JPH02174848A - 表皮シート並びにその製法、貯蔵方法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞培養に関する。詳しくは、本発明は、細
胞を培養して移植用表皮シートを形成し、該表皮シート
を後の使用のために凍結する方法に関する。

［従来の技術］ 重篤な皮膚創傷は、古来ｍ要な医学上の問題であった。

このような創傷は、■度およびｍ度の火傷によって起こ
ることが多い。このような皮膚創傷患者にとって主要な
問題は、どのようにして損傷された部分を保護し、その
治癒を助けるか、ということである。このような創傷に
よって患者はシ曹ツクを受け、腎臓障害を起こし、感染
に対する感受性が高くなる。

重症の火傷患者には、治癒すべき皮膚が充分に桟ってい
ないことが多い。残った皮膚も損傷されており、それ故
速く増殖し得ないということもある。更に、身体が、皮
膚による保護なしには、残った皮膚が再生するに充分な
期間生き永らえられないこともある。皮膚は通例侵入す
る生物体に対する第１の防御層となっているので、火傷
患者は特に感染を受は易い。このことは、皮膚の破損を
伴う他の種類の創傷においても問題となり得る。

過去には、そのような創傷の患者は、傷をふさぐのを助
け、感染性の生物体から隔離するために、包帯でくるま
れていた。しかし、そのような処置は決して完全に有効
なものではなかった。更に、包帯が治癒を妨げることも
ある。

近年ては、外科医により、ブタの皮膚片が傷に移植され
ている。このようなパッチは多少は有効であったが、人
体はブタの皮膚に対して侵入異物として反応するので、
拒絶の問題が生じた。充分な量の皮膚が残っている患者
においては、患者の皮膚の健康な部分から、いわゆる分
層皮膚移植を行い得る。しかし、これにより身体に新た
な傷が生じる。また、多くの火傷患者においては、その
ような処置を取るための健康な皮膚は充分には残りてい
ない。

この約１０年の間に、移植に用いるためのヒトの皮膚の
培養が開発された。本発明前に知られている方法におい
ては、皮膚の小片を、移植に使用し得るサイズになるま
でイン・ビトロで培養している。

しかし、この方法には重要な難点がある。すなわち、こ
の皮膚片は、移植を、受ける患者自身のものでなければ
ならないのである。換言すれば、そのような組織を用い
る自家移植をなし得るに過ぎないのである。このような
限定の理由は、同種移植（組織源は、移植を受ける患者
以外のものである）に対しては身体の免疫応答が高まり
、患者の身体がその移植片を拒絶するからである。

主としてこのために、培養方法の有用性が限定されてい
る。そもそも移植を必要とする多くの患者は、その全身
の皮膚の損失が大きく、それ故その方法の出発材料とし
て使用する大きな組織源を持たない。従って、利用でき
る組織をこの方法によって培養し、次いでそれを分割し
てさらなる出発材料を造らなければならない。これによ
りｎＭまでに時間がかかり、従って患者の危険が大きく
なる。

更に、そのような患者は身体に大きな外傷を有するので
、皮膚移植に急を要し、移植用の皮膚が早く利用可能と
なる程良い。旧来の方法では、移植に使用し得る充分な
皮膚が得られるまでに何カ月も要することがある。その
間に、患者によっては、身体の外傷または感染の故に死
亡してしまうことがある。

従来の皮膚培養方法の他の問題は、増殖する皮膚は通例
あまり均一でないということである。実際、凹凸および
穴が多い。このことは美容上望ましくないばかりでなく
、患者にとって危険である可能性もある。この穴は、異
種生物体による感染部位となり得る。更に、凹凸の多い
皮膚は、圧力および伸縮によって裂傷を生じる可能性が
高い。

均一な組織増殖のための一方法においては、３Ｔ３細胞
のマトリックスの上で皮膚細胞を増殖させる［ラインヴ
アルト（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）およびグリ−７（（ｉｒ
ｅｅｎ）、１９７５］。３Ｔ３細胞は、皮膚細胞の支持
細胞層として作用する。皮膚細胞は増殖して、３７３細
胞（皮膚組織の一部となる）の上に融合性の（ｃｏｎｆ
ｌｕａｎｔ）単層を形成することができる。

しかしながら、この方法は皮膚移植のために安全には使
用し得ない。３Ｔ３細胞は部分的に形質転換された細胞
である。つまり、３Ｔ３細胞は非形質転換細胞よりも発
ガン性物質に対する感受性が高（、より容易にガン化し
得る。皮膚は、日光中の紫外線のような多くの発ガン性
因子に常にさらされているので、皮膚移植片中の３７３
細胞の存在は、患者の実際の発ガンの危険を高め得る。

滑らかで均一な表皮シートを増殖によってａ１２する試
みにおいて、危険性を含んだ方法が他にも開発されてい
る。例えば、ケラチン細胞の増殖を促進するために、組
織培養培地にコレラ毒素が加えられてきた［グリーン、
１９７８］、移植時に組織内に毒素が残っていれば、毒
素は移植受容体当然このことは受容体にとって危険であ
る。

近年、構造が均一であり、患者の免疫ｎ構による拒絶を
起こさない皮膚シートの培養方法の必要性が高まってい
る。そのような方法は、３７３細胞のようなガンを促進
する物質にも、コレラ毒素のような危険な化学物質にも
依存してはならない。

そのような皮膚シートは、傷に移植する必要が生じた時
にいつでも使用できるように貯蔵可能であることも望ま
しい。それにより、患者の危険が緩和され、多くの火傷
および他の貢篤な皮膚創傷患者の生命を救うことが可能
となるであろう。

［発明の構成］ 本発明は、皮膚移植に使用する表皮シートの培養および
貯蔵方法を提供する。本発明方法は、多くの点で従来の
方法よりも有利である。本発明の方法においては、細胞
を培養して、穴も凹凸も無い比較的均一なシートを得る
ことができる。すなわち、本発明の方法により、従来の
ものよりもよ。

り耐久力があり、より保護効果の高い皮膚シートまた、
本発明の方法においては、３Ｔ３細胞の支持層のような
皮下マトリックスを用いない。従って、本発明の方法に
よるガン形成の危険は、従来の方法によるそれよりも非
常に小さい。本発明の方法は、コレラ毒素のような危険
性のある化学物質にも依存していないので、患者の罹患
または死亡の危険もより小さい。

本発明方法は、患者の免疫機構による移植拒絶の可能性
をも克服するものである。従って、移植受容体のもの以
外の組織源を増殖して表皮シートをｗ４製することがで
きる。これにより、出発材料の選択性が大きく広がり、
移植用表皮シートの供給も非常に増加する。

本発明の方法は、表皮シートの長期間貯蔵手段をも提供
する。その結果、表皮移植を必要とする患者に表皮シー
トを直ちに容易に提供することが可能となる。そのよう
な即時の供給が可能となることによって、患者の外傷を
軽減し、患者を感染から保護することができる。従って
、皮膚創傷のより早期の治癒が可能となる。

本発明の方法は、製造、貯蔵および移植を含めて７つの
工程から成る。工程ｌにおいては、細胞を初代培養する
。工程２においては、初代培養物を継代培養する。工程
３においては、継代培養物をＥＧＦ　（表皮増殖因子）
の存在下に培養して融合性の単層とする。工程４におい
ては、培地を替え、単層を増殖させて多層表皮とする。

工程５においては、得られた表皮シートを凍結し、貯蔵
する。工程６においては、凍結した組織を解凍する。

工程７においては、培養した表皮組織を、皮膚移植片と
して患者に適用する。工程ｌ〜４は、ビラチルコラ（Ｐ
ｉＬｔｅｌｋｏｗ）およびスコｙ　）　（Ｓｃｏｕｔ）
（１９８６）の変法であり、その開示をここに引用する
ものとする。

工程１においては、表皮シートの増殖のための出発材料
を得る。移植を受ける患者の損傷されていない生きた皮
膚のような、いずれの表皮組織源を用いてもよい。例え
ば、容易に得られるので、健康な成人男性の包皮を用い
る。組織源は、培養した表皮シートの移植を受ける患者
自身のものである必要はないということに注目すべきで
ある。

次いで、皮膚組織を、消化液中でインキ晶ベートするこ
とによって、２つの成分、すなわち表皮および真皮に分
ける。真皮は廃棄する。表皮細胞をそれぞれ解離する。

これは、組織を更に消化液処理するなど、初代培養を開
始するためのいずれの従来の方法によっても行うことが
できる。例えば、組織を更に消化液処理し、次いでピペ
ットによって個々の細胞を解離する。

本発明の重要な要素は、ケラチン細胞増殖に使用する組
織培養容器の調製方法である。前記のように、ケラチン
細胞が培養皿に付着して増殖するのを助ける種々の方法
が多くの研究者によって試みられてきたが、その成果は
不充分である。ある場合にはシートが不均一であり、ま
たある場合には危険性のある材料を用いていた。

本発明においては、培養容器をコラーゲンタイプＩで被
覆することによって細胞の付着および増殖を助ける。コ
ラーゲンタイプＩの滅菌溶液を培養皿に入れ、次いで蒸
発させることによって、増殖面にコラーゲンタイプＩの
コーティングを形成する。次いで、皿を使用前に照射に
よって再滅菌する。

次いで、解離した細胞を血清の不存在下にＭＣＤＢ１５
３または他の適当な細胞培養培地中で培養する。これに
より、初代培養細胞を分裂させ、数を増加することがで
きる。

工程２では、細胞数を更に増加する。この工程は、表皮
シートの増殖には必須ではないが、小組織片からの細胞
を、多数の表皮シートの製造に使用できるようにする。

この工程２においては、初代培養物から細胞を採る。こ
れは標準的な方法で行うことができる。例えば、細胞を
消化液処理し、次いでピペット操作により単離細胞の懸
濁液を調製する。次いで、これらの細胞を分裂させて、
１つの初代培養皿からの細胞を多くの培蓑皿に接種して
融合増殖させることができるようにする。

この分裂方法は、ｌ細胞継代と称される。初代細胞の種
類によって、死滅させることなく継代できる回数が異な
る。例えばヒト包皮のケラチン細胞は、４回まで継代し
て、１ｌｌｊＨ１）Ｎの出発材料を増やすことができる
。

本発明の工程３においては、初代または継代細胞を、ｍ
１ｌｌ細胞懸濁液から増殖させて、組織培養皿上に融合
性単層を形成する。このような細胞は、表皮増殖因子（
ＥＣ；Ｆ）の存在下、および血清の不存在下に、適当な
細胞培養培地中で増殖させる。

例えば、数種のアミノ酸のレベルの高い完全ＭｃＤＢ１
５３培地を使用する。培地には、ＥＧＦを５〜５０　ｎ
ｇ／　１１！％例えば１０％ｇ／ｓｉ２の量で含ませる
。ＥＧＦの存在により、ＥＧＦ不存在下ならば細胞分裂
が停止する時期以後にも細胞が分裂を続けることができ
る。すなわち、ＥＧＦの存在下に、細胞は均一な単層と
なるように増殖する。

この工程において、細胞の増殖は、融合度が８０％とな
るまで、ないし融合に達した後３日後まで続けられる。

１ＦＩＪえば、細胞が１００％の融合度に達するまて続
けることが好ましい。単層の融合度がより低いと、得ら
れる組織が裂は易くなる。

細胞が集密に達したら、数日間保存することができる。

それより長く保存すると、細胞が死に始め、単層に弱い
部分が生じる。

次いで、工程４を行う。培地を、血清を含有する培地に
切り替える。この培地はＥＧＦを含んでいても、含んで
いなくてもよい。例えば、牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）補充
ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用する。

適当な細胞培養培地のいずれを用いてもよい。牛胎児血
清濃度は５％の低−ａ度でもよいが、その場合は細胞は
非常にゆっくりとしか増殖しない。牛胎児血清濃度が２
０％を越えると、それは阻害因子となる。

この工程においては、細胞単層が増殖して細胞の表皮シ
ート（約６〜１２層の厚さ）を形成する。

この増殖には、１０％ＦＣ８含有培地中で約４〜５日間
を要する。表皮シートは、均一な厚さを有し、移植に用
いると、本来の皮膚と区別がつきにくい。

電子顕微鏡で観察すると、表皮シートは正常な組織のよ
うに見える。下方の３または４層の細胞構造は正常に見
える。遊離リポソーム、張原綿維およびミトコンドリア
のようなオルガネラは、細胞質中に散在している。細胞
の核は卵形で、滑らかな核膜を有するように見える。細
胞−細胞結合間の一定の構造を有するデスモソームも、
本来の皮膚にあるのと同じように存在する。上方の２層
の細胞においては、正常な原繊維構造がランダムに細胞
質中に分布している。

表皮シートの細胞は、染色して光学顕微鏡で観察するこ
ともできる。このテストにより、細胞が正常な数（ヒト
において２３対）の染色体を有することがわかった。

このように増殖した表皮シートの試料の発ガン性を、ヌ
ードマウスを用いて試験した。ヌードマウスは免疫機構
に欠陥があるので、発ガン性物質に対して特に感受性が
高い。本発明の表皮シートの細胞を注射したマウスに、
５力月後もガンが認められなかった。

更に、増殖の種々の段階において、組織の細胞のＦＡｖ
Ａを調べた。種々の皮膚細胞によって特異的に製造され
るタンパク質を検出するために、細胞を蛍光抗体ラベル
で染色した。次いで、細胞を蛍光顕微鏡で調べた。これ
により、シートは、最初の増殖のために単離された種類
の細胞を含有し、その純度は約９９％であることがわか
った。例えば、その組織の約９９％がケラチン細胞であ
った。

この細胞純度は、皮膚移植を受ける患者の組織の免疫拒
絶の軽減における重要な因子である。これは、おそらく
、ケラチン細胞はヒトの主要な組織適合性症を起こさな
いという事実によるものであろう。従って、ケラチン細
胞は、患者の身体によって異物であるとは認識されず、
患者の免疫機構はその新しい細胞を撃退しようとはしな
い。

本発明により初めてこの免疫応答の欠如が認識された。

その結果、本発明により、培養した組織を、その元の組
織を採った個体以外の患者に、同種移植として使用する
ことが可能となった。すなわち、本発明は、メラノサイ
トのような、主要な組織Ｊ１１合性層性症こさないいず
れの表皮細胞を培養することをも包含する。

本発明の工程５は、培養した表皮シートを、皮膚移植の
必要が生じた時にいつでも使用できるように貯蔵する方
法を提供する。この工程においては、組織を培養皿から
剥離する。まず培地を細胞シートから流し去り、消化溶
液＃３を入れる。この溶液は、リン［１衝生理食塩液（
ＰＢＳ）または培地巾約１〜１０％のディスパーゼ（Ｄ
ｉａｐａｇｅ）から成る。インキ１ベージ璽ン時間は、
ディスパーゼの濃度および溶媒による。濃度が非常に高
いか、またはインキ異ベージ嘗ンが非常に長いと、細胞
間結合が切れ始め、組織が個々の細胞となって溶解して
しまう。例えばディスパーゼを１％の濃度でＰＢＳに溶
解し、組織を１〜２時間時間インキ−ベートことより、
組織を培養皿から剥離することができる。

処理後、消化溶液を洗い流し、凍結溶液を入れる。凍結
溶液は、細胞内の水によって起こり得る損傷から組織を
保護することを目的とするもの７ある。従うて、そのよ
うな氷を形成しない溶液を使用する。細胞懸濁液の凍結
に用いられる凍結溶液を組織の凍結に使用し得る。

凍結溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を３〜
１０％、好ましくは５％の濃度で、およびグリセロール
を５〜２０％、好ましくは２０％の濃度で含有し得る。

これらを新しい培地に溶解する。次いで、この凍結溶液
を、培養皿内の洗浄した組織に加え、流出および／また
は汚染を防止するために皿を密閉する。例えば、皿をパ
ラフィンフィルムで覆うことによって密閉する。

次いで、皿の温度を室温から一１３５℃まで徐々に低下
する。これは、例えば皿を一２０℃のフリーザーに数時
間入れ、次いｒ−７０℃のフリーザーに一晩入れ、最終
的に一１３５℃のフリーザーに入れることによって行い
得る。より好ましい方法においては、室温から始めて一
１３５℃まで、１分間当たり１℃ずつ温度が低下するフ
リーザーに皿を入れる。このように温度を徐々に低下す
ることによって水の生成を防止し得る。

凍結した表皮シートは、−１３５℃で少なくとも２年間
貯蔵し得る。解凍すれば、このシートは増殖したばかり
のシートと同様に機能する。

本発明の工程６では、凍結表皮シートを急速に解凍する
。本発明の好ましい態様では、包装した培養皿をフリー
ザーから３７℃の水浴に移す。３０〜４０℃の空気また
は水によるインキ島ベーターを使用してもよい。しかし
、空気インキュベーターは水浴はど速くは熱を伝導しな
い。３７℃以下のインキ晶ベーターを用いても組織は解
凍するが、より長い時間を要する。より高温（４０℃以
上）のインキ−ベーターでは、細胞が過熱される恐れが
ある。

培養皿内の凍結溶液が解凍すると、組織シートも解凍す
る。このシートは凍結溶液に浮かぶ。溶液を、新しい培
地、次いでＰＢＳで洗い流す。これで表皮シートを工程
７に用いることが可能となる。

工程７においては、表皮シートを解凍後約２４時間以内
に皮膚移植に使用する。培地を、例えば吸引によって滅
菌的に除去する。滅菌ガーゼをシートに当てると、シー
トはガーゼに付着する。次いで、組織を、ガーゼ面を上
にして傷の上に配置する。組織は自動的に移植されて皮
膚に隣接する。

このような表皮シートは、自家移植または同種移植に使
用し得る。ヒトにおける試験では、同種移植として用い
た場合の拒絶は全く認められていない。本発明は、同種
移植の免疫拒絶の問題に対して、初めて完全な解決法を
提供するものである。

［実施例］ 本発明は、ピラチルコラおよびスコツト（１９８６）の
方法を本発明において改良したものを用いる。

健康で若い成人男性から１切により包皮を得た。

この標本を充分に滅菌し、滅菌条件下にペトリ皿内で小
片に分けた。標本片に０．１７％トリプシンを４℃にお
いて１０〜１２時間作用させた。薄い半透明の表皮を、
滅菌した鉗子で持ち上げることによって、その下層の真
皮から分離した。表皮を０．７５％トリプシンで３７℃
において１〜２時間更に処理し、ピペット操作により単
離細胞の懸濁液とした。増殖可能な表皮細胞の数を血球
計算板で数えた。

組織培養皿をコラーゲンタイプ菖でコーチインクシタ。

［ｍ７５ｃｓ＋”当たｅ）０．１％溶液０．５＊Ｑを入
れ、層流フード内で３日間水の蒸発により溶液を乾燥さ
せた。次いで、この工程を行う部屋において、皿を照射
により再滅菌した。

完全ＭＣＤＢ１５３培地中、増殖可能細胞５ｘ１０’個
／ｃｙｚ”の量で細胞を接種した。この培地は、ウシ下
垂体抽出物の代わりにブタ下垂体抽出物（１４０〜１６
０Ｍｇタンハク１ｊｌｔ／ｌ１ｅ）を用イタコトヲ除い
ては、ピラチルコラおよびスコツトの用いたものと同じ
ものであった。それ以外の培養方法は、。

ピラチルコラおよびスコツトによる方法と同じであった
。

組織を培養皿からディスパーゼによって剥離した後、そ
の一部を凍結した。凍結する組織は、新しいＤＭＥＭで
洗浄し、培地を、５％ＤＭＳＯおよび２０％グリセロー
ルを含有するＤＭＥＭに替えた。皿をパラフィンフィル
ムで密閉し、フリーザーに入れた。組織を−１℃／分の
速度で−１３５℃まで徐々に冷却した。次いで、組織を
−１３５℃で２年間貯蔵した。

培ａｎｕをフリーザーから出し、密閉した皿を３７℃の
水浴に入れることによって組織を急速に解凍した。培地
が解凍し、組織が浮かぶことによって解凍が完了した。

次いで、凍結溶液を組織から新しいＤＭＥＭによって洗
い流し、ＰＢＳを入れた。次いで、組織を解凍後２４時
間以内に使用するまで３７℃でインキ−ベートした。

滅菌ガーゼを組織表面に当て、壊死組織を除去した清潔
な傷に組織を直接移した。組織は自動的に傷に付着した
。３日後にガーゼを除去した。組織は治癒しつつある傷
の一部となった。本来の皮膚に重なったいずれの組織も
よ（乾燥して脱落し、傷の縁に跡を残さなかった。２０
力月後も拒絶の徴候は現れなかった。

特許出願人　テ１〜ターテ・ツク・インフーポレーテッ
ド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳類表皮細胞を培養して同種移植に適当なシート
   を調製する方法であって、 ａ、血清の不存在下、表皮増殖因子の存在下に、コラー
   ゲンタイプ I で処理した容器において細胞をほぼ融合
   するまで増殖させ、 ｂ、培地を血清含有培地に替え、 ｃ、組織を培養して複数の層とする ことを含んで成る方法。 ２、細胞がケラチン細胞である請求項１記載の方法。 ３、細胞源がヒトの皮膚である請求項１記載の方法。 ４、細胞源がヒトの包皮である請求項１記載の方法。 ５、表皮増殖因子の量が、５〜５０ｎｇ／ｍｌ、好まし
   くは１０〜４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／
   ｍｌである請求項１記載の方法。 ６、培養容器７５ｃｍ＾２当たり０．１〜１０ｍｇ、好
   ましくは０．５ｍｇの量のコラーゲンで培養容器を被覆
   する請求項１記載の方法。 ７、血清不含有増殖培地が改良ＭＣＤＢ１５３である請
   求項１記載の方法。 ８、ブタ下垂体抽出物の代わりにウシ下垂体抽出物を用
   いる請求項７記載の方法。 ９、細胞を、融合度８０％になるまで、ないし融合後３
   日後まで、好ましくは融合度１００％まで増殖させる請
   求項１記載の方法。 １０、血清含有培地が、ダルベッコ改良イーグル培地の
   ような標準的な血清含有培地である請求項１記載の方法
   。 １１、請求項１記載の方法に従って調製した皮膚移植用
   培養表皮シートの貯蔵方法であって、ａ、培養表皮シー
   トを培養容器から剥離し、ｂ、凍結し、 ｃ、貯蔵し、 ｄ、急速に解凍する ことを含んで成る方法。 １２、培養表皮シートをディスパーゼで処理して容器か
   ら剥離する請求項１１記載の方法。 １３、ディスパーゼを１〜１０％の濃度で１〜２時間作
   用させる請求項１２記載の方法。 １４、培養表皮シートを凍結溶液中に入れ、次いで徐々
   に温度を下げる請求項１１記載の方法。 １５、凍結溶液が、ジメチルスルホキシド３〜１０％、
   好ましくは５％、グリセロール５〜２０％、好ましくは
   ２０％を含有する組織培養培地である請求項１４記載の
   方法。 １６、組織培養培地がダルベッコ改良イーグル培地であ
   る請求項１５記載の方法。 １７、培養表皮シートを約−２０℃に１〜２時間、次い
   で約−７０℃に一晩保った後、約−１３５℃にする請求
   項１４記載の方法。 １８、培養表皮シートを、１分間当たり温度が約１℃低
   下するフリーザーに入れ、約−１３５℃まで温度を下げ
   る請求項１４記載の方法。 １９、凍結した培養表皮シートを１時間ないし少なくと
   も２年間貯蔵する請求項１１記載の方法。 ２０、凍結した培養表皮シートを、３０〜４０℃、好ま
   しくは３７℃で解凍する請求項１１記載の方法。 ２１、凍結した培養表皮シートを、空気または水インキ
   ュベーター内で、好ましくは水インキュベーター内で解
   凍する請求項１１記載の方法。 ２２、請求項１記載の方法に従って調製した培養表皮シ
   ートを表皮移植片として傷に適用する方法。 ２３、凍結および解凍した表皮シートを使用する請求項
   ２２記載の方法。 ２４、表皮シート上にガーゼを当て、シートを培地から
   傷に移すことによって移植する請求項２２記載の方法。 ２５、請求項１記載の方法に従って調製した培養表皮シ
   ート。 ２６、皮膚移植片として傷に適用する請求項２５記載の
   表皮シート。 ２７、同種移植に使用する請求項２５記載の表皮シート
   。