ES2265953T3 - Cultivo mejorado de queratinocitos y su uso. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para preparar un equivalente epidérmico o de complejo de la piel apropiado para el tratamiento subsiguiente de un defecto de la piel, comprendiendo dicho procedimiento: (a) cultivar un folículo piloso anagénico para obtener células de la vaina externa de la raíz; (b) cultivar dichas células de la vaina externa de la raíz para obtener células precursoras queratinocíticas, y (c) preparar un equivalente epidérmico o complejo de la piel que comprende dichas células precursoras queratinocíticas; caracterizado porque dicho folículo piloso es intacto, dichas células precursoras queratinocíticas se siembran a una densidad de entre 3 x 104 células /cm2 y 1 x 105 células /cm2 y dichas etapas de cultivo (a) y (b) se llevan a cabo en un medio que contiene suero humano a una concentración menor que 5 % aproximadamente.

Description

Cultivo mejorado de queratinocitos y su uso.

La invención se refiere al campo del cultivo celular de células fibroblásticas dérmicas y precursoras de queratinocitos humanos, las cuales células precursoras de queratinocitos humanos pueden utilizarse en la reparación de defectos de la piel mediante procedimientos de implantación dérmica.

La cicatrización de los defectos dérmicos progresa a través de tres etapas generales: (i) inflamación, (ii) migración de las células de la herida y mitosis y (iii) producción de matriz extracelular y remodelación. Se cree que la secuencia ordenada de estos eventos está orquestada por la interacción entre células, factores de crecimiento, y proteínas de la matriz extracelular. Una etapa crucial de la cicatrización de las heridas de la piel es la regeneración epidérmica (es decir, la reepitelialización). Además, los queratinocitos epidérmicos interfoliculares de los bordes de la herida, las células de la vaina externa de la raiz (ORS) de los folículos pilosos residuales contribuyen también al proceso (véase por ejemplo Eisen et al, 15 J. Invest. Dermatol. 145-155 (1955). La vaina externa de la raiz (ORS) de los folículos pilosos se compone en su mayor parte de queratinocitos no diferenciados que abarcan las estructuras cilíndricas de la vaina interior endurecida de la raiz y el eje del pelo (véase por por ejemplo Montagna & Parakkal, en The Structure and Function of Skin 172-258 (Academic Press New York, NY, 1974)). Literatura reciente ha indicado también que las células ORS se encuentran a un nivel más inferior de responsabilidad para la diferenciación que los queratinocitos foliculares basales (véase por ejemplo Coulombe et al, 109 J.Cell Biol. 2295-2312 (1989); Limat et al., 194 Exp. Cell Res.218-227 (1991); Limat et al 275 Cell Tissue Res. 169-176 (1994)), habiéndose detectado en los animales, así como en la región ORS humana, cerca del área sobresaliente células que conservan el marcaje, que representan posiblemente células troncales para los tejidos epiteliales dérmicos (véase por ejemplo Cotsarelis et al., 61 Cell 1329-1337 (1990); Kobayashi et al, 90 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7391-7395 (1993); Yang et al., 105 J. Invest. Dermatol.14-21 (1993); Rochat et al., 76 Cell 1073-1076 (1994); Moll, 105 J. Invest. Dermatol 14-21 (1995). Además, las células ORS humanas que se aislan de los folículos pilosos del cuero cabelludo anágeno depilado pueden desarrollarse ampliamente in vitro (véase por ejemplo, Weterings et al., 104 Brit. J. Dermatol. 1-5 (1981); Limat & Noser, 87 J. Invest. Dermatol, 485-488 (1986); Imcke et al., 17 J. Am. Acad. Dermatol. 779-786 (1987); Limat et al, 92 J. Invest. Dermatol. 758-762 (1989). Bajo condiciones de cultivo de inmersión convencionales, las células ORS se parecen a queratinocitos epidérmicos interfoliculares tanto por criterios morfológicos como bioquímicos (por ejemplo, perfiles queratínicos (véase por ejemplo, Stark et al., 35 Differentiation 236-248 (1987); Limat et al, 92 J. Invest. Dermatol 758-762 (1989); Limat et al., 642 Ann. NY Acad. Sci. 125-147 (1991). En co-cultivos organotípicos con fibroblastos dérmicos humanos (esto es, bajo condiciones que imitan el entorno epidérmico), las células ORS desarrollan, respecto a criterios histológicos, inmunohistológicos, ultraestructurales y bioquímicos, un epitelio estratificado que recuerda a la epidermis regeneradora (véase por ejemplo Lenoir et al., 130-Dev. Biol. 610-620 (1988); Limat et al., 194 Exp. Cell Res. 218-227 (1991); Limat et al. 642 Ann. N.Y. Acad. Sci. 125-147 (1991). Si dichos cultivos organotípicos se trasplantan a ratones desnudos, las células ORS forman una neo-epidermis regular que está bajo control homeostático (véase por ejemplo Limat et al., 59 Transplantation 1032-1038 (1995). Así, las células ORS humanas son de interés considerable para aplicación clínica.

En la década anterior, el interés se ha centrado en la utilización de células epiteliales cultivadas para cubrir las heridas. En primer lugar, láminas de queratinocitos interfoliculares auotólogos cultivados se trasplantaron con éxito a heridas agudas, principalmente en el tratamiento de heridas más grandes de tercer grado (véase por ejemplo O'Connor et al., 1 Lancet 75-78 (1981); Compton et al., 60 Lab. Invest. 600-612 (1989), pero también de la epidermólisis ampollosa (véase por ejemplo, Carter et al., 17 J. Am. Acad. Dermatol, 246-250 (1987), piodermitis gangrenosa (véase por ejemplo Dean et al., 26 Ann.Plast. Surg. 194-195 (1991); Limova & Mauro, 20 J. Dermatol. Oncol. 833-836 (1994)), y las heridas después de la ablación de nevi congénitos gigantes (véase por ejemplo, Gallico et al., 84 J. Plast. Reconstr. Surg. 1-9 (1989) o la separación de gemelos siameses (véase, por ejemplo, Higgins et al., 87 J. Royal Soc. Med. 108-109 (1994)).

Al contrario que en el tratamiento de dichas heridas agudas, el trasplante de heridas crónicas (por ejemplo, úlceras de las piernas) con queratinocitos cultivados, ha sido mucho menos exitoso. Los aloinjertos no "prenden" de forma permanente (véase por ejemplo, Fabre, 29 Immunol. Lett. 161-166 (1991) y de este modo, pueden clasificarse como un "apósito biológico muy efectivo pero caro" (véase Phillips et al., 21 J. Am. Acad. Dermatol 191-199 (1989). Un "prendimiento" definitivo importante reproducible de queratinocitos antólogos injertados mediante diversas modalidades, incluyendo láminas de cultivos queratinocíticos sumergidos formados por sólo algunas capas de células no cornificadas (Hetton et al., 14 J.Am. Acad. Dermatol., 399-405 (1986); Leigh & Purkis, 11 Clin. Exp. Dermatol, 650-652 (1986); Leigh et al, 117 Brit. J. Dermatol.591-597 (1987); Harris et al., 18 Clin. Exp. Dermatol 417-420 (1993), células únicas tripsinizadas unidas a apósitos revestidos por colágeno (Brysk et al, 25 J.Am. Acad. Dermatol. 238-244 (1991), o equivalentes dérmicos (Mol et al, 24 J.Am Acad. Dermatol. 77-82 (1991), tienen que documentarse de modo convincente, todavía, en la literatura científica. La misma falta de hallazgos cuantitativos se mantiene también para varios informes respecto al trasplante de queratinocitos iinterfoliculares antólogos, recién aislados (Hunyadi et al., 14 J. Dermatol. Surg. Oncol. 75-78 (1988)) o células ORS (Moll et al., 46 Hautarzt 548-552 (1995) fijados al lecho de la herida utilizando un adhesivo de fibrina. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las desventajas del suero bovino utilizado durante el cultivo de los queratinocitos puede conribuir a una tasa reducida de "prendimiento", debido al hecho de que opone resistencia a los queratinocitos (véase por ejemplo, Johnson et al., 11 J. Bum Care Rehab. 504-509 (1990)).

El documento de patente DE-A-19651992 describe el cultivo de células de la vaina exterior de la raiz en un suero homólogo o autólogo en un 3-60% para producir equivalentes dérmicos. Los equivalentes dérmicos pueden sembrarse en membranas de ácido hialurónico o en otro material biodegradable antes de llevar a cabo el trasplante, con objeto de optimizar la cicatrización.

Lenoir-Viale, M.C. (Arch. Dermatol. Res. 1993-285: páginas 197-204) describe la preparación in vitro de una epidermis reconstruída a partir de la vaina externa de la raiz de folículos pilosos humanos. La epidermis reconstruída se describe como una herramienta valiosa y prometedora para estudios farmacológicos y puede representar un modelo de cicatrización de las heridas.

Limat A, (1. de Investigative Dermatology 2000, nov 7, páginas 128-134 describe el cultivo de folículos pilosos (los bulbos pilosos y las partes infundibulares se eliminan) para generar equivalentes epidérmicos y su utilización para tratar las úlceras crónicas de las piernas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar procedimientos simplificados y mejorados para generar queratinocitos o precursores queratinocíticos a partir de células de la vaina externa de la raiz (células ORS) en condiciones de cultivo completamente definidas para el tratamiento de varios tipos de defectos dérmicos (por ejemplo, heridas crónicas tales como úlceras de las piernas, úlceras diabéticas, llagas debidas a la presión, y similares), tanto en el hombre como en los animales. Además de su uso en el tratamiento de heridas, los queratinocitos pueden también utilizarse en la cirugía plástica y cosmética, o allí donde exista una demanda de dicho soporte dérmico (por ejemplo, postoperatorios después de la eliminación de tatuajes, nevi, cáncer dérmico, papilomas, después de amputaciones, y la transformación sexual o recuperación de la virginidad, rejuvenecimiento de piel actínicamente dañada después de su reaparición, tinpanoplastia, epitelialización del canal externo del oído y similares).

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento tal como se reivindica a continuación en la reivindicación 1.

Cabellos anágenos, depilados o en crecimiento pueden ser explantados y cultivados in toto sobre membranas provistas con microporos que llevan células alimentadoras fibroblásticas humanas en su superficie inferior. En dichos cultivos primarios, grandes cantidades de células ORS pueden ser fácil y repetidamente obtenidas, independientemente de la edad cronológica del donante. Dichas células ORS pueden utilizarse para la subsiguiente preparación del complejo dérmico, es decir, equivalentes epidérmicos o dermo-epidérmicos, o mantenerse congelados y guardados para utilizarlos posteriormente.

La preparación subsiguiente de equivalentes dormidos o epidérmicos puede obtenerse "sembrando" estas células ORS sobre una membrana provista con microporos, modificada, que lleva células alimentadoras fibroblásticas (muy preferentemente células alimentadoras fibroblásticas dérmicas humanas limitadas/con detención del crecimiento) en su superficie inferior. Durante el cultivo, estas células ORS experimentan diferenciación tisular que se ha demostrado es similar a la de la epidermis normal. Este hallazgo es muy probablemente debido a un amplio compartimiento de células proliferantes. Las condiciones modificadas del cultivo que se dan a conocer en la presente memoria son importantes para el tratamiento con éxito de heridas crónicas con equivalentes epidérmicos generados in vitro a partir de células ORS autólogas.

Los queratinocitos derivados de ORS pueden cultivarse adhiriendo el cabello anagénico a una membrana micropórica revestida con una o más moléculas con origen en la matriz extracelular. Estos cultivos mejorados de células ORS, que se denominan como equivalentes dérmicos o equivalentes epidérmicos, pueden utilizarse para tratar defectos de la piel, especialmente heridas crónicas.

La utilización de una concentración reducida de suero alogénico u homólogo según la invención, disminuye grandemente el riesgo de transmisión de enfermedades, por ejemplo, mediante la utilización clínica de productos sanguíneos, utilizando suero humano homólogo o autólogo y sustancias derivadas o liberadas a partir de componentes sanguíneos (por ejemplo, plaquetas de la sangre) para suplementos en etapas de cultivo in vitro.

Las ventajas clínicas de la utilización de equivalentes epidérmicos o de complejos epidérmicos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a la no invasividad (por lo que las células están disponibles repetidamente), la no necesidad de instalaciones quirúrgicas o de anestesia durante los procedimientos de trasplante y un corto período requerido de sólo 2 horas de inmovilización después del procedimiento de trasplante.

Si no se define lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se utilizan en la presente memoria tienen los mismos significados que son entendidos habitualmente por cualquiera de los expertos en la técnica, a los cuales esta invención pertenece. Aunque cualquier procedimiento y material que sea similar o equivalente a los descritos en l a presente memoria puede utilizarse en la práctica de la presente invención, los procedimientos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria se incorporan enteramente a ésta, como referencia.

El término "capa queratinocítica" tal como se utiliza en la presente memoria significa un cultivo tisular queratinocítico generado in vitro con una estructura más o menos diferenciada. El término "equivalente epidérmico " tal como se utiliza en la presente memoria significa un cultivo tisular organotípico generado in vitro que se parece en su estructura histológica a la epidermis natural, especialmente respecto a la estratificación y desarrollo de la capa córnea. Una epidermis estratificada normal está formada por una capa basal de células cuboides pequeñas, varias capas espinosas de células progresivamente aplanadas, una capa granular prominente y una capa córnea ortoqueratótica. Todas estas capas pueden detectarse en los equivalentes epiteliales que son sujeto de la invención. La localización de los productos de diferenciación epidérmica que se han ensayado mediante inmunohistoquímica (por ejemplo, queratinas, involucrina, filagrina, integrinas) es similar a la encontrada en la epidermis normal.

El término "autólogo" tal como se utiliza en la presente memoria significa: (i) que el material biológico que va a ser trasplantado se deriva del individuo que va a ser tratado con los equivalentes epidérmicos; o (ii) que el material biológico que se añade a los cultivos titulares proviene del donador de células para el cultivo tisular.

El término "homólogo" tal como se utiliza en la presente invención, significa. (i) que el material biológico que va a trasplantarse deriva de uno o más individuos de la misma especie que el individuo que va a ser tratado con los equivalentes epidérmicos; o (ii) que el material biológico que se añade a los cultivos titulares proviene de uno o más individuos de la misma especie que el donador de las células para el cultivo tisular.

El término "cultivo organotípico" y similares, se refiere al cultivo de células bajo condiciones que promueven la diferenciación de las células. Bajo condiciones de cultivo organotípico, la proliferación de las células se enlentece, en comparación con el cultivo bajo condiciones "proliferativas" tales como las condiciones primarias de cultivo, y puede detenerse completamente. En este caso, una condición importante para el cultivo organotípico es el mantenimiento de las células en la interfase aire-líquido, una condición que se denomina condición de cultivo "elevado".

El término "liberado a partir de los componentes sanguíneos" (por ejemplo, plaquetas sanguíneas) tal como se utiliza en la presente memoria significa cualquier combinación de citoquinas o de otros factores de crecimiento obtenidos a partir de los componentes sanguíneos (por ejemplo,. Plaquetas sanguíneas). Las plaquetas estimuladas, por ejemplo, con trombina, liberan el contenido de sus gránulos alfa en el medio circundante. Los gránulos alfa contienen habitualmente varias citoquinas (por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), los factores alfa y beta transformantes del crecimiento (TGF alfa/beta), el factor 4 plaquetario (PF-4), la proteína básica de las plaquetas (PBP). Sin embargo, es posible obtener citoquinas y otros factores del crecimiento a partir de las plaquetas mediante otros procedimientos que con la trombina estimulante. Además, otros componentes sanguíneos producen también factores de crecimiento y citoquinas. Los monocitos, por ejemplo, II-1, TNF alfa, II-6 y otras sustancias de interés.

Método general para preparar equivalentes epidérmicos a partir de las células ORS

Células precursoras queratinocíticas pueden seleccionarse a partir de la vaina externa de la raiz (ORS) del cabello anágeno o en crecimiento derivado de los individuos, que va a ser tratado a continuación con los equivalentes epidérmicos. En general, aproximadamente 40 folículos pilosos se depilan a partir del cuero cabelludo, y los que se encuentran en fase anágena (es decir, con un eje piloso creciendo) son seleccionados entonces bajo el microscopio de disección. Es necesario habitualmente un total de 4 semanas de cultivo para obtener aproximadamente 1 cm^{2} a partir de cinco folículos pilosos. Sin embargo, con técnicas mejoradas de cultivo y fermentación, puede ser posible obtener un rendimiento más alto (es decir, un área más grande de equivalentes epidérmicos, en este período de
tiempo).

El procedimiento estándar previo para la generación de un cultivo primario de los queratinocitos ORS consistía en el depilado de un cabello anágeno (es decir, un eje creciente de pelo) seguido por una cuidadosa disección microscópica para eliminar los bulbos pilosos y el eje infundibular del pelo. La vaina externa de raiz resultante (ORS) se emplazó entonces en el encaje (o inserción) del cultivo para iniciar el cultivo primario de queratinocitos. Sin embargo, numerosos estudios subsiguientes (aproximadamente 200) en los que el cabello anágeno se situó directamente en la inserción del cultivo, sin llevar a cabo la microdisección inicial para eliminar los bulbos pilosos y el eje infundibular del pelo, han demostrado que dicha tediosa disección, que emplea mucho tiempo, del pelo anágeno depilado, no era necesaria. Esto ha servido para simplificar notablemente el proceso de manejo, reducir el riesgo de contaminación y dio lugar a una iniciación más eficiente del sembrado de las células queratinocíticas.

El cabello anágeno seleccionado puede incubarse en un apropiado tampón de lavado que contiene varios agentes antimicrobianos y antifúngicos (por ejemplo, fungizone, penicilina, y estreptomicina). A continuación de este procedimiento, el cabello anágeno depilado completo puede situarse directamente en la inserción del cultivo y dejarle que crezca durante varios días, preferentemente entre 7 y 14 días, y más preferentemente entre 8 y 10 días. Una etapa opcional y adicional comprende el paso del cultivo primario y la realización de un cultivo secundario para obtener más material celular para la preparación de áreas más grandes de equivalentes epidérmicos.

La inserción del cultivo, una membrana microspórica revestida con una o más sustancias matriciales extracelulares (por ejemplo, fibrina, fibronectina, colágenos, lamininas o hialuronano o sus mezclas), puede transportar un sistema celular alimentador limitado/de detención del crecimiento en su superficie inferior. El recubrimiento de la inserción de la membrana con dichas sustancias de la matriz extracelular proporciona: (i) la potenciación de la superficie de cultivo para la unión inicial del cabello anágeno (es decir, se pega fácilmente y permanece estacionario); (ii) una superficie que potencia significativamente la migración de los queratinocitos ORS lejos de los folículos de cabello anágeno de la vaina externa de la raiz (ORS) y (iii) el aumento de las tasas de propagación de los queratinocitos ORS (es decir, el tiempo total del cultivo que es necesario para la producción de piel completamente diferenciada o de equivalentes epidérmicos) puede reducirse a 3 semanas, en vez de 4.

El sistema celular alimentador limitado/de detención del crecimiento anteriormente mencionado que se localiza en la superficie inferior de la membrana microporosa de inserción puede comprender fibroblastos dérmicos primarios obtenidos a partir de una biopsia de piel humana. Los fibroblastos dérmicos primarios pueden ser tratados con mitomicina-C durante 4 a 6 horas antes de su utilización como un "capa celular alimentadora" para el cabello anágeno depilado y sembrarlos entonces en el lado inferior de la inserción del cultivo. La limitación/detención del crecimiento puede inducirse mediante mitomicina-C o tratamiento con rayos X o la concentración sérica reducida inferior al 5%: preferentemente, 2%. Deberá tenerse en cuenta que, aunque algunos cultivos se han llevado a cabo utilizando suero fetal de ternera al 10% (FCS; Boehringer Mannheim, Alemania), se ha encontrado que la utilización habitual del suero humano, para reducir el número de ingredientes alogénicos, proporciona un producto notablemente superior y la proliferación de las células ORS. Además, el suero humano se utiliza a una concentración menor que el 5%, preferentemente a una concentración del 2%. En presencia de dichas concentraciones séricas bajas, los fibroblastos dérmicos humanos primarios de la presente invención detienen el crecimiento completa o significativamente. Por consiguiente, de esta forma, pueden eliminarse dos etapas caras y que pueden potencialmente dar lugar a complicaciones en el sistema autólogo de cultivo de CRS. Las dos etapas que pueden dar lugar a complicaciones incluyen: (i) eliminación de concentraciones séricas altas, superiores al 5%, que reduce significativamente el coste total del proceso y; (ii) la eliminación del tratamiento con mitomicina-C, que proporciona un sistema de cultivo completamente libre de mitomicina-C y elimina cualquier preocupación respecto a la eliminación total del medicamento de la inserción del cultivo primario, previa al crecimiento de los equivalentes epidérmicos. Además, la utilización de concentraciones séricas reducidas permite el procedimiento alternativo de detención de las células alimentadoras (es decir, la etapa de exposición a los rayos x) que van a eliminarse, ahorrando de este modo tiempo y dinero en el conjunto del procedimiento.

Después de la expansión de las células ORS a una densidad apropiada (es decir, 1 x 10^{3} a 10^{6} células/cm^{2}, y preferentemente 5 x 10^{4} a 1 x 10^{5} células/cm^{2}), se utilizan para la preparación de equivalentes epidérmicos. Preferentemente, las células se hacen crecer hasta confluencia. Los equivalentes epidérmicos se preparan sembrando células ORS a una densidad celular apropiada (e 30 x 10^{3} a 100 x 10^{3} células/cm^{2}, preferentemente 60 x 10^{3} células/cm^{2}, en el interior de un dispositivo de cultivo que puede ser apropiado para "levantar" las células hasta la interfase aire-líquido durante el cultivo. A continuación, de uno a cuatro días después del sembrado (preferentemente 3 días después del sembrado) las células ORS pueden exponerse al aire (por ejemplo, mediante aspiración del medio en el interior de la inserción), continuándose entonces los cultivos durante aproximadamente 10-20 días, y preferentemente durante 14-18 días), en dicha condición de cultivo "levantada". El medio puede cambiarse periódicamente durante el cultivo levantado, preferentemente cada dos a tres días.

La presente invención abarca también equivalentes de la piel que incluyen capas adicionales, y por lo tanto, son estructuras más complejas que los equivalentes epidérmicos. Los equivalentes de la piel comprenden células ORS diferenciadas como su parte epidérmica y también una capa que incluye un componente matricial, preferentemente uno que contiene fibroblastos dérmicos incrustados y/otras células (es decir, "una matriz incrustante". Los equivalentes de la piel pueden obtenerse situando una matriz con una o más sustancias matriciales extracelulares (por ejemplo, fibrina, fibronectina, colágenos, lamininas o hialuronano o sus mezclas) en la superficie superior de la membrana microporosa descrita anteriormente. Cuando los fibroblastos dérmicos humanos se incrustan, preferentemente fibroblastos dérmicos humanos antólogos. Las células pueden incrustarse con una densidad de 1 x 10^{3} a 1 x 10^{7} células/cm^{3}; preferentemente 1 x 10^{4} a 1 x 10^{5} células/cm^{3}; y muy preferentemente aproximadamente 5 x 10^{4} células/cm^{3}. El cultivo primario de las células ORS puede entonces sembrarse en la parte superior de la matriz (que contenga preferentemente fibroblastos dérmicos incrustados y/otras células), pudiéndose llevar a cabo el cultivo organotípico, tal como se ha descrito anteriormente. Para una descripción detallada de la preparación de los equivalentes dérmicos (véase por ejemplo, Limat et al., 194 Exp. Cell Res. 218-277 (1991).

Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que las células que están incrustadas en la matriz no necesitan limitarse exclusivamente a los fibroblastos dérmicos, pues pueden utilizarse asimismo las células epidérmicas, mesenquimáticas, neuronales y/o endoteliales. Las células incrustadas se obtienen preferentemente a partir del tejido de la piel, son más preferentemente células alogénicas y son muy preferentemente células antólogas.

Todas las etapas del cultivo pueden llevarse a cabo en un medio apropiado que permite la proliferación de las células ORS y su producción a partir de los folículos pilosos; el medio se cambia típicamente cada dos a tres días. Generalmente, el medio que se utiliza para todas las etapas es el mismo. El medio se basa típicamente en un medio mínimo y contiene varios ingredientes adicionales. Un ingrediente habitual es el suero. Según la presente invención, se utiliza el suero humano a una concentración inferior al 5% y preferentemente a una concentración del 2%. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimula la migración de los queratinocitos y retrasa su senescencia que da lugar a una estimulación de la proliferación. La toxina colérica, la hidrocortisona, la insulina, la adenina y la triyodotironina tienen un efecto de estimulación de la proliferación Todos estos ingredientes son por tanto útiles en un medio para preparar equivalentes epidérmicos. Sin embargo, puede ser posible omitir o reemplazar uno u otro de estos ingredientes.

El producto de liberación de los componentes de la sangre (por ejemplo, plaquetas sanguíneas, monocitos o linfocitos) puede servir como una fuente de actividades proliferativas celulares y puede proporcionar otros ingredientes anteriormente mencionados El producto de liberación de componentes sanguíneos (por ejemplo, plaquetas, monocitos o linfocitos), especialmente de origen homólogo o autólogo, puede servir como una fuente de actividades proliferativas celulares y puede proporcionar otros ingredientes anteriormente mencionados o puede proporcionar verdaderamente ingredientes adicionales. Los componentes sanguíneos deberán añadirse al medio de cultivo en concentraciones de 0,1% al 20%, preferentemente entre 1% y 5%, después de que el producto liberado se lleve al mismo volumen final que la sangre a partir de la cual estos componentes se obtienen. Estos productos de la liberación contienen diversos factores de crecimiento que se encuentran en el suero (por ejemplo, PDGF, ECF o TGFs). Sin embargo, el suero, así como los productos de la liberación contienen muchas sustancias y no todas están caracterizadas.

El producto de liberación de las plaquetas sanguíneas puede obtenerse mediante centrifugación de la sangre entera anticoagulada, preferentemente sangre humana, para sedimentar la totalidad de las células excepto los trombocitos. El sobrenadante puede centrifugarse una vez más para que los trombocitos rueden hacia abajo. Los trombocitos pueden suspenderse en un tampón apropiado, por ejemplo, tampón fosfato y tratados con trombina para liberar sus gránulos alfa que contienen una mezcla de varios factores de crecimiento (por ejemplo, PDGF, PF-4, TGF-\beta, EGE, \beta-tromboglobulina). En una ulterior etapa de centrifugación, todo el material celular puede ser eliminado. Finalmente, el sobrenadante puede suplementarse con tampón hasta el volumen de la muestra original de sangre, de la que se obtienen los componentes. Los componentes sanguíneos deberán añadirse al medio de cultivo a una concentración de 0,1% al 20%, preferentemente del 1% al 10%; y más preferentemente entre el 2 y 5%.

De modo similar, los productos de la liberación pueden obtenerse a partir de otras células sanguíneas, tales como monocitos, rompiendo las células (por ejemplo, mediante ultrasonidos, procedimiento de congelación-descongelación, o similar) y purificando los factores de crecimiento (por ejemplo, mediante filtración o procedimientos inmunológicos).

Los productos de liberación de los componentes sanguíneos pueden también utilizarse para acondicionar el lecho de las heridas durante el trasplante de los equivalentes epidérmicos o dérmicos. Además, el medio de cultivo que contiene los productos de liberación y que se utiliza para llevar a cabo la etapa de cultivo organotípico, después de haber sido acondicionado por las células, puede utilizarse para acondicionar el lecho del defecto de la piel durante el trasplante de los equivalentes epidérmicos o dérmicos.

El cultivo se lleva a cabo habitualmente en inserciones con membranas microporosas, que contienen fibroblastos dérmicos humanos homólogos o antólogos (HDF), especialmente HDF postmitósicos en su superficie inferior. HDF secretan factores que acondicionan el medio para obtener un mejor crecimiento del equivalente epidérmico. La capa HDF puede estar formada entre 5 x 10^{3} a 1 x 10^{5} células/cm^{2} preferentemente, aproximadamente 1 x 10^{4} a 5 x 10^{4} células/cm^{2}. Las HDF son preferentemente postmitósicas pero células de un previo pasaje pueden utilizarse si son irradiadas, tratadas con mitomicina-C o de otro modo, para inhibir su proliferación pero conservar su metabolismo, es decir, por reducción de la concentración sérica.

En una forma de realización, el grosor del trasplante para el equivalente del complejo dérmico ("piel del complejo") no excede de 0,4 mm.

Las membranas microporosas son apropiadas como un sustrato de cultivo, porque permiten que las sustancias se difundan de un lado al otro, pero el trabajo es una barrera parar las células. El tamaño del poro de la membrana no constituye una limitación en la presente invención, pero deberá ser adecuado como para permitir la difusión de proteínas de hasta un peso molecular de 100000 Daltons, y preferentemente de un peso molecular de 70000 Daltons. La membrana deberá por lo menos permitir la difusión de pequeñas hormonas cono la insulina, y permitir el paso de proteínas de hasta 15000 Daltons de peso molecular. Serían asimismo utilizables otros medios distintos a una membrana microporosa para llevar a cabo la función de permitir la difusión de factores solubles a las células ORS cultivadas, mientras se evite la mezcla de las células ORS con los HDF.

Las membranas microporosas típicas en la técnica se utilizan habitualmente. Sin embargo, las membranas fabricadas a partir de un material biodegradable (por ejemplo, ácido polihialurónico o ácido poliláctico) pueden también utilizarse. Cuando una membrana microporosa biodegradable se utiliza, se considera que el cultivo entero, incluyendo las células ORS diferenciadas, la membrana microporosa y los HDF, será trasplantado al defecto de la piel. De este modo, en esta forma de realización alternativa los HDF desarrollados en el lado inferior de la membrana, no necesitan ser post-mitósicos o ser tratados para excluir la proliferación. Aunque los HDF tienden a ser menos inmunogénicos que los queratinocitos, es preferible que cuando se utilice esta forma de realización, los HDF sean células alogénicas, preferentemente células antólogas.

En una forma de realización, el grosor del injerto de malla puede oscilar entre 30 y 300 micrómetros. Preferentemente, el grosor del injerto de malla oscila entre 0,5 y 0,75 mm. Un injerto de tejido (por ejemplo, colágeno dérmico más fibroblastos recubierto con tejido queratinocítico) que es demasiado grueso, puede dar lugar a una muerte celular isquémica demasiado rápida, especialmente para la capa de queratinocitos situada por encima de la capa de colágeno fibroblástico dérmico. Al contrario, este tejido de injerto de malla puede "prender" en los sitios de la herida. Los equivalentes epidérmicos de la presente invención puede oscilar en tamaño de aproximadamente 6 mm a 2,5 cm aproximadamente, con un diámetro preferido de 2,5 cm.

En una forma de realización, el intervalo preferido para los equivalentes epidérmicos es 50-150 micrómetros. En una forma de realización particular, los equivalentes epidérmicos son muy delgados (más delgados de lo que habitualmente se utilizan en la técnica, por ejemplo, 60 micrómetros). Se ha planteado la hipótesis de que haciendo el injerto autólogo demasiado grueso, evitará un apropiado suministro de sangre a partir de que se haya establecido, de forma que la epidermis no "prenderá" en el sitio de la herida. Al contrario, los equivalentes epidérmicos de la invención, pueden "prender" en los sitios de la herida.

En muchos casos, sin embargo, la piel o los equivalentes epidérmicos tienen que suministrarse a partir del centro en el que se generan a la institución en la que se utilizan. Por tanto, es necesario un sistema para permitir el transporte de la piel o de los equivalentes epidérmicos, que se haya mantenido en una condición que esté preparada para realizar el trasplante, independientemente de si la membrana microporosa se elimina de la capa celular basal antes del transporte, condiciones que se parecen a aquellas que durante el cultivo parecen ser favorables. Para mantener la piel o los equivalentes epidérmicos en contacto con el medio solo de la capa basal, (es decir, durante el cultivo) puede utilizarse la agarosa a una concentración que oscila entre 0,1% y 5% y preferentemente a una concentración que oscila de 0,5% a 1%, o la metilcelulosa, o cualquier otra sustancia gelificante en concentraciones comparables, para solidificar el medio de transporte. La piel o los equivalentes epidérmicos pueden situarse con su capa basal hacia abajo sobre la membrana de una inserción previamente incrustada en la parte superior del medio solidificado o gelificado. La placa multipocillos que contiene estas inserciones puede situarse en un blister precintado mediante una cubierta y ser entonces enviada. La piel o los equivalentes epidérmicos son muy preferentemente, utilizados para llevar a cabo el trasplante entre las 24 y 48 horas del embalaje inicial.

Para mejorar la estabilidad de los equivalentes epidérmicos, se ha desarrollado la técnica de situar una membrana transportadora en la parte superior, es decir, sobre el aspecto cornificado del equivalente epidérmico, y eventualmente, adherirla a él. Como adhesivo, se prefiere el "pegamento" de fibrina, pero pueden utilizarse también otras opciones, que incluyen pero no se limitan a componentes matriciales extracelulares, tales como colágeno, fibronectina, proteoglicanos (por ejemplo, ácido hialurónico, condroitín sulfato, y similares) o componentes de la zona basal de la membrana (por ejemplo, laminita, Matrigel^{TM} o L-polilisina) o "pegamentos" titulares similares.

Los transportadores utilizados en la presente invención pueden consistir en una membrana sintética fabricada con uno o más de los materiales siguientes (poliéster, PTFE o poliuretano); de uno o más polímeros biodegradables (por ejemplo, ácido hialurónico, ácido poliláctico o colágeno); o un apósito de gasa de vaselina o silicona o cualquier otro material apropiado para llevar a cabo el apósito de heridas. Estos materiales, que son apropiados para el apósito de heridas, permiten que el transportador permanezca en el lugar para inmovilizar los equivalentes dérmicos o epidérmicos durante varios días, en vez de que haya que quitarlo inmediatamente después de que el equivalente dérmico o epidérmico sea trasplantado. De este modo, el transportador no sólo potencia la estabilidad y mejora el manejo, sino que sirve también como cubierta protectora contra el daño físico, así como para el medio proteolítico y las bacterias en la herida. Además, sirve para la orientación del trasplante (es decir, el lado basal hacia abajo, el lado opuesto hacia arriba).

Los equivalentes de la piel o epidérmicos que se disponen sobre el transportador tienen que mantenerse en condiciones, preparados para llevar a cabo el trasplante, independientemente de si la membrana microporosa se quita de la capa celular basal para el transporte, condiciones que se parecen a las que durante el cultivo parecen ser favorables para mantener los equivalentes de la piel o epidérmicos en contacto con el medio sólo de la capa basal (es decir, durante el cultivo), pudiendo utilizarse para solidificar el medio la agarosa a una concentración entre el 1% y el 5%, preferentemente a una concentración del 1 al 3%, o la metilcelulosa, o cualquier otra sustancia gelificante en concentraciones comparables. Los equivalentes epidérmicos conjuntamente con el transportador pueden situarse con su capa basal en la parte superior del medio solidificado o gelificado. El dispositivo completo se precinta entonces de forma estanca y se envía. Los equivalentes epidérmicos son, muy preferentemente, utilizados para llevar a cabo el trasplante en un plazo de 24 horas desde su embalaje inicial.

Los equivalentes de la piel o epidérmicos se trasplantan situándolos simplemente en el lecho de la herida o de otro defecto de la piel. Preferentemente, los equivalentes de la piel o epidérmicos se inmovilizan entonces (los pacientes son inmovilizados durante 2 horas). El procedimiento preferido para la inmovilización es utilizando material biodegradable, mediante algún tipo de tejido de "pegado" o mediante un vendaje adecuado. Como se ha descrito previamente, el lecho del defecto de la piel puede tratarse con productos de liberación sanguínea o con el medio del cultivo organotópico previo a, o concomitante con el trasplante.

En operaciones que utilizan dispositivos de células encapsuladas (membrana de 100 micrómetros, 200-250 micrómetros hasta el centro de la fibra agujereada), se ha obtenido, con distancias de 300 micrómetros a partir del vaso sanguíneo más cercano, una buena supervivencia de los fibroblastos dérmicos humanos.

Ejemplo 1 Preparación de las células ORS

Las células precursoras de los queratinocitos de la vaina externa de la raiz (ORS) de los folículos pilosos, son seleccionadas y cultivadas a continuación utilizando la metodología siguiente.

Aproximadamente 40 folículos pilosos se depilaron con pinzas a partir del cuero cabelludo occipital de los individuos, y los que se encontraban en fase anágena, que se detectó, por ejemplo, por las vainas bien desarrolladas de las raíces, se seleccionaron entonces bajo el microscopio de disección (véase por ejemplo, Limat & Noser, 87 J. Invest. Dermatol. 485-488 (1986); Limat et al., 92 J. invest. Dermatol. 758-762 (1989)). El cabello anágeno se situó directamente en la inserción del cultivo microporoso sin llevar a cabo la microdisección previamente utilizada para eliminar los bulbos pilosos y la vaina pilosa infundibular.

Generalmente, seis pelos anágenos se explantaron sobre la membrana microporosa de una inserción del cultivo celular (Costar), que en su superficie inferior llevaba una capa alimentadora preformada, que estaba comprendida preferentemente de 20 x 10^{3} fibroblastos dérmicos humanos postmitósicos (HDF) por cm^{2} (véase, por ejemplo, Limat et al., 92 J. Invest. Dermatol, 758-762 (1989)). Los HDFs se derivaban de los explantes de piel de individuos sanos, repetidamente negativos en la serología para el HIV y la hepatitis, y se cultivaron en medio DMEM suplementado con un suero humano inferior al 5%, preferentemente un suero humano al 2%.

Para obtener un producto eficiente de las células de la vaina externa de las raíces (ORS) del cabello anágeno y una alta tasa de proliferación, es importante no situar las células alimentadoras HDF en la parte inferior de la placa del cultivo, que da lugar a una capa adicional de medio entre la capa HDF y la membrana microporosa que soporta las células ORS. Dejar crecer a cada tipo celular a un lado de la membrana, permite una interacción muy cercana, pero evita la contaminación cruzada de las células ORS con los fibroblastos, y de este modo, garantiza un cultivo puro de las células ORS.

El medio de cultivo que se utilizó consistió en un medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 (3:1 vol/vol) suplementado con suero humano al 2%, 10 ng de factor de crecimiento epidérmico por ml de medio de cultivo, 0,4 microgramos de hidrocortisona por ml, 0,135 mM de adenina, y 2 nM de triyodotironina (obtenida toda de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La concentración preferida final de Ca^{2+} del medio de cultivo es 1,5 mM (véase por ejemplo, Wu et al., 31 Cell 693-703 (1982); Limat & Noser, 87 J. Invest. Dermatol, 486-488 (1986)). A las 2 semanas aproximadamente, las células PRS se habían expandido y alcanzaron confluencia. Se disociaron con una mezcla de tripsina al 0,1%/EDTA al 0,02% supervisándose respecto a la viabilidad, y utilizándose para la preparación de equivalentes dérmicos. Debe tenerse en cuenta que, aunque los cultivos iniciales se habían llevado a cabo utilizando suero fetal de ternera al 10% (FCS; Boehringer Mannheim, Alemania), la utilización habitual del suero humano, para reducir el número de ingredientes alogeneicos, proporcionó un producto superior y la proliferación de las células ORS. El suero humano se utiliza a una concentración menor que el 5%, preferentemente a una concentración del 2%.

La explantación de los cabellos depilados anágenos directamente sobre la membrana de las inserciones del cultivo que transportan los HDF postmitósicos en la superficie inferior como células alimentadoras, demostró constituir un procedimiento sencillo, eficiente y reproducible para establecer los cultivos primarios de las células ORS. El 80% aproximadamente de los folículos pilosos explantados dieron lugar a la producción de células ORS, incluso cuando se derivaban de individuos que tenían una edad superior a 90 años. Después de 14 días, amplias áreas de la inserción se cubrieron por pequeñas células distribuídas de forma compacta, en cuyo momento se utilizaron para la preparación de equivalentes epidérmicos de la presente invención.

La comparación del comportamiento del crecimiento de 70 cepas de células ORS, que se derivaron de un total de 30 donadores, demostró que no había diferencias significativas entre los donadores jóvenes (es decir, 21 donadores con edades comprendidas entre 19 y 50 años) y las personas mayores (es decir, 9 donadores con edades comprendidas entre 51 y 93 años). 5 x 10^{5} células aproximadamente se obtuvieron generalmente por folículo explantado, y el grado total de viabilidad celular fue típicamente más alto que el 95%. Al contrario de esto, en ausencia de HFD postmitósicos como capa alimentadora, sólo se encontró una producción esporádica de células ORS a partir de los folículos explantados.

Ejemplo 2 Preparación de equivalentes epidérmicos

Células ORS recuperadas de los cultivos primarios se sembraron con una densidad de 30 x 10^{3} células/cm^{2} a 100 x 10^{3} células/cm^{2}, preferentemente 60 x 10^{3} células/cm^{2}, sobre inserciones de cultivos celulares (Costar) que se habían previamente inoculado con 10 x 10^{3} células/cm^{2} a 50 x 10^{3} células/cm, preferentemente 20 x 10^{3} células/cm^{2}, de células HDF postmitósicas sobre la superficie inferior de su membrana microporosa. De forma similar al cultivo de las células ORS, es importante mantener las células alimentadoras HDF cercanas a las células ORS, manteniéndolas también a la vez separadas mediante la utilización de la membrana microporosa. Esta técnica de cultivo potencia la proliferación, diferenciación y por tanto, la homeóstasis del tejido en desarrollo.

El medio de cultivo fue idéntico que el utilizado para la preparación de los cultivos primarios tal como se describen lo que antecede. Después de 72 horas, las células ORS se expusieron al aire aspirando el medio líquido que se encontraba en el interior de la inserción (es decir, abandonando el lado inferior de la inserción en contacto con el medio) y cultivándolas durante otros 12-14 días, con tres cambios de medio por semana. Alternativamente, después de una semana el suero levantado del cultivo puede omitirse totalmente

Para el trasplante, el protocolo utilizado hasta ahora, que se utiliza generalmente para la preparación del equivalente epidérmico completamente diferenciado para el injerto de la herida, requiere que el médico corte cuidadosamente el perímetro completo de la inserción del cultivo con una cuchilla de escalpelo de forma que se facilite la liberación de la membrana de inserción (con los fibroblastos dérmicos humanos revestidos por debajo) con el parche escamoso de la piel unido hacia arriba. El parche de la piel es entonces liberado de esta membrana desprendiéndolo con un ligero fórceps y situándolo, con la cara inferior para arriba, sobre un nuevo disco membranoso en una placa de cultivo para un trasplante eventual al paciente. Este procedimiento que se acaba de mencionar es laborioso y consume tiempo y puede llevar a la inversión de la orientación basal y escamosa.

Se ha concebido un procedimiento notablemente más sencillo que utiliza la cabeza del parche de la membrana transportadora, que emplea la cabeza del parche de la membrana (análogo al procedimiento del "pegamento" de fibrina descrito a continuación) que se sitúa directamente sobre la parte superior de la capa superficial escamosa. La cabeza de la membrana puede entonces agarrarse conjuntamente con el parche de piel inferior, utilizando un ligero fórceps y desprendiéndolo de la superficie del pocillo de la inserción del cultivo, y por ejemplo, después de incubación en solución diluida de Dispasa, desprenderse de la membrana de inserción del cultivo.

Para la estabilización y como un revestimiento protector en caso de trasplante, los equivalentes epidérmicos de la presente invención pueden revertirse en la parte superior con pegamento de fibrina diluida, que también sirve para identificar claramente el lado superior (es decir, cornificado). El pegamento de fibrina, la forma de realización preferida de la presente invención, es un producto humano natural aceptado generalmente, que se utiliza ampliamente como un tejido de unión. Aplicando un fino revestimiento del pegamento de fibrina (que es claramente visible a simple vista) a la superficie escamosa cornificada expuesta al aire del equivalente epidérmico, y situando el médico el equivalente epidérmico sobre el sitio de la herida, estará completamente asegurada la orientación apropiada del injerto (es decir, la superficie basal del parche de piel estará siempre en el lado en el que no se aprecia claramente la cabeza del pegamento de fibrina). Previamente, en muchos casos, durante la preparación del parque epidérmico para injerto de la herida, la orientación del parche se confunde. Si el parche de piel se sitúa por debajo del lado escamoso, sobre el sitio del injerto, disminuirá significativamente la posibilidad de un injerto con éxito. Así, la utilización de este simple "marcado" elimina completamente este problema.

Además, sustancias antimicrobianas o antifúngicas pueden también incluirse en el pegamento de fibrina, de forma que se impida cualquier posible contaminación microbiana o sobrecrecimiento del injerto. Muchas lesiones crónicas están infectadas crónicamente, lo que puede conducir a la inhibición del "prendimiento" del injerto, y la subsiguiente cicatrización de la herida, después del injerto inicial de la piel. Además, la adición de uno o varios antibióticos o agentes antifúngicos mediante emulsificación directa en el interior de la cabeza superficial del pegamento de fibrina, puede proporcionar una mejoría significativa en el suministro de cantidades suficientes de agentes anti-microbianos al sitio del trasplante.

Se tendrá en cuenta que las células ORS que se recuperaron a partir de los cultivos primarios y se cultivaron en la interfase aire-líquido sobre las membranas de inserción que transportan los HDF postmitósicos en su superficie inferior, desarrollaron típicamente un epitelio estratificado a los 14 días. Este epitelio estratificado estaba formado por una capa basal de pequeñas células cuboides, por debajo de un compartimiento suprabasal grueso de células progresivamente aplanadas. Una capa granular prominente, así como una capa cornificada ortoqueratótica se encontraron también presentes.

Basándose en el hallazgo experimental de que un 80% aproximadamente de los folículos dieron lugar a la producción de células ORS, se necesitaron aproximadamente cinco folículos pilosos anágenos para la generación de 1 cm^{2} de equivalentes epidérmicos. El período para generar equivalentes epidérmicos capaces de ser trasplantados, fue habitualmente de cuatro semanas in toto (es decir, dos semanas parar el cultivo primario y dos semanas para el cultivo organotípico subsiguiente).

Ejemplo 3 Estabilización

Antes del suministro, se hace que los equivalentes epidérmicos revistan la parte superior situando una membrana de silicona de un diámetro apropiado sobre el aspecto superior de los cultivos. Para potenciar ulteriormente la estabilidad, por ejemplo, en el caso de equivalentes epidérmicos grandes y/o delgados, así como para aumentar la adhesión de la membrana de silicona, una capa delgada del pegamento tisular, por ejemplo, pegamento de fibrina, puede aplicarse antes.

El revestimiento sobre la parte superior, (1) potencia la estabilidad y mejora el manejo de los injertos, y(2) sirve como un recubrimiento protector contra el daño físico, así como para el medio proteolítico y las bacterias en la herica.

Ejemplo 4 Envío

Los equivalentes epidérmicos que revisten la parte superior se separan de las membranas de inserción del cultivo mediante la incubación en Dispasa diluida, agarrándolos entonces junto con la membrana de silicona utilizando finas pinzas y transfiriéndolos a la membrana de una inserción previamente incrustada en agarosa al 0,7% empapada con medio de cultivo en el pocillo de una placa multipocillos. Estas placas se sitúan entonces en el contenedor de envío. Para la aplicación al lecho de la herida, los equivalentes dérmicos se agarran otra vez, junto con la membrana de silicona, que (1) sirve para la orientación del injerto (es decir, el lado basal abajo, el lado cornificado arriba) y (2) dejándolo sobre los equivalentes epidérmicos injertados en la herida sirve como una capa protectora (véase anteriormente).

Ejemplo 5 Tratamiento satisfactorio de las úlceras crónicas de las piernas con equivalentes epidérmicos generados a partir de células cultivadas autólogas de la vaina externa de la raíz

Las células de la vaina externa de la raíz de los folículos pilosos pueden sustituir a los queratinocitos epidérmicos interfoliculares, pues durante la cicatrización de las heridas de la piel, estas células migran sobre el área denudada y contribuyen a la regeneración epidérmica (Limat et al, 107 (1) J. Invest. Dermatol. 128-35 (1996) que se incorpora para referencia). Utilizando las técnicas mejoradas del cultivo de la invención, generamos equivalentes epidérmicos a partir de células de la vaina externa de la raíz de pacientes que padecían úlceras crónicas recalcitrantes de las piernas, primariamente de origen vascular. En dichos equivalentes epidérmicos, la organización del tejido así como la inmunolocalización de los productos de diferenciación epidérmica (queratina 10, involucrina, filagrina) e integrinas, fueron indistinguibles de la epidermis normal. Como determinada por el número de células que incorporaban bromodesoxiuridina, la capa basal contenía un gran compartimiento de células proliferativas independientemente de la edad del donador. El análisis FACS de las células de la vaina externa de la raíz, utilizada parra preparar los equivalentes epidérmicos, dio a conocer una fracción de células pequeñas con la expresión de la \beta_{1}-integrina aumentada, un marcador celular troncal potencial. Al contrario que en las heridas agudas, en las heridas crónicas no se ha demostrado de modo convincente un prendimiento definitivo superior de queratinocitos autólogos cultivados trasplantados. El injerto de equivalentes epidérmicos generado in vitro a partir de las células antólogas de la vaina externa de la raíz en 11 úlceras en cinco pacientes dio lugar a una tasa de prendimiento definitivo de alrededor del 80%, con una cicatrización subsiguiente completa entre las 2 y 3 semanas, de 5 de 7 úlceras sometidas a injerto con cultivos densamente preparados. Esta mejoría en el tratamiento de las úlceras crónicas de las piernas con queratinocitos autólogos cultivados depende probablemente del gran compartimiento de células proliferativas así como de una capa cornificada bien desarrollada que evita la desintegración de los injertos. Las ventajas prácticas de la nueva técnica es su no invasividad, un corto período de inmovilización después del trasplante y la falta de la necesidad de servicios quirúrgicos y de anestesia.

Equivalentes epidérmicos autólogos son injertados con éxito en úlceras crónicas de la pierna. Un total de 11 úlceras se trataron, siete de ellas cubriendo alrededor del 90% de la superficie ulcerosa con cultivos densamente preparados, y cuatro disponiendo cultivos aislados en las partes centrales. En el primer cambio del apósito 3 días después del injerto, alrededor del 80% de los injertos eran visibles y adherentes al lecho de la herida en ambos tipos de tratamiento. En las 3 a 3 semanas siguientes, los injertos se consolidaron en cinco de las siete úlceras densamente injertadas, dando lugar a una reepitelialización completa y a una cicatrización. En las dos restantes úlceras infectadas crónicamente (Pseudomonas).los injertos fueron parcialmente destruídos, lo que condujo a un retardo en la cicatrización de 4 a 5 semanas. En las úlceras tratadas mediante injertos aislados, hubo una formación acelerada de tejido de granulación y reepitelialización principalmente a partir de los bordes de la herida, comparando con las úlceras de la misma pierna tratadas con sólo los apósitos. En este tipo de tratamiento, se documentó sólo un prendimiento permanente con la subsiguiente expansión de los injertos para una úlcera tratada con láminas epiteliales más grandes que medían 8 mm de diámetro. Las úlceras de control en los cuatro pacientes con más de dos úlceras en la misma pierna, mejoraron sólo ligeramente después de las 3 semanas, en cuyo momento se trataron injertando ulteriormente equivalentes autólogos epidérmicos o mediante cirugía convencional.

Después de la reepitelialización, la epidermis era todavía inicialmente frágil con alguna tendencia a formar ampollas después de traumas friccionales poco importantes, dando lugar ocasionalmente a pequeñas erosiones. Estas erosiones se reepitelializaron rápidamente bajo tratamiento convencional tópico. Se ha hecho ahora un seguimiento de los primeros pacientes durante 6 meses y muestran un aumento de la estabilización de las áreas tratadas y no muestran recurrencias en las úlceras.

A partir de la descripción detallada que sigue de las formas de realización específicas de la presente invención, será fácilmente evidente que se ha descrito una metodología única para la selección y cultivo de queratinocitos procedentes de la vaina externa de la raíz (ORS) de los folículos pilosos, para utilización subsiguiente en, por ejemplo, los procedimientos de injerto de la piel. Aunque formas de realización particulares se han dado a conocer en la presente memoria, esto se ha llevado a cabo mediante ejemplos, con propósitos ilustrativos solamente, no teniéndose la intención de limitar respecto al alcance las reivindicaciones adjuntas que se describen seguidamente.

Células ORS in vitro de diferencian a equivalentes epidérmicos similares a la epidermis normal

La explantación de los folículos pilosos anágenos depilados directamente sobre la membrana de inserciones de cultivo que llevan fibroblastos postmitósicos como células alimentadoras en su superficie inferior, mostró ser una herramienta fácil, eficiente y reproducible para establecer cultivos primarios de las células ORS. Alrededor del 80% de los folículos de cabello explantado dio lugar a l a producción de células ORS, incluso cuando se derivaron de individuos que tenían hasta 91 años. Después de 14 días, grandes áreas de la inserción se cubrieron con células pequeñas organizadas compactadamente, en cuyo momento se utilizaron para la preparación de los equivalentes epidérmicos. Al contrario, las células ORS derivadas de los folículos tratados con tripsina, exhibieron una organización menos compacta con numerosas células de un tamaño mayor. La comparación del comportamiento del crecimiento de 70 cepas de células ORS derivadas de 30 donadores, no reveló diferencias significativas entre los jóvenes (21 donadores de edades comprendidas entre 19 y 50 años) y donadores más mayores (9 donadores con edades desde 51 hasta 93 años), ya que alrededor de 0,5 x 10^{6} células se obtuvieron habitualmente por folículo explantado. La viabilidad celular fue mayor que el 95%. En ausencia de los fibroblastos mitósicos, sólo se encontró una producción esporádica de células ORS.

A causa de se ha postulado una relación lineal logarítmica entre el nivel relativo de la \beta_{1}-integrina en la superficie celular y la capacidad proliferativa de los querartinocitos, comparamos la expresión de las integrinas en cultivos primarios de células ORS, establecida mediante dos técnicas distintas, es decir, células ORS de folículos explantados o de folículos tratados con tripsina. Las células ORS de cuatro distintos donantes que se desarrollaron mediante ambas técnicas, se analizaron mediante citometría de flujo. Basándose en sus características de división de la luz, las células se pudieron subdividir en dos grupos, grupo A, con un separador de luz hacia adelante distintamente inferior, es decir, de un tamaño celular más pequeño, y el grupo B, con un separador de luz hacia delante superior, teniendo por tanto un tamaño celular más grande. Para las células ORS que se derivaron de los folículos explantados, el grupo A representó alrededor de un 4% y el grupo B representó alrededor del 72% del número total de células, mientras que los valores de 2,6% y 75%, respectivamente, se encontraron para las células ORS que crecieron a partir de los folículos tratados con tripsina (valores promedio de cuatro experimentos separados). En el grupo A, los valores del porcentaje de células que se tiñeron debido a las integrinas \beta_{1}-\beta_{4}, así como el de la fluorescencia promedio por célula de las integrinas \beta_{1} y, en un menor grado, también de las integrinas \alpha_{2}-, \alpha_{3}-, \alpha_{v}-, fueron más altos en las células ORS desarrolladas a partir de los folículos explantados que en las procedentes de los folículos tratados con tripsina. En el grupo B, no se detectaron diferencias en las dos técnicas de cultivo, ni en el porcentaje de las células positivas a la integrina, ni en la fluorescencia promedio por célula.

Las células ORS recuperadas a partir de los cultivos primarios y sembradas en membranas insertadas que llevan fibroblastos postmitósicos en su superficie inferior, desarrollaron un epitelio estratificado a los 14 días. Este consistió en una capa basal de células cuboideas pequeñas situadas por debajo de un compartimiento suprabasal grueso de células progresivamente aplanadas. Una capa granular y una capa cornificada ortoqueratótica estaban presentes.

La inmunolocalización de los productos de diferenciación epidérmica fue idéntica a la encontrada en la epidermis normal. Así, la diferenciación específica K10 no se encontraba en la capa basal, pero se expresó más intensamente suprabasalmente a partir de la segunda capa. La involucrina mostró su típico patrón en panal a partir del estrato espinoso medio, mientras que la tinción de la capa granular de la filagrina formaba una banda contínua por debajo de la capa callosa. Como en las epidermis normales, la reactividad de las cadenas \alpha_{2}, \alpha_{3}- y \beta_{1} de integrinas se distribuyó sobre todos los aspectos de la membrana plasmática de las células basales, mostrando una disminución de la intensidad con la diferenciación progresiva.

Las células BrdU positivas se encontraron predominantemente en la capa basal de los equivalentes epidérmicos y representó el 24% de las células basales (597 \pm 21 células BrdU positivas para 2464 \pm 115 células basales (promedio \pm SD): n=4).

Basándose en el 80% de los folículos que dan lugar a la producción de las células ORS, alrededor de cinco folículos pilosos anángenos se necesitaron para generar 1 cm^{2} de los equivalentes epidérmicos. El período para generar equivalentes epidérmicos capaces de injertarse fue habitualmente de 4 semanas, es decir, 2 semanas para el cultivo primario y 2 semanas parar el cultivo organotípico

Claims (20)

1. Un procedimiento in vitro para preparar un equivalente epidérmico o de complejo de la piel apropiado para el tratamiento subsiguiente de un defecto de la piel, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

cultivar un folículo piloso anagénico para obtener células de la vaina externa de la raíz;

(b)

cultivar dichas células de la vaina externa de la raíz para obtener células precursoras queratinocíticas, y

(c)

preparar un equivalente epidérmico o complejo de la piel que comprende dichas células precursoras queratinocíticas;

caracterizado porque dicho folículo piloso es intacto, dichas células precursoras queratinocíticas se siembran a una densidad de entre 3 x 10^{4} células/cm^{2} y 1 x 10^{5} células/cm^{2} y dichas etapas de cultivo (a) y (b) se llevan a cabo en un medio que contiene suero humano a una concentración menor que 5% aproximadamente.

2. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado por seleccionar dichas células precursoras queratinocíticas mediante:

(d)

cultivo primario de dichas células precursoras queratinocíticas derivadas de la vaina externa de la raíz mediante adhesión de dicho cabello anagénico intacto a una membrana microporosa, la cual membrana posee células alimentadoras limitadas/de detención del crecimiento en su superficie inferior, de modo que sean seleccionadas células precursoras queratinocíticas a partir de la vaina externa de la raíz del pelo.

(e)

cultivo organotípico de las células de la vaina externa de la raíz recuperadas a partir de dichos cultivos primarios, modulando una membrana microporosa que también posee células alimentadoras limitadas de detención del crecimiento en su superficie inferior; y

(f)

generar después dicho equivalente epidérmico o complejo de la piel para utilización subsiguiente como una inserción de un injerto, situando una membrana transportadora sobre la parte superior de dicho cultivo organotípico de la etapa (d) y separar dicho equivalente epidérmico o de complejo de la piel;

por lo que dicho injerto comprende las células percursoras queratinocíticas y la membrana transportadora como una unidad única laminar sembrándose dichas células precursoras queratinocíticas sobre dicha membrana transportadora con una densidad de entre 3 x 10^{4} células/cm^{2} y 1 x 10^{5} células/cm^{2}.

3. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que dicho equivalente epidérmico o de complejo de la pielestá revestido en su parte superior o lado cornificado con un pegamento de fibrina.

4. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 3, en el que dicho pegamento de fibrina contiene uno o más agentes antimicrobianos, antifúngicos o antivíricos que están emulsificados en el mismo.

5. Procedimiento según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dichas células de la vaina externa de la raíz son células homólogas.

6. Procedimiento según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho equivalente epidérmico o de complejo de la piel comprende células de la vaina externa de la raíz cultivadas en un medio que contiene sólo suplementos biológicos homólogos o autólogos.

7. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que dicho equivalente epidérmico está revestido en su parte superior o en su lado cornificado, con una membrana transportadora.

8. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que dichas células de la vaina externa de la raíz son células autólogas obtenidas a partir de un individuo que experimentará subsiguientemente un tratamiento para un defecto de la piel.

9. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que la densidad del cultivo de dichas células alimentadoras limitadas/de detención del crecimiento sobre dicha membrana microporosa está entre 1 x 10^{4} células/cm^{2} aproximadamente y 5 x 10^{4} células/cm^{2} aproximadamente.

10. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que dichas células alimentadoras limitadas/de detención del crecimiento son células depositadas o inmortalizadas.

11. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicho equivalente epidérmico o de complejo de la piel comprende células de la vaina externa de la raíz, cultivadas en un medio que contiene sólo productos de liberación homólogos o autólogos de componentes sanguíneos.

12. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 11, caracterizado porque dicho equivalente o complejo de la piel comprende células de la vaina externa de la raíz cultivadas en un medio que contiene sólo productos de liberación homólogos o autólogos de componentes sanguíneos a una concentración de entre 0,1% y alrededor de 20%.

13. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicha membrana microporosa está revestida por una o más sustancias matriciales extracelulares seleccionadas a partir de la fibrina, fibronectina, colágenos, lamininas y hialuronano.

14. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicha membrana microporosa posee un sistema celular de alimentación limitado/de detención del crecimiento en su superficie inferior, seleccionándose por lo menos un tipo de dichas células alimentadoras a partir de los fibroblastos dérmicos humanos, células epidérmicas, células mesenquimales, células neuronales y células endoteliales.

15. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicha membrana transportadora está fabricada con uno o más tipos de materiales seleccionados a partir de poliéster, PTFE, poliuretano, ácido hialurónico, ácido poliláctico, colágeno y un apósito de gasa de silicona o vaselina.

16. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que el tamaño de dicho equivalente epidérmico o del complejo de la piel se selecciona a partir de 1,0 cm, 1,5 cm, 2,0 cm y 2,5 cm de diámetro.

17. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1, que comprende además el envío o el transporte de dicho equivalente epidérmico o de complejo de la piel, mediante:

(g)

separación de dicho equivalente epidérmico o de complejo de la piel de dicho medio de cultivo,

(h)

transferencia de dicho equivalente a un transportador, y

(i)

poniendo en contacto dicho equivalente epidérmico y el transportador, con un medio solidificado o gelificado.

18. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 17, en el que dicho equivalente se reviste en su parte superior o lado cornificado con una membrana transportadora.

19. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 18, en el que dicho equivalente se precinta además y se envía para emplearlo en el futuro para realizar injertos.

20. Procedimiento según se reivindica en la reivindicación 17, en el que dicho medio solidificado o gelificado es seleccionado a partir de agarosa, metilcelulosa y otra sustancia gelificante.