；以及源自於接受者以外的同種個體的同種異體血清。另外，本說明書中，亦將自己血清以外的血清，即異種血清及同種異體血清總稱為非自己血清。

用以包覆培養基材的血清，能夠為市售，或是自期望的生物採取的血液藉由習知方法調製。具體而言，能舉例如將採取的血液於室溫放置約20分鐘至60分鐘使其凝固，再將其以約1000×g至約1200×g進行離心分離，而採取上清液的方法。

於培養基材上培養時，能夠將血清以原液使用，或是稀釋而使用。稀釋能夠以任意的媒介，不限定地例如水、生理食鹽水、各種緩衝液(例如PBS、HBSS等)、各種液體培養基(例如DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等)等以進行。稀釋濃度只要為血清成分能夠附著於培養基材上則無特別限定，能夠為例如約0.5%至約100%(v/v)、以約1%至約60%(v/v)較佳、以約5%至約40%(v/v)更佳。

培養時間亦只要為血清成分能夠附著於培養基材上則無特別限定，能夠為例如約1小時至約72小時、以約2小時~約48小時為佳、以約2小時至約24小時較佳、以約2小時至約12小時更佳。於本發明中，藉由如此培養時間進行培養後，不進行進一步的培養，而進行剝離片狀細胞培養物的步驟。培養溫度亦只要為血清成分得以附著於培養基材上則無特別限制，能夠為例如約0℃至約60℃、以約4℃至約45℃為佳、以室溫至約40℃更佳。

亦能夠於培養後將血清廢棄。作為血清的廢棄方法，能夠使用藉由移液器的抽取、傾析等慣用的液體廢棄方法。於本發明的適切的型態中，亦能夠於廢棄血清後，以無血清洗淨液洗淨培養基材。作為無血清洗淨液，只要為不含有血清且不對附著於培養基材的血清成分帶來不良影響的液體媒介則沒有特別限定，能夠以例如水、生理食鹽水、各種緩衝液(例如PBS、HBSS等)、 各種液體培養基(例如DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等)等以進行。作為洗淨方法，能夠使用慣用的培養基材洗淨方法，不限定地例如於培養基材上加入無血清洗淨液並攪拌指定時間(例如為約5秒至約60秒)後，將洗淨液廢棄的方法。

於本發明中，亦能夠將培養基材以生長因子包覆。此處「生長因子」為使細胞的增殖相較於不具有該物的狀況下為增進的任意物質，包含例如上皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞成長因子(FGF)等。以生長因子進行的培養基材的包覆方法、廢棄方法及洗淨方法，除了培養時的稀釋濃度為例如約0.0001μg/mL至約1μg/mL、以約0.0005μg/mL至約0.05μg/mL為佳、以約0.001μg/mL至約0.01μg/mL更佳之外，基本上與血清相同。

本發明中，培養基材亦能夠以類固醇劑包覆。此處的「類固醇劑」，為具有類固醇核心的化合物中，可能對生物體產生腎上腺皮質功能障礙、庫欣症候群等的不良影響之物。作為此類化合物，不限定地包含例如皮質醇、潑尼松龍、曲安奈德、地塞米松及倍他米松等。藉由類固醇劑進行的培養基材的包覆方法、廢棄方法及洗淨方法，除了培養時的稀釋濃度，以地塞米松為例，如約0.1μg/mL至約100μg/mL、以約0.4μg/mL至約40μg/mL為佳、以約1μg/mL至約10μg/mL較佳之外，基本上與血清相同。

培養基材能夠以血清、生長因子及類固醇劑中的任一種包覆，亦能夠以此些的任意組合，即血清及生長因子、血清及類固醇劑、血清及生長因子及類固醇劑、或是生長因子及類固醇劑的組合以包覆。以複數種成分包覆時，能夠混合此些成分同時包覆，亦能夠以分別的步驟包覆。

培養基材，能夠在以血清等包覆後立即接種細胞，亦能夠在包覆後保存，之後再接種細胞。經包覆的基材，藉由保存在約4℃以下、以-20℃以下為佳、以-80℃以下較佳，而能夠長期保存。

對培養基材的細胞接種，能夠以已知的任意方法及條件已進行。對培養基材的細胞接踵，亦能夠藉由例如將使細胞懸浮於培養液的細胞懸浮液注入於培養基材(培養容器)以進行。細胞懸浮液的注入，能夠使用滴管或移液器等，適合細胞懸浮液的注入操作的器具。

<1>本發明的製造方法

作為本發明的一面，提供高品質的片狀細胞培養物的製造方法。

本發明的製造方法包含以下內容：(i)將含有形成層片的細胞的細胞團接種於一培養基材；(ii)使上述(i)中接種的細胞團於一細胞培養液中片狀化，而形成一片狀細胞培養物；以及(iii)將於上述(ii)所形成的片狀細胞培養物自培養基材剝離。

於(i)中，於培養基材上接種含有形成層片的細胞的細胞團。形成層片的細胞，只要是作為得以構成片狀細胞培養物的細胞的上述細胞則無特別限定。細胞團中能夠至少含有一種形成層片的細胞、亦能夠含有兩種以上的形成層片的細胞、亦能夠含有形成層片的細胞以外的細胞。本發明的一型態中，細胞團所包含的至少一種形成層片的細胞為肌母細胞、以骨骼肌母細胞為佳。於此型態中，細胞團能夠進一步包含有纖維母細胞。即可列舉包含有作為形成層片的細胞的肌母細胞及纖維母細胞的片狀細胞培養物。於本發明的另一型態中，細胞團所包含的至少一種形成層片的細胞為心肌細胞。於此型態中，細胞 團能夠進一步包含有血管內皮細胞。即可列舉包含有作為形成層片的細胞的心肌細胞及血管內皮細胞的片狀細胞培養物。於本發明的又另一型態中，細胞團所包含的至少一種形成層片的細胞為間葉系幹細胞。於此型態中，細胞團能夠進一步包含有血管內皮細胞。

被接種的細胞密度，雖然只要為得以形成片狀細胞培養物的密度則無特別限定，但於較佳的型態中，細胞團為以達到融合(confluent)或在其以上的密度接種。本發明中，「達到融合的密度」，係指在接種細胞時，設想為藉由經接種的細胞，將培養容器的接合表面無空隙地覆蓋整面的密度。例如，於接種時，設想為細胞彼此接觸的密度、產生接觸抑制的密度、或是藉由接觸抑制而實質上使細胞的增殖停止的密度。

細胞團的接種密度的非限定例，包含約7.1×10⁵個/cm²至約3.0×10⁶個/cm²、約7.3×10⁵個/cm²至約2.8×10⁶個/cm²、約7.5×10⁵個/cm²至約2.5×10⁶個/cm²、約7.5×10⁵個/cm²至約3.0×10⁶個/cm²、約7.8×10⁵個/cm²至約2.3×10⁶個/cm²、約8.0×10⁵個/cm²至約2.0×10⁶個/cm²、約8.5×10⁵個/cm²至約1.8×10⁶個/cm²、約9.0×10⁵個/cm²至約1.6×10⁶個/cm²等的密度。另外，此些密度，若無特別記載，則為細胞團所含有的所有細胞的密度。

進一步於別的型態中，接種能夠於實質上不含有生長因子的細胞培養液中，能夠包含於細胞團的至少一種的形成層片的細胞實質上不增殖的密度以進行。此型態中，能夠包含於細胞團的其他細胞，能夠為即使受到增殖抑制亦得以增殖的密度。

得以使用於本發明的方法的培養基材，如上述所示。以一較佳的型態中，培養基材能夠以血清所披覆。於另一較佳的型態中，培養基材能夠以感溫性材料所披覆。於一更佳的型態中，培養基材能夠以感溫性材料及血清所披覆。

於(ii)中，經接種的細胞團，於細胞培養液中培養而層片化，形成為片狀細胞培養物。

經接種的細胞的層片化，能夠以已知的任意方法及條件以進行。此方法的非限定例子，例如專利文獻1、WO 2014/185517等所記載。細胞的層片化，可認為是細胞彼此藉由透過接合分子、細胞外基質等細胞間接合機制而彼此接合以達成。因此，經接種細胞的層片化，能夠藉由例如將細胞於形成細胞間接合的條件下進行培養以達成。如此條件，雖然只要是能夠形成細胞間接合即可，但通常以與一般的細胞培養條件相同的條件便得以形成細胞間接合。作為如此條件，可列舉例如在約37℃、5% CO₂下的培養。又培養能夠在通常的壓力下(大氣壓下、非加壓下)進行。培養能夠於任意大小及形狀的容器中進行。片狀細胞培養物的大小及形狀，能夠藉由調整培養容器的細胞附著面的大小、形狀而調整，或是於培養容器的細胞附著面，設置預期的大小、形狀的模具，並於其內部培養細胞而任意調節。本說明書中，亦將用以將經接種的細胞層片化的培養稱為「層片化培養」。由於層片化培養，培養基材上(培養容器內)的片狀細胞培養物的厚度會減少。即雖在接種後，細胞沉降後，由於之後的層片化培養基材上的細胞層的厚度會減少，但片狀細胞培養物由於自培養基材剝離而收縮，厚度再次增加。層片化所致的厚度的減少量為，若使接種後當下的細胞層的厚度為100%，則為約90%至10%。藉由自培養基材的剝離而片狀細胞培養物再次收縮， 此時片狀細胞培養物的厚度的增加率為，若使剝離後當下的細胞膜的厚度為100%，則為約120%至300%。

用以層片化的培養時間，只要為得以形成層片的時間則無特別限定。得以形成層片的時間，將會依照包含於經接種的細胞團的細胞的種類(特別是形成層片的細胞的種類)及細胞的狀態而變化，但於例如將包含作為形成層片的細胞的骨骼肌母細胞的細胞團予以接種時，以2小時左右便得以形成層片。因此於一型態中，用以層片化的培養時間，能夠為2小時以上。

如同上述，本案發明人發現了在形成片狀細胞培養物後，將所形成的片狀細胞培養物在自然地自培養基材剝離前人為地剝離，藉此對剝離後游離的片狀細胞培養物施加防止癒合的處理，而能夠將所製造的片狀細胞培養物保持在高品質。因此用以層片化的培養，在片狀細胞培養物自然剝離前結束。雖然自開始培養至開始自然剝離的時間，將會依所接種的細胞團所包含的細胞的種類(特別是形成層片的細胞的種類)及細胞的狀態而變化，但在例如將包含作為形成層片的細胞的骨骼肌母細胞的細胞團予以接種時，大多在約6至12小時產生自然剝離。因此於本發明的依型態中，用以層片化的培養時間的上限得以為12小時、11.5小時、11小時、10小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時或4小時。

因此本發明的製造方法中，用以層片化的培養時間得以為2至12小時、2至11.5小時、2至11小時、2至10小時、2至9小時、2至8小時、2至7小時、2至6小時、2至5小時或4小時，以2至4小時或2至6小時為佳。本發明的製造方法，在藉由該培養時間進行培養後，不進行進一步的培養，而是進行使片狀細胞培養物剝離的步驟。

用於培養的細胞培養液(亦僅稱為「培養液」或是「培養基」)只要為能夠維持細胞生存之物則無特別限定，但典型上能夠利用以胺基酸、維生素類及電解質為主成分之物。於本發明的一型態中，培養液為基於細胞培養用的基礎培養基之物。如此的基礎培養基，不限定地包含有例如DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等。此些基礎培養基大部分均為市售，其組成亦為公眾所知。

基礎培養基，能夠以標準組成(例如維持市售的狀態)使用，亦能夠依細胞種類或細胞條件適當地變更其組成。因此，使用於本發明的基礎培養基，並不限定於公眾所知的組成，亦包含追加、除去、增加或減少一種或二種以上的成分之物。

作為基礎培養基所包含的胺基酸，不限定地可包含例如L-精氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨醯胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸及L-纈氨酸等，作為維生素類，不限定地可包含例如D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、i-肌醇、煙醯胺、核黃素、硫胺素、吡哆醇、生物素、硫辛酸、維生素B12、腺嘌呤、胸苷等，作為電解質，不限定地可包含例如CaCl₂、KCl、MgSO₄、NaCl、NaH₂PO₄、NaHCO₃、Fe(NO₃)₃、FeSO₄、CuSO₄、MnSO₄、Na₂SiO₃、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、NaVO₃、NiCl₂、ZnSO₄等。基礎培養基中，除了此些成分，亦能夠包含D-葡萄糖等的醣類、丙酮酸鈉及酚紅等的pH指示劑及腐胺等。

於本發明的一型態中，基礎培養基所包含的胺基酸的濃度，L-精氨酸為約63.2mg/L至約84mg/L、L-胱氨酸為約35mg/L至約63mg/L、L-谷氨醯胺 為約4.4mg/L至約584mg/L、甘氨酸為約2.3mg/L至約30mg/L、L-組氨酸為約42mg/L、L-異亮氨酸為約66mg/L至約105mg/L、L-亮氨酸為約105mg/L至約131mg/L、L-賴氨酸為約146mg/L至約182mg/L、L-蛋氨酸為約15mg/L至約30mg/L、L-苯丙氨酸為約33mg/L至約66mg/L、L-絲氨酸為約32mg/L至約42mg/L、L-蘇氨酸為約12mg/L至約95mg/L、L-色氨酸為約4.1mg/L至約16mg/L、L-酪氨酸為約18.1mg/L至約104mg/L、L-纈氨酸為約94mg/L至約117mg/L。

又於本發明的一型態中，包含於基礎培養基的維生素的濃度，D-泛酸鈣為約4mg/L至約12mg/L、氯化膽鹼為約4mg/L至約14mg/L、葉酸為約0.6mg/L至約4mg/L、i-肌醇為約7.2mg/L、煙醯胺為約4mg/L至約6.1mg/L、核黃素為約0.0038mg/L至約0.4mg/L、硫胺素為約3.4mg/L至約4mg/L、吡哆醇為約2.1mg/L至約4mg/L。

細胞培養液，除了上述以外，亦能夠包含有血清、生長因子、類固醇劑成分及硒成分等的一種或二種以上的添加物。但是，由於此些的成分在非源於自己的狀況下，無法否定可能會成為臨床上成為對接受者的過敏性休克等副作用的原因的源於製造步驟的雜質，在臨床上的運用有時以排除如此的非源於自己成分為佳。因此，於本發明的較佳的型態中，細胞培養液，不包含有此些非源於自己成分的至少一種的有效量。又於本發明的更佳的型態中，細胞培養液實質上不包含有非源於自己的添加物。於一型態中，細胞培養液亦能夠僅含有基礎培養基。

本發明的一型態中，細胞培養液實質上不含有血清。本說明書中亦將實質上不含有血清的細胞培養液稱為「無血清培養基」。此處所謂「實質上不含有血清」，為培養液中血清的含量，為將片狀細胞培養物使用於生物體時不 會產生不良影響的程度(例如，於片狀細胞培養物中的血清白蛋白含量為未滿50ng的量)，較佳為不於培養液中積極地添加此些物質。本發明中，為了避免移植時的副作用，以細胞培養液實質上不含有異種血清為佳，以實質上不含有非自己血清更佳。

本發明的一型態中，細胞培養液包含血清。血清能夠為同種血清或異種血清。於特定的型態中，細胞培養液包含有自己血清。於以血清包覆的細胞培養基材上培養細胞時，細胞培養液所包含的血清(用於細胞培養的血清)，亦能夠與使用於包覆培養基材的血清相同或相異。於一型態中，細胞培養液所包含的血清，為與用以包覆培養基材的血清相同，於特定的型態中，該血清為自己血清。血清亦能夠為用以使用於本發明的製造方法之物。例如血清能夠為用以使用於細胞培養、亦能夠為用以使用於包覆培養基材之物。

本發明的一型態中，細胞培養液不包含有效量的生長因子。此處「有效量的生長因子」，為使細胞的增殖在與無生長因子時相比顯著地受到促進的生長因子的量，或是簡略而言，於所述技術領域中以細胞的增殖為目的而通常添加的量。促進細胞增殖的顯著性，能夠藉由所屬技術領域所知的任意統計學的方法，例如藉由t檢定等適當評價，又通常的添加量可自所屬技術領域的各種公知文獻得知。具體而言，細胞培養中的EGF的有效量為例如約0.005μg/mL以上。

因此，「不含有效量的生長因子」，為本發明中培養液中的生長因子的濃度未達該有效量。例如，使細胞培養中EGF的培養液中的濃度，以未滿0.005μg/L為佳、以未滿0.001μg/L較佳。本發明的較佳的型態中，培養液中生長因子的濃度，為未滿生物體中通常的濃度。如此型態中，例如細胞培養中培養液中的EGF的濃度，以未滿5.5ng/mL為佳、以未滿1.3ng/mL較佳、以未滿0.5ng/mL 更佳。於更佳的型態中，本發明中的培養液，實質上不包含有生長因子。此處所謂實質上不包含，為培養液中的生長因子的含量，為當將片狀細胞培養物使用於生物體時不會產生不良影響的程度，以不於培養液中積極地添加生長因子為佳。因此，於此型態中，培養液中不包含有於其中的其他成分，例如血清等中所包含的濃度以上的生長因子。

於本發明的依型態中，細胞培養液實質上不包含有類固醇劑成分。此處所謂「類固醇劑成分」，為含有類固醇核心的化合物中，可能對生物體產生腎上腺皮質功能障礙、庫欣症候群等的不良影響之物。作為此類化合物，不限定地包含例如皮質醇、潑尼松龍、曲安奈德、地塞米松及倍他米松等。因此，「實質上不包含有類固醇劑成分」，為培養液中此些化合物的含量，為當將片狀細胞培養物使用於生物體時不會產生不良影響的程度，以不於培養液中積極地添加生長因子為佳，即培養液中不包含有於其中的其他成分，例如血清等中所包含的濃度以上的類固醇劑成分。

本發明的一型態中，細胞培養液實質上不包含有硒成分。此處所謂「硒成分」，為硒分子及含硒化合物，特別是於生物體內得以游離出硒分子的含硒化合物，例如包含亞硒酸等。因此，「實質上不包含有硒成分」，為於培養液中此些物質的含量，為當將片狀細胞培養物使用於生物體時不會產生不良影響的程度，以為積極地不於培養液中添加此些物質為佳，即培養液中不包含有於其中的其他成分，例如血清等中所包含的濃度以上的硒成分。具體而言，例如人類的狀況中，培養液中的硒濃度，較人類血清中的正常值(例如10.6μg/dL至17.4μg/dL)相乘於培養基中所含有的人類血清的比率的值為低(即人血清的含量若為10%，則硒濃度為例如未滿約1.0μg/dL至約1.7μg/dL)。

本發明的上述較佳的型態中，不需要將習知中製作適用於生物體的細胞培養物時必須的生長因子、類固醇劑成分及異種血清成分等源自於製造步驟的雜質予以藉由洗淨以除去的步驟。因此，本發明的方法的一型態，不包含將此源自製造步驟的雜質予以除去的步驟。

此處所謂「源自製造步驟的雜質」，典型為包含源自各製造步驟的以下所列舉之物。即源自細胞基材之物(例如源自宿主細胞的蛋白質、源自宿主細胞的DNA)、源自細胞培養液之物(例如誘導劑、抗生素、培養基成分)、或是源自細胞培養之後的步驟的目標物質的萃取、分離、加工及精製步驟之物等(例如參照日本醫藥審發第571號)。

於(iii)中，所形成的片狀細胞培養物自培養基材剝離。

片狀細胞培養物自培養基材的剝離，只要為片狀細胞培養物得以至少一部份在維持層片構造的情況下，自附著點的培養基材游離(剝離)則並無特別限定，例如能夠藉由蛋白質分解酵素(例如胰蛋白酶)所進行的酵素處理及/或藉由吸排等機械性處理以進行。又在將細胞培養於表面披覆有應溫度及光的刺激而改變物理性質的材料的培養基材上而形成細胞培養物時，亦能夠藉由施加指定的刺激，以進行非酵素性地游離。

例如，將細胞培養於感溫性培養皿而形成細胞培養物時，藉由使溫度為相對於感溫材料的水的低臨界溶液溫度(LCST)以下或高臨界溶液溫度(UCST)以上的溫度處理，能夠將片狀細胞培養物非酵素性地游離。如此的溫度處理，不限定地能夠以例如將所形成的片狀細胞培養物所附著的培養基材，自較LCST高溫的培養環境(例如約37℃的培養器內)，移動至LCST以下的環境(例如培養器外的室溫環境)以達成。至LCST以下的環境的移動，不限定地能夠藉由例如 將所形成的片狀細胞培養物所存在的較LCST高溫的培養液，交換為LCST以下的溫度的媒介(例如緩衝液(PBS、HBSS等)及培養液等的液體)以達成。因此，上述緩衝液等的媒介，於本發明的製造方法中，能夠用以將片狀細胞培養物自培養基材非酵素性地游離。

藉由(iii)的步驟而被剝離的片狀細胞培養物，與剝離前相比收縮而面積縮小。藉由本發明的製造方法所製造的片狀細胞培養物，具有在剝離後不易收縮，而具有較大面積的特徵。本發明的一型態中，剝離後的片狀細胞培養物，相對於剝離前的片狀細胞培養物的面積(即培養基材的面積)，具有約20%以上的面積，例如為具有約20%、約25%、約30%、約31%、約32%、約33%、約34%、約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約50%及約60%的面積，以具有約35%以上的面積為佳，例如具有約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約50%及約60%的面積。

剝離後的片狀細胞培養物的面積，若於面積56.7cm²(直徑10cm)的培養皿層片化時，剝離後為1800mm²以上、1847mm²以上或1923mm²以上即可。上限並無特別限定，能夠為2600mm²、2505mm²、2462mm²。具體而言，剝離後的面積能夠為1800mm²至2600mm²、1847mm²至2600mm²、1923mm²至2600mm²、1923mm²至2505mm²中的任一種。於面積8.8cm²(直徑3.5cm)的培養皿層片化時，或於3.5cm²(12孔)的培養皿層片化時，各自能夠得到面積等比於以面積56.7cm²(直徑10cm)的培養皿剝離後所得到的片狀細胞培養物的面積的片狀細胞培養物。

片狀細胞培養物剝離後的收縮，被推測為主要受到構成片狀細胞培養物的細胞之細胞間接合力的大小影響。因此，為了達到特定程度的層片化而延長培養時間時，例如培養至片狀細胞培養物發生自然剝離的程度的時間時，被 認為片狀細胞培養物的剝離後收縮率達到最大。因此，亦能夠以當剝離後收縮率成為最大時，即剝離後的片狀細胞培養物成為最小時的面積為基準，而規定片狀細胞培養物的面積。本發明的一型態中，以剝離後的片狀細胞培養物的最小面積(即培養至發生自然剝離的程度的時間時之剝離後的片狀細胞培養物之面積)為1時，(iii)所得的片狀細胞培養物的面積能夠為約1.04至約1.4、約1.1至1.4或約1.3至約1.35。

因此於特佳的一型態中，本發明的製造方法包含如下：(i)將包含肌母細胞或心肌母細胞的細胞團，以7.1×10⁵個/cm²至約3.0×10⁶個/cm²、約7.3×10⁵個/cm²至約2.8×10⁶個/cm²、約7.5×10⁵個/cm²至約2.5×10⁶個/cm²、約7.5×10⁵個/cm²至約3.0×10⁶個/cm²、約7.8×10⁵個/cm²至約2.3×10⁶個/cm²、約8.0×10⁵個/cm²至約2.0×10⁶個/cm²、約8.5×10⁵個/cm²至約1.8×10⁶個/cm²或約9.0×10⁵個/cm²至約1.6×10⁶個/cm²中的任一接種密度接種於培養基材；(ii)將上述(i)中接種的細胞團於細胞培養液中培養2至12小時、2至11.5小時、2至11小時、2至10小時、2至9小時、2至8小時、2至7小時、2至6小時、2至5小時或2至4小時而形成片狀細胞培養物；以及(iii)將上述(ii)所形成的片狀細胞培養物自培養基材剝離，在以培養至發生自然剝離的時間下剝離後的片狀細胞培養物的面積為1時，此處經剝離的片狀細胞培養物的面積為約1.04至約1.4、約1.1至約1.4或約1.3至約1.35。

本發明的製造方法，亦能夠於(i)之前，包含將細胞(細胞團)冷凍的步驟及將冷凍細胞解凍的步驟。細胞的冷凍能夠以已知的任意方法進行。作為如此方法，能夠不限定地列舉例如將容器內的細胞放置於冷凍機構，例如冷凍器、深度冷凍器、低溫媒介(例如液態氮)等。冷凍機構的溫度，雖然只要得以使容器 內的細胞團的一部份冷凍、較佳為使整體冷凍的溫度則無特別限定，但典型而言為約0℃以下、以-20℃以下為佳、以-40℃以下較佳、以-80℃以下更佳。又於冷凍操作時的冷卻速度，只要不會大幅損及冷凍解凍後細胞的生存率及功能則無特別限定，但典型而言為自4℃開始冷卻而達到約-80℃為止為約1小時至5小時、以約2小時至4小時為佳、特別是約3小時的冷卻速度。具體而言，能夠以例如約0.46℃/分鐘的速度冷卻。如此的冷卻速度，能夠藉由將含有細胞的容器直接或是收容於冷凍處理器而一併置於設定為指定溫度的冷凍機構以達成。冷凍處理容器，亦能夠具有將容器內的溫度的下降速度控制於指定的速度的功能。作為如此的冷凍處理容器，能夠使用已知的任意之物，例如能夠使用BICELL^®(日本Freezer)，程式冷凍器等。

冷凍操作雖亦能夠使細胞浸漬於培養液或生理緩衝液等的狀態下進行，但亦能夠於培養液添加用以自冷凍、解凍操作保護細胞的冷凍保護劑，施加將培養液替換成含有冷凍保護劑的冷凍保存液等處理再進行。因此，包含冷凍步驟的本發明的製造方法，亦能夠進一步包含有於培養液添加冷凍保護劑的步驟、或是將培養液替換成包含有冷凍保護劑的冷凍保存液的步驟。將培養液替換成冷凍保存液時，只要冷凍時細胞所浸漬的液體包含有效濃度的冷凍保護劑，則能夠將培養液實質上完全除去再添加冷凍保存液，亦能夠留下一部份的培養液而添加冷凍保存液。此處所謂「有效濃度」，為冷凍保護劑不表現毒性，而表現出冷凍保護效果的濃度，該冷凍保護效果為例如與不使用冷凍保護劑的狀況相比，對冷凍解凍後的細胞的生存率、活力及功能等的降低的抑制效果。如此濃度能夠為由本發明領域具有一般知識者所知，或是藉由常規程序的實驗以適當決定。

冷凍保護劑，只要表現出對細胞具有冷凍保護作用之物則無特別限定，包含例如二甲基亞碸(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、絲膠、丙二醇、葡聚醣、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥乙基澱粉、硫酸軟骨素、聚乙二醇、甲醯胺、乙醯胺、乙醯胺、阿東糖醇、洋梨醇、棉子糖、乳糖、海藻糖、蔗糖及甘露醇等。冷凍保護劑能夠單獨使用，亦能夠組合使用二種或三種以上。

冷凍保護劑添加至培養液的添加濃度，或是冷凍保存液中的冷凍保護劑的濃度，只要為上述所定義的有效濃度則無特別限制，典型而言為例如相對於培養液或冷凍保存液整體為約2%至約20%(v/v)。但是，雖然超出此濃度範圍，亦能夠採用各個冷凍保護劑係為已知的，或經實驗決定的替代使用濃度，如此濃度亦在本發明的範圍內。

將經冷凍的細胞解凍的步驟，能夠藉由已知的任意的細胞解凍方法以進行，典型而言，能夠藉由例如將經冷凍的細胞安置於解凍機構，例如較冷凍溫度高溫的固態、液態或汽態的媒介(例如水)、水浴槽、培養器及恆溫器等，或是將冷凍的細胞浸漬於較冷凍溫度高溫的媒介(例如培養液)以達成，但並不限定於此。解凍機構或是浸漬媒介的溫度，只要為能夠將細胞在指定的時間內解凍的溫度則無特別限定，但典型而言為約4℃至約50℃、以約30℃至約40℃為佳、以約36℃至約38℃較佳。又解凍時間只要不會大幅損及解凍後細胞的生存率及功能則無特別限定，但典型而言為約2分鐘以內，特別是為約20秒以內則能夠大幅抑制生存率的降低。解凍時間能夠使解凍機構或浸漬媒介的溫度、冷凍時的培養液或冷凍保存液的容量或組成等改變以調節。冷凍的細胞，包含藉由任意的方法冷凍的細胞，作為其非限定的例子，可列舉例如藉由上述冷凍細胞的步驟而冷凍 的細胞。於一型態中，經冷凍的細胞為在冷凍保護劑的存在下冷凍的細胞。於一型態中，冷凍的細胞為使用於本發明的製造方法。

本發明的製造方法，亦能夠於上述的解凍經冷凍的細胞的步驟之後，且在形成片狀細胞培養物的步驟之前，較佳為於將細胞接種於培養基材的步驟之前，包含有洗淨細胞的步驟。細胞的洗淨，能夠藉由已知的任意方法以進行，典型而言為藉由例如將細胞懸浮於洗淨液(例如包含或不包含血清及血清成分(血清白蛋白)、培養液(例如培養基等)或生理緩衝液(例如PBS、HBSS等)等)、進行離心分離、廢棄上清液、回收沉澱的細胞以達成，但並不限定於此。於洗淨細胞的步驟中，亦能夠將如此懸浮、離心分離、回收的循環進行一次或複數次(例如二次、三次、四次、五次等)。於本發明的一型態中，洗淨細胞的步驟，在解凍經冷凍的細胞的步驟後立即進行。

本發明的製造方法，亦能夠在上述冷凍細胞的步驟前，進一步包含使細胞增殖的步驟。使細胞增殖的步驟，能夠以已知的任意方法以進行，本發明領域具有一般知識者熟知各種適合於細胞增殖的培養條件。

於一型態中，本發明的製造方法，不包含有將基因導入細胞的步驟。於另一型態中，本發明的製造方法，包含將基因導入細胞的步驟。導入的基因，只要為有益於作為對象的疾病之處理則無特別限定，例如能夠為HGF、VEGF等的細胞素。基因的導入，能夠使用磷酸鈣法、脂質轉染法、超音波導入法法、電穿孔法、粒子槍法、利用腺病毒載體及逆轉錄病毒載體等病毒載體的方法及微注射法等已知的任意方法。針對細胞的基因導入，不限定地可在例如冷凍細胞的步驟前進行。

於一型態中，本發明的製造方法中的所有步驟為於體外(in vitro)進行。於另一型態中，本發明的製造方法，於體內(in vivo)進行的步驟，不限定地包含例如自對象採取細胞或為細胞供給源的組織(例如橫紋肌組織、特別是骨骼肌組織)。於一型態中，本發明的製造方法中的所有步驟為於無菌條件下進行。於一型態中，本發明的製造方法，以使最終所得的片狀細胞培養物為實質上無菌的方式進行。於一型態中，本發明的製造方法，以使最終所得的片狀細胞培養物為無菌的方式進行。

本發明的另一觀點，係關於藉由本發明的製造方法所製造的片狀細胞培養物。本發明的片狀細胞培養物，有效於藉由片狀細胞培養物的運用而改善的疾病，例如組織異常相關的各種疾病的處理。因此，於一型態中，本發明的片狀細胞培養物，為用於藉由片狀細胞培養物的運用而改善的疾病，特別是組織異常相關的各種疾病的處理。本發明的片狀細胞培養物，除了與習知的片狀細胞培養物相比具有高機械強度，由於具有相同的構成細胞固有的性質，能夠至少運用於藉由習知的包含肌母細胞或是纖維母細胞的片狀細胞培養物而得以進行的處理的組織及疾病。作為處理對象的組織，不限定地可列舉心肌、食道、皮膚、胰臟及骨骼肌等。又作為處理對象的疾病，不特別限定地可列舉心臟病(例如心肌損傷(心肌梗塞、心臟外傷)、心肌病等)、食道疾病(例如食道手術(食道癌去除)後的食道的炎症及食道狹窄之預防)、皮膚疾病(例如皮膚損傷(外傷、燒燙傷)等)、胰臟疾病(例如胰腺液瘺等)、肌肉疾病(例如肌肉損傷、肌肉發炎等)。本發明的片狀細胞培養物對上述疾病有效之一事，記載於例如專利文獻1、非專利文獻1及Tanaka et al.,J Gastroenterol.2013；48(9)：1081-9.等。本發明的片狀細胞培養物，藉由斷片化為能夠注射的大小，並注射於需要處理的部位，能夠得到較注射單細 胞懸浮液更高的效果(Wang et al.,Cardiovasc Res.2008；77(3)：515-24)。因此，本發明的片狀細胞培養物亦能夠為如此運用法。

於一型態中，本發明的片狀細胞培養物為實質上無菌。於一型態中，本發明的片狀細胞培養物為無菌。於一型態中，本發明的片狀細胞培養物並未接受基因工程。於另一型態中，本發明的片狀細胞培養物，為有接受基因工程。基因工程不限定地包含例如導入提高片狀細胞培養物的生存性、移植能力及功能的基因，及/或有利於疾病治療的基因。作為導入的基因，不限定地可列舉例如HGF基因、VEGF基因等細胞素基因。

本發明的另一觀點，為關於包含本發明的片狀細胞培養物的組合物(例如醫藥組成物等)、移植片及醫療製品等(以下亦總稱為「組成物群」)。

本發明的組成物群，除了本發明的片狀細胞培養物，亦能夠包含各種追加成分，例如藥學上容許的載體、提高片狀細胞培養物的生存性、移植性及或功能等的成分，及有益於對象疾病的處理的其他有效成分等。作為如此的追加成分，能夠使用已知的任意之物，本發明領域具有一般知識者熟知此些追加成分。又本發明的組成物群，能夠併用提高片狀細胞培養物的生存性、移植性及或功能的成分及有益於對象疾病的處理的其他有效成分等。於一型態中，本發明的組成物群為用以藉由運用片狀細胞培養物而改善的疾病(例如關於組織異常的疾病等)的處理。作為處理對象的組織及疾病，如同上述關於本發明的片狀細胞培養物的記載。

<2>本發明的處理方法

本發明的另一觀點，為關於對象中藉由運用片狀細胞培養物而改善的疾病(例如關於組織異常的疾病)的處理方法，及包含本發明的片狀細胞培養物或組成 物群的有效量，並將其投予至必須的對象的方法(以下亦稱為「本發明的處理方法」)。本發明的處理方法的對象的組織及疾病，如同上述關於本發明的片狀細胞培養物的記載。又本發明的處理方法中，能夠將提高片狀細胞培養物的生存性、移植性及或功能的成分及有益於對象疾病的處理的其他有效成分等與本發明的片狀細胞培養物或組成物群併用。

本發明的處理方法，亦能夠進一步包含依照本發明的製造方法製造片狀細胞培養物的步驟。本發明的處理方法，亦能夠在製造片狀細胞培養物的步驟之前，進一步包含有自對象採取用以製造片狀細胞培養物的細胞或是作為細胞的供給源的組織的步驟。於一型態中，採取細胞或是作為細胞的供給源的組織的對象，與接受片狀細胞培養物或是組成物群的投予的對象為同一個體。於其他型態中，採取細胞或是作為細胞的供給源的組織的對象，與接受片狀細胞培養物或是組成物群的投予的對象為同種的相異個體。於其他型態中，採取細胞或是作為細胞的供給源的組織的對象，與接受片狀細胞培養物或是組成物群的投予的對象為異種個體。

本發明中，所謂「對象」，為任意的生物個體，以動物為佳、以哺乳動物較佳、以人類的個體更佳。本發明中，對象雖然可為健康、亦可為患有疾病，但在計畫藉由運用片狀細胞培養物以改善的疾病(例如關於組織異常的疾病)的處理時，典型而言罹患有該疾病，或是有罹患風險的對象。

又所謂「處理」，為包含以疾病的治癒、暫時的緩解或是預防等為目的的醫學上所容許的所有種類的預防及/或治療的介入。例如「處理」一詞，包含藉由運用片狀細胞培養物而改善的疾病(例如關於組織的異常的疾病等)的進 程的延緩或停止、病變的縮減或消失、及該疾病發病的預防或復發的預防等各種目的的醫學上所容許的介入。

於本發明中，所謂有效量，為例如得以抑制疾病的發病及復發、減輕症狀、或是延緩或停止疾病進程的量(例如，片狀細胞培養物的尺寸、重量及片數等)，以預防該疾病的發病及復發或治療該疾病的量為佳。又以不產生超過投予的利益的不良影響的量為佳。如此的量能夠藉由於例如小鼠、大鼠、犬或豬等的實驗動物及疾病模型動物中的實驗而適當決定，如此的實驗方法為所屬技術領域中具有一般知識者所熟知。又處理的對象的病變組織的大小，亦能夠成為用以決定有效量的重要指標。

作為投予方法，典型而言可列舉對組織的直接運用，但於使用片狀細胞培養物的碎片時，亦能夠自能夠藉由注射所投予的各種通路，例如靜脈內、肌肉內、皮下、局部、動脈內、門脈內、心室內及腹腔內以投予。

投予頻度，典型而言為每次的處理進行一次，但在得不到預期的效果時，亦能夠投予複數次。

〔實施例〕

雖參照以下例子更加詳細說明本發明，但此為顯示本發明的特定具體例，本發明並非限定於此。

例1. 片狀細胞培養物的製造

(1)細胞團的調製

將自成人大腿部無菌採取的骨骼肌組織所得的細胞接種於培養瓶，為了調整肌母細胞及纖維母細胞的比率，使其於含有20%FBS的MCDB131培養基中增殖。將增殖的細胞以蛋白質分解酵素液自培養瓶剝離、回收後，藉由離心分離以濃縮。

(2)片狀細胞培養物的製作

將含有20%人類血清的DMEM/F12培養基添加於Φ10cm感溫培養皿靜置一晚。之後拋棄添加的培養基。

將含有20%人類血清的DMEM/F12培養基每1mL中懸浮6.0×10⁶至6.1×10⁶個細胞所得的細胞懸浮液取10mL接種於Φ10cm感溫培養皿(UpCell^®、CellSeed公司製、培養基材的面積：56.7cm²)。接種後，將細胞以37℃、5%CO₂的條件培養，於30分鐘後、1小時後、2小時後、4小時後、5.5小時後、6小時後、11.5小時後及12小時後分別進行自培養基材剝離片狀細胞培養物的步驟(n=3)。

結果顯示於圖1及下表。圖1為顯示各培養時間後進行剝離的片狀細胞培養物的狀態的照片。確認到培養時間為2小時以上時，層片形成而能夠無損傷地剝離。關於經剝離的片狀細胞培養物，計測大小(短徑及長徑)的平均值，而算出面積。使培養時間為12小時的狀態下的面積為1，算出上述各培養時間所得的剝離片狀細胞培養物的面積比。

另外，培養時間為12小時以上時，經剝離的片狀細胞培養物的面積幾乎沒有變化。

【表1】

本說明書所記載的本發明的各種特徵能夠進行各式組合，藉由如此的組合所得的型態，包含本發明書中未具體記載的組合，皆為本發明的範圍之內。又所屬技術領域中具有一般知識者，能夠理解能夠進行不偏離本發明的精神的多種改變，而包含如此改變的均等物亦被包含於本發明的範圍內。因此，應知本說明書所記載的型態僅為例示，此些記載並非用以限制本發明的範圍。

Claims (8)

1. 一種片狀細胞培養物的製造方法，包含：步驟一，將含有至少一種形成層片的細胞的細胞團接種於一培養基材；步驟二，使步驟一中接種的細胞團於一細胞培養液中片狀化，而形成一片狀細胞培養物；以及步驟三，將於步驟二所形成的該片狀細胞培養物自該培養基材自然剝離前人為地剝離，其中，步驟二中的片狀化係藉由2至4小時的培養以進行，其中經過2至4小時的片狀培養而剝離後的該片狀細胞培養物之面積，與經過12小時的片狀培養而剝離後的該片狀細胞培養物之面積之比值為1.33至1.36。
2. 如請求項1所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該形成層片的細胞為肌母細胞或心肌細胞。
3. 如請求項1或2所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該細胞培養液中包含同種血清。
4. 如請求項1所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基材係以血清覆蓋。
5. 如請求項1所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中該培養基材係以感溫材料覆蓋。
6. 如請求項1所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中於步驟一中，將細胞團以7.5×10⁵個/cm²至3.0×10⁶個/cm²的密度接種。
7. 如請求項1所述的片狀細胞培養物的製造方法，其中剝離後的該片狀細胞培養物，具有相對於該培養基材的面積的35%以上的面積。
8. 一種將請求項1至7中任一項所述的製造方法所製造的片狀細胞培養物用於製造用於處理藉由運用片狀細胞培養物而改善的疾病的醫學上所容許的介入物之用途。

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