JP6130868B2 - 単離されたシート状細胞培養物の製造方法 - Google Patents
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(1)培養基材上に形成されたシート状細胞培養物を、該培養基材に付着させた状態で凍結する工程、
凍結したシート状細胞培養物を解凍する工程、および
培養基材からシート状細胞培養物を単離する工程、
を含む、単離されたシート状細胞培養物の製造方法。
(2)培養基材上に、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で細胞を播種する工程をさらに含む、(1)に記載の方法。
(3)培養基材上で細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程をさらに含む、(1)または(2)に記載の方法。
(4)培養液に凍結保存剤を添加する工程、および/または、培養液を凍結保存液に置換する工程をさらに含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)培養基材が細胞接着性を有する、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載の方法で製造された、単離されたシート状細胞培養物。
(7)培養基材上に形成されたシート状細胞培養物を、該培養基材に付着させた状態で凍結する工程、および
凍結したシート状細胞培養物を解凍する工程
を含む、シート状細胞培養物の単離促進方法。
(8)培養基材に付着した状態で凍結された、シート状細胞培養物。
(9)基材表面に付着した状態で凍結されたシート状細胞培養物を含む、培養基材。
(10)培養基材上に形成されたシート状細胞培養物を、該培養基材に付着させた状態で凍結する工程を含む、シート状細胞培養物の保存方法。
また、温度応答性ポリマーでコーティングされた培養基材等を利用する場合、ピペッティング操作を行うことなく、容易にシート状細胞培養物を回収することができるため、従来必要であった室温下での長時間の静置が不要となり、ピペッティング操作によるコンタミやシートの破損を回避できるといった利点がある。
さらに、本発明の方法により、シート状細胞培養物を、高回収率・高バイアビリティーで容易に単離できる状態で長期保存でき、かつ、保管や輸送が容易にできるうえ、簡易に短時間で単離できるため、予めシート状細胞培養物の状態で保存をしておき、必要に応じていつでもシート状細胞培養物の移植が可能になるなど、シート状細胞培養物の利用性が格段に高まる。
凍結したシート状細胞培養物を解凍する工程、および
培養基材からシート状細胞培養物を剥離させる工程
を含む、単離したシート状細胞培養物の製造方法に関する。
上記培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、1〜200cm2、好ましくは2〜100cm2、より好ましくは3〜50cm2である。
培養基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で20〜60分程度放置して凝固させ、これを1000〜1200×g程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。
インキュベート時間も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、1〜72時間、好ましくは4〜48時間、より好ましくは5〜24時間、さらに好ましくは6〜12時間である。インキュベート温度も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、0〜60℃、好ましくは4〜45℃、より好ましくは室温〜40℃である。
凍結操作時の培養液(凍結保護剤を含んでも含まなくてもよい)または凍結保存液の量は、シート状細胞培養物を完全に浸漬でき(すなわち、シート状細胞培養物が付着した培養基材を凍結手段に供したときに、シート状細胞培養物を凍結保存液に完全に覆うことができ)、かつ、所定時間内の解凍が可能な量であれば特に限定されないが、骨格筋芽細胞で形成したシート状細胞培養物であれば、典型的には、例えば、培養面積に対して20〜200μL/cm2、および/または、細胞1.0×107個あたり280〜1600μLである。これはまた、凍結操作時の細胞密度が、6.3×106〜3.6×107個/mLであってもよいことを意味する。当業者であれば、所望の細胞で形成したシート状細胞培養物に適した凍結操作時の培養液または凍結保存液の量を、過度の実験を要することなく決定することができる。
本発明の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、細胞が分化に移行しない期間内に行われる。したがって、この態様において、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、MHCの発現、クレアチンキナーゼ(CK)活性、細胞の多核化、筋管の形成などを分化の指標とすることができる。本発明の好ましい態様において、培養期間は48時間以内、より好ましくは40時間以内、さらに好ましくは24時間以内である。
また、本発明の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、D−パントテン酸カルシウム:4〜12mg/L、塩化コリン:4〜14mg/L、葉酸:0.6〜4mg/L、i−イノシトール:7.2mg/L、ナイアシンアミド:4〜6.1mg/L、リボフラビン:0.0038〜0.4mg/L、チアミン:3.4〜4mg/L、ピリドキシン:2.1〜4mg/Lである。
本発明の一態様において、細胞培養液は血清を実質的に含まない。血清を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。ここで、「血清を実質的に含まない」とは、培養液における血清の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度(例えば、細胞培養物中の血清アルブミン含量が50ng未満となる量)であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。本発明においては、移植時の副作用を回避するために、細胞培養液は異種血清を実質的に含まないことが好ましく、非自己血清を実質的に含まないことがさらに好ましい。
ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの(例えば、宿主細胞由来タンパク質、宿主細胞由来DNA)、細胞培養液に由来するもの(例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分)、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである(例えば、医薬審発第571号参照)。
(i)対象から採取した組織または生体液から所望の細胞を単離する工程、
(ii)単離した細胞を増殖させる工程、
(iii)培養基材上で細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
(iv)形成されたシート状細胞培養物を、該培養基材に付着させた状態で凍結する工程
(v)凍結したシート状細胞培養物を解凍する工程
(vi)培養基材からシート状細胞培養物を単離する工程、および任意に
(vii)単離したシート状細胞培養物を洗浄する工程
を含む、再生治療用シート状細胞培養物の製造方法にも関する。
好ましい態様において、本発明のシート状細胞培養物は、浸漬撹拌などの洗浄操作や、取出し、保持、移送などの移植操作に対して十分な物理的強度を有する。十分な物理的強度を有するとは、上記操作を施しても細胞培養物のシート状構造が損なわれないことを意味し、これは、例えば、得られたシート状細胞培養物に実際に上記操作を施し、シート状構造が保たれていることを肉眼的または顕微鏡的に調査することにより確認することができる。シート状細胞培養物を血清でコートした培養基材上で形成すれば、通常かかる十分な物理的強度を有する。
かかる好ましい細胞培養物は、骨格筋芽細胞を用いたものであれば、例えば、血清で被覆された培養基材上に、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度の細胞を播種して培養することにより得ることができる。
かかる好ましい細胞培養物は、骨格筋芽細胞を用いたものであれば、例えば、血清で被覆された培養基材上に、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度の細胞を播種して培養することにより得ることができる。
凍結したシート状細胞培養物を解凍する工程
を含む、シート状細胞培養物の単離促進方法に関する。
本方法における各工程の詳細は、本発明の製造方法について上述したとおりである。「単離が促進される」とは、培養基材上に形成された凍結解凍工程を経ていないシート状細胞培養物と比較して、単離が容易になったことを意味し、例えば、単離時間が短縮したこと、単離時の損傷が少ないこと、単離したシート状細胞培養物における細胞回収率、すなわち、播種した細胞数に対する、単離シート状細胞培養物を構成する細胞数の比率が高いこと、単離シート状細胞培養物における細胞の生存率が高いこと、剥離に要する機械的処理および/または酵素処理の強度が低下したことなどにより評価することができる。
比較例1
20%のウシ胎仔由来血清(Invitrogen製)、0.01μg/mLの上皮成長因子(Invitrogen製)、4μg/mLのリン酸デキサメタゾンナトリウム(シェリング・プラウ製)を含有するMCDB131培地(Invitrogen製)(以下、継代増殖用培地)1.5mLに、ヒト骨格筋芽細胞(Lonza製)3.6×106または9.0×106個を懸濁させ、Φ3.5cmの細胞培養皿(Corning(R) 35mm TC-Treated Culture Dish、Corning製)に播種した。播種後、インキュベーター内で37℃、5%CO2の条件で18時間培養した。培養後、インキュベーターから取り出し、室温で約60分間静置後、シート状細胞培養物の確認を行った。その結果、シート状細胞培養物の形成は認められたものの、培養皿から剥離させるためにピペッティング操作をしたところ、シート状細胞培養物は破れ、回収することができなかった(図1)。このように、通常の細胞接着性を有する培養基材上で形成されたシートは、細胞間の接着よりも、培養基材に対する接着のほうが強力であるため、シート状細胞培養物を培養基材から剥離させる際に加わる圧力に、細胞間の接着が耐えられず、破れてしまうことが明らかとなった。
従来のシート状細胞培養物の製造方法に従い、継代増殖用培地1.5mLに、ヒト骨格筋芽細胞を懸濁させ、Φ3.5cm温度応答性培養皿(UPCELL(R)、セルシード製)に9.0×106個のヒト骨格筋芽細胞を播種した。播種後、37℃、5%CO2の条件で18時間培養した。培養後、インキュベーターから取り出し、室温で約60分間静置後、シート状細胞培養物の確認を行った。培養面上にシート状細胞培養物の形成が認められ、ピペッティング操作によって温度応答性培養皿からシート状細胞培養物を回収することができた。
継代増殖用培地1.5mLにヒト骨格筋芽細胞を懸濁させ、Φ3.5cm温度応答性培養皿(UPCELL(R)、セルシード製)に9.0×106個ずつ播種した。播種後、37℃、5%CO2の条件で18時間培養した。培養後、培養面上にシート状細胞培養物の形成を確認してから、継代増殖用培地を温度応答性培養皿から廃棄し、4℃に冷蔵した凍結保存液(ウシ胎仔由来血清20%、上皮成長因子0.01μg/mLおよびリン酸デキサメタゾンナトリウム4μg/mLを含有するMCDB131培地(継代増殖用培地)とDMSO(ジメチルスルフォキシド、純正化学製)とを9:1の割合で混合したもの)を1000μLずつ加え、2〜8℃で20分間静置した。続いて、温度応答性培養皿から凍結保存液を廃棄し、新しい凍結保存液を500μL(シート1)または1000μL(シート2)加えた。シート状細胞培養物が付着した温度応答性培養皿を凍結保存用容器(BICELL(R)、日本フリーザー製)に入れた後、凍結保存用容器を−85℃に設定した超低温フリーザーに入れ、シート状細胞培養物を凍結した。24時間後、超低温フリーザーから温度応答性培養皿を取り出し、37℃に加温した継代増殖用培地を温度応答性培養皿に加えることで、凍結したシート状細胞培養物を急速に解凍した。その結果、ピペッティング操作をすることなく、容易に温度応答性培養皿からシート状細胞培養物を回収することができた(図2)。
継代増殖用培地1.5mLにヒト骨格筋芽細胞を懸濁させ、Φ3.5cmの細胞培養皿(Corning(R) 35mm TC-Treated Culture Dish、Corning製)に9.0×106個ずつヒト骨格筋芽細胞を播種した。播種後、インキュベーター内で37℃、5%CO2の条件で18時間培養した。培養後、培養面上にシート状細胞培養物の形成を確認してから、継代増殖用培地を細胞培養皿から廃棄し、4℃に冷蔵した凍結保存液を1000μLずつ加え、2〜8℃で20分間静置した。続いて、細胞培養皿から凍結保存液を廃棄し、新しい凍結保存液を1000μL(シート3)または1500μL(シート4)加えた。細胞培養皿を凍結保存用容器に入れた後、凍結保存用容器を−85℃に設定した超低温フリーザーに入れ、シート状細胞培養物を凍結した。24時間後、超低温フリーザーから細胞培養皿を取り出し、37℃に加温した継代増殖用培地を細胞培養皿に加えることで、凍結したシート状細胞培養物を急速に解凍した。解凍後直にピペッティング操作を行ったところ、細胞培養皿からシート状細胞培養物を回収することができた。また、得られたシート状細胞培養物をトリプシン様タンパク質分解酵素で解離させた後、セルカウントを行ったところ、細胞生存率はシート3で94.8%、シート4で91.0%、回収率は、シート3で85.4%、シート4で70.2%と、いずれも実用に耐える高いものであった。
継代増殖用培地1.5mLにヒト骨格筋芽細胞を懸濁させ、Φ3.5cmの細胞培養皿(Corning(R) 35mm TC-Treated Culture Dish、Corning製)2枚に3.6×106個のヒト骨格筋芽細胞を播種した。播種後、インキュベーター内で37℃、5%CO2の条件で18時間培養した。培養後、培養面上にシート状細胞培養物の形成を確認してから、継代増殖用培地を細胞培養皿から廃棄し、4℃に冷蔵した凍結保存液を1000μLずつ加え、2〜8℃で20分間静置した。続いて、細胞培養皿から凍結保存液を廃棄し、新しい凍結保存液を1000μLずつ加えた。細胞培養皿を凍結保存用容器に入れた後、凍結保存用容器を−85℃に設定した超低温フリーザーに入れ、シート状細胞培養物を凍結保存した。1枚の細胞培養皿は24時間後に超低温フリーザーから取り出し、37℃に加温した継代増殖用培地を細胞培養皿に加えることで、凍結したシート状細胞培養物を急速に解凍した。解凍後にピペッティング操作をすることでシート状細胞培養物を回収することができた。また、もう1枚の細胞培養皿は3ヶ月後に超低温フリーザーから取り出し、37℃に加温した継代増殖用培地を細胞培養皿に加えることで、凍結したシート状細胞培養物を急速に解凍した。解凍後にピペッティング操作をすることでシート状細胞培養物を回収することができた。
このことから、本方法を用いることで、長期間のシート状細胞培養物の保存が可能であることが明らかとなった。
Claims (8)
- 培養基材上に播種した細胞を24時間以内の期間培養して形成されたシート状細胞培養物を、該培養基材に付着させた状態で、−80℃以下の温度で24時間以内の期間凍結する工程、
凍結したシート状細胞培養物を、30℃〜50℃の媒体で浸漬することにより20秒以内で解凍する工程、および
培養基材からシート状細胞培養物を単離する工程、
を含む、単離されたシート状細胞培養物の製造方法。 - 培養基材からシート状細胞培養物を単離する工程が、ピペッティング操作なしで行われる、請求項1に記載の製造方法。
- 培養基材上に、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で細胞を播種する工程をさらに含み、前記密度が、前記細胞がコンフルエントに達する密度またはそれ以上である、請求項1または2に記載の方法。
- 培養基材上で細胞を24時間以内の期間培養してシート状の細胞培養物を形成する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 培養液に凍結保存剤を添加する工程、および/または、培養液を凍結保存液に置換する工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 培養基材が細胞接着性を有する、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 細胞が骨格筋芽細胞である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 培養基材上に播種した細胞を24時間以内の期間培養して形成されたシート状細胞培養物を、該培養基材に付着させた状態で、−80℃以下の温度で24時間以内の期間凍結する工程、および
凍結したシート状細胞培養物を、30℃〜50℃の媒体で浸漬することにより20秒以内で解凍する工程
を含む、シート状細胞培養物の単離促進方法。
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