DE69100748T2

DE69100748T2 - Kühllagerung gezüchteter epithelschichten.

Info

Publication number: DE69100748T2
Application number: DE91902347T
Authority: DE
Inventors: Richard Odessey; Susan Schaeffer; Alexander Schermer; Ross Tubo
Original assignee: Biosurface Technology Inc
Current assignee: Biosurface Technology Inc
Priority date: 1990-02-02
Filing date: 1991-01-07
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2011-01-08
Also published as: AU639982B2; ES2048583T3; US5100676A; WO1991011100A1; JPH05503930A; AU7157191A; ATE98088T1; JP2693640B2; CA2011111C; DE69100748D1; EP0507849B1; CA2011111A1; DK0507849T3; EP0507849A1

Description

Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die kurzfristige Lagerung von Gewebekulturen. Sie bezieht sich insbesondere auf die kurzfristige Lagerung von als Hautwundverband verwendbaren Epithelgewebeschichten, bei der die Lebensfähigkeit der Zellen und die Koloniebildungsfähigkeit aufrechterhalten werden.
In der Medizin ist die Entwicklung von Hautwundverbänden, die neues Wachstum begünstigen und gleichzeitig Flüssigkeitsverluste und Infektionen bei Hautverletzungen durch Verbrennungen, Geschwüre oder operative Entfernungen verhindern, vorrangig behandelt worden. Bandagen und Verbände schützen großflächige Wunden nicht ausreichend, und verschiedene Alternativen sind entwickelt worden. Dazu gehören Spalthaut- oder Vollhauttransplantate von Kadaver- oder Schweinehaut sowie Allo- und Autotransplantate vom Menschen. Die meisten haben sich für die Abdeckung großflächiger Wunden als ungeeignet erwiesen, da alle Transplantate außer körpereigenen schließlich vom Körper abgestoßen werden, wenn keine immunsuppressive Behandlung erfolgt. Körpereigene Transplantate sind für kleine Flächen sinnvoll, jedoch nicht für große Verletzungen.
Green et al. haben eine Methode zur Züchtung von mehrere Zellen dicken Epithelschichten zur Behandlung von Brandwunden, Geschwüren und anderen Hautverletzungen entwickelt. U.S. Patent Nr. 4,016,036 offenbart eine Methode zur serienmäßigen Züchtung von Keratinozyten zur Bildung von mehrschichtigem Epithel. In U.S. Patent Nr. 4,304,866 wird eine Methode zur Herstellung transplantierbarer Zellschichten offenbart, in der Keratinozyten gezüchtet werden und die Zellschicht durch ein Enzym, z.B. Dispase, von ihrem Verankerungssubstrat abgelöst wird. In U.S. Patent Nr. 4, 456, 687 werden Wirkstoffe zur Förderung des Epithelzellwachstums offenbart. In dem von Green et al. entwickelten Kultursystem teilen sich die Epithelzellen schnell an der Oberfläche von Gewebekulturschalen oder -flaschen und bilden schließlich eine zusammenfließende, leichtgeschichtete Lage von fest untereinander verbundenen Zellen. Diese zusammenfließenden Kulturen können als kohäsive Zellschicht abgelöst werden, z. B. durch Behandlung mit dem Enzym Dispase (siehe U.S. 4,304,866). Die gezüchteten Schichten können dann auf mit Petrolatum getränkte Gaze oder eine andere, nichtklebende Unterlage geheftet, im Kulturmedium in den Operationssaal gebracht und dem Patienten aufgelegt werden.
Nach diesen Methoden hergestellte Transplantate körpereigenen Gewebes werden für Brandwundenverbände bevorzugt. Für die Züchtung wird allerdings einige Zeit benötigt. Während der Züchtung solcher Transplantate kann die Wunde mit Fremdgewebe, das als vorübergehender Wundverband geeignet ist, abgedeckt werden. Gezüchtete epidermale Allotransplantate fördern die Heilung chronischer Hautgeschwüre und von Spalthauttransplantaten. Nach der Methode von Green et al. gezüchtete, epidermale Auto- und Allotransplantate sind jetzt von Biosurface Technology, Inc. aus Cambridge, Massachusetts für kommerzielle und klinische Versuche erhältlich.
In der Praxis wird die Verwendung gezüchteter Epitheltransplantate durch die begrenzte Lagerfähigkeit stark eingeschränkt. Lebens- und Koloniebildungsfähigkeit der Zellen in den Schichten nehmen nach Ablösung vom Verankerungssubstrat schnell ab. Die Zellschichten sind außerordentlich zerbrechlich. Sie sind reproduzierbar in der Lage, sich zu vermehren und ein differenziertes Epithel zu bilden, wenn sie nicht später als acht Stunden nach der Dispasebehandlung auf die Wunde aufgelegt werden. Somit müssen die Transplantationsorte in der Nähe der Herstellungsstätte liegen. Eine Ausweitung der Verfügbarkeit ist möglich durch ein weltweites Netz von Herstellungsorten oder die Entwicklung einer Methode zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von gezüchteten Zellschichten.
Es gibt eine Fülle von Beschreibungen von Methoden zur Konservierung von Gewebe, einschließlich Kältekonservierung, Verwendung besonderer Zellmedien und verschiedener Verpackungstechniken. Kältekonservierung erlaubt eine lange Lagerung durch Gefrieren des Materials in Gegenwart eines Kälteschutzmittels. Dieses Mittel verdrängt den wäßrigen Stoff in den Zellen und verhindert so die Bildung von Eiskristallen. In zahlreichen Veröffentlichungen werden Art und Menge des Kälteschutzmittels und/oder der zeitliche Ablauf oder die Gefriertemperatur mit dem Ziel variiert, die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Auftauen aufrechtzuerhalten (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4,559,298, U.S. Patent Nr. 4,688,387 und insbesondere EP 0 296 475).
Eine zweite Methode zur Verlängerung der Lagerfähigkeit von lebenden Zellen ist die Auswahl des zellumgebenden Mediums. U.S. Patent Nr. 4,681,839 offenbart z.B. ein System zur Konservierung von lebendem Gewebe, das von seinem Wirtsorganismus getrennt wurde: das Gewebe wird in einen gasdurchlässigen Beutel gepackt, der eine elektrolytabgebende 'Tablette', einen Puffer, eine chemische Energiequelle, energiereiche Phosphatverbindungen, Metaboliten und aufsaugendes Material zur Entfernung von giftigen Trümmern enthält. Auch die Patente von DeRoissart beschreiben eine Methode und ein Gerät zur Konservierung von lebendem Gewebe in einer mit einem biochemisch neutralem Gas unter Druck gesetzten Nährflüssigkeit (siehe U.S. 3,607,646 und 3,772,153).
Eine dritte Methode zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit besteht in der Verwendung verschiedener Behälter, z.B. das beschriebene Hornhautlagersystem von Lindstrom et al. (siehe U.S. Patent Nr. 4,695,536), oder der in U.S. Patent Nr. 4,630,448 beschriebene Behälter zur Lagerung von festen, lebenden Gewebeteilen.
Wenn keine Kältekonservierung angewendet wird, werden die Gewebe üblicherweise bei 4 ºC gelagert (siehe Rosenquist et al., 'Short-Term Skin Preservation at 4 ºC: Skin Storage Configuration and Tissue-to-Volume Medium Ratio', 9(1), J.B.C.R., 52-54 (1988).
Die Lagerung von Gewebe durch Kältekonservierung ist kompliziert und teuer. Sie ist zur Zeit keine praktische Lösung für den Transport von Tranplantaten vom Herstellungsort zum Operationssaal. Mit keinem der anderen Systeme konnte bisher die Lagerfähigkeit lebender Zellen über die sehr kurze Zeit von 8 Stunden verlängert werden (siehe z.B. Pittelkow et al., 86, J. Invest. Dermatol., 4: 410-17, 413-14 (1986).
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Möglichkeit zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von gezüchteten Epitheltransplantaten und der Lager- und Transportzeit vom Herstellungsort zum Operationsaal, so daß lebensrettende Transplantate über weite Entfernungen transportiert werden können und gleichzeitig ihre Fähigkeit, zu wachsen und als lebender Epithelwundverband zu dienen, behalten und/oder verbessern. Außerdem ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, dies ohne Tranport der Transplantate in teuren Kältekonservierungskammern zu erreichen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde eine einfache Methode zur Aufrechterhaltung und oft auch Verbesserung der Koloniebildungsfähigkeit einer gezüchteten Epithelschicht nach Trennung von ihrem Substrat entdeckt. Diese Methode umfaßt die Aufbewahrung der Schicht in steriler Umgebung über einen Zeitraum von mehr als 8 Stunden bei Temperaturen im Bereich von 8 ºC bis 25 ºC, vorzugsweise 13 ºC bis 23 ºC. Bei Anwendung dieser Methode können die Zellschichten deutlich länger als 8 Stunden aufbewahrt werden, reproduzierbar mindestens 26 Stunden, manchmal sogar bis zu 72 Stunden. Sie können somit leicht ohne teure und komplizierte Kältekonservierung in die ganze Welt transportiert werden. Diese Methode verlängert nicht nur die Lagerfähigkeit der gezüchteten, lebenden Epithelschichten, sondern verbessert gewöhnlich auch, zumindest am ersten Tag der Lagerung, die gemessene Koloniebildungsfähigkeit der Zellen in den Schichten. Die prozentuale Anwachsquote von Transplantaten, die nach Trennung von ihrem Substrat 24 Stunden bei der richtigen Temperatur vor Auflegung auf den Patienten gelagert wurden, ist mindestens so hoch und kann sogar höher sein als die von Transplantaten, die weniger als 6 Stunden gelagert wurden.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines gebrauchsfertigen Wundverbandes, z.B. für Hautwunden, der dem Patienten sofort angelegt werden kann und aus einer kohäsiven Schicht gezüchteter, lebender Epithelzellen besteht, die länger als 8 Stunden von ihrem Substrat getrennt ist. Die Koloniebildungsfähigkeit dieses Wundverbands ist größer als die einer gerade abgelösten Kultur.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines lagerstabilisierten Produkts zur Wundheilung, bestehend aus einer gezüchteten, kohäsiven Schicht menschlicher Epithelzellen auf einem nicht damit zusammengewachsenen Substrat in steriler Verpackung, einschließlich der Möglichkeit, die Temperatur der Zellschicht zwischen 8 ºC und 25 ºC zu halten. Die Aufbewahrung der Schicht bei einer Temperatur von 13 ºC bis 23 ºC über einen Zeitraum von mehr als 8 Stunden bedeutet nicht nur die Verlängerung der Lagerfähigkeit der lebenden Zellen, sondern auch oft die Erhöhung der Koloniebildungsfähigkeit der Zellen in der Schicht nach Trennung von ihrem Substrat. Der bevorzugte Temperaturbereich ist 13 ºC bis 23 ºC. Bei diesen Temperaturen können die Schichten etwa 8 bis 72 Stunden aufbewahrt werden. Ihre Koloniebildungsfähigkeit wird dabei aufrechterhalten oder sogar verbessert.
Keratinozyten werden als Epithelzellen bevorzugt. Die kohäsive Schicht ist vorzugsweise mehrere Zellen dick und besteht zumindest aus keimfähigen und differenzierten Zellen.
Andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung sind im folgenden aus der Zeichnung und Beschreibung sowie den Ansprüchen offenkundig.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 ist ein Mikrobild eines senkrechten Schnitts durch eine mehrschichtige Lage gezüchteter Keratinozyten, wie sie in praktischer Anwendung der Erfindung zum Einsatz kommt.
Abbildung 2 ist die Darstellung eines Behälters für den Transport gezüchteter Epithelschichten, wie er in praktischer Anwendung der Erfindung zum Einsatz kommt.
Abbildung 3 ist eine Graphik der Lebensfähigkeit von Transplantaten, die 20 bzw. 26 Stunden bei 13 ºC - 23 ºC gelagert wurden, angegeben in Prozent der Lebensfähigkeit der Vergleichstransplantate, d.h. frisch abgetrennter Transplantate. Die Lebensfähigkeit ist dargestellt als gesamter Zellwiederaufbau, Koloniebildungsfähigkeit der Zellen nach Auflösung der Zellschicht und Überlebensdauer der koloniebildenden Zellen. Koloniebildende Zellen = Wiederaufgebaute Zellen Koloniebildungsfähigkeit der wiederaufgebauten Zellen.
Abbildung 4 ist eine Graphik, die die Veränderungen aller koloniebildenden Zellen in abgelösten Zellschichten nach 20 bis 30stündiger Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen zeigt.
Abbildung 5 ist eine Graphik, die die Temperaturveränderungen des Transplantatlagermediums in den im folgenden beschriebenen Behältern zeigt. Die Temperatur wurde mit einem geeichten, elektronischen Thermoelement gemessen.

Ausführliche Beschreibung

Mit gezüchteten Epithelzellschichten vom Menschen können Verbrennungen oder andere Hautschäden bei noch vorhandener Epidermis geheilt werden. Als provisorisches Fremdtransplantat eignen sich diese Schichten auch als hochwirksamer Brandwundenverband und können die Heilung von chronischen Hautgeschwüren und Spaltgeweben fördern. Die Zellschichten werden mit einer von Rheinwald und Green entwickelten Kultur hergestellt, wobei sich die Epithelzellen schnell an der Oberfläche der Gewebekulturschalen oder -flaschen teilen und schließlich eine zusammenfließende, schwachgeschichtete Lage von fest miteinander verbundenen Zellen bilden. Zusammenhängende Epithelkulturen können als kohäsive Zellschicht durch Enzymbehandlung, z.B. mit Dispase, abgelöst, danach auf mit Vaseline getränkte Gaze geheftet, in einem Kulturmedium zum Operationssaal gebracht und dem Patienten aufgelegt werden.
Die Verwendung von gezüchteten Hauttransplantaten wird durch deren extreme Zerbrechlichkeit und kurze Lagerfähigkeit stark eingeschränkt. Frühere Versuche hatten gezeigt, daß die Lebensfähigkeit der Zellen in den Transplantaten deutlich sank, wenn die Transplantate länger als 8 Stunden von ihrem Substrat getrennt waren. Gemessen wurde dies an der Fähigkeit der zerfallenen Zellen, nach Wiederanlegung unter optimalen Kultivierungsbedingungen weiterzuwachsen und Kolonien zu bilden. Aus diesem Grund war die Verteilung von gezüchteten Epithelschichten geographisch begrenzt, d.h. auf die Krankenhäuser, die innerhalb von 8 Stunden nach der ersten Zugabe von Dispase zwecks Ablösung der Kulturen am Herstellungsort erreichbar waren. Die tatsächliche Übertragungszeit betrug jedoch nur wenige Stunden, da auch noch einige Zeit zur Vorbereitung der Transplantate benötigt wurde. Operationszeitplan und Ankunftzeit der Transplantate mußten sorgfältig koordiniert werden.
Eine mögliche Erklärung für die kurze Lebensfähigkeit abgelöster Epithelzellschichten fand man durch die Beobachtung, daß Epithelzellen ihre Fähigkeit zu weiterer Teilung verlieren und die Differenzierung abbricht, wenn einzelne, durch Behandlung mit Trypsin und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) von den Kulturen abgelöste Zellen vorübergehend daran gehindert werden, sich wieder an eine Oberfläche anzuheften (Green, 'Terminal Differentiation of Cultured Human Epidermal Cells', Cell, 11, 405-16 (1977); Rheinwald und Beckett, 'Defective terminal differentiation in culture as a consistent and selectable character is malignant to human keratinocytes', Cell, 22, 629-32 (1980).
Versuche zur Beurteilung der Lebensfähigkeit über einen Zeitraum von mehr als 8 Stunden zeigten, daß die Temperatur, bei der die mit Dispase behandelten Transplantate aufbewahrt wurden, für die Lebensfähigkeit der Zellen entscheidend war. Gemessen wurde dies durch die Koloniebildungsfähigkeit und die Anzahl der wiederaufgebauten, koloniebildenden Zellen (Anzahl wiederaufgebauter Zellen Koloniebildungsfähigkeit, siehe Abbildung 4). Bei Aufbewahrung der gezüchteten Epithelschichten bei physiologischer Temperatur (ca. 37 ºC) konnten die koloniebildenden Zellen nicht auf dem Niveau frisch abgelöster Zellschichten gehalten werden. In ähnlicher Weise führte die Aufbewahrung bei 4 ºC, trotz sorgfältiger Überwachung der Bedingungen für das Nährmedium, des pH-Werts und des CO&sub2;- Haushalts, zu einer deutlichen Abnahme der Lebensfähigkeit. Es wurde jedoch gefunden, daß bei Lagerung abgelöster Epithelzellschichten bei Temperaturen von 8 ºC bis 25 ºC, vorzugsweise 10 ºC bis 23 ºC, insbesondere 13 ºC bis 23 ºC, die Lebensfähigkeit der Transplantate aufrechterhalten oder sogar erhöht werden konnte, wie an der Koloniebildungsfähigkeit und der Anzahl der koloniebildenden Zellen meßbar war (siehe Abbildung 3).
Die Ergebnisse zeigen, daß eine Aufbewahrung der Zellschichten bei physiologischer Temperatur und die für biologische Proben herkömmliche Lagerung (4 ºC) zu einer deutlichen Abnahme der koloniebildenden Zellen im Vergleich zu frisch abgelösten Schichten führen. Werden die Zellschichten in dem bevorzugten Temperaturbereich aufbewahrt, können Koloniebildungsfähigkeit und die Anzahl koloniebildender Zellen sogar zunehmen im Vergleich zu frisch abgelösten Schichten. Dieser Temperaturbereich kann leicht durch Kühlpackungen in einem mit Schaum isolierten Behälter, wie weiter unten beschrieben, oder durch andere Möglichkeiten eingehalten werden.
Die Ergebnisse einer Lagerung unter solchen Bedingungen können durch kontrollierte Versuche zur Beurteilung der Eignung des Transplantats als Wundverband bewertet werden. Die Fähigkeit zur Bildung einer gut ausgebildeten, differenzierenden Epidermis in Tiermodellversuchen innerhalb einer Woche nach Transplantation, wie durch Transplantation auf die Lederhaut einer thymuslosen Maus (nu/nu) bestimmt, ist ein sinnvolles Kriterium zur Beurteilung der Transplantatleistung in vivo. Aufgrund dieser Kriterien beträgt die Lagerzeit für optimal lebensfähige, nach der erfindungsgemäßen Methode hergestellte Transplantate mindestens 24 Stunden, wenn diese bei einer Temperatur von 13 ºC bis 23 ºC aufbewahrt werden. Abgesehen von der Temperatur, können die anderen Lagerbedingungen die üblichen sein. Die Temperatur muß während der Lagerung nicht statisch sein, jedoch darf die Temperatur des Transplantats nur geringfügig außerhalb des obengenannten Bereichs liegen.
Die Richtigkeit der Laborversuche wird durch die Ergebnisse unserer Feldversuche bestätigt, in denen die prozentuale Anwachsquote von Transplantaten (epidermisbildende Fähigkeit gezüchteter Transplantate) nach 24stündiger Lagerung vor Auflegen auf den Patienten mindestens so gut war wie die von Transplantaten, die weniger als 8 Stunden gelagert worden waren. Diese klinischen Prüfungen haben bestätigt, daß mehr als 20 Stunden alte Transplantate, die erfindungsgemäß behandelt worden sind, folgerichtig mindestens so leistungsfähig sind wie 6 bis 8 Stunden alte.
Zum weiteren Verständnis der Erfindung werden im folgenden einige nicht einschränkende Beispiele aufgeführt.

Herstellung gezüchteter Epithelzellschichten

In Kulturflaschen (T 150) wurden durch Einsäen epidermaler Zellen (Keratinozyten) in einer Dichte, die ein Zusammenfließen innerhalb von 10 bis 12 Tagen ermöglichten, Kulturen angelegt. Die Kulturen wurden in gasdichten Flaschen bei 37 ºC in einem Medium aus FAD (Mischung aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DME) und mit Adenin ergänztem Hams F12), 10 % Rinderfetusserum, 0,4 ug/ml Hydrocortison, 5 ug/ml Insulin, 5 ug/ml Transferrin, 1 10&supmin;¹&sup0;M Choleratoxin und 2 10&supmin;&sup9;M Liothyronin gehalten und in Gegenwart von tödlich bestrahlten 3T3 Fibroblasten gezüchtet (siehe U.S. 4,016,036). 10 ng/ml epidermaler Wachstumsstoff sind ab der ersten Fütterung enthalten.
Die Zellkulturen wurden innerhalb von 2 Tagen nach dem Zusammenfließen zur Herstellung von Transplantaten verwendet. Von jeder T150 Flasche wurde der obere Teil mit einem Lötkolben abgetrennt. Das überstehende Medium wurde abgesaugt, und in die Flasche wurden 40 ml Dispase II (Boehringer Mannheim) mit einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml (ca. 1,2 U/ml) gegeben. Der Deckel wurde wiederaufgesetzt, und die Flasche wurde bei 37 ºC in einem sterilen Kunststoffbeutel inkubiert. Als sich die Ränder der Zellschicht abzulösen begannen (bis zu 45 Minuten), wurde die Flasche in einen wirbelfreien Abzug gestellt.
Die Enzymlösung wurde durch 20 ml DME Medium ersetzt. Die Epithelzellschicht wurde dann vorsichtig mit Hilfe eines 'rubber policeman' abgelöst und mit 20 ml DME gespült. Die zweite Spülung wurde bis auf 3 - 4 ml abgesaugt. Anschließend wurde jede Zellschicht mit einem 5 x 10 cm großen Stück Gaze, die mit Petrolat (Vaseline ) getränkt war (Chesebrough Ponds), so abgedeckt, daß Zellen und Gaze sich berührten. Die kohäsive Zellschicht wurde dann mit 12 - 15 Klammern an den Verband geheftet (Ligaclips, Ethicon/J & J). Die Transplantate wurden anschließend mit dem Epithel nach oben in 100 mm Schalen gelegt. Die Ränder der Transplantate wurden mit einem 'rubber policeman' an die Schalen angedrückt, um ein Auftreiben zu verhindern. Dann wurden vorsichtig 12 ml DME zugegeben, und die Schalen wurden in den Lagerbehälter gesetzt.
Abbildung 1 zeigt einen senkrechten Schnitt durch eine typische Zellschicht, die nach der vorhergehenden Beschreibung gezüchtet wurde. Die Zellschicht wurde mit Dispase von der Kulturschale gelöst. Die Basal- oder Keimschicht ist die einzelne Zellschicht ganz unten auf dem Photo. Die hellen Stellen zwischen den Zellen sind ein Gewebebefestigungsartefakt.

Temperaturbedingungen

Kulturschalen mit Transplantaten können in gasdichten Behältern (10), wie in Abbildung 2 dargestellt, gelagert oder transportiert werden. Diese Behälter können z.B. aus nichtrostendem Stahl (316L, ca. 1,6 mm stark) gefertigt sein und ein Außenmaß von 11,5 x 8,25 x 11 Zoll (ca. 29 x 21 x 28 cm) haben. Die Tür (12) des Behälters besteht aus 0,25 Zoll (ca. 6 mm) Lexan mit einer Silikongummidichtung (14) und wird mit drei Schnappriegeln (16) geschlossen. Zwei Gasnippel (17) stehen aus der Tür (12) hervor. Im Inneren des Behälters (10) befindet sich oben (19) ein Fach (18). Die Kulturschalen (20) mit den Transplantaten werden in den unteren Teil des Behälters gestellt (bis zu 63 Schalen), die Kühlpackungen (26) werden in das obere Fach (18) gelegt.
Bei Lagerung bei Raumtemperatur (21 - 23 ºC) wird der Behälter einfach auf einen Labortisch in einem Raum mit diesem Temperaturbereich gestellt. Eine Temperatur von 13 ºC bis 23 ºC wird erreicht, indem man z.B. in das obere Fach (18) des Behälters (10) zwei Beutel (26) mit je 1 kg Wasser (4 ºC) und einen Beutel (26) mit 250 g Eis (-15 ºC) legt. Ein engerer Temperaturbereich, etwas niedriger als die Umgebungstemperatur, kann erreicht werden, wenn in das obere Fach vier ca. 340 g schwere Kühlpackungen (UTEK #412, Polyfoam Packers, Wheeling, IL) gelegt werden, die vorher auf 4 ºC gekühlt wurden. Der Stahlbehälter wird in eine Faserplattenkiste (21) gestellt, die ganz mit 2,5 cm dickem Styrolisolierschaum ausgekleidet ist.
In allen Fällen wird der Behälter unmittelbar nach Einlagerung der Transplantate mit 10 % CO&sub2; in Luft gefüllt. Die Temperatur im Behälter kann zu Versuchszwecken mit einem Thermoelement und Schreiber überwacht werden. Abbildung 5 zeigt als Beispiel ein Durchschnittstemperaturprofil bei der obenbeschriebenen Verwendung von Behälter und Kühlpackungen. Ein elektronischer Temperaturüberwacher kann neben die Kulturschalen (20) gestellt werden, damit der Chirurg nachprüfen kann, ob während des Transports der zulässige Temperaturbereich eingehalten wurde.

Effizienz einer temperaturgesteuerten Lagerung

Prüfungen der Lebensfähigkeit wurden an Transplantaten durchgeführt, die bei unterschiedlichen Temperaturen 20 und 26 Stunden nach Ablösung von ihrem Nährsubstrat (gerechnet vom Zeitpunkt der Dispasezugabe) gelagert worden waren. Die Ergebnisse wurden mit denen von Zellschichten verglichen, die zwei Stunden nach Zugabe von Dispase untersucht worden waren (Kontrolluntersuchungen). Die abgelöste Zellschicht wurde in einem Gemisch aus Trypsin (0,05 %) und EDTA (0,01 %) zu einer einzigen Zellsuspension aufgelöst. Die enzymatische Wirkung wurde durch Zugabe von Kalbserum gehemmt. Anschließend wurde zweimal hintereinander eine Verdünnung (1 : 10) von 0,5 ml Zellsuspension in 4,5 ml FAD zugegeben. Die Blutkörperchen einer aliquoten Menge der ursprünglichen Zellsuspension wurden in einer Zählkammer gezählt, und die Anzahl aller wiederaufgebauten Zellen wurde bestimmt. Abschließend wurde ein Konzentrat aus 2000 Zellen/ml hergestellt, und 1 ml dieser Zellsuspension wurde in 100 mm Kulturschalen im obenbeschriebenen, vollständigen Nährmedium ausgestrichen. Die Schalen wurden bei 37 ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10 % CO&sub2; in Luft gelagert.
Nach 14 Tagen wurden die Kulturen mit einer Lösung von 10 % Formalin in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) fixiert und mit einer Mischung aus 1 % Rhodamin und 1 % Nilblau A gefärbt. Die Kolonien wurden unter einem Seziermikroskop gezählt und als wachsend oder abgestorben gewertet.
Die Koloniebildungsfähigkeit (KBF) wurde folgendermaßen berechnet:
KBF [%] = Gesamtzahl der Kolonien/2000 100
Die Gesamtzahl der koloniebildenden Zellen (KBZ) wurde wie folgt berechnet:
KBZ = Gesamtzahl der wiederaufgebauten Zellen KBF/100
Es wurden fünf Versuche mit drei verschiedenen Epithelzellstämmen von Patienten mit Brandwunden durchgeführt, bei denen körpereigenes Gewebe transplantiert werden sollte. Die Kulturen wurden, wie oben beschrieben, gezüchtet und als Transplantate vorbereitet. Für jeden Zeitpunkt wurden in jedem Versuch vier Transplantate verwendet. Die Transplantate wurden in jedem Versuch den unterschiedlichen Lagerzeiten so zugeordnet, daß die zwei Transplantate aus jeweils einer Kulturflasche unterschiedlich lange gelagert wurden. Außerdem wurde eine gleiche Anzahl Transplantate von der Vorder- und Rückseite der Flaschen unter denselben Bedingungen gelagert. In den durchgeführten fünf Versuchen wurden die Transplantate, wie oben beschrieben, in einem schaumisolierten Behälter mit auf 4 ºC vorgekühlten Packungen gelagert.
Die Gesamtzahl der in jedem Transplantat durch Auflösung in Trypsin/EDTA wiederaufgebauten Zellen und die Koloniebildungsfähigkeit der Zellen wurden bestimmt. Die Gesamtzahl an koloniebildenden Zellen in jedem Transplantat wurde dann, wie oben beschrieben, berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Abbildung 3 dargestellt. Die Tabelle zeigt die Ergebnisse von fünf Versuchen, in denen auf Gaze geheftete, gezüchtete Epitheltransplantate bis zu 26 Stunden bei Temperaturen von 13 ºC bis 23 ºC gelagert wurden. Zur Prüfung der Lebensfähigkeit wurden die Epithelzellschichten enzymatisch in einzelne Zellen getrennt, und die Anzahl wiederaufgebauter Zellen, die Koloniebildungsfähigkeit sowie die Anzahl der koloniebildenden Zellen pro Transplantat wurden für die angegebenen Lagerzeiten bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Anzahl der verbleibenden, koloniebildenden Zellen, bezogen auf die Vergleichstransplantate, zusammengefaßt. Tabelle 1 Lagerfähigkeit von gezüchteten, epidermalen Transplantaten Versuch Gesamtzahl wiederaufgebauter Zellen pro Transplantat ( 10&sup6;) Stunden Koloniebildungsfähigkeit (%) Koloniebildende Zellen ( 10&sup6;) Relative koloniebildende Zellen (%)
Die Gesamtzahl wiederaufgebauter Zellen lag bei allen untersuchten Lagerzeiten über 74 %, bezogen auf die Vergleichstransplantate, d.h. auf eine Lagerzeit von unter 2 Stunden, und betrug im Durchschnitt in den fünf Versuchen 100 %. Beobachtet wurde ein geringfügiger, statistisch aber unbedeutender Rückgang der Gesamtzahl wiederaufgebauter Zellen nach 26stündiger Lagerung im Vergleich zu 20stündiger Lagerung.
Die Anzahl wiederaufgebauter, koloniebildender Zellen sank nach 20 bis 26stündiger Lagerung nur unwesentlich und war interessanterweise zwei- bis zweieinhalbmal größer als die der Vergleichstransplantate. Der Grund für dieses unerwartete Verhalten ist unbekannt. Es wird jedoch angenommen, daß durch Dispase abgelöste, fixierte Zellschichten einen reversiblen Schaden erleiden. Ein Teil dieser Schädigung kann während der ersten 20 Stunden der Lagerung bei geeigneten Temperaturen behoben werden und führt zu den beobachteten Resultaten.
In einer anderen Versuchsserie (siehe nachfolgende Tabelle 2) wurden Keratinozyten (Stamm YF29, Vorhaut von Neugeborenen) in Schichten gezüchtet. Im Versuch 1 wurden die Schichten mit Dispase vom Kunststoff abgelöst und bei 18 ºC - 23 ºC während der angegebenen Zeiten in DME Medium in einer Atmosphäre von 10 % CO&sub2; inkubiert. In den Versuchen 2 und 3 wurden die Schichten, wie oben beschrieben, auf Gaze geheftet und bei den angegebenen Temperaturen und Zeiten inkubiert. Die Versuchsergebnisse zeigen, daß eine beträchtliche Anzahl koloniebildender Zellen eine Lagerung von mehr als 24 Stunden überleben. Die Werte bewegten sich zwischen 44 % - 91 % bei 44 bis 48 Stunden bzw. 46 - 48 % bei 68 bis 72 Stunden unter kontrollierten Bedingungen. Tabelle 2 Lebensfähigkeit von epidermalen Transplantaten nach längerer Lagerung Lagerzeit (Std.) Versuch 1 (18 - 23 ºC, unbefestigte Zellschichten) Gesamtzahl wiederaufgebauter Zellen pro Transplantat ( 10&sup6;) Koloniebildungsfähigkeit (%) Koloniebildende Zellen ( 10&sup6;) Versuch (ºC, auf Gaze fixiert) Relative koloniebildende Zellen Versuch (%)

Tierversuch zur Beurteilung der Lebensfähigkeit des Transplantats

Die Taconic Farm, New York, lieferte weibliche, thymuslose Mäuse vom Stamm NIH nu/nu, die 6 bis 8 Wochen alt waren und ein Körpergewicht von 18 bis 20 g hatten. Sie wurden durch subkutane Injektion von Pentobarbitalnatrium betäubt (0,038 mg/g Körpergewicht) und bis zum Aufwachen in einem warmen Käfig gehalten. Bis zur Entnahme der Transplantate wurden sie dann in getrennten Käfigen gehalten.
Auf mit Vaseline getränkter Gaze wurden Epithelzellschichten, wie oben offengelegt, fixiert und dann 4, 20 und 26 Stunden in serumfreiem Medium bei 18 - 22 ºC gelagert. Für jede Lagerbedingung wurden vier Transplantate vorbereitet. Bei der Transplantation wurde zwischen Zellschicht und Gazeunterlage eine Scheibe (1 cm Durchmesser) aus sterilem Silastic (Dow Corning, NJ) eingesetzt. Mit einer sterilen Skalpellklinge wurde die Zellschicht auf die Größe der Scheibe zugeschnitten. Die Silastic-Scheibe mit dem anhaftenden Epithel wurde vorsichtig mit einer Pinzette am Rand hochgehoben und auf die Transplantationsstelle übertragen.
Die Transplantation wurde in Abwandlung der von Barrandon, Li und Green beschriebenen Methode ('New Techniques for the Grafting of Cultured Human Epidermal Cells onto Athymic Mice', J. Invest. Dermatol., 91, 315-8(1988) durchgeführt. Die Rückenoberfläche der Maus wurde mit Alkohol desinfiziert. Mit einer Schere wurde ein Hautlappen ausgeschnitten und zum Schädel hin umgeschlagen. Die Silastic-Scheibe mit dem anhaftenden Epithel wurde behutsam genau über dem Rippenbogen mit der Basalzellschicht des Epithels nach oben auf die Thoraxwand gelegt. Der Hautlappen wurde über das Transplantat zurückgeklappt, und die Schnittstellen wurden mit sterilen Wundklammern verschlossen.
Zur Entnahme des Transplantats wurde das Tier mit Narkoseether getötet. Der Gewebelappen mit dem Epitheltransplantat vom Menschen wurde herausgeschnitten. Das Silastic wurde abgezogen und das Mausgewebe um das Transplantat herum weggeschnitten. Die Probe mit der Mausepidermis außen und der durch das Transplantat erzeugten menschlichen Epidermis innen wurde dann auf ein Fixiermittel übertragen. Die Probeexzisionen wurden in 3,7 % Formaldehyde fixiert und in Paraffin eingelegt. Schnitte von 5 um Stärke wurden mit Harris Hämatoxylinlösung in 5 % alkoholischem Eosin gefärbt. Für die drei Versuchsbedingungen wurden an zwölf Mäusen Transplantationen vorgenommen. Die Transplantate wurden 7 Tage nach der Verpflanzung entnommen.
Die Anwachsquote betrug 100 %. Die menschliche Epidermis war unter der Maushaut als blasse Fläche sichtbar. Bei der Untersuchung nach Entfernung des Hautlappens erscheint das Transplantat als weiße Fläche, die sich deutlich von dem umgebenden Mausgewebe abgrenzt. Die Differenzierung der Keratinozytenschicht zu einer vollständig geschichteten Epidermis dauert bis zu 7 Tage nach der Transplantation. In senkrechten Paraffinschnitten sind die vier Hauptschichten menschlicher Epidermis in den Transplantaten erkennbar: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum und stratum corneum. Die stratum basale besteht aus einer einzigen Schicht basophiler Zellen auf der Lamina. Die Zellen sind würfelförmig, und gelegentlich werden Kernteilungsfiguren beobachtet. Die Zellen der stratum spinosum sind von flacher, polyedrischer Form. Die stratum granulosum besteht aus zwei Schichten flacher Zellen. Ihr Merkmal ist das Keratohyalin-Granula. Die Dicke der Hornschicht ist bei den 7 Tage alten Transplantaten unterschiedlich.
Bei den 4, 20 und 26 Stunden gelagerten Transplantaten wurden keine offensichtlichen histologischen Unterschiede festgestellt. Nach 7 Tagen ist die Epidermis 4 bis 6 Zellen dick (40 um). In allen drei Fällen lagen die vier Schichten in gleichen Proportionen vor. Unversehrtheit und Aufbau der Basalzellenschicht können durch Zählen der Zellkerne auf einer bestimmten Strecke beurteilt werden. Bei allen drei Lagerzeiten wurden durchschnittlich 9 Basalzellkerne pro 100 um gezählt. Gelegentlich wurden Kernteilungsfiguren beobachtet, aber die Anzahl veränderte sich bei den unterschiedlichen Bedingungen offensichtlich nicht. Das auffälligste Merkmal der Transplantate war die vorstehende, kernhaltige stratum granulosum, die nach 4, 20 und 26 Stunden bei allen Proben gleich war. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Lagerzeitversuche mit nackten Mäusetransplantaten Inkubationszeit (Stunden) Basalzellkerne pro 100 um Epitheldicke (um)
Aus dem Vorhergehenden ist offenkundig, daß es bei Lagerung von gezüchteten Epitheltransplantaten über einen Zeitraum von 26 Stunden vor der Verwendung zu keinem Verlust an koloniebildenden Zellen oder zu keiner Einschränkung der Epithelbildungsfähigkeit in einem Transplantatbett kommt. Es wird somit bewiesen, daß die Lagerfähigkeit von hergestellten Transplantaten von 8 auf mindestens 26 Stunden verlängert werden kann. Die Lagertemperatur ist äußerst wichtig. Optimal für den Erhalt der koloniebildenden Zellen, wie aus dem in vitro Versuch hervorgeht, ist eine Lagerung der Transplantate bei 13º bis 23 ºC. Das Überleben der Transplantate ist bei Raumtemperatur fast genauso gut wie bei etwas niedrigeren Temperaturen.
Temperaturen von 15º bis 20 ºC können über einen Zeitraum von 18 Stunden leicht eingehalten werden (mit anschliessendem Anstieg der Behältertemperatur auf Raumtemperatur), wenn vorgekühlte Kühlpackungen in den isolierten Behälter gelegt werden und die Umgebungstemperatur zwischen 21º und 23 ºC liegt. Um die Temperatur im Innern des Behälters 24 Stunden zwischen 13º und 23 ºC zu halten (bei einer Außentemperatur von nicht unter etwa 20 ºC und einer Wärmebelastung, wie sie beim bevorzugten Lufttransport an der Oberfläche auftreten kann), genügt ein mit ca. 2,5 cm dickem Schaum isolierter Stahlbehälter mit 2 Liter Wasser (4 ºC) in versiegelten Plastikbeuteln und 250 ml Eis. Solch ein Behälter kann sofort versandt werden und faßt etwa 63 100-mm Kulturschalen, wovon jede 12 ml Nährmedium enthält. Selbstverständlich können auch andere, dem Fachmann bekannte Methoden einer wirkungsvollen, zuverlässigen und preiswerten Temperatursteuerung genutzt werden.
Die obendargelegten Ergebnisse zeigen, daß die Lebensfähigkeit von gezüchteten Epitheltransplantaten mindestens 26 Stunden und sogar 72 Stunden aufrechterhalten werden kann, wenn die Lagerung unter den beschriebenen Bedingungen erfolgt. Diese Schlußfolgerung wird auch durch die Ergebnisse der fünf klinischen Tests bestätigt, die eindeutig zeigten, daß Transplantate, die 24 Stunden vor ihrer Verwendung gelagert worden waren, mindestens so gut anwachsen wie die, die dem Patienten innerhalb von 6 Stunden Herstellungszeit aufgelegt wurden.

Claims

1. Verfahren zur Aufrechterhaltung oder Verbesserung der Kolonie bildenden Effektivität von Zellen in einer gezüchteten Epithelzellschicht (z.B. Keratinocyten) nach Trennung von ihrem Substrat, wobei dieses Verfahren den folgenden Verfahrensschritt aufweist:

Halten der Zellschicht in einem physiologisch verträglichen Medium für einen Zeitraum von mehr als 8 Stunden (z.B. 8 bis 26 Stunden) bei einer Temperatur in Bereich von 8 ºC bis 19 ºC (z.B. 13 ºC bis 19 ºC).

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Schicht in einer Menge des physiologisch verträglichen Mediums gehalten wird, die ausreicht, um die Zellschicht unterzutauchen.

3. Ein zur Aufbringung auf eine Wunde geeigneter Verband, enthaltend oder bestehend aus einer kohäsiven Schicht von gezüchteten, lebenden Epithelzellen (z.B. Keratinocyten), herstellbar nach dem Verfahren des Anspruchs 1.

4. Verband nach Anspruch 3, worin die kohäsive Schicht germinative und differenzierte Zellen aufweist.

5. Ein Produkt zur Wundheilung, das den Verband des Anspruches 3 oder Anspruches 4 enthält oder daraus besteht, worin die kohäsive Schicht auf ein nicht anhaftendes Substrat aufgebracht und in einer Packung vorgesehen ist, welche Kühlpackungen aufweist, die die Wärme so absorbieren, daß die Schicht in der Packung bei einer Temperatur in Bereiche von 13 ºC bis 19 ºC für mindestens 12 Stunden gehalten wird.

6. Verfahren zur Verlängerung der Lebend-Lagerfähigkeit einer kohäsiven Schicht von lebenden gezüchteten Epithelzellen nach Trennung von ihrem Verankerungssubstrat zur Aufrechterhaltung der Wirksamkeit der Schicht als Verband für Hautwunden, wobei deren Zellen die Fähigkeit zur Replikation unter Bildung von Kolonien beibehalten, indem das Verfahren den Verfahrensschritt aufweist:

Halten der Schicht bei einer Temperatur im Bereich von 8 ºC bis 19 ºC für eine Zeit von mehr als 8 Stunden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Zeitraum 8 bis 26 Stunden beträgt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Wundverbands, welches die Verfahrensschritte aufweist

Züchtung von Epithelzellen auf einem Verankerungssubstrat unter Bildung einer kohäsiven Schicht;

Enzymatische Ablösung dieser Schicht von dem Verankerungssubstrat;

Halten dieser Schicht für einen Zeitraum von mehr als 8 Stunden bei einer Temperatur in Bereiche von 8 ºC bis 19 ºC;

wobei, wenn eine solcher Verband auf eine Wunde aufgebracht wird (z.B. eine Hautwunde) die Zellen dieser Schicht die Heilung der Wunde beschleunigen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Temperatur in Bereiche von 17 ºC bis 19 ºC liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Zeitraum bis zu 72 Stunden beträgt.