JP2693640B2 - 培養上皮細胞シートの低温保存 - Google Patents
培養上皮細胞シートの低温保存Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は培養組織の短期間保存に関する。特に本発明
は、皮膚創傷保護剤として有用な培養上皮細胞組織シー
トを、細胞の生育性及びコロニー形成能を維持しつつ短
期間保存することに関する。
は、皮膚創傷保護剤として有用な培養上皮細胞組織シー
トを、細胞の生育性及びコロニー形成能を維持しつつ短
期間保存することに関する。
医学界においては、火傷、潰瘍又は外科的切除による
皮膚創傷後の体液喪失と感染を防ぐと同時に、新しい増
殖を促進するような皮膚創傷保護剤の開発が重要事項で
あった。包帯及び保護剤は広い創傷を十分に保護するこ
とができず、様々な代用物が開発されてきた。これらの
中には、死体皮膚、人工皮膚、及びヒトの同種移植及び
自己移植の、薄く剥ぐかそのままの厚さの移植片があ
る。ほとんどのものは広い創傷を十分に覆うことができ
なかった。これは、免疫抑制療法がなかったため、自己
移植を除き、結局身体によって排除されるためである。
自己移植は狭い面積の場合には有用であるが、大きな創
傷においては従来の自己移植は実用的ではない。
皮膚創傷後の体液喪失と感染を防ぐと同時に、新しい増
殖を促進するような皮膚創傷保護剤の開発が重要事項で
あった。包帯及び保護剤は広い創傷を十分に保護するこ
とができず、様々な代用物が開発されてきた。これらの
中には、死体皮膚、人工皮膚、及びヒトの同種移植及び
自己移植の、薄く剥ぐかそのままの厚さの移植片があ
る。ほとんどのものは広い創傷を十分に覆うことができ
なかった。これは、免疫抑制療法がなかったため、自己
移植を除き、結局身体によって排除されるためである。
自己移植は狭い面積の場合には有用であるが、大きな創
傷においては従来の自己移植は実用的ではない。
グリーン（Green）らは、火傷、潰瘍、その他の皮膚
創傷の治療用の、細胞数個の厚さの上皮細胞シートの培
養方法を開発した。米国特許第4,016,036号は、連続的
にケラチノサイトを培養し、上皮細胞の層状のシートを
製造する方法を開示している。米国特許第4,304,866号
は、ケラチノサイトを培養し、ディスパーゼ等の酵素を
用いて付着基層からシートを剥がすことによって、移植
可能な細胞シートを製造する方法を開示している。米国
特許第4,456,687号は、上皮細胞の増殖促進に有用な因
子を開示している。本明細書の一部として、これらの特
許の開示をここに引用する。グリーンらによって開発さ
れた培養システムにおいては、上皮細胞は組織培養シャ
ーレ又はフラスコの表面で急速に分裂し、最終的にはす
きまなく相互に連結した細胞の、集密的な、層状のシー
トを形成する。これらの集密的培養細胞は、酵素ディス
パーゼ（米国特許第4,304,866号を参照）等で処理して
剥離させ、粘着力のある細胞シートとすることができ
る。次に、この培養細胞シートを、ペトロラタム浸漬ガ
ーゼ又はその他の非接着性裏打ちに綴じ付け、培養液中
に入ったまま手術室に運び、患者に貼用する。
創傷の治療用の、細胞数個の厚さの上皮細胞シートの培
養方法を開発した。米国特許第4,016,036号は、連続的
にケラチノサイトを培養し、上皮細胞の層状のシートを
製造する方法を開示している。米国特許第4,304,866号
は、ケラチノサイトを培養し、ディスパーゼ等の酵素を
用いて付着基層からシートを剥がすことによって、移植
可能な細胞シートを製造する方法を開示している。米国
特許第4,456,687号は、上皮細胞の増殖促進に有用な因
子を開示している。本明細書の一部として、これらの特
許の開示をここに引用する。グリーンらによって開発さ
れた培養システムにおいては、上皮細胞は組織培養シャ
ーレ又はフラスコの表面で急速に分裂し、最終的にはす
きまなく相互に連結した細胞の、集密的な、層状のシー
トを形成する。これらの集密的培養細胞は、酵素ディス
パーゼ（米国特許第4,304,866号を参照）等で処理して
剥離させ、粘着力のある細胞シートとすることができ
る。次に、この培養細胞シートを、ペトロラタム浸漬ガ
ーゼ又はその他の非接着性裏打ちに綴じ付け、培養液中
に入ったまま手術室に運び、患者に貼用する。
これらの方法によって調製された自己移植材料は、火
傷保護剤として好ましいが、培養に時間がかかる。自己
移植片を培養している間、一時的創傷保護剤として有効
な同種移植材料を用いて創傷を保護することができる。
培養表皮同種移植片は慢性の皮膚潰瘍及び薄く剥いた移
植片供与部位の治癒を促進する。グリーンらの方法によ
って製造した培養表皮自己移植及び同種移植材料は、現
在バイオサーフェス・テクノロジー社（Biosurface Tec
hnology,Inc.,Cambridge,Massachusetts）から商業的使
用及び臨床試験用に市販されている。
傷保護剤として好ましいが、培養に時間がかかる。自己
移植片を培養している間、一時的創傷保護剤として有効
な同種移植材料を用いて創傷を保護することができる。
培養表皮同種移植片は慢性の皮膚潰瘍及び薄く剥いた移
植片供与部位の治癒を促進する。グリーンらの方法によ
って製造した培養表皮自己移植及び同種移植材料は、現
在バイオサーフェス・テクノロジー社（Biosurface Tec
hnology,Inc.,Cambridge,Massachusetts）から商業的使
用及び臨床試験用に市販されている。
培養上皮移植片を使用する際の、深刻で非常に実際的
な限界は、貯蔵期間が限られていることである。シート
中の細胞の生育性及びコロニー形成能は、付着基層から
はずすと急速に低下する。この細胞シートは非常にこわ
れやすい。これらはディスパーゼ処理後、最大で約８時
間以内に創傷に貼用された場合には、再現性よく再び増
殖し始め、分化した上皮を形成することができる。この
ため、移植片を配送することのできる地域は、製造施設
の付近に限定される。入手可能性を拡大するためには、
世界中に多くの製造施設をを設けるか、又は培養された
シートの生育可能な期間を延ばす方法を開発するかのど
ちらかが必要である。
な限界は、貯蔵期間が限られていることである。シート
中の細胞の生育性及びコロニー形成能は、付着基層から
はずすと急速に低下する。この細胞シートは非常にこわ
れやすい。これらはディスパーゼ処理後、最大で約８時
間以内に創傷に貼用された場合には、再現性よく再び増
殖し始め、分化した上皮を形成することができる。この
ため、移植片を配送することのできる地域は、製造施設
の付近に限定される。入手可能性を拡大するためには、
世界中に多くの製造施設をを設けるか、又は培養された
シートの生育可能な期間を延ばす方法を開発するかのど
ちらかが必要である。
凍結保存、特殊な細胞培地の使用、特定の包装技術な
ど、様々な組織の保存方法に関する多くの技術が知られ
ている。凍結保存は、材料を凍結保存剤の存在下に凍結
することにより、長期間の保存を可能にしている。この
保存剤は細胞内の水性物質と置き換わり、このことによ
って氷の結晶の形成を防止している。これまで多くの実
験手順が開示されているが、凍結−解凍サイクルの後の
細胞の生育性を維持すべく、凍結保存剤の性質、量、又
は凍結工程の過程や温度を様々に変えている。例えば、
米国特許第4,559,298号、同第4,688,387号、及び、特に
欧州特許第0,296,475号を参照されたい。
ど、様々な組織の保存方法に関する多くの技術が知られ
ている。凍結保存は、材料を凍結保存剤の存在下に凍結
することにより、長期間の保存を可能にしている。この
保存剤は細胞内の水性物質と置き換わり、このことによ
って氷の結晶の形成を防止している。これまで多くの実
験手順が開示されているが、凍結−解凍サイクルの後の
細胞の生育性を維持すべく、凍結保存剤の性質、量、又
は凍結工程の過程や温度を様々に変えている。例えば、
米国特許第4,559,298号、同第4,688,387号、及び、特に
欧州特許第0,296,475号を参照されたい。
生育可能な状態での保存期間を延長しうる第２の方法
は、細胞を取り囲む培地の選択に関連したものである。
例えば、米国特許第4,681,839号は、電解質、緩衝剤、
化学的エネルギー源、高エネルギーリン酸化合物、代謝
物質、及び毒性残渣除去用の収着物質を放出する「ビス
ケット（biscuit）」の入ったガス透過性の袋に組織を
入れることによって、宿主生物から分離された生きた組
織を保存するシステムを開示する。また、デロイザート
（DeRoissart）の特許は、生きた組織を生化学的に不活
性なガスで圧力をかけた栄養液中に保存するための方法
及び装置を開示している。米国特許第3,607,646号及び
同第3,722,153号を参照されたい。
は、細胞を取り囲む培地の選択に関連したものである。
例えば、米国特許第4,681,839号は、電解質、緩衝剤、
化学的エネルギー源、高エネルギーリン酸化合物、代謝
物質、及び毒性残渣除去用の収着物質を放出する「ビス
ケット（biscuit）」の入ったガス透過性の袋に組織を
入れることによって、宿主生物から分離された生きた組
織を保存するシステムを開示する。また、デロイザート
（DeRoissart）の特許は、生きた組織を生化学的に不活
性なガスで圧力をかけた栄養液中に保存するための方法
及び装置を開示している。米国特許第3,607,646号及び
同第3,722,153号を参照されたい。
生育性を維持しうる第３の方法は、リンドストローム
（Lindstrom）らの米国特許第4,695,536号に述べられて
いる角膜保存システム、又は、米国特許第4,630,448号
に述べられている固体の生きた組織の一部を保存するた
めの容器等の、様々なタイプの容器を使用することであ
る。
（Lindstrom）らの米国特許第4,695,536号に述べられて
いる角膜保存システム、又は、米国特許第4,630,448号
に述べられている固体の生きた組織の一部を保存するた
めの容器等の、様々なタイプの容器を使用することであ
る。
非凍結保存温度において保存される組織は、一般には
４℃において保存される。ローゼンクイスト（Rosenqui
st）らの、「４℃における短期間皮膚保存（"Short−Te
rm Skin Preservation at 4℃:Skin Strage Configurat
ion and Tissue−to−Volume Medium Ratio",9（１）,
J.B.C.R.52−54（1988）」を参照されたい。
４℃において保存される。ローゼンクイスト（Rosenqui
st）らの、「４℃における短期間皮膚保存（"Short−Te
rm Skin Preservation at 4℃:Skin Strage Configurat
ion and Tissue−to−Volume Medium Ratio",9（１）,
J.B.C.R.52−54（1988）」を参照されたい。
凍結保存法による組織の保存は、複雑で高価な工程で
ある。これは現在のところ、移植片を製造施設から手術
室まで運搬するのには実用的な方法ではない。この他に
は、保存中の生育性を８時間という非常に短い時間から
延長するようなシステムはこれまでには知られていな
い。ピッテルコウ（Pittelkow）らの文献（86J.Invest.
Dermatol.4:410−17,413−14（1986））等を参照された
い。
ある。これは現在のところ、移植片を製造施設から手術
室まで運搬するのには実用的な方法ではない。この他に
は、保存中の生育性を８時間という非常に短い時間から
延長するようなシステムはこれまでには知られていな
い。ピッテルコウ（Pittelkow）らの文献（86J.Invest.
Dermatol.4:410−17,413−14（1986））等を参照された
い。
本発明は培養上皮細胞移植片の生育性を延長する方法
を提供し、かつ、保存時間及び製造施設から手術室まで
の運搬時間の延長を可能にすることによって、再増殖の
能力及び生きた上皮創傷被覆剤としての機能を維持又は
高めながら、生命救助用移植材料を遠くまで運搬するこ
とができるようにすることを目的とする。本発明はま
た、これらの目的を達成すると同時に、移植片を高価な
凍結保存容器中で運搬することを回避することを目的と
する。
を提供し、かつ、保存時間及び製造施設から手術室まで
の運搬時間の延長を可能にすることによって、再増殖の
能力及び生きた上皮創傷被覆剤としての機能を維持又は
高めながら、生命救助用移植材料を遠くまで運搬するこ
とができるようにすることを目的とする。本発明はま
た、これらの目的を達成すると同時に、移植片を高価な
凍結保存容器中で運搬することを回避することを目的と
する。
発明の概要 基層から分離した後の培養上皮細胞シートのコロニー
形成能を維持し、かつしばしばこれを改良する、簡単な
方法が発見された。この方法は、シートを無菌的環境の
下で、８時間以上、約８℃〜約25℃、好ましくは13℃〜
23℃の温度範囲において維持する工程からなる。この方
法を用いることにより、８時間を十分に越える時間（少
なくとも26時間までは再現性良く、場合によっては72時
間まで）シートを保存することができ、かつ、高価で複
雑な凍結保存容器を用いることなく、シートを世界中に
容易に運搬することができる。この方法によれば、培養
上皮細胞シートの、生育可能な保存期間が長くなるのみ
でなく、少なくとも保存第１日目の間は通常、シート内
の細胞のコロニー形成能の測定値が向上している。増殖
基層から分離された後、患者に貼用されるまで、所定の
温度において24時間保存された移植片が患者に「癒着」
した割合は、６時間より短い時間保存された移植片の場
合と比べ、少なくとも同等であり、それより高いことも
ありうる。
形成能を維持し、かつしばしばこれを改良する、簡単な
方法が発見された。この方法は、シートを無菌的環境の
下で、８時間以上、約８℃〜約25℃、好ましくは13℃〜
23℃の温度範囲において維持する工程からなる。この方
法を用いることにより、８時間を十分に越える時間（少
なくとも26時間までは再現性良く、場合によっては72時
間まで）シートを保存することができ、かつ、高価で複
雑な凍結保存容器を用いることなく、シートを世界中に
容易に運搬することができる。この方法によれば、培養
上皮細胞シートの、生育可能な保存期間が長くなるのみ
でなく、少なくとも保存第１日目の間は通常、シート内
の細胞のコロニー形成能の測定値が向上している。増殖
基層から分離された後、患者に貼用されるまで、所定の
温度において24時間保存された移植片が患者に「癒着」
した割合は、６時間より短い時間保存された移植片の場
合と比べ、少なくとも同等であり、それより高いことも
ありうる。
別の態様においては、本発明は、すぐに患者に貼用で
きる皮膚創傷保護剤等の創傷保護剤であって、基層から
分離されて８時間以上経過した、粘着性の生きた培養上
皮細胞シートからなる創傷保護剤を提供する。この創傷
保護剤は、最初に分離された培養細胞のコロニー形成能
よりも高いコロニー形成能を有する。
きる皮膚創傷保護剤等の創傷保護剤であって、基層から
分離されて８時間以上経過した、粘着性の生きた培養上
皮細胞シートからなる創傷保護剤を提供する。この創傷
保護剤は、最初に分離された培養細胞のコロニー形成能
よりも高いコロニー形成能を有する。
また別の態様においては、本発明は、非接着性の基層
上に固定され、シートを約８℃〜約25℃の温度範囲に維
持する手段を有する無菌容器に収容された、粘着性の培
養ヒト上皮細胞シートからなる、保存安定性のある、創
傷治癒のための製品を提供する。８時間を越える間シー
トを約13℃〜約23℃の温度範囲に維持することは、生育
可能な保存期間を延長する効果だけでなく、しばしば基
層から分離した後のシート内の細胞のコロニー形成能を
増加させる効果を有している。好ましい温度範囲は約13
℃〜約23℃である。シートは、この温度において、コロ
ニー形成能を維持又は向上させつつ、約８時間から72時
間保存することができる。
上に固定され、シートを約８℃〜約25℃の温度範囲に維
持する手段を有する無菌容器に収容された、粘着性の培
養ヒト上皮細胞シートからなる、保存安定性のある、創
傷治癒のための製品を提供する。８時間を越える間シー
トを約13℃〜約23℃の温度範囲に維持することは、生育
可能な保存期間を延長する効果だけでなく、しばしば基
層から分離した後のシート内の細胞のコロニー形成能を
増加させる効果を有している。好ましい温度範囲は約13
℃〜約23℃である。シートは、この温度において、コロ
ニー形成能を維持又は向上させつつ、約８時間から72時
間保存することができる。
上皮細胞は、好ましくはケラチノサイトである。粘着
性のシートは、好ましくは細胞数個の厚さであって、少
なくとも発芽細胞及び分化細胞を含む。
性のシートは、好ましくは細胞数個の厚さであって、少
なくとも発芽細胞及び分化細胞を含む。
本発明のその他の目的及び特徴は、以下の図面、発明
の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかとなるで
あろう。
の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかとなるで
あろう。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の実施に用いられた、層状の培養ケラ
チノサイトシートの垂直断面の顕微鏡写真である。
チノサイトシートの垂直断面の顕微鏡写真である。
図２は、本発明の実施に適した、培養上皮細胞シート
を運搬するための容器の実例である。
を運搬するための容器の実例である。
図３は、13℃〜23℃において、20時間及び26時間保存
された移植片の生育性を、対照移植片、すなわち新しく
調製された移植片の生育性に対する比率で示したグラフ
である。生育性は、細胞シートを解離した後に回収され
た細胞の総数とそのコロニー形成能（CFE）、及び残存
するコロニー形成細胞（CFC）によって表わされる。
された移植片の生育性を、対照移植片、すなわち新しく
調製された移植片の生育性に対する比率で示したグラフ
である。生育性は、細胞シートを解離した後に回収され
た細胞の総数とそのコロニー形成能（CFE）、及び残存
するコロニー形成細胞（CFC）によって表わされる。
CFC＝回収細胞数×回収細胞のCFE 図４は、剥離させた後、様々な温度で20〜30時間保存
した細胞シートのコロニー形成細胞の総数の変化をまと
めたグラフである。
した細胞シートのコロニー形成細胞の総数の変化をまと
めたグラフである。
図５は、後述のように設計された箱の中における、移
植片保存培養液の温度変化を示すグラフである。温度は
検量した熱電対を用いて測定した。
植片保存培養液の温度変化を示すグラフである。温度は
検量した熱電対を用いて測定した。
発明の詳細な説明 本発明は、発芽力のある分化した細胞を含む培養上皮
細胞シート中の細胞のコロニー形成能を、該シートを基
層から分離した後に改良する方法を提供する。この方法
は、シートを浸すのに十分な量の生理学的適合性を有す
る培地中に、８℃〜19℃、好ましくは約13℃〜19℃、よ
り好ましくは約17℃〜約19℃の範囲の温度において、８
時間以上シートを維持する工程を含む。好ましくは、培
養上皮細胞シートは培養ケラチノサイトシートである。
また、好ましくはシートは約８時間〜約26時間、シート
を浸すのに十分な量の培地中に維持される。
細胞シート中の細胞のコロニー形成能を、該シートを基
層から分離した後に改良する方法を提供する。この方法
は、シートを浸すのに十分な量の生理学的適合性を有す
る培地中に、８℃〜19℃、好ましくは約13℃〜19℃、よ
り好ましくは約17℃〜約19℃の範囲の温度において、８
時間以上シートを維持する工程を含む。好ましくは、培
養上皮細胞シートは培養ケラチノサイトシートである。
また、好ましくはシートは約８時間〜約26時間、シート
を浸すのに十分な量の培地中に維持される。
本発明の別の態様によれば、本発明は創傷に貼用する
のに適した保護剤を提供する。この保護剤は、付着基層
から８時間以上前に剥離された、発芽力のある分化した
細胞を含む生きた培養上皮細胞の粘着性シートからな
り、新たに付着基層から剥離されたときの培養集密シー
トの細胞のコロニー形成能よりも高いコロニー形成能を
有することを特徴とする。好ましくは、培養上皮細胞シ
ートは培養ケラチノサイトシートである。
のに適した保護剤を提供する。この保護剤は、付着基層
から８時間以上前に剥離された、発芽力のある分化した
細胞を含む生きた培養上皮細胞の粘着性シートからな
り、新たに付着基層から剥離されたときの培養集密シー
トの細胞のコロニー形成能よりも高いコロニー形成能を
有することを特徴とする。好ましくは、培養上皮細胞シ
ートは培養ケラチノサイトシートである。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明は上記の保
護剤を含む創傷治療用の製品を提供する。この製品は、
粘着性シートが非接着性基盤上に載せられており、か
つ、熱を吸収する冷却パックを含む容器内に置かれてい
ることを特徴とする。この冷却パックにより、容器内の
シートを少なくとも12時間、約13℃〜約19℃の範囲の温
度に維持することができる。
護剤を含む創傷治療用の製品を提供する。この製品は、
粘着性シートが非接着性基盤上に載せられており、か
つ、熱を吸収する冷却パックを含む容器内に置かれてい
ることを特徴とする。この冷却パックにより、容器内の
シートを少なくとも12時間、約13℃〜約19℃の範囲の温
度に維持することができる。
本発明のさらにまた別の態様によれば、本発明は、付
着基層から剥離された後、生きた培養上皮細胞の粘着性
シートの生存可能な保存時間を長くする方法を提供す
る。この方法によれば、細胞が複製してコロニーを形成
する能力を保持しているため、該シートの皮膚創傷保護
剤としての有用性を維持することができる。この方法
は、該シートを約８℃〜約19℃の範囲の温度に８時間以
上、好ましくは約８時間〜約26時間、維持する工程を含
む。好ましくは、培養上皮細胞シートは培養ケラチノサ
イトシートである。
着基層から剥離された後、生きた培養上皮細胞の粘着性
シートの生存可能な保存時間を長くする方法を提供す
る。この方法によれば、細胞が複製してコロニーを形成
する能力を保持しているため、該シートの皮膚創傷保護
剤としての有用性を維持することができる。この方法
は、該シートを約８℃〜約19℃の範囲の温度に８時間以
上、好ましくは約８時間〜約26時間、維持する工程を含
む。好ましくは、培養上皮細胞シートは培養ケラチノサ
イトシートである。
本発明のさらにまた別の態様によれば、本発明は、創
傷治癒を促進するために創傷に貼用する保護剤を提供す
る。この保護剤は、 上皮細胞を付着基層の上で培養して発芽力のある分化し
た細胞を含む粘着性シートを形成する； 前記シートを酵素的に付着基層から剥離する；および 前記シートを８時間以上、約８℃〜約19℃、好ましくは
約13℃〜約19℃、より好ましくは約13℃〜約17℃の範囲
の温度において維持する； の各工程からなる方法によって製造される。好ましく
は、上皮細胞はケラチノサイトである。また、好ましく
は、シートは、前記温度において約８時間〜約26時間維
持される。
傷治癒を促進するために創傷に貼用する保護剤を提供す
る。この保護剤は、 上皮細胞を付着基層の上で培養して発芽力のある分化し
た細胞を含む粘着性シートを形成する； 前記シートを酵素的に付着基層から剥離する；および 前記シートを８時間以上、約８℃〜約19℃、好ましくは
約13℃〜約19℃、より好ましくは約13℃〜約17℃の範囲
の温度において維持する； の各工程からなる方法によって製造される。好ましく
は、上皮細胞はケラチノサイトである。また、好ましく
は、シートは、前記温度において約８時間〜約26時間維
持される。
培養ヒト上皮細胞シートは、火傷及びその他の表皮傷
害の治療用の永久表皮を再形成することができる。この
シートはまた、一時的な同種移植材料として非常にに有
効な火傷創傷保護剤であり、慢性皮膚潰瘍及び薄く剥い
だ移植片供与部位の治癒を促進することができる。この
シートは、レインウォルド（Rheinwald）及びグリーン
（Green）の開発した培養システムを用いて製造され
る。このシステムにおいては、上皮細胞は組織培養シャ
ーレ又はフラスコの表面で急速に分裂し、最終的にはす
きまなく相互に連結した細胞の、集密的な層状のシート
を形成する。集密的上皮細胞は、ディスパーゼ等の酵素
で処理することによって剥離させて粘着性の細胞シート
とし、次にワセリン（VaselineR）浸漬ガーゼに綴じ付
け、培養液中に入ったまま手術室に運び、患者に貼用す
ることができる。
害の治療用の永久表皮を再形成することができる。この
シートはまた、一時的な同種移植材料として非常にに有
効な火傷創傷保護剤であり、慢性皮膚潰瘍及び薄く剥い
だ移植片供与部位の治癒を促進することができる。この
シートは、レインウォルド（Rheinwald）及びグリーン
（Green）の開発した培養システムを用いて製造され
る。このシステムにおいては、上皮細胞は組織培養シャ
ーレ又はフラスコの表面で急速に分裂し、最終的にはす
きまなく相互に連結した細胞の、集密的な層状のシート
を形成する。集密的上皮細胞は、ディスパーゼ等の酵素
で処理することによって剥離させて粘着性の細胞シート
とし、次にワセリン（VaselineR）浸漬ガーゼに綴じ付
け、培養液中に入ったまま手術室に運び、患者に貼用す
ることができる。
培養表皮移植片の使用を著しく制限しているものは、
これらが非常にこわれやすく、貯蔵期間が短いことであ
る。これまでの実験によれば、移植片中の細胞の生育性
は、解離させた細胞を最適培養条件下でシャーレに再び
撒いたときに、細胞が再増殖してコロニーを形成する能
力によって測定して、移植片を剥離して８時間以上経過
した場合に顕著に減少することを示している。この理由
のため、培養上皮細胞シートの流通は地理的に限定さ
れ、製造施設においてディスパーゼを最初に添加し、培
養細胞の剥離が開始してから８時間以内に到達できる病
院に限られていた。移植片の調製に時間を要したため、
実際の運搬時間がわずか数時間という場合もあった。手
術室の予定と移植片の到着時間とを、注意深く整合させ
なければならなかった。
これらが非常にこわれやすく、貯蔵期間が短いことであ
る。これまでの実験によれば、移植片中の細胞の生育性
は、解離させた細胞を最適培養条件下でシャーレに再び
撒いたときに、細胞が再増殖してコロニーを形成する能
力によって測定して、移植片を剥離して８時間以上経過
した場合に顕著に減少することを示している。この理由
のため、培養上皮細胞シートの流通は地理的に限定さ
れ、製造施設においてディスパーゼを最初に添加し、培
養細胞の剥離が開始してから８時間以内に到達できる病
院に限られていた。移植片の調製に時間を要したため、
実際の運搬時間がわずか数時間という場合もあった。手
術室の予定と移植片の到着時間とを、注意深く整合させ
なければならなかった。
剥離された上皮細胞シートの生育性がこのように短い
ことは、上皮細胞がトリプシン及びEDTA処理によって培
養系から解離して単一の細胞となり、一時的に表面に再
結合することを防ぐ条件の下におかれた時に、さらに分
裂して最終分化する能力を失ったという観察によって、
説明することができた。グリーン（Green,"Terminal Di
fferentiation of Cultured Human Epidermal Cells",C
ell 11:405−16（1977））、及び、レインウォルドとベ
ケット（Rheinwald and Beckett,"Defective terminal
differentiation in culture as a consistent and sel
ectable character is malignant human keratinocyte
s",Cell 22:629−32（1980））を参照のこと。
ことは、上皮細胞がトリプシン及びEDTA処理によって培
養系から解離して単一の細胞となり、一時的に表面に再
結合することを防ぐ条件の下におかれた時に、さらに分
裂して最終分化する能力を失ったという観察によって、
説明することができた。グリーン（Green,"Terminal Di
fferentiation of Cultured Human Epidermal Cells",C
ell 11:405−16（1977））、及び、レインウォルドとベ
ケット（Rheinwald and Beckett,"Defective terminal
differentiation in culture as a consistent and sel
ectable character is malignant human keratinocyte
s",Cell 22:629−32（1980））を参照のこと。
８時間以上の生育性を評価する実験によって、コロニ
ー形成能（CFE）及び回収されたコロニー形成細胞の総
数（CFC、又は、回収された細胞の総数×CFE、図４を参
照のこと）で表わされる細胞の生育性には、ディスパー
ゼ処理移植片の保存温度が極めて重要であることが明ら
かになった。培養上皮細胞シートを生理学的温度（約37
℃）で保存すると、CFCを新しく剥離された細胞シート
のレベルに維持することができなかった。同様に、４℃
で保存した場合には、培地の条件、pH、及びCO2バラン
スを注意深く制御したにもかかわらず、生育性が非常に
低下するという結果になった。これに対し、剥離された
上皮細胞シートを８℃〜25℃、好ましくは10℃〜23℃、
最も好ましくは13℃〜23℃の温度範囲で保存すると、CF
E及びCFCによって表わされる移植片の生育性は維持さ
れ、あるいは実際に増加しうることが発見された（図３
を参照のこと）。
ー形成能（CFE）及び回収されたコロニー形成細胞の総
数（CFC、又は、回収された細胞の総数×CFE、図４を参
照のこと）で表わされる細胞の生育性には、ディスパー
ゼ処理移植片の保存温度が極めて重要であることが明ら
かになった。培養上皮細胞シートを生理学的温度（約37
℃）で保存すると、CFCを新しく剥離された細胞シート
のレベルに維持することができなかった。同様に、４℃
で保存した場合には、培地の条件、pH、及びCO2バラン
スを注意深く制御したにもかかわらず、生育性が非常に
低下するという結果になった。これに対し、剥離された
上皮細胞シートを８℃〜25℃、好ましくは10℃〜23℃、
最も好ましくは13℃〜23℃の温度範囲で保存すると、CF
E及びCFCによって表わされる移植片の生育性は維持さ
れ、あるいは実際に増加しうることが発見された（図３
を参照のこと）。
データが示すように、細胞シートを生理学的温度ある
いは生物学的サンプルの伝統的な低温保存温度（４℃）
で保存しようとする試みは、新しく剥離されたシートと
比べてCFCが非常に低下する結果となった。シートを好
ましい温度範囲に維持した場合には、CFE及びCFCは実際
に、新しく剥離されたシートと比べて向上していた。こ
の温度範囲は、後述するように、発泡スチロールを内張
りした箱の中に冷却パックと共に保存するか、あるいは
その他の方法で保存することによって容易に維持するこ
とができる。
いは生物学的サンプルの伝統的な低温保存温度（４℃）
で保存しようとする試みは、新しく剥離されたシートと
比べてCFCが非常に低下する結果となった。シートを好
ましい温度範囲に維持した場合には、CFE及びCFCは実際
に、新しく剥離されたシートと比べて向上していた。こ
の温度範囲は、後述するように、発泡スチロールを内張
りした箱の中に冷却パックと共に保存するか、あるいは
その他の方法で保存することによって容易に維持するこ
とができる。
移植片の創傷保護剤としての適合性を測定すべく計画
された対照つきの実験によって、このような条件下にお
ける保存の結果を評価した。胸腺欠損マウス（nu/nu）
の皮膚に移植し、移植後１週間以内によく形成され分化
した表皮を発生させる能力の測定は、インビボにおける
移植成績の動物モデル試験として有用である。この規準
によって、本発明の方法に従って調製された移植片が最
適な生育性を有する保存時間は、移植片が13℃〜23℃の
温度範囲で保存された場合には、24時間以上である。保
存温度以外の条件は、従来の通りでよい。移植片の温度
が上述の範囲から著しく逸脱しないかぎり、温度が保存
期間中一定であることは重要ではない。
された対照つきの実験によって、このような条件下にお
ける保存の結果を評価した。胸腺欠損マウス（nu/nu）
の皮膚に移植し、移植後１週間以内によく形成され分化
した表皮を発生させる能力の測定は、インビボにおける
移植成績の動物モデル試験として有用である。この規準
によって、本発明の方法に従って調製された移植片が最
適な生育性を有する保存時間は、移植片が13℃〜23℃の
温度範囲で保存された場合には、24時間以上である。保
存温度以外の条件は、従来の通りでよい。移植片の温度
が上述の範囲から著しく逸脱しないかぎり、温度が保存
期間中一定であることは重要ではない。
４回の実地試験の結果は、24時間保存した後に患者に
貼用された移植片が癒着した割合（培養移植片が表皮を
形成する有効性）が、移植片の保存時間が８時間未満の
場合よりも同程度又はそれ以上に高いことを示し、この
ことは、実験室における研究の妥当性を支持している。
これらの臨床試験によって、本発明に忠実に従って処理
され、20時間以上保存された移植片が、６〜８時間保存
の移植片と同程度又はそれ以上の効果を有していること
が確認された。
貼用された移植片が癒着した割合（培養移植片が表皮を
形成する有効性）が、移植片の保存時間が８時間未満の
場合よりも同程度又はそれ以上に高いことを示し、この
ことは、実験室における研究の妥当性を支持している。
これらの臨床試験によって、本発明に忠実に従って処理
され、20時間以上保存された移植片が、６〜８時間保存
の移植片と同程度又はそれ以上の効果を有していること
が確認された。
本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによ
って、さらに理解されるであろう。
って、さらに理解されるであろう。
培養上皮細胞シートの調製 培養は、上皮細胞（ケラチノサイト）を、10〜12時間
で集密となるプレート密度でT150培養フラスコに植える
ことによって行った。培養は、気密のフラスコ中で37℃
において、FAD培地（ダルベコ変法イーグル培地（DME）
及びアデニン添加ハムス（Hams）F12、10％ウシ胎児血
清（FBS）、0.4μg/mlのヒドロコルチゾン、５μg/mlの
インスリン、５μg/mlのトランスフェリン、１×10-10M
のコレラ毒、及び２×10-9Mのトリヨードチロニンの混
合物）中で行い、致死照射された3T3繊維芽細胞の存在
下で増殖させた。米国特許第4,016,036号を参照のこ
と。10ng/mlの表皮細胞増殖因子が最初の培養液（feedi
ng）から含まれていた。
で集密となるプレート密度でT150培養フラスコに植える
ことによって行った。培養は、気密のフラスコ中で37℃
において、FAD培地（ダルベコ変法イーグル培地（DME）
及びアデニン添加ハムス（Hams）F12、10％ウシ胎児血
清（FBS）、0.4μg/mlのヒドロコルチゾン、５μg/mlの
インスリン、５μg/mlのトランスフェリン、１×10-10M
のコレラ毒、及び２×10-9Mのトリヨードチロニンの混
合物）中で行い、致死照射された3T3繊維芽細胞の存在
下で増殖させた。米国特許第4,016,036号を参照のこ
と。10ng/mlの表皮細胞増殖因子が最初の培養液（feedi
ng）から含まれていた。
培養細胞は、集密となった後２日以内に、移植片を調
製するために用いた。それぞれのT150フラスコの上部を
はんだごてで焼いて除去した。培養上清を吸引し、40ml
のディスパーゼII（Boehringer Mannheim社製）を最終
濃度2.5mg/ml（約1.2U/ml）となるようにフラスコに加
えた。ふたを元に戻し、フラスコを無菌のプラスチック
の袋に入れ、37℃で培養した。シートの端が剥離し始め
た時（〜45分）、フラスコを層流フード内に移した。
製するために用いた。それぞれのT150フラスコの上部を
はんだごてで焼いて除去した。培養上清を吸引し、40ml
のディスパーゼII（Boehringer Mannheim社製）を最終
濃度2.5mg/ml（約1.2U/ml）となるようにフラスコに加
えた。ふたを元に戻し、フラスコを無菌のプラスチック
の袋に入れ、37℃で培養した。シートの端が剥離し始め
た時（〜45分）、フラスコを層流フード内に移した。
酵素溶液を20mlのDME培地と交換し、次に上皮細胞シ
ートをゴムポリスマンを用いて穏やかに剥がし、再び20
mlのDEM培地で洗浄した。２回目の洗浄培地を３〜4ml残
して吸引し、５×10cmのペトロラタム（ワセリンR）浸漬ガ
ーゼ（Chesebrough Ponds社製）をそれぞれの細胞シー
トの上に、外面の細胞がガーゼに向き合うようにかぶせ
た。次に、粘着性の細胞シートを12〜15針（Ligaclips,
Ethicon/J＆Ｊ社製）で保護剤に綴じ付けた。この移植
片を、上皮細胞が上向きになるように100mmのシャーレ
に移した。移植片が浮遊しないように、移植片の端をゴ
ムポリスマンを用いてシャーレに押し付けた。12mlのDM
E培地を静かに加え、シャーレを保存容器に移した。
ートをゴムポリスマンを用いて穏やかに剥がし、再び20
mlのDEM培地で洗浄した。２回目の洗浄培地を３〜4ml残
して吸引し、５×10cmのペトロラタム（ワセリンR）浸漬ガ
ーゼ（Chesebrough Ponds社製）をそれぞれの細胞シー
トの上に、外面の細胞がガーゼに向き合うようにかぶせ
た。次に、粘着性の細胞シートを12〜15針（Ligaclips,
Ethicon/J＆Ｊ社製）で保護剤に綴じ付けた。この移植
片を、上皮細胞が上向きになるように100mmのシャーレ
に移した。移植片が浮遊しないように、移植片の端をゴ
ムポリスマンを用いてシャーレに押し付けた。12mlのDM
E培地を静かに加え、シャーレを保存容器に移した。
図１は、上述の工程に従って調製された、典型的な培
養シートの垂直切断面を示す。細胞シートはディスパー
ゼを用いて培養シャーレから剥離させた。基層又は発芽
層は、写真の最下部の単細胞層である。透明な細胞間間
隙は、組織固定によって生じた人為的構造である。
養シートの垂直切断面を示す。細胞シートはディスパー
ゼを用いて培養シャーレから剥離させた。基層又は発芽
層は、写真の最下部の単細胞層である。透明な細胞間間
隙は、組織固定によって生じた人為的構造である。
温度維持 移植片の入った培養シャーレは、図２に示す、ステン
レス（316L、16ゲージ）等で構築された、11 1/2インチ
×8 1/4インチ×11インチ（約29cm×21cm×28cm）の外
寸法の気密箱10の中で保存又は運搬することができる。
箱の扉12はシリコンゴムのガスケット14のついた、1/4
インチ（約0.6cm）のレキサン（lexan、ポリカーボネー
ト樹脂）からなり、３カ所の圧力ラッチ16で密封する。
２つのガスニップル17が扉12から突き出している。箱10
の内部の、上端19に近い所に棚18が設けられている。移
植片の入った培養シャーレ20を底部に置き（63個以
内）、冷却剤パック26を上部棚18の上に置く。
レス（316L、16ゲージ）等で構築された、11 1/2インチ
×8 1/4インチ×11インチ（約29cm×21cm×28cm）の外
寸法の気密箱10の中で保存又は運搬することができる。
箱の扉12はシリコンゴムのガスケット14のついた、1/4
インチ（約0.6cm）のレキサン（lexan、ポリカーボネー
ト樹脂）からなり、３カ所の圧力ラッチ16で密封する。
２つのガスニップル17が扉12から突き出している。箱10
の内部の、上端19に近い所に棚18が設けられている。移
植片の入った培養シャーレ20を底部に置き（63個以
内）、冷却剤パック26を上部棚18の上に置く。
室温保存（21℃〜23℃）は、単にこの温度範囲に維持
された場所の実験台の上に箱を置くだけで行うことがで
きる。13℃〜23℃の温度範囲は、例えば箱10の上部棚18
の上に、４℃の水1kgの入った袋26を２個及び−15℃の
氷250gの入った袋１個を置くことによって達成される。
周囲温度よりわずかに低い、より狭い温度範囲は、あら
かじめ４℃に冷却した４個の12オンス（約340g）冷却パ
ック（UTEK ♯412,Polyfoam Packers,Wheeling,IL）を
上部棚に置くことによって達成することができる。スチ
ール箱は１インチ（約2.5cm）の発泡スチロール22で内
張りしたファイバーボックス21の中に置く。
された場所の実験台の上に箱を置くだけで行うことがで
きる。13℃〜23℃の温度範囲は、例えば箱10の上部棚18
の上に、４℃の水1kgの入った袋26を２個及び−15℃の
氷250gの入った袋１個を置くことによって達成される。
周囲温度よりわずかに低い、より狭い温度範囲は、あら
かじめ４℃に冷却した４個の12オンス（約340g）冷却パ
ック（UTEK ♯412,Polyfoam Packers,Wheeling,IL）を
上部棚に置くことによって達成することができる。スチ
ール箱は１インチ（約2.5cm）の発泡スチロール22で内
張りしたファイバーボックス21の中に置く。
すべての場合において、移植片を中に置いた後、保存
容器を直ちに10％CO2を含む空気で満たす。容器温度は
実験用熱電対及び記録計を用いてモニターすることがで
きる。この箱と上述の冷却パックを用いた時の平均温度
曲線の例を図５に示す。運搬中に許容温度範囲が維持さ
れていたかどうかを外科医に示すため、シャーレ20の温
度変化のモニター用に設計された電気的装置を用いるこ
とができる。
容器を直ちに10％CO2を含む空気で満たす。容器温度は
実験用熱電対及び記録計を用いてモニターすることがで
きる。この箱と上述の冷却パックを用いた時の平均温度
曲線の例を図５に示す。運搬中に許容温度範囲が維持さ
れていたかどうかを外科医に示すため、シャーレ20の温
度変化のモニター用に設計された電気的装置を用いるこ
とができる。
温度制御保存の効果 増殖基層から剥離されてから20時間および26時間（デ
ィスパーゼ添加からの時間）、様々な温度で保存した移
植片について生育性の測定を行い、ディスパーゼ添加後
２時間以内の細胞シート（対照）の生育性と比較した。
剥離細胞シートをトリプシン（0.05％）及びEDTA（0.01
％）の混合物中で解離させ、単細胞懸濁液とした。子牛
血清を加えて酵素反応を停止させた。次に、0.5mlの細
胞懸濁液を4.5mlのFADで1:10に希釈し、これを２回続け
て行った。最初の細胞懸濁液のアリコートを血球計測器
で数え、回収された細胞の総数を決定した。細胞の最終
濃度を2,000個/mlとし、この細胞懸濁液1mlを上述の完
全培地の入った100mmシャーレにまき、10％CO2を含む湿
潤空気中で37℃に維持した。
ィスパーゼ添加からの時間）、様々な温度で保存した移
植片について生育性の測定を行い、ディスパーゼ添加後
２時間以内の細胞シート（対照）の生育性と比較した。
剥離細胞シートをトリプシン（0.05％）及びEDTA（0.01
％）の混合物中で解離させ、単細胞懸濁液とした。子牛
血清を加えて酵素反応を停止させた。次に、0.5mlの細
胞懸濁液を4.5mlのFADで1:10に希釈し、これを２回続け
て行った。最初の細胞懸濁液のアリコートを血球計測器
で数え、回収された細胞の総数を決定した。細胞の最終
濃度を2,000個/mlとし、この細胞懸濁液1mlを上述の完
全培地の入った100mmシャーレにまき、10％CO2を含む湿
潤空気中で37℃に維持した。
14日後、培養液を10％ホルマリンを含むPBSで固定
し、１％ローダミン及び１％ナイルブルーＡで染色し
た。解剖顕微鏡下でコロニーを数え、増殖しているか否
かを記録した。CFEは以下のようにして計算した。
し、１％ローダミン及び１％ナイルブルーＡで染色し
た。解剖顕微鏡下でコロニーを数え、増殖しているか否
かを記録した。CFEは以下のようにして計算した。
CFE＝コロニーの総数/2000×100 コロニー形成細胞（CFC）の総数は、以下のようにして
計算した。
計算した。
CFC＝回収された細胞の総数×CFE/100 自己移植の候補となった火傷患者から得た、３種の異
なる上皮細胞系を用いて５回の実験を行った。細胞を培
養して増殖させ、上述の方法に従って移植片を調製し
た。各々の実験について、４つの移植片をそれぞれの測
定時に用いた。各々のフラスコから得られた２つの移植
片の保存時間が異なるように、移植片を異なった保存時
間に割り当てた。さらに、フラスコの前部及び後部から
得られた同数の移植片を、各々の保存条件に用いた。こ
の実験中に行われた５回の実験においては、移植片は上
述のように、あらかじめ冷却された（４℃）冷却パック
の入った発泡スチロール内張り箱において保存した。
なる上皮細胞系を用いて５回の実験を行った。細胞を培
養して増殖させ、上述の方法に従って移植片を調製し
た。各々の実験について、４つの移植片をそれぞれの測
定時に用いた。各々のフラスコから得られた２つの移植
片の保存時間が異なるように、移植片を異なった保存時
間に割り当てた。さらに、フラスコの前部及び後部から
得られた同数の移植片を、各々の保存条件に用いた。こ
の実験中に行われた５回の実験においては、移植片は上
述のように、あらかじめ冷却された（４℃）冷却パック
の入った発泡スチロール内張り箱において保存した。
それぞれの移植片からトリプシン/EDTAで解離して回
収された細胞の総数及び細胞のコロニー形成能を測定し
た。次に、それぞれの移植片のコロニー形成細胞の総数
を上述のようにして計算した。結果を表１及び図３に示
す。表１には、裏打ちガーゼに接着した培養上皮細胞移
植片を、13℃〜23℃の温度範囲で26時間まで保存した、
５回の実験の結果を示す。生育性を測定するため、所定
の保存時間経過後、上皮細胞シートを酵素的に解離させ
て単細胞とし、移植片１片あたりの回収細胞数、コロニ
ー形成能（CFE）及びコロニー形成細胞数（CFC）を測定
した。さらに、残存したコロニー形成細胞数（CFC）
を、対照移植片のCFCに対する割合としてまとめた。
収された細胞の総数及び細胞のコロニー形成能を測定し
た。次に、それぞれの移植片のコロニー形成細胞の総数
を上述のようにして計算した。結果を表１及び図３に示
す。表１には、裏打ちガーゼに接着した培養上皮細胞移
植片を、13℃〜23℃の温度範囲で26時間まで保存した、
５回の実験の結果を示す。生育性を測定するため、所定
の保存時間経過後、上皮細胞シートを酵素的に解離させ
て単細胞とし、移植片１片あたりの回収細胞数、コロニ
ー形成能（CFE）及びコロニー形成細胞数（CFC）を測定
した。さらに、残存したコロニー形成細胞数（CFC）
を、対照移植片のCFCに対する割合としてまとめた。
実験されたすべての保存時間後において、回収された
細胞の総数は対照移植片（２時間以内の保存）の74％以
上であり、５回の実験の平均では100％であった。26時
間保存後の回収細胞総数について20時間保存のものと比
較すると、非常にわずかな、しかし統計的には有意でな
い減少がみられた。
細胞の総数は対照移植片（２時間以内の保存）の74％以
上であり、５回の実験の平均では100％であった。26時
間保存後の回収細胞総数について20時間保存のものと比
較すると、非常にわずかな、しかし統計的には有意でな
い減少がみられた。
回収されたコロニー形成細胞数は20時間から26時間の
間に顕著には減少しておらず、興味深いことには、一様
に対照移植片の２倍から2.5倍であった。この予期され
なかった挙動の理由は不明である。しかし、ディスパー
ゼで剥離して固定した細胞シートは、ある程度可逆的な
細胞傷害を有しているという仮説をたてることができ
る。この傷害の一部が、適当な温度条件下における最初
の20時間の保存中に自発的に修復され、観察されたよう
な結果を生み出したのかもしれない。
間に顕著には減少しておらず、興味深いことには、一様
に対照移植片の２倍から2.5倍であった。この予期され
なかった挙動の理由は不明である。しかし、ディスパー
ゼで剥離して固定した細胞シートは、ある程度可逆的な
細胞傷害を有しているという仮説をたてることができ
る。この傷害の一部が、適当な温度条件下における最初
の20時間の保存中に自発的に修復され、観察されたよう
な結果を生み出したのかもしれない。
別の一連の実験（表２を参照のこと）においては、ケ
ラチノサイトYF29（新生児包皮）をシート状に培養し
た。実験１においては、このシートをディスパーゼを用
いてプラスチックから剥離し、DME培地中で10％CO2環境
下、18℃〜23℃の温度範囲で所定時間培養した。実験２
及び３においては、シートを上述のように裏打ちガーゼ
に接着させ、所定の温度において、所定時間培養した。
これらの実験結果は、24時間以内の保存中CFCは実質的
に残存することを示した。制御された条件において、CF
Cの値は、44〜48時間においては44％〜91％であり、68
〜72時間においては46％〜48％であった。
ラチノサイトYF29（新生児包皮）をシート状に培養し
た。実験１においては、このシートをディスパーゼを用
いてプラスチックから剥離し、DME培地中で10％CO2環境
下、18℃〜23℃の温度範囲で所定時間培養した。実験２
及び３においては、シートを上述のように裏打ちガーゼ
に接着させ、所定の温度において、所定時間培養した。
これらの実験結果は、24時間以内の保存中CFCは実質的
に残存することを示した。制御された条件において、CF
Cの値は、44〜48時間においては44％〜91％であり、68
〜72時間においては46％〜48％であった。
移植片の生育性を評価する動物モデル 雌胸腺欠損マウスはタコニック農場（Taconic Farm,N
ew York）から入手した。すべてのマウスはNIH nu/nu種
であり、６〜８週齢（体重18〜20g）であった。これら
のマウスをペントバルビタールナトリウム（0.038mg/g
体重）で皮下注射により麻酔した。マウスは意識を取り
戻すまで暖かなケージに置き、その後、移植片を採取す
るまで、分離してケージに入れた。
ew York）から入手した。すべてのマウスはNIH nu/nu種
であり、６〜８週齢（体重18〜20g）であった。これら
のマウスをペントバルビタールナトリウム（0.038mg/g
体重）で皮下注射により麻酔した。マウスは意識を取り
戻すまで暖かなケージに置き、その後、移植片を採取す
るまで、分離してケージに入れた。
上述のようにして、上皮細胞シートをワセリンRガー
ゼに固定し、無血清培地中で18〜22℃において、４、20
及び26時間保存した。それぞれの保存条件用に４つの移
植片を調製した。移植においては、無菌のシラスチック
（Silastic,Dow Corning,NJ）の円板（直径1cm）を細胞
シートと裏打ちガーゼの間に挿入した。無菌のメスを用
いて、シートを円板の大きさに切った。シラスチック板
及びこれに接着した上皮細胞の端をピンセットを用いて
静かに持ち上げ、移植部位に移した。
ゼに固定し、無血清培地中で18〜22℃において、４、20
及び26時間保存した。それぞれの保存条件用に４つの移
植片を調製した。移植においては、無菌のシラスチック
（Silastic,Dow Corning,NJ）の円板（直径1cm）を細胞
シートと裏打ちガーゼの間に挿入した。無菌のメスを用
いて、シートを円板の大きさに切った。シラスチック板
及びこれに接着した上皮細胞の端をピンセットを用いて
静かに持ち上げ、移植部位に移した。
移植はバランドン（Barrandon）、リー（Li）及びグ
リーン（Green）の、「培養ヒト上皮細胞を胸腺欠損マ
ウスに移植する新技術（"New Techniques for the Graf
ting of Cultured Human Epidermal Cells onto Athymi
c Mice",J.Invest.Dermatol.91:315−８（1988））」の
技術に変法に従って行った。マウスの背側表面をアルコ
ールで消毒した。鋏を用いて皮膚に皮弁を形成し、頭部
側に持ち上げた。上皮細胞シートの接着したシラスチッ
クを、上皮細胞の基底表面が上向きになるように胸壁の
胸郭の上に静かにのせた。皮弁を移植片の上にかぶせて
もとの位置に戻し、切開部を無菌のリガクリップ（Liga
clip）を用いて縫合した。
リーン（Green）の、「培養ヒト上皮細胞を胸腺欠損マ
ウスに移植する新技術（"New Techniques for the Graf
ting of Cultured Human Epidermal Cells onto Athymi
c Mice",J.Invest.Dermatol.91:315−８（1988））」の
技術に変法に従って行った。マウスの背側表面をアルコ
ールで消毒した。鋏を用いて皮膚に皮弁を形成し、頭部
側に持ち上げた。上皮細胞シートの接着したシラスチッ
クを、上皮細胞の基底表面が上向きになるように胸壁の
胸郭の上に静かにのせた。皮弁を移植片の上にかぶせて
もとの位置に戻し、切開部を無菌のリガクリップ（Liga
clip）を用いて縫合した。
移植片を採取するため、動物をエーテル麻酔によって
死亡させた。ヒト上皮細胞移植片を含む皮弁が得られ
た。シラスチックを引き剥がし、移植片を囲むマウス組
織を取り去った。次に、外表面にマウス上皮細胞を、内
表面に移植片から生じたヒト上皮細胞を含むサンプルを
固定液に移した。生検体を3.7％のホルムアルデヒドで
固定し、パラフィンに包埋した。切片を５μｍに切断
し、５％アルコール性エオシン中ハリス（Harris）ヘマ
トキシリン溶液で染色した。３つの実験条件において、
12匹のマウスに移植を行った。移植片は、移植７日後に
採取した。
死亡させた。ヒト上皮細胞移植片を含む皮弁が得られ
た。シラスチックを引き剥がし、移植片を囲むマウス組
織を取り去った。次に、外表面にマウス上皮細胞を、内
表面に移植片から生じたヒト上皮細胞を含むサンプルを
固定液に移した。生検体を3.7％のホルムアルデヒドで
固定し、パラフィンに包埋した。切片を５μｍに切断
し、５％アルコール性エオシン中ハリス（Harris）ヘマ
トキシリン溶液で染色した。３つの実験条件において、
12匹のマウスに移植を行った。移植片は、移植７日後に
採取した。
癒着頻度は100％であった。ヒト上皮細胞は、マウス
皮膚の下で青白い領域として見ることができた。皮弁を
除去した後に調べたところ、移植片は白い領域として認
められ、まわりのマウスの組織から明らかに区別され
た。移植後７日以内に、ケラチノサイトシートは完全に
層状の表皮に分化していた。表面に垂直なパラフィン切
片においては、ヒト表皮の４つの主要な層である、基底
層、有棘層、顆粒層及び角層が移植片中で区別できた。
基底層は薄層の上にある好塩基性細胞の単層からなる。
この細胞は、立方形で、時々有糸分裂の形体が観察され
る。有棘層の細胞は平たい、多面体の形状を有してい
る。顆粒層は平たい細胞の２層からなり、区別できる細
胞の特徴はケラトヒアリン顆粒の存在である。角層の厚
さは７日目の移植片においては様々である。
皮膚の下で青白い領域として見ることができた。皮弁を
除去した後に調べたところ、移植片は白い領域として認
められ、まわりのマウスの組織から明らかに区別され
た。移植後７日以内に、ケラチノサイトシートは完全に
層状の表皮に分化していた。表面に垂直なパラフィン切
片においては、ヒト表皮の４つの主要な層である、基底
層、有棘層、顆粒層及び角層が移植片中で区別できた。
基底層は薄層の上にある好塩基性細胞の単層からなる。
この細胞は、立方形で、時々有糸分裂の形体が観察され
る。有棘層の細胞は平たい、多面体の形状を有してい
る。顆粒層は平たい細胞の２層からなり、区別できる細
胞の特徴はケラトヒアリン顆粒の存在である。角層の厚
さは７日目の移植片においては様々である。
４、20及び26時間保存した移植片の間では、明らかな
組織学的差異は見られなかった。７日目において、表皮
は４〜６細胞の厚さ（40μｍ）であった。３つの場合に
おいて４層は同じ比率で存在した。基底層の完全性及び
状態は、固定された単位距離あたりの核の数を定量する
ことによって評価することができる。すべての保存時間
において、基底細胞核の平均の数は100μｍあたり9.0で
あった。有糸分裂の形体は時々観察されたが、その数は
条件の違いによっては明らかな変化は認められなかっ
た。移植片の最も顕著な特徴は、核の突起した顆粒層で
あるが、これもまた４、20及び26時間のサンプルにおい
て同じであった。これらの結果を以下の表３に示す。
組織学的差異は見られなかった。７日目において、表皮
は４〜６細胞の厚さ（40μｍ）であった。３つの場合に
おいて４層は同じ比率で存在した。基底層の完全性及び
状態は、固定された単位距離あたりの核の数を定量する
ことによって評価することができる。すべての保存時間
において、基底細胞核の平均の数は100μｍあたり9.0で
あった。有糸分裂の形体は時々観察されたが、その数は
条件の違いによっては明らかな変化は認められなかっ
た。移植片の最も顕著な特徴は、核の突起した顆粒層で
あるが、これもまた４、20及び26時間のサンプルにおい
て同じであった。これらの結果を以下の表３に示す。
上述から明らかなように、培養上皮細胞移植片を使用
前に26時間保存した場合に、コロニー形成細胞の減少も
移植床上に上皮細胞組織を形成する能力の低下も認めら
れなかった。このことは、調製された移植片の「貯蔵期
間」を８時間から少なくとも26時間に延長できることを
示している。保存温度が非常に重要であり、移植片はイ
ンビトロで測定した場合、13℃〜23℃の温度範囲で保存
されたときに最適のコロニー形成細胞の維持を示した。
室温において保存された移植片の残存性は、やや低い温
度のものとほぼ同等に良よかった。
前に26時間保存した場合に、コロニー形成細胞の減少も
移植床上に上皮細胞組織を形成する能力の低下も認めら
れなかった。このことは、調製された移植片の「貯蔵期
間」を８時間から少なくとも26時間に延長できることを
示している。保存温度が非常に重要であり、移植片はイ
ンビトロで測定した場合、13℃〜23℃の温度範囲で保存
されたときに最適のコロニー形成細胞の維持を示した。
室温において保存された移植片の残存性は、やや低い温
度のものとほぼ同等に良よかった。
あらかじめ冷却した冷却パックを内張りした空気容器
の中に置くと、周囲温度が約21〜23℃（68〜73゜F）であ
れば、15℃〜20℃の温度範囲を約18時間（容器温度はそ
の後室温まで上昇する）容易に維持することができる。
外気温が約20℃以上の場合、及び、地上あるいは空輸の
優先配送において受けるタイプの熱負荷が与えられた場
合に、内部の箱を24時間13℃〜23℃の温度範囲に維持す
るためには、密封プラスチック容器に入った４℃の水21
及び250mlの氷を含む、発泡スチロール内張り（１ンチ
（約2.5cm））のスチール箱で十分である。このタイプ
の容器は容易に運搬することができ、12mlの培地に入っ
た100ml培養シャーレ約63個分の容量を有している。も
ちろん、当業者は、この温度範囲を効果的に、信頼性高
く、廉価で維持するその他の方法を用いることができる
であろう。
の中に置くと、周囲温度が約21〜23℃（68〜73゜F）であ
れば、15℃〜20℃の温度範囲を約18時間（容器温度はそ
の後室温まで上昇する）容易に維持することができる。
外気温が約20℃以上の場合、及び、地上あるいは空輸の
優先配送において受けるタイプの熱負荷が与えられた場
合に、内部の箱を24時間13℃〜23℃の温度範囲に維持す
るためには、密封プラスチック容器に入った４℃の水21
及び250mlの氷を含む、発泡スチロール内張り（１ンチ
（約2.5cm））のスチール箱で十分である。このタイプ
の容器は容易に運搬することができ、12mlの培地に入っ
た100ml培養シャーレ約63個分の容量を有している。も
ちろん、当業者は、この温度範囲を効果的に、信頼性高
く、廉価で維持するその他の方法を用いることができる
であろう。
上述のデータは、上述の方法に従えば、培養上皮細胞
移植材料の生育性を少なくとも26時間、そして27時間維
持しうることを示している。この結論はまた、使用前に
24時間保存された移植片の癒着が、調製後６時間以内に
患者に貼用されたものと少なくとも同程度であることを
明らかに示す、５回の臨床試験の結果によっても支持さ
れる。
移植材料の生育性を少なくとも26時間、そして27時間維
持しうることを示している。この結論はまた、使用前に
24時間保存された移植片の癒着が、調製後６時間以内に
患者に貼用されたものと少なくとも同程度であることを
明らかに示す、５回の臨床試験の結果によっても支持さ
れる。
本発明はその他の特定の形態において具体化すること
ができ、その他の具体例も以下の特許請求の範囲に含ま
れるであろう。
ができ、その他の具体例も以下の特許請求の範囲に含ま
れるであろう。
フロントページの続き (72)発明者 スキーファー，スーザン・エフ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01778，ウェイランド，ハッピー・ハー ロー・ロード ５ (72)発明者 トゥーボ，ロス・エイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02170，クィンシー，ウィルソン・アベ ニュー 208 (56)参考文献 特表 平２−500800（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500564（ＪＰ，Ａ)
Claims (15)
- 【請求項１】発芽力のある分化した細胞を含む培養上皮
細胞シート中の細胞のコロニー形成能を、前記シートを
基層から分離した後に改良する方法であって、シートを
浸すのに十分な量の生理学的適合性を有する培地中に、
８℃〜19℃の範囲の温度において８時間以上26時間以内
の時間シートを維持する工程を含む方法。 - 【請求項２】培養上皮細胞シートが培養ケラチノサイト
シートである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】シートが、シートを浸すのに十分な量の生
理学的適合性を有する培地中に、13℃〜19℃の範囲の温
度において維持される、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】シートが、シートを浸すのに十分な量の生
理学的適合性を有する培地中に、17℃〜19℃の範囲の温
度において維持される、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】付着基層から８時間以上26時間前に剥離さ
れた、発芽力のある分化した細胞を含む生きた培養上皮
細胞シートからなる、創傷に貼用するのに適した保護剤
であって、前記シートは８℃〜19℃の範囲の温度におい
て維持され、このことにより新たに付着基層から剥離さ
れたときの培養シートの細胞のコロニー形成能よりも高
いコロニー形成能を有することを特徴とする保護剤。 - 【請求項６】培養上皮細胞シートが培養ケラチノサイト
シートである、請求項５記載の保護剤。 - 【請求項７】請求項５記載の保護剤を含む創傷治療用の
製品であって、シートが非接着性基盤上に載せられてお
り、かつ、熱を吸収する冷却パックを含む容器内に置か
れており、このことによって容器内のシートを少なくと
も12時間、13℃〜19℃の範囲の温度に維持しうることを
特徴とする製品。 - 【請求項８】付着基層から剥離された後、細胞が複製し
てコロニーを形成する能力を保持して生きた培養上皮細
胞シートの皮膚創傷保護剤としての有用性を維持するよ
うに、前記シートの生存可能な保存時間を長くする方法
であって、前記シートを８℃〜19℃の範囲の温度に８時
間以上26時間以内の時間維持する工程を含む方法。 - 【請求項９】培養上皮細胞シートが培養ケラチノサイト
シートである、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】創傷治癒を促進するために創傷に貼用す
る保護剤であって、該保護剤が、上皮細胞を付着基層の
上で培養して発芽力のある分化した細胞を含むシートを
形成する； 前記シートを酵素的に付着基層から剥離する；および 前記シートを８時間以上72時間以内の時間、８℃〜19℃
の範囲の温度において維持する； の各工程からなる方法によって製造されることを特徴と
する保護剤。 - 【請求項１１】上皮細胞がケラチノサイトである、請求
項10記載の保護剤。 - 【請求項１２】シートが、前記温度において26時間以内
の時間維持されることを特徴とする、請求項10記載の保
護剤。 - 【請求項１３】シートが、13℃〜19℃の範囲の温度にお
いて維持されることを特徴とする、請求項10記載の保護
剤。 - 【請求項１４】シートが、13℃〜17℃の範囲の温度にお
いて維持されることを特徴とする、請求項10記載の保護
剤。 - 【請求項１５】付着基層から８時間以上26時間前に剥離
された、発芽力のある分化した細胞を含む生きた培養上
皮細胞シートであって、前記シートは８℃〜19℃の範囲
の温度において維持され、このことにより新たに付着基
層から剥離されたときの培養シートの細胞のコロニー形
成能よりも高いコロニー形成能を有することを特徴とす
るシート。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/473,899 US5100676A (en) | 1990-02-02 | 1990-02-02 | Cool storage of cultured epithelial sheets |
| US473,899 | 1990-02-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503930A JPH05503930A (ja) | 1993-06-24 |
| JP2693640B2 true JP2693640B2 (ja) | 1997-12-24 |
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ID=23881482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3502996A Expired - Fee Related JP2693640B2 (ja) | 1990-02-02 | 1991-01-07 | 培養上皮細胞シートの低温保存 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5100676A (ja) |
| EP (1) | EP0507849B1 (ja) |
| JP (1) | JP2693640B2 (ja) |
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| AU (1) | AU639982B2 (ja) |
| CA (1) | CA2011111C (ja) |
| DE (1) | DE69100748T2 (ja) |
| DK (1) | DK0507849T3 (ja) |
| ES (1) | ES2048583T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991011100A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008041744A1 (fr) | 2006-10-05 | 2008-04-10 | Cell Bank, Corp. | Procédé de conservation par congélation d'une cellule dérivée de tissu |
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|---|---|---|---|---|
| IT1256621B (it) * | 1992-12-04 | 1995-12-12 | Soluzioni crioprotettrici | |
| US5689961A (en) | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
| FR2798668B1 (fr) * | 1999-09-17 | 2001-12-21 | Genevrier Lab | Nouveau procede pour le transport des cellules et les greffes ainsi realisees |
| CN1596100A (zh) * | 2001-09-28 | 2005-03-16 | 麦克内尔-Ppc股份有限公司 | 可食用组合物及含可食用外壳的制剂 |
| JP2010528983A (ja) * | 2007-04-26 | 2010-08-26 | メーディノーヴァ アーエス | 移植物の保存 |
| TWI401098B (zh) * | 2010-09-09 | 2013-07-11 | Univ China Medical | 傷口敷料 |
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| FR1577356A (ja) * | 1968-04-04 | 1969-08-08 | ||
| US3772153A (en) * | 1969-04-02 | 1973-11-13 | Air Liquide | Apparatus for the preservation of animal or human organs in living condition |
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| US3753357A (en) * | 1970-12-14 | 1973-08-21 | Ovitron Res Corp | Method and apparatus for the preservation of cells and tissues |
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-
1990
- 1990-02-02 US US07/473,899 patent/US5100676A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-02-28 CA CA002011111A patent/CA2011111C/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-01-07 ES ES91902347T patent/ES2048583T3/es not_active Expired - Lifetime
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