JP3025931B2 - 表皮細胞シートの凍結保存用液 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は表皮細胞シートの凍結保
存液に関する。

【０００２】

【従来の技術】熱傷や火傷等による皮膚損傷の治療法の
一つとして、従来より皮膚移植が知られており、近年培
養表皮細胞を利用した培養皮膚移植が注目を集めている
〔石倉直敬他、日形会誌（Ｊ．Ｊｐｎ．Ｐ．Ｒ．
Ｓ．），７，１０８６−１０９３（１９８７）；熊谷憲
夫他、日形会誌（Ｊ．Ｊｐｎ．Ｐ．Ｒ．Ｓ．），８，５
７４−５８５（１９８８）；熊谷憲夫、皮膚病診療，１
０（１２），１０８８−１０９３（１９８８）；黒柳能
光，蛋白質核酸酵素，３６（７），１４４３−１４４９
（１９９１）；Ｈ．グリーン，日経サイエンス，１９９
２年１月号，８４−９２頁等参照〕。殊に上記皮膚損傷
の治療においては、受傷１週間までの間の体液の漏出や
創傷部の細菌感染等が深刻な問題であり、その時期に適
当な表皮細胞シート等により損傷部を被覆することが熱
傷治療の重要な課題である。

【０００３】上記培養皮膚移植は、既に臨床の場におい
てその有用性が確認されてはいるものの、移植に利用す
るヒト表皮細胞シートの供給体制、特にその作製や保存
性については未だ数種の問題点が残されている。即ち上
記表皮細胞シートは、一般に凍結保存した懸濁状態の細
胞から培養を開始して作製され、各臨床施設に輸送され
るが、その間通常２週間程度の期間を要する不利があ
り、緊急時等を考慮すれば、細胞シートの状態で長期間
安定して保存でき、必要時に直ちに使用できる凍結保存
法の確立が急務とされている。

【０００４】しかして、一般に動物細胞の凍結保存法と
しては、その凍結速度により、緩慢凍結と急速凍結とが
知られており、上記表皮細胞シートは、膜透過性の異な
る未分化細胞と分化細胞とを含み且つ細胞同志が密に接
着し細胞収縮によるダメージが大きいと考えられるた
め、その凍結法としては急速凍結の方が適しているが、
この急速凍結法は、凍結時に細胞をかなりの高浸透圧に
順化させる必要があり、また融解時に３００℃以上／分
の急速な昇温を必要とし、しかも厳密な温度管理下で数
段階に分けて浸透圧をさげる繁雑な操作が必要なこと等
から、実用化は不可能であると考えられる。

【０００５】一方、緩慢凍結法は、その操作は簡単であ
るものの、細胞内自由水の脱水等による細胞収縮、ひい
ては細胞の破裂が起こる欠点は避けがたい。この欠点を
解消するための最も重要な課題の一つとしては凍結保存
液の組成が考えられ、従来より、該保存液は、通常培養
液に１０〜２０％程度の血清と共に、凍結による細胞外
液の濃縮抑制、細胞収縮抑制、凍結部分の拡大抑制、細
胞膜の保護等の作用を期待して１０〜２０％程度の凍結
保護剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグ
リセロール等の細胞内に浸透する透過型凍結保護剤を添
加したものからなっている。

【０００６】しかるに、上記ＤＭＳＯはその細胞毒性を
考慮すればこの種細胞シートへの利用は不適当であると
考えられ、また本発明者等の研究によれば、上記従来の
凍結保存液を単に表皮細胞シートに応用しても実用可能
な細胞数を保有する所望のシートは到底得られず、凍結
融解後の細胞数が極端に少なく生細胞数は実際に測定で
きないものとなることが確認された。

【０００７】また、凍結融解後の表皮細胞シートの利用
に際し、移植後感染症等を引き起こさないようにできる
だけ栄養成分の少ない凍結保存液の開発が望まれている
ものの、現状では血清成分及びアミノ酸の利用を避ける
ことは困難とされている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、表皮細胞シートの凍結保存に適しており、従来の凍
結保存液に見られる欠点を全て解消した新しい表皮細胞
シートの凍結保存液及びこれを用いた凍結保存方法を提
供することにある。

【０００９】本発明者等は上記目的より鋭意研究を重ね
た結果、血清成分及びアミノ酸を含有しない基礎溶液中
にグリセロール及びポリエチレングリコールを含有させ
る時には、上記目的に合致する凍結保存用液が得られる
ことを見出だし、ここに本発明を完成するに至った。

【００１０】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
グリセロール及びポリエチレングリコールを含有し、血
清成分及びアミノ酸を含有しないことを特徴とする表皮
細胞シートの凍結保存用液が提供される。

【００１１】また本発明は上記凍結保存用液を利用して
表皮細胞シートを凍結保存する方法をも提供する。

【００１２】本発明の凍結保存用液につき詳述すれば、
これはグリセロール及びポリエチレングリコールを含有
し、血清成分及びアミノ酸を含有しないことを必須とし
て、他は通常のこの種細胞の凍結保存用液と同様とする
ことができる。即ち、該液は例えば通常の生理的塩類溶
液を基礎溶液とし、これに上記特定成分を配合して調整
される。

【００１３】ここで基礎溶液としては、特に限定はない
が、通常知られている各種の生理的塩類溶液、好ましく
は平衡塩類溶液を例示でき、特に本発明に適したものと
しては、ハンクス溶液〔Hanks' solution 〕等を例示で
きる。

【００１４】本発明凍結保存用液は、上記基礎溶液に細
胞の保存に有効量のグリセロール及びポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）を添加配合して調整される。

【００１５】グリセロールは、本発明の保存用液におい
て、細胞膜透過型の保存剤として作用し、かかる作用有
効量が配合されている限りにおいて、その配合量に特に
制限はないが、好ましくは約１０〜２０（ｖ／ｖ）％程
度とするのが望ましい。

【００１６】ＰＥＧとしても特に限定なく、通常容易に
入手できる平均分子量２００から２００００程度のもの
をいずれも利用できる。本発明においては、好ましくは
平均分子量４０００から２００００程度のＰＥＧを利用
できる。該ＰＥＧは、本発明の保存用液において、細胞
膜非透過型の保存剤として作用し、かかる作用有効量が
配合されている限りにおいて、その配合量に特に限定は
ないが、好ましくは約５〜１０（ｗ／ｖ）％程度とされ
るのが望ましい。

【００１７】本発明凍結保存用液を用いた表皮細胞シー
トの凍結保存は、上記特定の保存用液を利用することを
除いて、常法に従うことができる〔例えば「凍結保
存」、朝倉書店発行、酒井昭編集、１９８９年、第７４
〜７６頁、「厚生省細胞バンクにおける方法」、水澤博
等を参照〕。凍結は、例えばプログラムフリーザーによ
る緩慢凍結法により行なうことができ、また発泡スチロ
ール容器に入れて−８０℃デープフリーザー中で凍結す
ることもできる。

【００１８】凍結された表皮細胞シートの保存は、例え
ば液体窒素デュワー内で、又は−１３５℃ウルトラディ
ープフリーザー中で好適に行なうことができ、輸送時は
ドライアイス中での保存も可能である。

【００１９】ここで本発明凍結保存用液により凍結保存
される表皮細胞シートは、通常のヒト表皮細胞シートで
あり、これは例えば常法に従い、ヒト表皮細胞（ケラチ
ノサイト）を、例えば３７℃、５％炭酸ガス気相下に初
代培養及び継代培養することにより得られる。上記培養
はより具体的には、培養基材としてのコラーゲン、特に
タイプＩコラーゲンがコーティングされた培養皿で、播
種時の細胞密度が、初代培養の場合は、２〜５×１０⁴
細胞／ｃｍ² 程度、継代培養の場合は、０．５〜１．５
×１０⁴ 細胞／ｃｍ² 程度となる条件下で実施されるの
が好ましく、２日に一度の培地交換により、所望の良好
な細胞増殖を行ない得る。

【００２０】かくして得られる増殖ヒト表皮細胞は、該
細胞の提供者の年齢や細胞の状態等により一定ではない
が、一般には約２４時間の培養により約２倍の細胞数に
増加する。かくして増殖された増殖ヒト表皮細胞のシー
トは、例えば上記のようにして得られるコンフルエント
（confluent ）にまで増殖した単層のヒト表皮細胞を、
重層化培地で更に培養して表皮細胞を層状に重層化し、
生体表皮と同様の組織形態に分化させて行ない得る。該
重層化培地は、通常の基礎培地から調整でき、そのカル
シウム濃度は約０．４〜２．０ｍＭに調整され、また牛
胎児血清（ＦＣＳ）を添加配合されるのが好ましい。上
記重層化培地で１週間程度培養することにより、表皮細
胞は５〜６層に多層化し、下層には増殖能を有する基底
細胞、上層には分化した角化細胞が観察される。このよ
うにして作成されるヒト表皮細胞シートは、既に知られ
ているこの種のシートと同様にして培養皮膚移植に利用
できる。

【００２１】上記凍結保存された表皮細胞シートの融解
は、３７℃温浴中で行われるのが最も簡便であり、好適
である。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を更に具体的に説明するため参
考例及び実施例を挙げるが、本発明はこれに限定される
ものではない。

【００２３】

【参考例１】表皮細胞培養用基礎溶液の調整 （１）極東ＭＣＤＢ１５３培地（極東製薬工業株式会社
製）に、以下のアミノ酸が下記組成となるように、各ア
ミノ酸の所定量（括弧内は各アミノ酸のモル濃度を示
す）を追加配合して、基礎培地を調整した。

【００２４】 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩・１水塩 ５０．３１ｍｇ／ｌ（２．４×１０^-4Ｍ） Ｌ−イソロイシン １９６．７８ｍｇ／ｌ（１５×１０^-4Ｍ） Ｌ−メチオニン ５３．７２ｍｇ／ｌ（３．６×１０^-4Ｍ） Ｌ−フェニルアラニン ５９．４８ｍｇ／ｌ（３．６×１０^-4Ｍ） Ｌ−トリプトファン １８．３８ｍｇ／ｌ（０．９×１０^-4Ｍ） Ｌ−チロシン ５４．３６ｍｇ／ｌ（３．０×１０^-4Ｍ） かくして得られた培地は用時に水に溶解し更に６７００
ｍｇ／ｌのＨＥＰＥＳ及び１２００ｍｇ／ｌの重曹を添
加して使用される。以下、これを「基礎培地２」とい
う。

【００２５】（２）上記（１）で調整された基礎培地２
を用いて、次の通りヒト表皮細胞増殖用培地（基礎溶
液）を調整した。

【００２６】即ち６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整
後、濾過滅菌した基礎培地２に、以下の成長促進物質及
び抗生物質を添加配合して、各増殖培地を調整した。以
下これを「基礎溶液２」という。

【００２７】 インスリン ２×１０^-7Ｍ ハイドロコーチゾン ０．５μｇ／ｍｌ エタノールアミン １００μＭ ホスホエタノールアミン １００μＭ ＢＨＥ（参考例２にて調整） １００μｇ蛋白量／ｍｌ カナマイシン ０．１ｇ／ｌ

【００２８】

【参考例２】ＢＨＥ（牛大脳−視床下部抽出物）の調整 牛脳組織より視床下部を中心とした大脳−視床下部の組
織部位を摘出し、凝固した血液や膜成分を取り除いた
後、冷却した生理食塩水で３〜４回洗浄し、−８０℃に
て凍結保存し、使用時に４℃にて解凍し、引続く操作に
供した。

【００２９】解凍した約３００ｇの上記組織を、冷却し
た生理食塩水５００ｍｌ中でポリトロンホモジナイザー
（カイネティクス社製）で３〜４分間粉砕し、更にポッ
ター型テフロンホモジナイザーにて冷却しながら、１〜
２分間細かく粉砕後、４℃、３８０００×ｇで４０分間
遠心分離して上清を得た。該上清に硫酸ストレプトマイ
シン（明治製菓社製）を終濃度が０．５ｗ／ｖ％となる
ように加え、４℃で１８時間撹拌し、３８０００×ｇで
６０分間遠心分離して上清を得た。

【００３０】得られた上清をクリーンベンチ内でポアサ
イズ０．２２μｍの滅菌済みフィルター（ミリポア社
製）で加圧濾過滅菌し、約１０ｍｇ蛋白量／ｍｌの抽出
液を得た。これを５ｍｌずつ分注し、−８０℃にて保存
し、用時室温にて解凍し、ＢＨＥとして用いた。

【００３１】

【参考例３】ヒト表皮細胞シートの調整 皮膚移植手術時又は皮膚組織除去手術時の不要破棄皮膚
組織片１×１ｃｍをシャーレに移し、冷却したダルベッ
コＰＢＳ中で２〜３回洗浄後、脂肪層を切除した。これ
を０．０５％グルコン酸クロルヘキシジン含有７５％エ
タノール溶液に約３０秒間浸漬することでその皮膚片表
面を殺菌し、更にＤＭＥ培地で１〜２回洗浄した。真皮
部分を、滅菌した手術用小型ハサミにて、できるだけ取
り除き、０．２〜０．３ｍｍ×０．５ｍｍの短冊状に切
断した。再度０．０５％グルコン酸クロルヘキシジン含
有７５％エタノール溶液に約２０秒間浸漬する殺菌処理
を行ない、ＤＭＥ培地で１〜２回洗浄して前処理を終了
した。

【００３２】上記で前処理した皮膚小片を２５０Ｕ／ｍ
ｌのディスパーゼ（合同酒精社製）を含むＤＭＥ培地中
に４℃で一晩（約２４時間）浸漬した後、ピンセットに
て表皮層と真皮層とに分け、表皮層を０．２５ｗ／ｖ％
トリプシン溶液（ギブコ社製）を含むダルベッコＰＢＳ
（−）に３７℃、１０分間浸漬し、３０ｖ／ｖ％ＦＣＳ
（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥ培地を加えピペッティン
グにより表皮細胞を分散させた細胞懸濁液を得た。これ
を４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈渣部を
少量の増殖培地２に懸濁させて、ヒト表皮細胞を調整し
た。

【００３３】上記に従い細胞濃度が１〜２×１０⁵ 細胞
／ｍｌとなるように調整されたヒト表皮細胞懸濁液５ｍ
ｌを、コラーゲン（タイプＩ）をコーティングした６ｃ
ｍ径の培養皿（コーニング社製）に播種し、培養培地２
を用いて初代培養した。該培養は３７℃、５％炭酸ガス
気相下で行ない、培養開始２０〜２４時間後及び以後１
日おきに培地交換を行なった。表皮細胞は１２日間で培
養皿一杯（コンフルエント）にまで良好に増殖したの
で、次いで、継代処理を行ない、第２細胞世代の継代培
養を行なった。

【００３４】継代処理は、培養液を除き、ダルベッコＰ
ＢＳ（−）（日水社製）で２回洗浄後、０．０１ｗ／ｖ
％ＥＤＴＡ及び０．１２５％トリプシンを含むダルベッ
コＰＢＳ（−）を加え、３７℃で５分間インキュベート
し、表皮細胞が培養皿から剥がれた状態であることを確
認した後、３０ｗ／ｖ％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含む
ＤＭＥ培地（日水社製）を加え、ピペッティングにより
表皮細胞懸濁液を得、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠
心分離して得た沈渣部を少量の培養培地２に懸濁させる
ことにより行なった。

【００３５】継代培養は、細胞密度が０．５〜１．５×
１０⁴ 細胞／ｃｍ² になるように調整した懸濁液を用い
る以外は、上記初代培養と同様にして実施した。表皮細
胞は、１週間で培養皿一杯にまで良好に増殖した。更
に、同様にして継代処理と継代培養とを繰返してヒト表
皮細胞を得た。かくして、コンフルエントになった細胞
を、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、重層化用培地（１０％Ｆ
ＣＳ及び３．３ｇ／ｌＨＥＰＥＳを含むＤＭＥ培地）に
培地交換した。１日おきに培地交換し、７〜８日後に重
層化した細胞をＰＢＳ（−）及びＤＭＥ培地にて各１回
洗浄した。０．７５％コラーゲナーゼを含むＤＭＥ培地
で３７℃下に４０〜６０分間、周囲が僅かに剥がれる程
度まで、酵素処理し、ＰＢＳ（−）及び保存液（Ｌ−１
５培地）で各１回洗浄した。保存液を入れ、細胞シート
が僅かに浸る程度まで吸引除去し、支持体（ベスキチン
Ｗ）を載せ、一緒に剥離して細胞シートを得た。

【００３６】

【実施例１】本発明凍結保存用液の調整 ハンクス液に、それぞれ１０（ｖ／ｖ）％グリセロール
及び５（ｗ／ｖ）％ポリエチレングリコール６０００を
添加配合して、本発明凍結保存用液を調整した。

【００３７】

【実施例２】ヒト表皮細胞シートの凍結保存 参考例３で調整した細胞シート（５代継代、重層化７日
目）をＰＢＳ（−）で洗浄し、酵素処理（０．５％コラ
ーゲナーゼ／ＤＭＥＭ、３７℃、３０分間）しＤＭＥ培
地で洗浄後、実施例１で調整した本発明凍結保存用液で
洗浄し、該保存用液で膨潤したアロアスクＤ（大鵬薬品
工業株式会社製）を載せ一緒に剥離し、保存用液を滴下
し、−８０℃ディープフリーザー中で−８０℃まで凍結
させた。

【００３８】かくして、得られた凍結細胞シートを３７
℃炭酸ガスインキュベーター中で融解し、融解細胞シー
トの状態を次の方法により判定した。

【００３９】即ち、この判定は細胞シート内の接着能を
もつ細胞数を指標とするものであり、上記で融解した細
胞シートをトリプシン処理（０．１２５％トリプシン及
び０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）、３７℃、１５
分）により細胞分散を行ない、得られた細胞をＭＣＤＢ
１５３培地に懸濁させ、Ｉ型コラーゲンコートディッシ
ュ（コーニング社製）に播種し、３７℃で１時間培養
後、接着した細胞を上記と同一のトリプシン処理（３７
℃、５分間）により剥がし、コールターカウンター（コ
ールター社製）で細胞数を測定して、該細胞数により判
定した。

【００４０】得られた結果は、図１に示す通りである。

【００４１】図１は本発明凍結保存用液を用いて−８０
℃で凍結保存した細胞シートの融解後の平方センチメー
トル当りの接着細胞数（縦軸）を求めたグラフである。
また、該図には、上記凍結細胞シートを液体窒素中で１
日間及び７日間それぞれ保存した後に、同様にして融解
して求めた同値を併記した。

【００４２】図１より、本発明凍結保存用液の利用によ
れば、高い凍結保護効果が奏されることが明らかであ
る。

【００４３】

【実施例３】本発明による細胞シートの凍結保護効果 実施例２に従う本発明凍結保存用液による細胞シートの
凍結保護効果を、血清成分又はアミノ酸の栄養成分を含
ませた場合との比較により検討した。

【００４４】結果を図２に示す。

【００４５】図２中、縦軸は前記図１と同じであり、横
軸の（１）〜（４）はそれぞれ次の保存用液を用いた場
合を示す。

【００４６】 （１）…実施例１で調整した本発明凍結保存用液 （２）…２０％ＦＣＳを添加した上記本発明凍結保存用
液である比較例 （３）…上記本発明凍結保存用液において、ハンクス液
の代わりにアミノ酸含量の高いＬ−１５培地を用いる以
外は同様にして調整した保存用液である比較例 （４）…２０％ＦＣＳを添加した上記（３）の凍結保存
用液である比較例。

【００４７】図２より、血清及びアミノ酸を含有しない
ことで特徴付けられる本発明の凍結保存用液は、その凍
結保護効果において、血清及び／又はアミノ酸を含有さ
せた場合と比較しても遜色のないことが明らかである。

【００４８】

【実施例４】本発明による細胞シートの凍結保護効果 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の配合量（濃度）を
変化させる以外は、実施例１と同様にして調製した本発
明凍結保存用液を利用して、実施例２に従い、各凍結保
存用液におけるＰＥＧ配合量とその凍結保護効果との関
連を試験した。

【００４９】結果を図３に示す。図３中、縦軸は図１と
同じであり、横軸は供試した各凍結保存用液における使
用ＰＥＧ濃度（０、０．１、０．５、１、５及び１０ｗ
／ｖ％）を示す。

【００５０】図３より、使用ＰＥＧ濃度が５ｗ／ｖ％以
上において、顕著に優れた効果が発揮されることが判
る。尚、細胞シートへの影響を考慮すると、ＰＥＧ配合
量は１０ｗ／ｖ％程度までとするのが好ましい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明凍結保存用液を利用して凍結後、融解さ
せて表皮細胞増シートの状態を判定したグラフである。

【図２】本発明凍結保存用液による表皮細胞シートの凍
結保護効果を評価したグラフである。

【図３】本発明凍結保存用液による表皮細胞シートの凍
結保護効果を評価したグラフである。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 5/06 - 5/08 A61L 27/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グリセロール及びポリエチレングリコール
   を含有し、血清成分及びアミノ酸を含有しないことを特
   徴とする表皮細胞シートの凍結保存用液。