DE60027724T2

DE60027724T2 - Verbesserte keratinozytenkultur und deren verwendungen

Info

Publication number: DE60027724T2
Application number: DE60027724T
Authority: DE
Inventors: Thomas Hunziker; Alain Limat
Original assignee: DFB Pharmaceuticals Inc
Current assignee: DFB Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: AU784221B2; CA2379949A1; AU6009800A; US20060292126A1; US7014849B1; EP1198557A2; EP1702979A2; US20090257986A1; ES2265953T3; JP3738273B2; WO2001005942A3; DE60027724D1; ATE325186T1; EP1702979B1; CA2379949C; PT1198557E; EP1198557B1; WO2001005942A2; EP1702979A3; JP2003505122A

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Zellkultur von menschlichen Keratinozyten-Vorläuferzellen und dermalen Fibroplastzellen, wobei die kultivierten Keratinozyten-Vorläuferzellen zur Reparatur von Hautdefekten mittels Hauttransplantationsverfahren verwendet werden können.
Das Verheilen von Hautdefekten durchläuft drei allgemeine Phasen: (i) Entzündung, (ii) Wundzellenmigration und -mitose und (iii) extrazelluläre Matrixproduktion und Remodellierung. Man geht davon aus, daß die geordnete Reihenfolge dieser Vorgänge durch Wechselwirkungen zwischen Zellen, Wachstumsfaktoren und extrazellulären Matrixproteinen aufeinander abgestimmt und gesteuert werden. Ein entscheidender Schritt der Hautwundheilung ist die epidermale Regenerierung (d.h. die Epithel-Neubildung). Neben interfollikulären epidermalen Keratinozyten von den Wundrändern tragen auch die Zellen der äußeren Wurzelscheide (ÄWS) von residualen Haarfollikeln zu diesem Prozeß bei (siehe zum Beispiel Eisen und Mitarbeiter, 15 J. Invest. Dermatol. 145–155 (1995)). Die ÄWS von Haarfollikeln besteht größtenteils aus undifferenzierten Keratinozyten, die die zylindrischen Strukturen der gehärteten inneren Wurzelscheide und des Haarschaftes umschließen (siehe beispielsweise Montagna und Parakkal in: The Structure and Function of Skin, 172–258 (Academic Press New York, NY, 1974)). In der Literatur neueren Datums wird auch darauf hingewiesen, daß die ÄWS-Zellen in geringerem Maße an der Differenzierung beteiligt sind als die basalen interfollikulären Keratinozyten (siehe beispielsweise Coulombe und Mitarbeiter, 109 J. Cell Biol. 2295–2312 (1989); Limat und Mitarbeiter, 194 Exp. Cell Res. 218–227 (1991); Limat und Mitarbeiter, 275 Cell Tissue Res. 169–176 (1994), und es wurden sowohl beim Tier als auch beim Menschen Marker-tragende Zellen in der ÄWS-Region nahe dem Wulstbereich nachgewiesen, die möglicherweise Stammzellen für Hautepithelialgewebe darstellen (siehe zum Beispiel Cotsarelis und Mitarbeiter, 61 Cell 1329–1337 (1990); Kobayashi und Mitarbeiter, 90 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7391–7395 (1993); Yang und Mitarbeiter, 105 J. Invest. Dermatol. 14–21 (1993); Rochat und Mitarbeiter, 76 Cell 1073–1076 (1994); Moll, 105 J. Invest. Dermatol. 14–21 (1995)). Außerdem können menschliche ÄWS-Zellen, die von ausgerupften anagenen Kopfhaarfollikeln isoliert werden, extensiv in vitro expandiert werden (siehe zum Beispiel Weterings und Mitarbeiter, 104 Brit. J. Dermatol. 1–5 (1981); Limat und Noser, 87 J. Invest. Dermatol. 485–488 (1986); Imcke und Mitarbeiter, 17 J. Am. Acad. Dermatol. 779–786 (1987); Limat und Mitarbeiter, 92 J. Invest. Dermatol. 758–762 (1989)). Unter herkömmlichen Submerskulturbedingungen ähneln ÄWS-Zellen interfollikulären epidermalen Keratinozyten sowohl nach morphologischen als auch nach biochemischen (zum Beispiel Keratinprofil-) Kriterien (siehe zum Beispiel Stark und Mitarbeiter, 35 Differentiation 236–248 (1987); Limat und Mitarbeiter, 92 J. Invest. Dermatol. 758–762 (1989); Limat und Mitarbeiter, 642 Ann. N.Y. Acad. Sci. 125–147 (1991)). In organotypischen Co-Kulturen mit menschlichen dermalen Fibroplasten (d.h. unter Bedingungen, in denen die epidermale Umgebung nachgeahmt wird) entwickeln ÄWS-Zellen im Hinblick auf histologische, immunohistologische, ultrastrukturelle und biochemische Kriterien ein Schichtepithel, das an eine sich regenerierende Epidermis erinnert (siehe beispielsweise Lenoir und Mitarbeiter, 130 Dev. Biol. 610–620 (1988); Limat und Mitarbeiter, 194 Exp. Cell Res. 218–227 (1991); Limat und Mitarbeiter, 642 Ann. NY. Acad. Sci. 125–147 (1991)). Wenn solche organotypischen Kulturen auf nackte Mäuse transplantiert werden, so bilden ÄWS-Zellen eine normale Neoepidermis, die sich unter homöostatischer Kontrolle befindet (siehe zum Beispiel Limat und Mitarbeiter, 59 Transplantation 1032–1038 (1995)). Somit sind ÄWS-Zellen für die klinische Anwendung von großem Interesse.
In den zurückliegenden zehn Jahren hat sich das Interesse auf die Verwendung kultivierter Epithelialzellen zur Wundabdeckung konzentriert. Zuerst wurden Lagen aus kultivierten autologen interfollikulären Keratinozyten erfolgreich auf akute Wunden transplantiert, überwiegend zur Behandlung größerer drittgradiger Verbrennungen (siehe beispielsweise O'Connor und Mitarbeiter, 1 Lancet 75–78 (1981); Compton und Mitarbeiter, 60 Lab. Invest. 600–612 (1989)), aber auch zur Behandlung von Epidermolysis bullosa (siehe beispielsweise Carter und Mitarbeiter, 17 J. Am. Acad. Dermatol. 246–250 (1987)), Pyoderma gangrenosum (siehe beispielsweise Dean und Mitarbeiter, 26 Ann. Plast. Surg. 194–195 (1991), Limova und Mauro, 20 J. Dermatol. Surg. Oncol. 833–836 (1994))) und Wunden nach der Exzision angeborener großflächiger Muttermale (siehe beispielsweise Gallico und Mitarbeiter, 84 J. Plast. Reconstr. Surg. 1–9 (1989)) oder der Trennung siamesischer Zwillinge (siehe beispielsweise Higgins und Mitarbeiter, 87 J. Royal Soc. Med. 108–109 (1994)).
Im Gegensatz zur Behandlung solcher akuter Wunden war die Transplantation von kultivierten Keratinozyten auf chronische Wunden (zum Beispiel Beingeschwüre) bisher weit weniger erfolgreich. Allogene Transplantate führen zu keiner dauerhaften Annahme (siehe beispielsweise Fabre, 29 Immunol. Lett. 161–166 (1991)) und können darum als ein "recht effektiver, aber teurer biologischer Wundverband" klassifiziert werden (siehe Phillips und Mitarbeiter, 21 J. Am. Acad. Dermatol. 191–199 (1989). Eine reproduzierbare, größere, definitive Annahme autologer Keratinozyten, die mittels verschiedener Modalitäten transplantiert wurden, darunter: Lagen submerser Keratinozytkulturen, die nur aus eini gen wenigen, nicht-verhornten Zellschichten bestehen (Hetton und Mitarbeiter, 14 J. Am. Acad. Dermatol. 399–405 (1986); Leigh und Purkis, 11 Clin. Exp. Dermatol. 650–652 (1986); Leigh und Mitarbeiter, 117 Brit. J. Dermatol. 591–597 (1987); Harris und Mitarbeiter, 18 Clin. Exp. Dermatol. 417–420 (1993)), trypsinierte Einzelzellen, die an Collagen-beschichtete Wundverbände angehaftet sind (Brysk und Mitarbeiter, 25 J. Am. Acad. Dermatol. 238–244 (1991)) und Hautäquivalente (Mol und Mitarbeiter, 24 J. Am. Acad. Dermatol. 77–82 (1991)), müssen in der wissenschaftlichen Literatur erst noch überzeugend belegt werden. Der gleiche Mangel an quantitativen Befunden gilt auch für verschiedene Berichte über das Transplantieren von frisch isolierten, autologen interfollikulären Keratinozyten (Hunyadi und Mitarbeiter, 14 J. Dermatol. Surg. Oncol. 75–78 (1988)) oder ÄWS-Zellen (Moll und Mitarbeiter, 46 Hautarzt 548–552 (1995)), die mit Hilfe eines Fibrinklebers am Wundbett befestigt werden. Es ist jedoch zu beachten, daß die Nachteile des bovinen Serums, das während der Kultivierung der Keratinozyten verwendet wird, zur Verringerung der Annahmerate beitragen können, was daran liegt, daß es in Keratinozyten resistiert (siehe beispielsweise Johnson und Mitarbeiter, 11 J. Burn Care Rehab. 504–509 (1990)).
DE-A-19651992 beschreibt die Kultivierung von Zellen der äußeren Wurzelscheide in 3–60%-igem autologem oder homologem Serum zur Herstellung dermaler Äquivalente. Die dermalen Äquivalente können auf Hyaluronsäuremembranen oder einem anderen biologisch abbaubaren Material vor der Transplantation gesät werden, um die Handhabung zu optimieren.
Lenoir-Viale, M. C. (Arch. Dermatol. Res. 1993, 285: Seiten 197–204) beschreibt die in-vitro-Präparierung einer rekonstruierten Epidermis aus der äußeren Wurzelscheide menschlicher Haarfollikel. Die rekonstruierte Epidermis wird als ein wertvolles und vielversprechendes Hilfsmittel für pharmakologische Studien beschrieben und kann ein Modell für die Wundheilung darstellen.
Limat, A. (1. of Investigative Dermatology 2000, 7. Nov., Seiten 128–134) beschreibt die Kultivierung von Haarfollikeln (wobei die Haarzwiebeln und die infundibulären Teile entfernt wurden) zum Herstellen epidermaler Äquivalente und deren Verwendung zur Behandlung chronischer Beingeschwüre.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung verbesserter und vereinfachter Verfahren für die Gewinnung von Keratinozyten oder Keratinozyten-Vorläufern aus Zellen der äußeren Wurzelscheide (ÄWS-Zellen) unter vollständig definierten Kulturbedingungen für die Behandlung verschiedener Arten von Hautdefekten (zum Beispiel chronischer Wunden wie beispielsweise Beingeschwüre, diabetische Geschwüre, Druckgeschwüre und dergleichen) sowohl beim Menschen als auch beim Tier. Neben ihrer Verwendung zur Wundbehandlung können Keratinozyten auch in der plastischen und kosmetischen Chirurgie Anwendung finden, oder wo immer Bedarf an einer solchen Hautunterstützung besteht (beispielsweise postoperativ nach der Entfernung von Tätowierungen, Muttermalen, Hautkrebs, Papillomen, nach Amputationen, bei Geschlechtsumwandlung und Revirgination, Rejuvinierung strahlengeschädigter Haut nach Hautoberflächenerneuerungen, Tympanoplastik, Epithelisierung des äußeren Gehörgangs und dergleichen).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird darum ein Verfahren bereitgestellt, wie es in Anspruch 1 unten beansprucht wird.
Ausgerupfte, anagene oder wachsende Haare können explantiert und in toto auf mikroporösen Membranen kultiviert werden, die menschliche Fibroplast-Feederzellen an ihrer Unterseite tragen. Aus solchen Primärkulturen lassen sich ÄWS-Zellen auf einfache Weise und wiederholt in großer Zahl gewinnen, und zwar unabhängig vom chronologischen Alter des Spenders. Solche ÄWS-Zellen können für die anschließende Herstellung komplexer Haut, d.h. dermo-epidermaler oder epidermaler Äquivalente, verwendet werden oder können in gefrorenem Zustand gehalten und aufbewahrt werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden.
Die anschließende Gewinnung von Haut oder epidermalen Äquivalenten kann durch das "Säen" dieser ÄWS-Zellen auf eine modifizierte mikroporöse Membran bewerkstelligt werden, die Fibroplast-Feederzellen (ganz besonders bevorzugt menschliche dermale Fibroplast-"Feederzellen", deren Wachstum zum Stillstand gekommen oder eingeschränkt ist) an ihrer Unterseite trägt. Während der Kultivierung vollzieht sich bei diesen ÄWS-Zellen eine Zelldifferenzierung, von der nachgewiesen wurde, daß sie derjenigen von normaler Epidermis ähnelt. Dieser Befund hat seine Ursache höchstwahrscheinlich in einem großen Kompartiment proliferierender Zellen. Die im vorliegenden Text offenbarten modifizierten Kulturbedingungen sind wichtig für die erfolgreiche Behandlung chronischer Wunden mit epidermalen Äquivalenten, die in vitro aus autologen ÄWS-Zellen gewonnen werden.
Aus ÄWS gewonnene Keratinozyten können kultiviert werden, indem man das anagene Haar auf einer polymeren, mikroporösen Membran anhaftet, die mit einem oder mehreren Molekülen extrazelluären Matrixursprungs beschichtet ist. Diese verbesserten Kulturen aus ÄWS-Zellen, die als Hautäquivalente oder epidermale Äquivalente gedacht sind, können zur Behandlung von Hautdefekten, insbesondere chronischer Wunden, verwendet werden.
Die Verwendung einer verringerten Konzentration von allogenem oder homologem Serum gemäß der Erfindung mindert deutlich das Risiko der Übertragung von Krankheiten, beispielsweise durch die klinische Verwendung von Blutprodukten, durch die Verwendung von autologem oder homologem menschlichen Serum und Substanzen, die aus Blutbestandteilen gewonnen oder freigesetzt wurden (beispielsweise Blutplättchen), für Supplemente in in-vitro-Kultivierungsschritten.
Zu den klinischen Vorteilen der Verwendung epidermaler oder komplexer Hautäquivalente der vorliegenden Erfindung gehören beispielsweise Nicht-Invasivität (so daß die Zellen wiederholt zur Verfügung stehen), das Nichtvorhandensein der Notwendigkeit chirurgischer Einrichtungen oder Anästhesie während des Transplantierens und ein kurzer erforderlicher Immobilisierungszeitraum von 2 Stunden im Anschluß an die Transplantation.
Sofern nicht anders definiert, haben alle im vorliegenden Text verwendeten Fachbegriffe und wissenschaftlichen Begriffe die gleichen Bedeutungen, wie sie der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, gemeinhin versteht. Obgleich jegliche Verfahren und Materialien, die den im vorliegenden Text beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Alle im vorliegenden Text zitierten Publikationen werden in ihrem Vollen Umfang durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen.
Der Begriff "Keratinozytschicht" im Sinne des vorliegenden Textes meint eine in vitro hergestellte Keratinozytgewebekultur mit mehr oder weniger differenzierter Struktur. Der Begriff "epidermales Äquivalent" im Sinne des vorliegenden Textes meint eine in vitro hergestellte organotypische Gewebekultur, deren histologische Struktur der natürlichen Epidermis ähnelt, insbesondere im Hinblick auf die Stratifizierung und Entwicklung der Hornschicht. Eine normale Schichtepidermis besteht aus einer Basalschicht aus kleinen Würfelzellen, mehreren stacheligen Schichten aus schrittweise abgeflachten Zellen, einer hervorstehenden Körnerschicht und einer orthokeratotischen Hornschicht. Alle diese Schichten lassen sich in den epidermalen Äquivalenten feststellen, die den Gegenstand der Erfindung bilden. Die Anordnung jener epidermalen Differenzierungsprodukte, die immunhistochemischen Assays unterzogen wurden (beispielsweise Keratine, Involucrin, Filaggrin, Integrine), ähnelt derjenigen, die man in normaler Epidermis findet.
Der Begriff "autolog" im Sinne des vorliegenden Textes meint: (i) daß zu transplantierendes biologisches Material von dem Individuum gewonnen wird, das mit epidermalen Äquivalenten behandelt werden soll; oder (ii) daß biologisches Material, das Gewebekulturen beigegeben wird, vom Spender der Zellen für die Gewebekultur stammt.
Der Begriff "homolog" im Sinne des vorliegenden Textes meint: (i) daß zu transplantierendes biologisches Material von einem oder mehreren Individuen der gleichen Spezies wie das Individuum, das mit epidermalen Äquivalenten behandelt werden soll, gewonnen wird; oder (ii) daß biologisches Material, das Gewebekulturen beigegeben wird, von einem oder mehreren Individuen der gleichen Spezies wie der Spender der Zellen für die Gewebekultur stammt.
Der Begriff "organotypische Kultur" und dergleichen meint eine Zellkultur unter Bedingungen, die eine Differenzierung der Zellen fördern. Unter Bedingungen einer organotypischen Kultur wird die Proliferierung der Zellen im Vergleich zu einer Kultur unter "proliferativen" Bedingungen, wie beispielsweise Primärkulturbedingungen, verlangsamt und kann vollständig gestoppt werden. Im vorliegenden Fall ist eine wichtige Bedin gung für eine organotypische Kultur das Halten der Zellen an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit (ein sogenannter "Aufschwimm"-Kultivierungszustand).
Der Begriff "aus Blutbestandteilen freigesetzter Stoff" (beispielsweise aus Blutplättchen) im Sinne des vorliegenden Textes meint jegliche Kombination von Cytokinen oder sonstigen Wachstumsfaktoren, die aus Blutbestandteilen (beispielsweise Blutplättchen) gewonnen werden. Blutplättchen, die zum Beispiel mit Thrombin stimuliert werden, setzen den Inhalt ihrer Alphakörner in das umgebende Medium frei. Alphakörner enthalten in der Regel verschiedene Cytokine (beispielsweise aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktoren Alpha und Beta (TGF alpha/beta), Blutplättchenfaktor 4 (PF-4), Blutplättchenbasisprotein (PBP)). Es ist jedoch möglich, Cytokine und weitere Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen auch mittels anderer Verfahren als durch Stimulierung mit Thrombin zu gewinnen. Darüber hinaus produzieren auch andere Blutbestandteile Wachstumsfaktoren und Cytokine. Monocyten zum Beispiel produzieren IL-1, TNF alpha, IL-6 und weitere interessierende Substanzen.
Allgemeines Verfahren zum Herstellen epidermaler Äquivalente aus ÄWS-Zellen
Keratinozyten-Vorläuferzellen können aus der äußeren Wurzelscheide (ÄWS) von anagenem oder wachsendem Haar ausgewählt werden, das von dem Individuum stammt, das anschließend mit epidermalen Äquivalenten behandelt werden soll. Im allgemeinen werden ungefähr 40 Haarfollikel aus der Kopfhaut gerupft, und dann werden diejenigen in der anagenen Phase (d.h. mit einem wachsenden Haarschaft) unter dem Seziermikroskop ausgewählt. Insgesamt sind in der Regel vier Wochen Kultivierung nötig, um ungefähr 1 cm² an epidermalen Äquivalenten aus fünf Haarfollikeln zu erhalten. Allerdings kann es mit verbesserten Kultivierungs- und Fermentierungstechniken möglich sein, eine höhere Ausbeute (d.h. eine größere Fläche epidermaler Äquivalente innerhalb dieses Zeitraums) zu erhalten.
Das bisherige Standardverfahren für die Herstellung einer Primärkultur aus ÄWS-Keratinozyten bestand darin, ein anagenes Haar (d.h. mit einem wachsenden Haarschaft) auszureißen, gefolgt von einer sorgfältigen mikroskopischen Sezierung zum Entfernen der Haarzwiebeln und des infundibulären Haarschaftes. Die resultierende äußere Wurzelscheide (ÄWS) wurde dann auf den Kultureinsatz gelegt, um die primäre Keratinozytkultur zu initiieren. Jedoch haben zahlreiche anschließende Studien (ungefähr 200), bei denen das anagene Haar direkt auf den Kultureinsatz gelegt wurde, ohne mittels der anfänglichen Mikrosezierung die Haarzwiebeln und den infundibulären Haarschaft zu entfernen, gezeigt, daß eine solche mühsame und zeitaufwändige Sezierung des ausgerupften anagenes Haares nicht notwendig ist. Das hat zu einer deutlichen Vereinfachung des Handhabungsverfahrens, zu einer Verringerung des Kontaminierungsrisikos und zu einer effizienteren Initiierung der Keratinozytzellplattierung geführt.
Die ausgewählten anagenen Haare können in einem geeigneten Spülpuffer inkubiert werden, der verschiedene antimikrobielle und antifungale Wirkstoffe enthält (beispielsweise Fungizon, Penicillin und Streptomyzin). Im Anschluß an dieses Verfahren kann das gesamte ausgerupfte anagene Haar direkt auf den Kultureinsatz gelegt werden, wo man es mehrere Tage wachsen läßt, bevorzugt 7–14 Tage und besonders bevorzugt 8 bis 10 Tage. Ein optionaler zusätzlicher Schritt beinhaltet die Passage der Primärkultur und das Züchten einer Sekundärkultur, um mehr Zellmaterial für die Herstellung größerer Bereiche epidermaler Äquivalente zu erhalten.
Der Kultureinsatz, eine mikroporöse Membran, die mit einer oder mehreren extrazellulären Matrixsubstan zen beschichtet ist (zum Beispiel Fibrin, Fibronektin, Collagene, Laminine oder Hyaluronan oder Gemische daraus), kann ein in seinem Wachstum gestopptes oder gehemmtes Feederzellensystem an seiner Unterseite tragen. Die Beschichtung des Membraneinsatzes mit solchen extrazellulären Matrixsubstanzen sorgt für: (i) eine optimierte Kulturoberfläche für das anfängliche Anhaften des anagenen Haares (d.h. es klebt leicht an und bleibt an seinem Platz); (ii) eine Oberfläche, die deutlich die Migration der ÄWS-Keratinozyten von den anagenen Haarfollikeln der äußeren Wurzelscheide (ÄWS) weg verbessert; und (iii) erhöhte Wachstumsraten der sich ausbreitenden ÄWS-Keratinozyten (d.h. die Gesamtkulturzeit, die für die Produktion vollständig differenzierter Haut oder epidermaler Äquivalente benötigt wird, kann von vier auf drei Wochen verkürzt werden).
Das oben erwähnte in seinem Wachstum gestoppte oder gehemmte Feederzellensystem an der Unterseite der mikroporösen Einsatzmembran kann primäre dermale Fibroplasten aufweisen, die aus einer Biopsie menschlicher Haut gewonnen wurden. Die primären dermalen Fibroplasten können vor ihrer Verwendung als "Feederzellenschicht" für das ausgerupfte anagene Haar 4 bis 6 Stunden lang mit Mitomyzin-C behandelt werden und dann an die Unterseite des Kultureinsatzes plattiert werden. Der Wachstumsstopp oder die Wachstumshemmung kann entweder durch Mitomyzin-C oder Röntgenbestrahlung oder eine reduzierte Serumkonzentration von unter 5%, bevorzugt 2%, hervorgerufen werden. Es ist anzumerken, daß, obgleich einige Kulturen unter Verwendung von 10%-igem Kalbsfötenserum durchgeführt wurden (FCS; Boehringer Mannheim, Deutschland), festgestellt wurde, daß die derzeitige Verwendung von menschlichem Serum zum Zweck der Verringerung der Anzahl allogenischer Bestandteile zu einer deutlich überlegenen Keimung und Proliferierung der ÄWS-Zellen führt. Des Weiteren wird das menschliche Serum in einer Konzentration von weniger als 5% verwendet, bevorzugt in einer Konzentration von 2%. In Gegenwart solch geringer Serumkonzentrationen wird das Wachstum der primären menschlichen dermalen Fibroplasten der vorliegenden Erfindung deutlich oder vollständig gestoppt. Auf diese Weise können zwei teure und möglicherweise verkomplizierende Schritte in dem autologen ÄWS-Kultursystem wegfallen. Die zwei verkomplizierenden Schritte sind: (i) der Wegfall hoher Serumkonzentrationen von über 5%, wodurch die Gesamtkosten des Verfahrens deutlich gesenkt werden, und (ii) der Wegfall der Behandlung mit Mitomyzin-C, wodurch ein vollständig Mitomyzin-C-freies Kultursystem entsteht und alle Bedenken hinsichtlich der vollständigen Beseitigung des Arzneistoffs aus den Primärkultureinsätzen vor dem Wachstum der epidermalen Äquivalente ausgeräumt sind. Außerdem kann durch die Verwendung reduzierter Serumkonzentrationen das alternative Feederzellenstoppverfahren (d.h. der Röntgenbestrahlungsschritt) wegfallen, wodurch spürbare Zeit- und Kosteneinsparungen im Gesamtverfahren realisiert werden.
Nach der Expansion der ÄWS-Zellen auf eine geeignete Dichte (d.h. 1 × 10³ bis 1 × 10⁶ Zellen/cm², und bevorzugt 5 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ Zellen/cm²) werden sie zum Herstellen epidermaler Äquivalente verwendet. Vorzugsweise läßt man die Zellen konfluent wachsen. Die epidermalen Äquivalente werden durch Aussäen von ÄWS-Zellen in einer geeigneten Zellendichte (von 30 × 10³ bis 100 × 10³ Zellen/cm², bevorzugt 60 × 10³ Zellen/cm²) in einer Kulturvorrichtung hergestellt, die dafür geeignet sein kann, die Zellen während der Kultivierung bis zur Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit "aufschwimmen" zu lassen. Anschließend können die ÄWS-Zellen einen bis vier Tage nach dem Säen (bevorzugt 3 Tage nach dem Säen) mit Luft in Kontakt gebracht werden (beispielsweise durch Absaugen des Mediums im Inneren des Einsatzes), woraufhin die Kulturen etwa 10–20 Tage lang, und bevorzugt 14–18 Tage lang, in diesem "Aufschwimm"-Kultivierungszustand weitergeführt werden. Das Medium kann während der aufschwimmenden Kultur periodisch gewechselt werden, bevorzugt alle zwei bis drei Tage.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Hautäquivalente, die zusätzliche Schichten enthalten und so komplexere Strukturen sind als epidermale Äquivalente. Hautäquivalente enthalten differenzierte ÄWS-Zellen als ihren epidermalen Teil und auch eine Schicht, die eine Matrixkomponente aufweist, vorzugsweise eine, die eingebettete dermale Fibroplasten und/oder weitere Zellen enthält (d.h. eine "Einbettungsmatrix"). Hautäquivalente können hergestellt werden, indem man eine Matrix mit einer oder mehreren extrazellulären Matrixsubstanzen (zum Beispiel Fibrin, Fibronektin, Collagene, Laminine oder Hyaluronan oder Gemische daraus) auf die Oberseite der oben beschriebenen mikroporösen Membran aufbringt. Wenn menschliche dermale Fibroplasten vorzugsweise autologe menschliche dermale Fibroplasten, eingebettet werden, so können die Zellen mit einer Dichte von 1 × 10³ bis 1 × 10⁷ Zellen/cm², bevorzugt 1 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ Zellen/cm² und ganz besonders bevorzugt etwa 5 × 10⁴ Zellen/cm² eingebettet werden. Die Primärkultur der ÄWS-Zellen kann dann auf der Oberseite der Matrix (die vorzugsweise eingebettete dermale Fibroplasten und/oder sonstige Zellen enthält) ausgesät werden, und es kann eine organotypische Kultivierung, wie oben beschrieben, ausgeführt werden. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung dermaler Äquivalente findet sich beispielsweise bei Limat et al, 194 Exp. Cell Res. 218–277 (1991).
Es ist jedoch zu beachten, daß die Zellen, die in die Matrix eingebettet sind, nicht unbedingt auf dermale Fibroplasten beschränkt sein müssen, denn epidermale, mesenchymale, neuronale und/oder endotheliale Zellen können ebenso verwendet werden. Die eingebetteten Zellen werden vorzugsweise aus Hautgewebe gewonnen, sind besonders bevorzugt allogenische Zellen und sind ganz besonders bevorzugt autologe Zellen.
Alle Kulturschritte können in einem geeigneten Medium ausgeführt werden, das die Proliferierung der ÄWS-Zellen und ihr Keimen aus den Haarfollikeln gestattet. Das Medium wird in der Regel alle 2 bis 3 Tage gewechselt. Das Medium, das für alle Schritte verwendet wird, ist im allgemeinen das gleiche. Das Medium basiert in der Regel auf einem Minimalmedium und enthält verschiedene zusätzliche Bestandteile. Ein üblicher Bestandteil ist Serum. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird menschliches Serum in einer Konzentration von weniger als 5% und bevorzugt in einer Konzentration von 2% verwendet. Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) stimuliert die Migration von Keratinozyten und verzögert ihre Seneszenz, was eine Stimulierung der Proliferation zur Folge hat. Choleratoxin, Hydrocortison, Insulin, Adenin und Triiodthyronin haben eine Auswirkung auf das Stimulieren der Proliferation. Alle diese Bestandteile sind somit in einem Medium zum Herstellen epidermaler Äquivalente brauchbar. Ungeachtet dessen kann es möglich sein, den einen oder anderen dieser Bestandteile wegzulassen oder zu ersetzen.
Aus Blutbestandteilen (beispielsweise Blutplättchen, Monocyten und Lymphocyten) freigesetzte Stoffe können als eine Quelle zellproliferierender Aktivitäten dienen und können weitere oben erwähnte Bestandteile bereitstellen. Die aus Blutbestandteilen (beispielsweise Blutplättchen, Monocyten oder Lymphocyten) freigesetzten Stoffe, insbesondere homologen oder autologen Ursprungs, können als eine Quelle zellproliferierender Aktivitäten dienen und können weitere oben erwähnte Bestandteile bereitstellen oder können auch zusätzliche Bestandteile bereitstellen. Die Blutbestandteile sollten dem Kulturmedium in einer Konzentration von 0,1% bis 20%, bevorzugt 1% bis 5%, beigegeben werden, nachdem die freigesetzten Stoffe auf das gleiche Endvo lumen gebracht wurden wie das Blut, aus dem diese Bestandteile gewonnen wurden. Diese freigesetzten Stoffe enthalten verschiedene Wachstumsfaktoren, die in dem Serum vorhanden sind (beispielsweise PDGF, ECF oder TGFs). Allerdings enthalten Serum sowie freigesetzte Stoffe viele Substanzen, und nicht alle sind charakterisiert.
Aus Blutplättchen freigesetzte Stoffe können durch Zentrifugieren von antikoaguliertem Vollblut, vorzugsweise menschlichem Blut, gewonnen werden, um alle Zellen außer Thrombozyten zu pelletisieren. Der Überstand kann noch einmal zentrifugiert werden, um die Thrombozyten auszuschleudern. Die Thrombozyten können in einem geeigneten Puffer suspendiert werden, beispielsweise einem Phosphatpuffer, und mit Thrombin behandelt werden, um ihre Alphakörner freizusetzen, die ein Gemisch aus verschiedenen Wachstumsfaktoren enthalten (beispielsweise PDGF, PF-4, TGF-β, EGE, β-Thromboglobulin). In einem weiteren Zentrifugierschritt kann alles Zellmaterial entfernt werden. Abschließend kann der Überstand mit Puffer auf das Volumen der ursprünglichen Blutprobe aufgefüllt werden, aus der die Bestandteile gewonnen wurden. Die Blutbestandteile sollten dem Kulturmedium in einer Konzentration von 0,1% bis 20%, bevorzugt 1% bis 10% und besonders bevorzugt von 2 bis 5% beigegeben werden.
In ähnlicher Weise können freigesetzte Stoffe auch aus anderen Blutzellen, wie beispielsweise Monocyten, durch Aufbrechen der Zellen (beispielsweise durch Beschallung, ein Gefrier-und-Auftau-Verfahren oder dergleichen) und Reinigen der Wachstumsfaktoren (beispielsweise durch Filtration oder immunologische Verfahren) gewonnen werden.
Die aus den Blutbestandteilen freigesetzten Stoffe können auch zum Konditionieren des Wundbettes im Verlauf des Transplantierens der epidermalen oder der malen Äquivalente verwendet werden. Des Weiteren kann das Kulturmedium, das die freigesetzten Stoffe enthält und zur Durchführung des organotypischen Kultivierungsschrittes verwendet wird, nach der Konditionierung durch die Zellen zum Konditionieren des Bettes des Hautdefekts im Verlauf des Transplantierens der epidermalen oder dermalen Äquivalente verwendet werden.
Die Kultivierung erfolgt gewöhnlich in Einsätzen mit mikroporösen Membranen, die homologe oder autologe menschliche Dermalfibroplasten (MDF), insbesondere postmitotische MDF, an ihrer Unterseite enthalten. MDF sekretieren Faktoren, die das Medium konditionieren, um ein besseres Wachstum des epidermalen Äquivalents zu erreichen. Die MDF-Schicht kann aus zwischen 5 × 10³ bis 1 × 10⁵ Zellen/cm², bevorzugt etwa 1 × 10⁴ bis 5 × 10⁴ Zellen/cm², gebildet werden. Die MDF sind vorzugsweise postmitotisch, aber es können auch frühere Passagezellen verwendet werden, wenn sie bestrahlt sind, mit Mitomyzin-C behandelt sind oder auf sonstige Weise behandelt sind, um ihre Proliferation zu hemmen, aber ihren Metabolismus aufrecht zu erhalten, d.h. durch Verringern der Serumkonzentration.
Bei einer Ausführungsform übersteigt die Transplantatdicke für die komplexen dermalen ("komplexen Haut-") Äquivalente nicht 0,4 mm.
Mikroporöse Membranen eignen sich als Kultursubstrat, weil die das Diffundieren von Substanzen von einer Seite zur anderen gestatten, aber als eine Sperre für Zellen fungieren. Die Porengröße der Membran stellt keine Beschränkung für die vorliegende Erfindung dar, sondern sollte angemessen sein, um die Diffusion von Proteinen mit einem Molekulargewicht von bis zu 100.000 Dalton und bevorzugt bis zu 70.000 Dalton zu gestatten. Die Membran sollte wenigstens die Diffusion von kleinen Hormonen wie beispielsweise Insulin gestatten und das Passieren von Proteinen mit einem Molekulargewicht von bis zu 15.000 Dalton gestatten. Andere Mittel als eine mikroporöse Membran zum Durchführen der Funktion des Gestattens einer Diffusion von löslichen Faktoren zu den kultivierten ÄWS-Zellen bei gleichzeitigem Verhindern eines Vermischens der ÄWS-Zellen mit den MDF kommen ebenfalls in Frage.
Es werden gewöhnlich die mikroporösen Membranen verwendet, die auf diesem Gebiet typisch sind. Es können jedoch auch Membranen verwendet werden, die aus einem biologisch abbaubaren Material hergestellt sind (beispielsweise Polyhyaluronsäure oder Polymilchsäure). Wenn eine biologisch abbaubare mikroporöse Membran verwendet wird, so wird in Betracht gezogen, daß die gesamte Kultur, einschließlich der differenzierten ÄWS-Zellen, der mikroporösen Membran und der MDF, in den Hautdefekt transplantiert wird. Somit brauchen bei dieser alternativen Ausführungsform die MDF, die an der Unterseite der Membran gezüchtet wurden, nicht postmitotisch oder behandelt zu sein, um eine Proliferation zu verhindern. Zwar neigen MDF dazu, weniger immunogen zu sein als Keratinozyten, doch es ist bevorzugt, daß, wenn diese Ausführungsform verwendet wird, die MDF allogenische Zellen, vorzugsweise autologe Zellen, sind.
Bei einer Ausführungsform kann die Dicke von Maschentransplantat zwischen 30 und 300 Mikron liegen. Bevorzugt liegt die Dicke des Maschentransplantats im Bereich von 0,5 bis 0,75 mm. Ein Gewebetransplantat (beispielsweise dermales Collagen zuzüglich Fibroplasten, über denen Keratinozytengewebe liegt), das zu dick ist, kann zu einem zu schnellen ischämischen Zelltod führen, insbesondere bei der Keratinozytschicht, die sich über der Dermalfibroplast-Collagen-Schicht befindet. Im Gegensatz dazu kann dieses Maschentransplantat von der Wundstelle angenommen werden. Die epidermalen Äquivalente der vorliegenden Erfindung können in ihrer Größe zwischen etwa 6 mm und etwa 2,5 cm Durchmesser liegen, mit einem bevorzugten Durchmes ser von 2,5 cm. Aus praktischen Gründen wurden die im vorliegenden Text offenbarten Experimente mit epidermalen Äquivalenten von ungefähr 2,5 cm Durchmesser ausgeführt.
Bei einer Ausführungsform beträgt der bevorzugte Bereich für epidermale Äquivalente 50–150 Mikron. Bei einer speziellen Ausführungsform sind die epidermalen Äquivalente sehr dünn (dünner, als sie im allgemeinen auf diesem Gebiet verwendet werden, beispielsweise 60 Mikron). Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß ein zu dickes autologes Transplantat das Ausbilden einer richtigen Blutversorgung verhindert, so daß die Epidermis von der Wundstelle nicht angenommen wird. Im Gegensatz dazu können die epidermalen Äquivalente der Erfindung von der Wundstelle angenommen werden.
In vielen Fällen müssen die Haut- oder epidermalen Äquivalente jedoch von der Einrichtung, wo sie hergestellt werden, zu der Institution gebracht werden, wo sie verwendet werden. Darum wird ein System benötigt, um den Transport der Haut- oder epidermalen Äquivalente, die in einem transplantierungsbereiten Zustand gehalten wurden, zu ermöglichen. Unabhängig davon, ob die mikroporöse Membran von der basalen Zellschicht vor dem Transport abgelöst wird, scheinen Bedingungen, die denen während der Kultivierung ähneln, günstig zu sein. Um die Haut- oder epidermalen Äquivalente nur von der Basalschicht aus in Kontakt mit dem Medium zu halten (d.h. während der Kultivierung), kann Agarose in einer Konzentration im Bereich von 0,1% bis 5%, bevorzugt in einer Konzentration von 0,5% bis 1%, oder Methylcellulose oder eine sonstige andere gelierende Substanz in vergleichbaren Konzentrationen zum Verfestigen des Transportmediums verwendet werden. Die Haut- oder epidermalen Äquivalente können mit ihrer Basalschicht nach unten auf die Membran eines Einsatzes gelegt werden, der zuvor auf dem verfestigten oder gelierten Medium eingebettet wurde. Die Mehrmuldenschale, die diese Ein sätze enthält, kann dann in eine Blisterpackung gelegt werden, die mit einer Tyvek-Hülle verschlossen wird, und kann versandt werden. Die Haut- oder epidermalen Äquivalente werden ganz besonders bevorzugt innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach dem ursprünglichen Verpacken zum Transplantieren verwendet.
Um die Stabilität der epidermalen Äquivalente zu verbessern, wurde die Technik entwickelt, eine Trägermembran auf die epidermalen Äquivalente, d.h. auf den verhornten Aspekt der epidermalen Äquivalente, zu legen und schließlich daran anzuhaften. Als Klebstoff ist Fibrinkleber bevorzugt, aber es kommen auch andere Optionen in Frage, einschließlich beispielsweise extrazelluläre Matrixkomponenten wie beispielsweise Collagen, Fibronektin, Proteoglycans (beispielsweise Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und dergleichen) oder Basalmembranzonenkomponenten (beispielsweise Laminin, Matrigel^TM oder L-polylysin) oder ähnliche Gewebekleber.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Träger können aus einer synthetischen Membran bestehen, die aus einem oder mehreren der folgenden Materialien hergestellt ist: Polyester, PTFE oder Polyurethan; aus einem oder mehreren biologisch abbaubaren Polymeren, beispielsweise Hyaluronsäure, Polymilchsäure oder Collagen; oder einem Silikon oder einem Vaselinegazeverband oder einem sonstigen Material, das als Wundverband geeignet ist. Diese Materialien, die sich als Wundverband eignen, ermöglichen es dem Träger, an seinem Platz zu bleiben, um die implantierten dermalen oder epidermalen Äquivalente mehrere Tage lang zu immobilisieren, anstatt den Träger unmittelbar nach der Transplantation der dermalen oder epidermalen Äquivalente entfernen zu müssen. Somit verbessert der Träger nicht nur die Stabilität und die Handhabung, sondern er dient gleichzeitig als Überzug zum Schutz vor physischer Beschädigung sowie des proteolytischen Milieus und der Bakterien in der Wunde. Darüber hinaus dient er der Ausrichtung des Transplantats (d.h. die basale Seite nach unten und die verhornte Seite nach oben).
Die auf den Träger gelegten Haut- oder epidermalen Äquivalente müssen in einem transplantationsbereiten Zustand gehalten werden. Unabhängig davon, ob die mikroporöse Membran von der basalen Zellschicht vor dem Transport abgelöst wird, scheinen Bedingungen, die denen während der Kultivierung ähneln, günstig zu sein. Um die Haut- oder epidermalen Äquivalente nur von der Basalschicht aus in Kontakt mit dem Medium zu halten (d.h. während der Kultivierung), kann Agarose in einer Konzentration im Bereich von 1% bis 5%, bevorzugt in einer Konzentration von 1% bis 3%, Methylcellulose oder eine sonstige andere gelierende Substanz in vergleichbaren Konzentrationen zum Verfestigen des Mediums verwendet werden. Die epidermalen Äquivalente können zusammen mit dem Träger mit ihrer Basalschicht auf das verfestigte oder gelierte Medium gelegt werden. Die gesamte Vorrichtung wird dann luftdicht verschlossen und versandt. Die epidermalen Äquivalente werden ganz besonders bevorzugt innerhalb von 24 Stunden nach dem ursprünglichen Verpacken zum Transplantieren verwendet.
Die Haut- oder epidermalen Äquivalente werden transplantiert, indem man sie einfach in das Bett der Wunde oder eines sonstigen Hautdefekts legt. Die Haut- oder epidermalen Äquivalente werden dann vorzugsweise immobilisiert (die Patienten werden für 2 Stunden immobilisiert). Das bevorzugte Verfahren zur Immobilisierung ist mittels Verwendung eines biologisch abbaubaren Materials, mittels einer Art von Gewebekleber oder einer entsprechenden Bandage. Wie zuvor beschrieben, kann das Bett des Hautdefekts mit aus Blut freigesetzten Stoffen oder dem Medium aus der organotypischen Kultivierung vor oder gleichzeitig mit der Transplantation behandelt werden.
Bei der Arbeit unter Verwendung verkapselter Zellenapparaturen (100-Mikron-Membran, 200–250 Mikron bis zur Mitte der Hohlfaser) wurde ein gutes Überleben menschlicher dermaler Fibroplasten bei 300 Mikron Abstand zum nächstgelegenen Blutgefäß erreicht.
Beispiel 1
Präparierung von ÄWS-Zellen
Keratinozyten-Vorläuferzellen aus der äußeren Wurzelscheide (ÄWS) der Haarfollikel werden nach dem folgenden Verfahren ausgewählt und anschließend kultiviert.
Ungefähr 40 Haarfollikel wurden mit einer Pinzette aus der Hinterhaupthaut von Individuen ausgerupft, und jene in der anagenen Phase – was zum Beispiel anhand gut-entwickelter Wurzelscheiden festgestellt wurde – wurden dann unter dem Seziermikroskop ausgewählt (siehe beispielsweise Limat und Noser, 87 J. Invest. Dermatol. 485–488 (1986); Limat und Mitarbeiter, 92 J. Invest. Dermatol. 758–762 (1989)). Das anagene Haar wurde direkt auf den mikroporösen Kultureinsatz gelegt, ohne die bisher angewendete Mikrosezierung zum Entfernen der Haarzwiebeln und des infundibulären Haarschaftes auszuführen.
Im allgemeinen wurden sechs anagene Haare auf die mikroporöse Membran eines Zellkultureinsatzes (Costar) explantiert, der an seiner Unterseite eine vorgebildete Feederschicht trug, die vorzugsweise aus 20 × 10³ postmitotischen menschlichen Dermalfibroplasten (MDF) je cm² bestand (siehe beispielsweise Limat und Mitarbeiter, 92 J. Invest. Dermatol. 758–762 (1989)). Die MDFs wurden aus Hautexplantaten eines gesunden, wiederholt HIV-Serologie-negativen und Hepatitis-Serologie-negativen Individuums gewonnen und in DMEM kultiviert, das mit weniger als 5% menschlichem Serum, vorzugsweise 2% menschlichem Serum, supplementiert war.
Um ein effizientes Auskeimen der Zellen der äußeren Wurzelscheide (ÄWS-Zellen) aus dem anagenen Haar und eine hohe Proliferationsrate zu erhalten, ist es wichtig, die MDF-Feederzellen nicht am Boden der Kulturschale anzuordnen, was zu einer weiteren Mediumschicht zwischen der MDF-Schicht und der mikroporösen Membran führt, die die ÄWS-Zellen trägt. Das Züchten jedes Zelltyps auf einer Seite der mikroporösen Membran gestattet eine sehr enge Wechselwirkung, aber verhindert eine Kreuzkontaminierung der ÄWS-Zellen mit Fibroplasten und garantiert somit eine Reinkultur aus ÄWS-Zellen.
Das verwendete Kulturmedium bestand aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/F12 (Volumen-in-Volumen-Verhältnis 3 : 1), supplementiert mit 2% menschlichem Serum, 10 ng epidermalem Wachstumsfaktor je ml Kulturmedium, 0,4 Mikrogramm Hydrocortison je ml, 0,135 mM Adenin und 2 nM Triiodthyronin (alle bei der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, bezogen). Die bevorzugte abschließende Ca²⁺-Konzentration des Kulturmediums beträgt 1,5 mM (siehe zum Beispiel Wu und Mitarbeiter, 31 Cell 693–703 (1982); Limat und Noser, 87 J. Invest. Dermatol. 485–488 (1986)). Innerhalb von etwa 2 Wochen waren die ÄWS-Zellen expandiert und hatten Konfluenz erreicht. Sie wurden mit einem Gemisch aus 0,1% Trypsin und 0,02% EDTA dissoziiert, auf Lebensfähigkeit geprüft und zur Herstellung epidermaler Äquivalente verwendet. Es ist anzumerken, daß, obgleich ursprüngliche Kulturen unter Verwendung von 10%-igem Kalbsfötenserum (FCS; Boehringer Mannheim, Deutschland) ausgeführt worden waren, die derzeitige Verwendung von menschlichem Serum zum Zweck der Verringerung der Anzahl allogenischer Bestandteile zu einer überlegenen Keimung und Proliferierung der ÄWS-Zellen führt. Das menschliche Serum wird in einer Konzentration von weniger als 5%, vorzugsweise in einer Konzentration von 2%, verwendet.
Das Explantieren ausgerupfter anagener Haare direkt auf die Membran von Kultureinsätzen, die postmitotische MDF an der Unterseite als Feederzellen tragen, erwies sich als ein einfaches, effizientes und reproduzierbares Verfahren zum Herstellen von Primärkulturen aus ÄWS-Zellen. Ungefähr 80% der explantierten Haarfollikel riefen ein Auskeimen von ÄWS-Zellen hervor, selbst wenn sie von Individuen mit einem Alter von über 90 Jahren gewonnen wurden. Nach 14 Tagen waren weite Bereiche des Einsatzes mit vollständig angeordneten kleinen Zellen bedeckt, woraufhin sie zur Herstellung von epidermalen Äquivalenten der vorliegenden Erfindung verwendet wurden.
Der Vergleich des Wachstumsverhaltens von 70 ÄWS-Zellstämmen, die von insgesamt 30 Spendern erhalten wurden, zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den jungen Spendern (d.h. 21 Spender zwischen 19 und 50 Jahren) und alten Spendern (d.h. 9 Spender zwischen 51 und 93 Jahren). Es wurden im allgemeinen etwa 5 × 10⁵ Zellen je explantiertem Follikel gewonnen, und der Gesamtgrad der Lebensfähigkeit der Zellen lag in der Regel über 95%. Im Gegensatz dazu kam es beim Fehlen von postmitotischer MDF als Feederschicht nur zu einem sporadischen Auskeimen von ÄWS-Zellen aus den explantierten Follikeln.
Beispiel 2
Herstellung von epidermalen Äquivalenten
ÄWS-Zellen, die von Primärkulturen geerntet wurden, wurden in einer Dichte von 30 × 10³ Zellen/cm² bis 100 × 10³ Zellen/cm², bevorzugt 60 × 10³ Zellen/cm², auf Zellkultureinsätzen (Costar) ausgesät, die zuvor mit 10 × 10³ Zellen/cm² bis 50 × 10³ Zellen/cm², bevorzugt 20 × 10³ Zellen/cm², postmitotischer MDF-Zellen auf der Unterseite ihrer mikroporösen Membran geimpft worden waren. Ähnlich wie bei der Kultur von ÄWS-Zellen ist es wichtig, die MDF-Feederzellen in unmittelbarer Nähe zu den ÄWS-Zellen zu halten, während sie gleichzeitig mittels der mikroporösen Membran voneinander getrennt gehalten werden. Diese Kulturtechnik verbessert die Proliferation, die Differenzierung und somit die Homöostase des sich entwickelnden Gewebes.
Das Kulturmedium war mit dem identisch, das zur Herstellung der Primärkulturen verwendet wurde, wie oben beschrieben. Nach 72 Stunden wurden die ÄWS-Zellen mit Luft in Kontakt gebracht, indem das flüssige Medium im Inneren des Einsatzes abgesaugt wurde (d.h. so daß die Unterseite des Einsatzes in Kontakt mit dem Medium kam), und weitere 12–14 Tage kultiviert, wobei dreimal in der Woche das Medium gewechselt wurde. Alternativ kann aufschwimmendes Kulturserum nach einer Woche vollständig weggelassen werden.
Für die Transplantation verlangt die bisher befolgte Verfahrensvorschrift, die allgemein für die Präparierung des vollständig differenzierten epidermalen Äquivalents für Wundtransplantationen Anwendung findet, vom Arzt, den gesamten Umfangsrand des Kulteinsatzes sorgfältig mit einem Skalpell einzuschneiden, um das Ablösen der Einsatzmembran (mit darunter aufbeschichteten menschlichen Dermalfibroplasten) zu vereinfachen, wobei die Schuppenseite des anhaftenden Hautlappens nach oben weist. Der Hautlappen wird dann durch Abziehen mit einer feinen Pinzette von dieser Membran abgelöst und mit der Basalseite nach oben auf eine neue Membranscheibe in einer Kulturschale gelegt, um ihn abschließend zu dem Patienten zu transportieren. Diese oben beschriebene Vorgehensweise ist ebenso mühselig wie zeitaufwändig und kann zu einer Umkehrung der basalen und der schuppigen Ausrichtung führen.
Es ist ein entschieden einfacheres Verfahren, bei dem eine Trägermembranlappendeckschicht verwendet wird, entwickelt worden, bei dem eine Membranlappendeckschicht (analog dem weiter unten beschriebenen Fi brinkleberlappenverfahren) verwendet wird, die direkt auf die Schuppenoberflächenschicht gelegt wird. Die Membrandeckschicht kann dann mühelos zusammen mit dem darunterliegenden Hautlappen mit Hilfe einer feinen Pinzette ergriffen und von der Kultureinsatzmuldenoberfläche abgelöst werden und beispielsweise nach der Inkubation in verdünnter Dispaselösung von der Kultureinsatzmembran abgelöst werden. Die Membran kann dann als eine Platte zum Anordnen des Transplantats auf der Wunde dienen, ohne daß die Ausrichtung des Transplantats vertauscht wird (d.h. die basale Seite nach unten und die schuppige Seite nach oben).
Zum Stabilisieren und als eine Schutzbeschichtung im Fall des Transplantierens können die epidermalen Äquivalente der vorliegenden Erfindung auf der Oberseite mit verdünntem Fibrinkleber beschichtet werden, der auch dazu dient, die Oberseite (d.h. die verhornte Seite) eindeutig zu kennzeichnen. Fibrinkleber, die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist ein allgemein akzeptiertes natürliches Humanprodukt, das weithin als Gewebekleber verwendet wird. Durch Auftragen einer dünnen Schicht Fibrinkleber (der mit bloßem Auge klar zu erkennen ist) auf die verhornte, schuppige, mit der Luft in Kontakt stehende Oberfläche des epidermalen Äquivalents kann der Arzt, der das epidermale Äquivalent auf die Wundstelle legt, vollkommen sicher sein, daß das Transplantat richtig herum ausgerichtet ist (d.h. die basale Fläche des Hautlappens ist immer die Seite, auf der sich nicht die deutlich sichtbare Fibrinkleberdeckschicht befindet). Bisher kam es in vielen Fällen während der Präparation des Epidermallappens zur Wundtransplantation zu einem Vertauschen der Ausrichtung des Lappens. Wenn der Hautlappen mit der Schuppenseite nach unten auf die Transplantationsstelle gelegt wird, so besteht eine deutlich verringerte Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Transplantation. Die Verwendung dieser einfachen "Markierung" räumt dieses Problem vollständig aus.
Überdies können dem Fibrinkleber noch antimikrobielle und/oder antifungale Substanzen beigegeben werden, um einer möglichen mikrobiellen Kontaminierung oder einem Überwachsen des Transplantats entgegenzuwirken. Viele chronische Läsionen sind chronisch infiziert, was dazu führen kann, daß die Annahme des Transplantats und die anschließende Wundheilung im Anschluß an die ursprüngliche Hauttransplantation gehemmt wird. Des Weiteren kann die Beigabe eines oder mehrerer antibiotischer oder antifungaler Wirkstoffe durch direkte Emulgierung in der Fibrinkleberoberflächendeckschicht zu einer deutlichen Verbesserung bei der Abgabe ausreichender Mengen mikrobieller Wirkstoffe zur Transplantationsstelle führen.
Es ist zu beachten, daß die ÄWS-Zellen, die von Primärkulturen geerntet wurden und an der Grenzfläche von Luft und Flüssigkeit auf Einsatzmembranen kultiviert wurden, die die an ihrer Unterseite postmitotische MDF trugen, in der Regel innerhalb von 14 Tagen ein Schichtepithel entwickelten. Dieses Schichtepithel bestand aus einer Basalschicht kleiner Würfelzellen unter einem dicken suprabasalen Kompartiment aus schrittweise abgeflachten Zellen. Das Vorhandensein einer hervorstehenden Körnerschicht sowie einer orthokeratotischen Hornschicht wurde ebenfalls festgestellt.
Auf der Grundlage des experimentellen Befundes, wonach etwa 80% der Follikel ein Auskeimen von ÄWS-Zellen hervorrufen, wurden etwa fünf anagene Haarfollikel zur Herstellung eines Quadratzentimeters epidermaler Äquivalente benötigt. Der Zeitraum zur Herstellung transplantierbarer epidermaler Äquivalente betrug in der Regel insgesamt vier Wochen (d.h. zwei Wochen für die Primärkultur und zwei Wochen für die anschließende organotypische Kultur).
Beispiel 3
Stabilisierung
Vor der Auslieferung werden die epidermalen Äquivalente auf der Oberseite beschichtet, indem eine Silikonmembran mit einem geeigneten Durchmesser auf den verhornten oberen Aspekt der Kulturen gelegt wird. Um die Stabilität weiter zu verbessern, beispielsweise im Fall von dünnen und/oder großflächigen epidermalen Äquivalenten, kann zuvor eine dünne Schicht Gewebekleber, zum Beispiel Fibrinkleber, aufgetragen werden.
Ein Beschichten der Oberseite (1) verbessert die Stabilität und die Handhabung der Transplantate und (2) dient als Überzug zum Schutz vor physischer Beschädigung sowie des proteolytischen Milieus und der Bakterien in der Wunde.
Beispiel 4
Versand
Auf der Oberseite beschichtete epidermale Äquivalente werden von den Kultureinsatzmembranen durch Inkubation in verdünnter Dispase und anschließendes Ergreifen der epidermalen Äquivalente zusammen mit der Silikonmembran mittels einer feinen Pinzette abgelöst und auf die Membran eines Einsatzes übertragen, der zuvor in 0,7%-iger Agarose eingebettet und mit Kulturmedium in der Mulde einer Mehrmuldenschale getränkt wurde. Diese Schalen werden dann in den Versandbehälter eingebracht. Zum Aufbringen auf das Wundbett werden die epidermalen Äquivalente erneut zusammen mit der Silikonmembran ergriffen, was (1) der Ausrichtung des Transplantats dient (d.h. die basale Seite nach unten und die verhornte Seite nach oben) und (2) – indem sie auf den transplantierten epidermalen Äquivalenten verbleibt – als ein Schutzüberzug fungiert (siehe oben).
Beispiel 5
Erfolgreiche Behandlung chronischer Beingeschwüre mit epidermalen Äquivalenten, die aus kultivierten autologen Zellen der äußeren Wurzelscheide gewonnen wurden
Die Zellen der äußeren Wurzelscheide von Haarfollikeln können an die Stelle interfollikulärer epidermaler Keratinozyten treten, wie während des Heilens von Hautwunden, wenn diese Zellen auf die denudierte Fläche migrieren und zur epidermalen Regeneration beitragen (Limat und Mitarbeiter, 107(1) J. Invest. Dermatol. 128–35 (1996), durch Bezugnahme aufgenommen). Unter Verwendung der verbesserten erfindungsgemäßen Kultivierungstechniken gewannen wir epidermale Äquivalente aus kultivierten Zellen der äußeren Wurzelscheide von Patienten, die an persistierenden chronischen Beingeschwüren, überwiegend vaskulären Ursprungs, litten. Bei diesen epidermalen Äquivalenten waren die Gewebeorganisation sowie die Immunlokalisation von epidermalen Differenzierungsprodukten (Keratin 10, Involucrin, Filaggrin) und Integrinen nicht von normaler Epidermis zu unterscheiden. Gemäß Bestimmung anhand der Anzahl der Bromdeoxyuridin-haltigen Zellen enthielt die Basalschicht ein großes Kompartiment an proliferativen Zellen, und zwar unabhängig vom Alter der Spender. Eine FACS-Analayse der Zellen der äußeren Wurzelscheide, die zur Herstellung der epidermalen Äquivalente verwendet wurden, offenbarte eine Teilmenge kleiner Zellen mit verstärkter Exprimierung von β₁-Integrin, einem potenziellen Stammzellenmarker. Im Gegensatz zu akuten Wunden wurde bei chronischen Wunden bis jetzt noch keine größere definitive Annahme transplantierter kultivierter autologer Keratinozyten überzeugend nachgewiesen. Das Transplantieren epidermaler Äquivalente, die in vitro aus autologen Zellen der äußeren Wurzelscheide hergestellt wurden, auf 11 Geschwüre bei fünf Patienten führte zu einer Rate der definitiven Annahme von etwa 80%, wobei anschließend innerhalb von 2 bis 3 Wochen fünf von sieben Geschwüren, auf die dicht-angeordnete Kulturen transplantiert wurden, vollständig heilten. Diese Verbesserung bei der Behandlung chronischer Beingeschwüre mit kultivierten autologen Keratinozyten hängt wahrscheinlich von dem großen Kompartiment proliferativer Zellen sowie von einer gut-entwickelten Hornschicht ab, die ein Ablösen der Transplantate verhindert. Die praktischen Vorteile der neuen Technik sind ihre Nicht-Invasivität, das Nichtvorhandensein der Notwendigkeit chirurgischer Einrichtungen oder Anästhesie und ein kurzer Immobilisierungszeitraum im Anschluß an die Transplantation.
Autologe epidermale Äquivalente werden erfolgreich auf chronische Beingeschwüre transplantiert. Es wurden insgesamt 11 Geschwüre behandelt, davon sieben durch Bedecken von etwa 90% der Geschwüroberfläche mit dicht-angeordneten Kulturen und vier durch Einbringen von isolierten Kulturen in die zentralen Teile. Beim ersten Verbandswechsel 3 Tage nach der Transplantation waren bei beiden Behandlungsarten etwa 80% der Transplantate sichtbar und hafteten am Wundbett an. Innerhalb der folgenden 2 bis 3 Wochen konsolidierten die Transplantate in fünf der sieben dicht transplantierten Geschwüre, was zu einer vollständigen Epithel-Neubildung und Heilung führte. Bei den zwei übrigen, chronisch infizierten (Pseudomonas-) Geschwüren wurden die Transplantate zum Teil zerstört, was zu einer um 4 bis 5 Wochen verzögerten Heilung führte. Bei den Geschwüren, die mit isolierten Transplantaten behandelt wurden, gab es eine beschleunigte Bildung von Granulationsgewebe und Epithel-Neubildung überwiegend von den Wundrändern her, im Vergleich zu den Geschwüren am selben Bein, die nur mit den Verbänden behandelt wurden. Bei dieser Behandlungsart wurde eine dauerhafte Annahme mit anschließender Expansion der Transplantate mit dem Ergebnis einer vollständigen Epithel-Neubildung lediglich für ein einziges Geschwür dokumentiert, das mit größeren Epithellagen mit einem Durchmesser von 8 mm behandelt wurde. Die Kontrollgeschwüre bei den vier Patienten mit mehr als zwei Geschwüren am selben Bein hatten sich nach 3 Wochen nur leicht gebessert, woraufhin sie entweder mit weiteren Transplantierungen von autologen epidermalen Äquivalenten oder mit konventioneller Chirurgie behandelt wurden.
Nach der Epithel-Neubildung war die Epidermis zu Beginn immer noch fragil, mit einer gewissen Neigung zur Blasenbildung nach kleinem Friktionstrauma, was gelegentlich kleine Erosionen zur Folge hatte. Diese Erosionen re-epithelisierten rasch bei konventioneller topischer Behandlung. Die ersten Patienten wurden inzwischen 6 Monate lang beobachtet und zeigen eine zunehmende Stabilisierung der behandelten Bereiche und bisher keine Wiederkehr der Geschwüre.
Aus der obigen detaillierten Beschreibung der konkreten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dürfte klar hervorgehen, daß eine einzigartige Verfahrensweise für die Auswahl und Kultivierung von Keratinozyten aus der äußeren Wurzelscheide (ÄWS) von Haarfollikeln zur anschließenden Verwendung beispielsweise in Hauttransplantationen beschrieben wurde. Obgleich im vorliegenden Text konkrete Ausführungsformen eingehend offenbart wurden, geschah dies lediglich beispielhaft zu Veranschaulichungszwecken, und es besteht nicht die Absicht, damit den Geltungsbereich der angehängten folgenden Ansprüche einzuschränken.
In-vitro-ÄWS-Zellen differenzieren zu epidermalen Äquivalenten, die normaler Epidermis ähneln. Das Explantieren ausgerupfter anagener Haarfollikel direkt auf die Membran von Kultureinsätzen, die postmitotische Fibroplasten als Feederzellen an ihrer Unterseite tragen, erwies sich als ein einfacher, effizienter und reproduzierbarer Weg zum Herstellen von Primärkulturen aus ÄWS-Zellen. Etwa 80% der explantierten Haarfollikel riefen das Auskeimen von ÄWS-Zellen hervor, selbst wenn sie von Individuen stammten, die bis zu 91 Jahren alt waren. Nach 14 Tagen waren weite Bereiche des Ein satzes von kompakt angeordneten kleinen Zellen bedeckt, woraufhin sie für die Herstellung epidermaler Äquivalente benutzt wurden. Im Gegensatz dazu wiesen ÄWS-Zellen, die aus den trypsinbehandelten Follikeln stammten, eine weniger kompakte Anordnung mit zahlreichen Zellen auf, die größer waren. Der Vergleich des Wachstumsverhaltens von 70 ÄWS-Zellstämmen, die von 30 Spendern erhalten wurden, zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen jungen Spendern (21 Spender zwischen 19 und 50 Jahren) und alten Spendern (9 Spender zwischen 51 und 93 Jahren), weil in der Regel etwa 0,5 × 10⁶ Zellen je explantiertem Follikel gewonnen wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen lag bei über 95%. Beim Fehlen von postmitotischen Fibroplasten fand nur ein sporadisches Auskeimen von ÄWS-Zellen statt.
Weil eine logarithmische lineare Beziehung zwischen dem relativen Niveau von β₁-Integrin auf der Zellenoberfläche und dem Proliferationsvermögen von Keratinozyten postuliert wurde, verglichen wir die Exprimierung von Integrinen in Primärkulturen aus ÄWS-Zellen, die mittels der beiden unterschiedlichen Techniken hergestellt wurden, d.h. ÄWS-Zellen aus explantierten Follikeln oder aus trypsinbehandelten Follikeln. Es wurden mittels der beiden Techniken gewonnene ÄWS-Zellen von vier verschiedenen Spendern mittels Durchflußcytometrie analysiert. Auf der Grundlage ihrer Lichtstreuungseigenschaften konnten die Zellen in zwei Gruppen unterteilt werden: Gruppe A mit einer deutlich geringeren Vorwärtsstreuung des Lichts, d.h. einer kleineren Zellengröße, und Gruppe B mit einer stärkeren Vorwärtsstreuung des Lichts und somit einer größeren Zellengröße. Bei den ÄWS-Zellen, die aus explantierten Follikeln gewonnen wurden, machte die Gruppe A etwa 4% und die Gruppe B 72% der Zellen-Gesamtzahl aus, während Werte von 2,6% bzw. 75% bei den ÄWS-Zellen festgestellt wurden, die aus trypsinbehandelten Follikeln gewonnen wurden (Mittelwerte für vier separate Experimente). In der Gruppe A waren der prozentuale Anteil von Zellen, die eine Färbung für β₁-β₄-Integrine anzeigten, sowie die mittlere Fluoreszenz je Zelle der β₁-Integrine – und zu einem geringeren Grad auch der α₂-, α₃- und α_V-Integrine – in den ÄWS-Zellen, die aus explantierten Follikeln gewonnen wurden, höher als bei den ÄWS-Zellen, die aus trypsinbehandelten Follikeln gewonnen wurden. In der Gruppe B wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Kulturtechniken festgestellt, weder beim Prozentsatz der Integrin-positiven Zellen noch bei der mittleren Fluoreszenz je Zelle.
Die ÄWS-Zellen, die aus Primärkulturen geerntet und auf Einsatzmembranen plattiert wurden, die postmitotische Fibroplasten an ihrer Unterseite trugen, entwickelten innerhalb von 14 Tagen ein Schichtepithel. Dies bestand aus einer Basalschicht aus kleinen Würfelzellen unter einem dicken suprabasalen Kompartiment aus schrittweise abgeflachten Zellen. Eine Körnerschicht und eine überwiegend orthokeratotische Hornschicht waren ebenfalls vorhanden.
Die Immunlokalisation von epidermalen Differenzierungsprodukten war mit derjenigen identisch, die man in normaler Epidermis findet. So fehlte das differenzierungsspezifische K10 in der Basalschicht, war aber suprabasal ab der zweiten Schicht stark exprimiert. Involucrin zeigte seine typische wabenförmige Struktur ab dem mittleren Stratum Spinosum, während die körnige Färbung von Filaggrin ein durchgängiges Band unterhalb der Hornschicht bildete. Wie in normaler Epidermis war die Reaktivität der α₂-, α₃- und β₁-Ketten der Integrine über sämtliche Aspekte der Plasmamembran der Basalzellen verteilt, wobei die Intensität mit fortschreitender Differenzierung abnahm.
BrdU-positive Zellen wurden überwiegend in der Basalschicht der epidermalen Äquivalente festgestellt und machten 24% der Basalzellen aus [597 ± 21 BrdU- positive Zellen für 2464 ± 115 Basalzellen (Mittel ± SD): n = 4].
Auf der Grundlage des Umstandes, daß 80% der Follikel ein Auskeimen von ÄWS-Zellen hervorriefen, wurden etwa fünf anagene Haarfollikel benötigt, um 1 cm² epidermaler Äquivalente herzustellen. Der Zeitraum zum Herstellen transplantierbarer epidermaler Äquivalente betrug in der Regel vier Wochen, d.h. 2 Wochen für die Primärkultur und 2 Wochen für die organotypische Kultur.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines für die anschließende Behandlung eines Hautdefekts geeigneten epidermalen oder komplexen Hautäquivalents, bei dem man: a) ein anagenes Haarfollikel zur Gewinnung von Zellen der äußeren Wurzelscheide kultiviert; b) die Zellen der äußeren Wurzelscheide zur Gewinnung von Keratinozyten-Vorläuferzellen kultiviert; und c) ein diese Keratinozyten-Vorläuferzellen enthaltendes epidermales oder komplexes Hautäquivalent herstellt; dadurch gekennzeichnet, daß das Haarfollikel intakt ist, die Keratinozyten-Vorläuferzellen in einer Dichte zwischen 3 × 10⁴ Zellen/cm² und 1 × 10⁵ Zellen/cm² gesät werden und die Kulturschritte (a) und (b) in einem Medium durchgeführt werden, das humanes Serum in einer Konzentration von weniger als etwa 5% enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Keratinozyten-Vorläuferzellen auswählt, indem man: d) die von der äußeren Wurzelscheide gewonnenen Keratinozyten-Vorläuferzellen einer Primärkultur unterzieht, indem man das intakte anagene Haar an eine mikroporöse Membran anheftet, wobei die Membran an ihrer unteren Oberfläche Feederzellen aufweist, deren Wachstum zum Stillstand gekommen ist/eingeschränkt ist, sodaß Keratinozyten-Vorläuferzellen aus der äußeren Haar-wurzelscheide ausgewählt werden; e) die aus den Primärkulturen geernteten äußeren Wurzelscheidenzellen organotypisch kultiviert, indem man eine mikroporöse Membran moduliert, die ebenfalls auf ihrer unteren Oberfläche Feederzellen aufweist, deren Wachstum zum Stillstand gekommen ist/eingeschränkt ist; und f) im Anschluß daran das für eine anschließende Verwendung als Transplantat bestimmte epidermale oder komplexe Hautäquivalent generiertindem man eine Trägermembran auf die organotypische Kultur aus Schritt (d) legt und das komplexe bzw. epidermale Hautäquivalent ablöst; wobei das Transplantat die Keratinozyten-Vorläuferzellen und die Trägermembran als eine einzelne laminare Einheit enthält, wobei die Keratinozyten-Vorläuferzellen auf der Trägermembran in eine Dichte zwischen 3 × 10⁴ Zellen/cm² und 1 × 10⁵ Zellen/cm² gesät sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das epidermale oder komplexe Hautäquivalent auf seiner Oberfläche oder verhornhauteten Seite mit einem Fibrinkleber beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Fibrinkleber darin emulgiert ein oder mehrere Mittel mit antimikrobieller Wirkung, Wirkung gegen Pilze oder antiviraler Wirkung enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei es sich bei den äußeren Wurzelscheidenzellen um homologe Zellen handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das epidermale oder komplexe Hautäquivalent äußere Wurzelscheidenzellen enthält, die in einem Medium kultiviert wurden, das ausschließlich homologe oder autologe biologische Zusätze enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das epidermale Äquivalent auf seiner Oberfläche oder seiner verhornhauteten Seite mit einer Trägermembran beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den äußeren Wurzelscheidenzellen um autologe Zellen handelt, die von einem Individuum erhalten wurden, das sich anschließend einer Behandlung wegen eines Hautdefekts unterzieht.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Kulturdichte der Feederzellen, deren Wachstum zum Stillstand gekommen ist/eingeschränkt ist, auf der mikroporösen Membran zwischen etwa 1 × 10⁴ Zellen/cm² und etwa 5 × 10⁴ Zellen/cm² liegt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei den Feederzellen, deren Wachstum zum Stillstand gekommen ist/eingeschränkt ist, um konservierte oder unsterblich gemachte Zellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das epidermale oder komplexe Hautäquivalent äußere Wurzelscheidenzellen enthält, die in einem Medium kultiviert wurden, das ausschließlich homologe oder autologe aus Blutkomponenten freigesetzte Stoffe enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das epidermale oder komplexe Hautäquivalent äußeren Wurzelscheidenzellen enthält, die in einem Medium kultiviert wurden, das ausschließlich, in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 20%, homologe oder autologe aus Blutkomponenten freigesetzte Stoffe enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mikroporöse Membran durch einen oder mehrere extrazelluläre Matrixsubstanzen ausgewählt aus Fibrin, Fibronektin, Collagenen, Lamininen und Hyaluronan beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mikroporöse Membran auf ihrer unteren Oberfläche ein System von Feederzellen, deren Wachstum zum Stillstand gekommen ist/eingeschränkt ist, aufweist, wobei die Feederzellen von wenigstens einem Zelltyp ausgewählt aus humanen dermalen Fibroplasten, epidermalen Zellen, mesenchymalen Zellen, neuronalen Zellen und Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Trägermembran aus einem oder mehreren Materialtypen ausgewählt aus Polyester, PTFE, Polyurethan, Hyaloronsäure, Polymilchsäure, Collagen und einem Silikon oder einem Vaselinegazeverband hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Größe des epidermalen bzw. komplexen Hautäquivalents ausgewählt ist aus einem Durchmesser von 1,0 cm, 1,5 cm, 2,0 cm und 2,5 cm.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man weiterhin das epidermale oder komplexe Hautäquivalent versendet bzw. transportiert, indem man: g) das epidermale bzw. komplexe Hautäquivalent aus dem Kulturmedium ablöst, h) das Äquivalent auf einen Träger transferiert und i) das epidermale Äquivalent und den Träger mit einem verfestigten oder gelierten Medium in Kontrakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Äquivalent auf seiner Oberfläche oder seiner verhornhauteten Seite mit einer Trägermembran beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Äquivalent weiterhin für eine zukünftige Verwendung beim Transplantieren versiegelt und versendet wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das verfestigte bzw. gelierte Medium ausgewählt ist aus Agarose, Methylcellulose und anderen gelierenden Substanzen.