ES2249928T3

ES2249928T3 - Constructos de tejido manipulado mediante bioingenieria y metodos para producirlos y utilizarlos.

Info

Publication number: ES2249928T3
Application number: ES99962807T
Authority: ES
Inventors: Michael P. Murphy; Vincent Ronfard
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2019-11-19
Also published as: AU2010201787B2; PT1612265E; CA2351396A1; CA2351396C; US7824913B2; ES2402739T3; DE69927600T2; JP2002530069A; WO2000029553A1; US20080108134A1; DK1131410T3; EP1612265A2; CN102051343A; HK1040740A1; DE69927600D1; AU769637B2; EP1131410A1; AU2004201787A1; BR9915476A; EP2295540A1

Abstract

Constructo de piel cultivada que tiene al menos dos capas, que comprende: (a) una primera capa de células de fibroblastos dérmicos cultivados, cultivadas en condiciones para producir una capa de matriz extracelular que se sintetiza y ensambla mediante las células de fibroblastos cultivados, estando contenidas las células de fibroblastos cultivados dentro de la capa de matriz extracelular sintetizada, en la que la matriz extracelular comprende: (i) colágeno tipo I y tipo III que muestra una organización empaquetada de las fibrillas y mostrando los haces de fibrillas un modelo de bandas de 67 nm escalonadas un cuarto de su longitud; (ii)decorina; (iii) fibronectina; (iv)tenascina; y (v) glucosaminoglucanos; en el que dicha matriz extracelular se produce por las células de fibroblastos dérmicos cultivados en ausencia de componentes de la matriz exógenos o elementos sintéticos durante las condiciones de cultivo; y, (b) una segunda capa de células de queratinocitos dispuesta sobre la primera capa para formar una capa de células epidérmicas, en la que la capa de células epidérmicas es diferenciada, estratificada, de varias capas, y muestra una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo; y en el que el constructo de piel cultivada de dos capas tiene una membrana basal presente en la unión de la primera y segunda capas.

Description

Constructos de tejido manipulado mediante bioingeniería y métodos para producirlos y utilizarlos.

Campo de la invención

La invención se encuentra en el campo de la ingeniería genética de tejidos. Esta invención se refiere a un método in vitro para inducir a células a producir una matriz extracelular. Esta matriz extracelular viva, que tiene propiedades similares a las del tejido, puede utilizarse para pruebas o con fines clínicos.

Antecedentes de la invención

El campo de la ingeniería genética de tejidos combina métodos de bioingeniería con los principios de las ciencias de la vida para comprender las relaciones estructurales y funcionales en tejidos de mamíferos sanos y patológicos. El objetivo de la ingeniería genética de tejidos es el desarrollo y la aplicación final de sustitutos biológicos para restablecer, mantener o mejorar las funciones tisulares. Por tanto, mediante la ingeniería genética de tejidos, es posible diseñar y fabricar un tejido manipulado mediante bioingeniería en un laboratorio. Los tejidos manipulados mediante bioingeniería pueden incluir células que se asocian normalmente con tejidos humanos o de mamíferos nativos y estructuras de matriz sintética o exógena. El nuevo tejido manipulado mediante bioingeniería debe ser funcional cuando se injerta en un huésped, e incorporarse de manera permanente dentro del organismo del huésped o reestructurarse biológicamente de manera progresiva por las células del paciente huésped receptor. La fabricación de un tejido equivalente sin un elemento de soporte o estructura conduce a retos científicos en la creación del nuevo tejido manipulado mediante bioingeniería.

Sumario de la invención

La invención según se define en las reivindicaciones se refiere a constructos de tejido manipulado mediante bioingeniería de células cultivadas y componentes de la matriz extracelular producidos endógenamente sin la necesidad de componentes de la matriz exógenos ni elementos de soporte reticular o estructurales. Por tanto, la invención puede realizarse ventajosamente en su totalidad a partir de células humanas, y componentes de la matriz humanos producidos por esas células, por ejemplo, cuando se diseña el constructo de tejido manipulado mediante bioingeniería para su uso en seres humanos.

La invención según se define en las reivindicaciones también se refiere a métodos para producir constructos de tejido mediante la estimulación de células de fibroblastos cultivados para producir componentes de la matriz extracelular sin la adición ni de componentes de la matriz exógenos, ni de un soporte reticular ni de elementos estructura-
les.

Además, este constructo de tejido según se define en las reivindicaciones puede prepararse mediante siembras en serie de diferentes tipos celulares para producir un tejido cultivado que imita la composición celular y estructuras tisulares de los tejidos nativos.

Todavía adicionalmente, según se define en las reivindicaciones, el constructo de tejido se produce y autoensambla mediante células cultivadas sin la necesidad de un soporte estructural ni de la adición de componentes de la matriz extracelular exógenos.

Las características de resistencia de los constructos de tejido lo hacen manejable para retirarse fácilmente y de manera despegable del aparato de cultivo en el que se forma y trasplantarse directamente, sin la necesidad de ningún soporte o vehículo en aplicaciones clínicas o de prueba.

Los constructos de tejido de la invención son útiles para fines clínicos tales como el injerto a un paciente con un defecto orgánico o tisular, tal como una úlcera o herida en la piel, o para las pruebas del tejido in vitro o el injerto a un animal, tales como las pruebas de seguridad o la validación de productos farmacéuticos, cosméticos y químicos.

Descripción de las figuras

La figura 1 es una gráfica que representa el aumento de la concentración de colágeno determinado mediante el ensayo de la hidroxiprolina, en comparación con el número de células en el constructo dérmico derivado de células de prepucio neonatal humano descrito en el ejemplo 1.

La figura 2 es una fotomicrografía (objetivo 20x) de una sección fijada, incluida en parafina, teñida con hematoxilina y eosina, de un constructo de matriz celular a partir de fibroblastos dérmicos humanos cultivados, en medio definido químicamente a los 21 días. La membrana porosa aparece como una banda translúcida delgada por debajo del constructo.

La figura 3 muestra imágenes al microscopio electrónico de transmisión de dos ampliaciones de un constructo de matriz celular formado a partir de fibroblastos humanos dérmicos cultivados, en medio definido químicamente, a los 21 días. La figura 3A es una ampliación 7600X que muestra la matriz endógena, incluyendo la alineación de las fibras de colágeno entre los fibroblastos. La figura 3B es una ampliación 19000X de fibras de colágeno endógenas totalmente formadas, que demuestran la disposición y empaquetamiento de las fibrillas.

La figura 4 es una fotomicrografía (objetivo 20x) de una sección fijada, incluida en parafina, teñida con hematoxilina y eosina de un constructo de piel cultivada formado en medio definido químicamente en ausencia de componentes de la matriz exógenos que comprende un constructo de matriz celular formado a partir de fibroblastos dérmicos humanos cultivados, en medio definido químicamente, con una epidermis diferenciada, de varias capas formada a partir de queratinocitos humanos cultivados en medio definido químicamente.

Descripción detallada de la invención

Hasta este momento, los constructos actuales de tejido vivo manipulado mediante ingeniería genética no son completamente de células ensambladas y deben basarse en la adición o incorporación de componentes de la matriz exógenos o elementos sintéticos para estructura o soporte, o ambos.

Los constructos de tejido manipulado mediante bioingeniería descritos en el presente documento y definidos en las reivindicaciones muestran muchas de las características nativas del tejido a partir del cual se derivan sus células. Los constructos de tejido así producidos pueden utilizarse para su injerto a un paciente o para pruebas in vitro.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un constructo de piel cultivada que tiene al menos dos capas, que comprende:

(a) una primera capa de células de fibroblastos dérmicos cultivados, cultivadas en condiciones para producir una capa de matriz extracelular que se sintetiza y ensambla mediante las células de fibroblastos cultivados, estando contenidas las células de fibroblastos cultivados dentro de la capa de matriz extracelular sintetizada, en la que la matriz extracelular comprende:

(i): colágeno tipo I y tipo III que muestra una organización de empaquetamiento de las fibrillas y mostrando los haces de fibrillas un modelo de bandas de 67 nm escalonadas un cuarto de su longitud ("quarter-staggered");

(ii): decorina;

(iii): fibronectina;

(iv): tenascina; y

(v): glucosaminoglucanos;

en el que dicha matriz extracelular se produce por las células de fibroblastos dérmicos cultivados en ausencia de componentes de la matriz exógenos o elementos sintéticos durante las condiciones de cultivo; y,

(b) una segunda capa de células de queratinocitos dispuesta sobre la primera capa para formar una capa de células epidérmicas, en la que la capa de células epidérmicas es diferenciada, estratificada, de varias capas, y muestra una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo;

y en el que el constructo de piel cultivada de dos capas tiene una membrana basal presente en la unión de la primera y segunda capas.

De manera adecuada, en tales constructos de la invención, las células de fibroblastos cultivados pueden modificarse mediante ingeniería genética para producir componentes de la matriz extracelular. Las células de fibroblastos cultivados pueden modificarse mediante ingeniería genética para producir un factor de crecimiento, hormona, péptido o proteína.

Los constructos de piel cultivada de la invención comprenden una capa estructural de al menos un tipo de células de fibroblastos dérmicos productores de matriz extracelular y componentes de la matriz extracelular producidos endógenamente, denominados más sencillamente "matriz", en la que la matriz se sintetiza completamente por células y se ensambla cultivando las células. Esta capa se denomina en el presente documento "constructo de matriz celular" o "capa de matriz celular" porque las células secretan y están contenidas ellas mismas dentro y a través de su matriz. Los constructos de tejido cultivado no requieren, y por tanto no incluyen, componentes de la matriz exógenos, es decir, componentes de la matriz no producidos por las células cultivadas sino introducidos por otros medios. El constructo de matriz celular producido por fibroblastos dérmicos humanos ha demostrado tener una concentración predominante de colágeno, similar a la piel nativa. Tal como se demuestra mediante microscopía electrónica, la matriz es de naturaleza fibrosa, comprendiendo colágeno que muestra el modelo de bandas de 67 nm escalonadas un cuarto de su longitud, así como la organización empaquetada de las fibrillas y los haces de fibrillas, similar al colágeno nativo. La SDS-PAGE de reducción retardada ha detectado la presencia tanto de colágeno tipo I como tipo III en estos constructos, los tipos de colágeno predominantes que se encuentran en la piel humana nativa. Utilizando técnicas de inmunohistoquímica (IHC) convencionales, el constructo de matriz celular dérmica se tiñe positivamente para decorina, un proteoglucano de sulfato de dermatán que se sabe que se asocia con las fibrillas de colágeno y que se cree que regulan el diámetro de las fibrillas in vivo. La decorina también puede visualizarse en el constructo con TEM. El tejido producido también se tiñe positivamente para tenascina, una glucoproteína de la matriz celular que se encuentra, por ejemplo, en la mesénquima o tejidos en reparación. De manera muy similar al tejido en reparación in vivo, el tejido producido en cultivo ha demostrado aumentar su razón de colágeno tipo I con respecto al tipo III a medida que se forma la matriz. Aunque no se desea limitarse a ninguna teoría, se cree que las células llenan el espacio abierto entre ellas rápidamente con una matriz laxa análoga al tejido de granulación compuesto principalmente por colágeno tipo III y fibronectina, y luego reestructura esta matriz laxa con una matriz más densa compuesta en su mayor parte por colágeno tipo I. La matriz celular producida ha demostrado que contiene glucosaminoglucanos (GAG), tales como ácido hialurónico (HA); fibronectina; proteoglucanos además de la decorina, tales como biglucano y versicano; y un perfil de glucosaminoglucanos sulfatados tales como ácido di-hialurónico, O-sulfato de di-condroitina; 4-sulfato de di-condroitina; 6-sulfato de di-condroitina; 4,6-sulfato de di-condroitina; 4-sulfato-UA-2S de di-condroitina; y 6-sulfato-UA-2S de di-condroitina. Estas características estructurales y bioquímicas se muestran por sí mismas según se desarrolla el constructo en cultivo y son evidentes de manera particular cuando el constructo se aproxima a su forma final. La presencia de estos componentes en un constructo de matriz celular dérmica cultivada completamente formado indica que el constructo tiene características estructurales y bioquímicas que se aproximan a la de la dermis normal.

El constructo de piel cultivada de la invención tiene una capa de matriz celular que tiene una segunda capa de células dispuesta sobre la misma. La segunda capa de células se cultiva sobre la capa de matriz celular para formar un constructo de tejido de dos capas manipulado mediante bioingeniería. La segunda capa comprende queratinocitos cultivados que junto con la primera capa de matriz celular, un constructo de matriz celular formado a partir de fibroblastos dérmicos y una matriz endógena para formar una capa dérmica, comprenden un constructo de piel viva. Cuando se forma completamente, la capa epidérmica es una capa bien diferenciada, estratificada, de varias capas de queratinocitos que muestran una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo. El constructo de piel tiene una membrana basal bien desarrollada presente en la unión dermo-epidérmica, tal como muestra mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). La membrana basal parece ser más gruesa alrededor de los hemidesmosomas, marcado mediante fibrillas de anclaje que se componen de colágeno tipo VII, tal como se visualiza mediante TEM. Las fibrillas de anclaje pueden observarse saliendo de la membrana basal y atrapando las fibrillas de colágeno en la capa dérmica. Estas fibrillas de colágeno, así como otros componentes de la membrana basal, se secretan por los queratinocitos. También se sabe que aunque los queratinocitos pueden secretar componentes de la membrana basal por sí mismos, no se formará una membrana basal reconocible en ausencia de fibroblastos. La tinción inmunohistoquímica del constructo de piel de la presente invención también ha mostrado que está presente laminina, una proteína de la membrana basal.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un constructo de piel cultivada de dos capas que comprende una capa dérmica y una capa epidérmica dispuesta sobre la misma en ausencia de una estructura de soporte estructural o componentes de la matriz exógenos, en el que el método comprende las etapas de:

(a) sembrar las células de fibroblastos sobre una membrana porosa en un recipiente de cultivo, en un primer medio de cultivo celular definido químicamente, a una densidad de entre aproximadamente 1 x 10^{5} células/cm^{2} y aproximadamente 6,6 x 10^{5} células/cm^{2};

(b) cultivar las células de fibroblastos de la etapa (a) en el primer medio de cultivo celular definido químicamente hasta una confluencia de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 100%;

(c) estimular las células de fibroblastos de la etapa (a) para sintetizar, secretar y organizar los componentes de la matriz extracelular mediante el cultivo de las células en un segundo medio de cultivo definido químicamente;

(d) cultivar de manera continuada las células de fibroblastos hasta que las células formen una capa de matriz extracelular sintetizada de al menos 30 micras de espesor, con las células de fibroblastos cultivados contenidas dentro de la capa de matriz extracelular sintetizada,

en el que la matriz extracelular comprende:

(i): colágeno tipo I y tipo III que muestra una organización empaquetada de las fibrillas y los haces de fibrillas que muestra un modelo de bandas de 67 nm escalonadas en un cuarto de su longitud;

(ii): decorina;

(iii): tenascina; y

(iv): glucosaminoglucanos;

: en el que dicha matriz extracelular se produce por las células de fibroblastos dérmicos cultivados, en ausencia de componentes de la matriz exógenos o elementos sintéticos durante las condiciones de cultivo;

(e) sembrar células de queratinocitos en la superficie superior de la matriz extracelular sintetizada de la etapa (d), y,

(f) cultivar las células de queratinocitos en condiciones de cultivo para formar una capa epidérmica,

en el que la capa de células epidérmicas es una capa diferenciada, estratificada, de varias capas de queratinocitos que muestran una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo;

y en el que el constructo de piel cultivada de dos capas tiene presente una membrana basal en la unión de la primera y segunda capas.

Generalmente, las células de fibroblastos producen varias proteínas de la matriz extracelular, principalmente colágeno. Existen varios tipos de colágenos producidos por los fibroblastos, sin embargo, el colágeno tipo I es el más frecuente in vivo. Las cepas celulares de fibroblastos humanos pueden derivarse de varias fuentes, incluyendo pero sin limitarse a prepucio masculino neonatal, dermis, tendón, pulmón, cordón umbilical, cartílago, uretra, estroma corneal, mucosa oral e intestino. Las células humanas pueden incluir pero sin limitarse necesariamente a fibroblastos, sino que pueden incluir: células de músculo liso, condrocitos y otras células del tejido conjuntivo de origen mesenquimatoso. Se prefiere, pero no se requiere, que el origen de la célula productora de matriz utilizada en la producción de un constructo de tejido se derive de un tipo de tejido al que va a parecerse o imitar tras el empleo de los métodos de cultivo de la invención. Por ejemplo, cuando se produce un constructo de piel, la célula productora de matriz es un fibroblasto, preferiblemente de origen dérmico. En otra realización preferida, pueden utilizarse los fibroblastos aislados mediante microdisección de la papila dérmica de folículos capilares para producir la matriz sola o en asociación con otros fibroblastos. En la realización en la que se produce un constructo corneal, la célula productora de matriz se deriva del estroma corneal. Los donantes de células pueden variar en desarrollo y edad. Las células pueden derivarse de tejidos de donantes de embriones, neonatos o individuos mayores incluyendo adultos. Pueden utilizarse células progenitoras embrionarias tales como células madre mesenquimatosas en la invención e inducir que se diferencien para desarrollarse hasta el tejido deseado.

Aunque se prefieren células humanas para su uso en la invención, las células que van a utilizarse en el método de la invención no se limitan a células de fuentes humanas. Pueden utilizarse células procedentes de otras especies de mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a, fuentes equinas, caninas, porcinas, bovinas y ovinas; o especies de roedores tales como ratón o rata. Además, también pueden utilizarse células que se transfectan espontánea, química o viralmente o recombinantes o células manipuladas mediante ingeniería genética en esta invención. Para aquellas realizaciones que incorporan más de un tipo celular, pueden utilizarse mezclas híbridas de células normales de dos o más fuentes; mezclas de células normales y modificadas genéticamente o transfectadas; o mezclas de células de dos o más especies o fuentes tisulares.

Las células recombinantes o manipuladas mediante ingeniería genética pueden utilizarse en la producción de un constructo de matriz celular para crear un constructo de tejido que actúa como un injerto de administración de fármaco para un paciente que necesita un aumento de los niveles de los productos celulares naturales o tratamiento con un agente terapéutico. Las células pueden producir y suministrar al paciente a través del injerto, productos celulares recombinantes, factores de crecimiento, hormonas, péptidos o proteínas durante una cantidad continua de tiempo o según se necesite cuando se señalice biológica, química o térmicamente debido a las condiciones presentes en el paciente. Es deseable la expresión del producto génico a corto o largo plazo, dependiendo de la indicación de uso del constructo tisular cultivado. La expresión a largo plazo es deseable cuando el constructo de tejido cultivado se implanta para suministrar productos terapéuticos a un paciente durante un periodo prolongado de tiempo. Por el contrario, la expresión a corto plazo se desea en los casos en los que el constructo de tejido cultivado se injerta a un paciente que tiene una herida en la que las células del constructo de tejido cultivado van a promover la cicatrización normal o casi normal o van a reducir la cicatrización patológica del sitio de la herida. Una vez que la herida ha cicatrizado, los productos génicos procedentes del constructo de tejido cultivado ya no se necesitan más o pueden no desearse ya en el sitio. Las células también pueden manipularse mediante ingeniería genética para expresar proteínas o diferentes tipos de componentes de la matriz extracelular que son "normales" pero expresados a niveles elevados o modificados de alguna manera para preparar un dispositivo de injerto que comprende matriz extracelular y células vivas que son ventajosas terapéuticamente para mejorar la cicatrización de heridas, facilitar o dirigir la neovascularización o minimizar las cicatrices o la formación cicatrices hipertróficas. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica, y se describen en Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), incorporado como referencia al presente documento. Todos los tipos de células mencionados anteriormente se incluyen dentro de la definición de una "célula productora de matriz" tal como se utiliza en esta invención.

El componente principal de la matriz extracelular predominante producido por los fibroblastos es colágeno fibrilar, particularmente colágeno tipo I. El colágeno fibrilar es un componente clave en la estructura de la matriz extracelular; sin embargo, esta invención no se limita a matrices compuestas sólo por esta proteína o tipo de proteína. Por ejemplo, pueden producirse otros colágenos, tanto colágeno fibrilar como no fibrilar de la familia del colágeno, tales como los tipos de colágeno II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, mediante el uso del tipo de célula apropiado. De manera similar, otras proteínas de la matriz que pueden producirse y depositarse utilizando el presente método incluyen, pero sin limitarse a, elastina; proteoglucanos tales como decorina o biglucano; o glucoproteínas tales como tenascina; vitronectina; fibronectina; laminina, trombospondina I, y glucosaminoglucanos (GAG) tales como ácido hialurónico (HA).

La célula productora de la matriz se cultiva en un recipiente adecuado para un cultivo tisular o celular animal, tal como una placa, matraz o frasco rotativo de cultivo, que permiten la formación de una estructura tridimensional similar a un tejido. Las superficies de crecimiento celular adecuadas sobre las que pueden hacerse crecer las células pueden ser cualquier material compatible biológicamente al que pueden adherirse las células y proporcionar un medio de anclaje para que se forme en constructo de matriz celular. Pueden utilizarse materiales tales como vidrio; acero inoxidable; polímeros, incluyendo policarbonato, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polivinilideno, polidimetilsiloxano, fluoropolímeros y etileno-propileno fluorados; y sustratos de silicio, incluyendo sílice fundida, polisilicio o cristales de silicio, como superficies de crecimiento celular. El material de la superficie de crecimiento celular puede tratarse o modificarse químicamente, cargarse electrostáticamente o recubrirse con productos biológicos tales como poli-L-lisina o péptidos. Un ejemplo de un recubrimiento peptídico es el péptido RGD.

Aunque el constructo de tejido de la invención puede hacerse crecer sobre una superficie sólida de crecimiento celular, se prefiere una superficie de crecimiento celular con poros que comunican tanto la superficie superior como la inferior de la membrana para permitir el contacto bilateral del medio con el constructo de tejido en desarrollo o para el contacto sólo desde abajo del cultivo. El contacto bilateral permite que el medio esté en contacto tanto con la superficie superior como con la inferior del constructo en desarrollo para una exposición del área superficial máxima para los nutrientes contenidos en el medio. El medio también puede estar en contacto sólo con la parte inferior del tejido cultivado en formación de modo que la superficie superior puede exponerse al aire, como en el desarrollo de un constructo de piel cultivada. El recipiente de cultivo preferido es el que utiliza un inserto de vehículo, un elemento permeable tratado con el cultivo tal como una membrana porosa que se suspende en el recipiente de cultivo que contiene el medio. Normalmente, la membrana se sujeta a un extremo del elemento o armazón tubular que se inserta dentro y hace contacto con una base, tal como una placa Petri o de cultivo que puede cubrirse con una tapa. Los recipientes de cultivo que incorporan un inserto de vehículo con una membrana porosa se conocen en la técnica y se prefieren para llevar a cabo la invención y se describen en varias patentes de los Estados Unidos en el campo, algunas de las cuales se han hecho disponibles comercialmente, incluyendo por ejemplo: 5.766.937, 5.466.602, 5.366.893, 5.358.871, 5.215.920, 5.026.649, 4.871.674, 4.608.342, cuyas descripciones se incorporan al presente documento. Cuando se emplean estos tipos de recipientes de cultivo, se produce el constructo de tejido sobre una superficie de la membrana, preferiblemente la superficie superior, que da hacia arriba y el cultivo se pone en contacto mediante los medios celulares tanto en la superficie superior como en la inferior. Los poros en la superficie de crecimiento permiten el paso de los medios de cultivo para proporcionar nutrientes al lado inferior del cultivo a través de la membrana, permitiendo así que las células se alimenten bilateralmente o sólo desde el lado inferior. Un tamaño de poro preferido es uno suficientemente pequeño para que no permita el crecimiento de células a través de la membrana, aunque suficientemente grande para permitir el paso libre de los nutrientes contenidos en el medio de cultivo hasta la superficie inferior del constructo de matriz celular, tal como mediante acción capilar. Los tamaños de poro preferidos son aproximadamente inferiores a 3 micras, pero se emplean poros de tamaño que oscilan entre aproximadamente 0,1 micras y aproximadamente 3 micras, más preferiblemente entre aproximadamente 0,2 micras y aproximadamente 1 micra y lo más preferiblemente entre aproximadamente 0,4 micras y aproximadamente 0,6 micras. En el caso de fibroblastos dérmicos humanos, el material más preferido es policarbonato que tiene un tamaño de poro que esta entre aproximadamente 0,4 micras y aproximadamente 0,6 micras. El tamaño de poro máximo depende no sólo del tamaño de la célula sino también de la capacidad de la célula para alterar su forma y pasar a través de la membrana. Es importante que el constructo similar a tejido se adhiera a la superficie pero no se incorpore o envuelva el sustrato, de modo que pueda retirarse de él, tal como mediante despegado con una fuerza mínima. El tamaño y la forma del constructo de tejido formado están dictados por el tamaño de la superficie del recipiente o membrana sobre la que crece. Los sustratos pueden ser redondos o angulares o formarse con ángulos de esquinas redondeadas, o de forma irregular. Los sustratos también pueden ser planos o contorneados como un molde para producir un constructo con cierta forma para entrar en contacto con una herida o imitar la estructura física del tejido nativo. Para dar cuenta de mayores áreas superficiales del sustrato de crecimiento, se siembran proporcionalmente más células en la superficie y se necesita un mayor volumen de medios para bañar y nutrir suficientemente las células. Cuando se forma finalmente un constructo de tejido, ya sea un constructo de matriz celular de una sola capa o un constructo de dos capas, se retira mediante despegado del sustrato de membrana antes de injertárselo a un paciente.

Los constructos de tejido cultivado de la invención no se basan en elementos sintéticos o biorreabsorbibles, tales como un elemento de malla para la formación de constructos de tejido. El elemento de malla se organiza como un material tejido, de tejido de punto o de fieltro. En los sistemas en los que se emplea un elemento de malla, las células se cultivan sobre el elemento de malla y se hacen crecer sobre cada lado y dentro de los intersticios de la malla para envolver e incorporar la malla dentro del constructo de tejido cultivado. El constructo final formado mediante los métodos que incorporan una malla de este tipo se basan en ella para el soporte físico y para su volumen. Ejemplos de constructos de tejido que se basan en elementos de malla sintética se encuentran en las patentes de los EE.UU. números 5.580.781, 5.443.950, 5.266.480, 5.032.508, 4.963.489 concedidas a Naughton, et al.

El sistema para la producción de la capa de matriz celular puede ser estático o puede emplear un medio de perfusión para los medios de cultivo. En el sistema estático, el medio de cultivo está quieto y relativamente sin movimiento en contraste con el sistema de perfusión en el que el medio está en movimiento. La perfusión del medio afecta a la viabilidad de las células y aumenta el desarrollo de la capa de matriz. Los medios de perfusión incluyen, pero no se limitan a: utilizar una barrita de agitación magnética o impulsor motorizado en la placa de cultivo subyacente (por debajo) o adyacente al vehículo del sustrato que contiene la membrana de cultivo para agitar el medio; bombear el medio dentro o a través de la placa o cámara de cultivo; agitar suavemente la placa de cultivo sobre una plataforma con agitación o rotación; o hacerlo girar, si se produce, en un frasco rotativo. Otros medios de perfusión pueden determinarse por el experto en la técnica para su uso en el método de la invención.

Las formulaciones de medios de cultivo adecuadas para su uso en la presente invención se seleccionan basándose en los tipos celulares que van a cultivarse y en la estructura de tejido que va a producirse. El medio de cultivo que se utiliza y las condiciones de cultivo específicas necesarias para promover el crecimiento celular, la síntesis de la matriz y la viabilidad dependerán del tipo de célula que se esté haciendo crecer.

En la fabricación de constructos de piel de dos capas manipulados mediante bioingeniería de la presente invención, la composición de los medios varía con cada fase de fabricación según es necesario un aporte complementario distinto para diferentes fines. La capa de matriz celular se forma en condiciones definidas, es decir, se cultiva en medios definidos químicamente.

El constructo de tejido comprende una capa de matriz celular dotada con una segunda capa de células dispuesta y cultivada sobre ella, en la que se cultivan ambos tipos de células en un sistema de medios de cultivo definidos. Alternativamente, el constructo de tejido comprende una capa de matriz celular fabricada en condiciones de medios definidos y se forma una segunda capa sobre ella en condiciones de medios no definidos. Al contrario, el constructo de tejido comprende una capa de matriz celular que puede fabricarse en condiciones de medios definidos y se forma una segunda capa sobre ella en condiciones de medios definidos.

Se prefiere el uso de medios definidos químicamente, es decir, medios sin extractos de tejidos u órganos de animales no definidos, por ejemplo, suero, extracto hipofisario, extracto hipotalámico, extracto placentario o extracto embrionario o proteínas o factores secretados por las células alimentadoras. En la realización más preferida, los medios carecen de componentes no definidos y componentes biológicos definidos derivados de fuentes no humanas. Aunque no se prefiere la adición de componentes no definidos, pueden utilizarse según los métodos descritos en cualquier punto en cultivo, con el fin de fabricar satisfactoriamente un constructo de tejido. Cuando la invención se lleva a cabo utilizando células humanas seleccionadas, cultivadas utilizando componentes definidos químicamente que no se derivan de fuentes de animales no humanos, el constructo de tejido resultante es un constructo de tejido humano definido. También pueden añadirse equivalentes funcionales sintéticos para complementar los medios definidos químicamente dentro del ámbito de la definición de definido químicamente para su uso en el método de fabricación más preferido. Generalmente, un experto en la técnica del cultivo celular podrá determinar equivalentes humanos naturales, recombinantes humanos o sintéticos adecuados de componentes animales conocidos comúnmente para complementar los medios de cultivo de la invención sin excesiva investigación o experimentación. Las ventajas de utilizar tal constructo en la clínica es que disminuyen la preocupación por la contaminación cruzada y la infección por especies víricas o animales adventicias. En el contexto de las pruebas, las ventajas de un constructo definido químicamente es que cuando se prueba, no hay posibilidad de que se confundan los resultados debido a la presencia de componentes no definidos.

El medio de cultivo está compuesto por una base de nutrientes normalmente complementada adicionalmente con otros componentes. La persona experta puede determinar bases de nutrientes apropiadas en la técnica del cultivo de células animales con expectativas razonables de producir satisfactoriamente un constructo de tejido de la invención. Muchas fuentes de nutrientes disponibles comercialmente son útiles en la práctica de la presente invención. Éstas incluyen fuentes de nutrientes disponibles comercialmente que suministran sales inorgánicas, una fuente de energía, aminoácidos y vitaminas B, tales como el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); medio esencial mínimo (MEM); M199; RPMI 1640; medio de Dulbecco modificado por Iscove (EDMEM). El medio esencial mínimo (MEM) y M199 requieren la complementación adicional de precursores de fosfolípidos y aminoácidos no esenciales. Las mezclas ricas en vitaminas disponibles comercialmente que suministran aminoácidos, ácidos nucleicos, cofactores enzimáticos, precursores de fosfolípidos y sales inorgánicas incluyen F-12 de Ham, F-10 de Ham, NCTC 109 y NCTC 135. Aunque en concentraciones variables, todos los medios basales proporcionan una fuente de nutrientes básicos para las células en la forma de glucosa, aminoácidos, vitaminas e iones inorgánicos, junto con otros componentes de los medios básicos. El medio base más preferido de la invención comprende una base de nutrientes de un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin calcio o con baja cantidad de calcio o, alternativamente, DMEM y F-12 de Ham entre una razón de 3 a 1 y una razón de 1 a 3, respectivamente.

El medio base se complementa con componentes tales como aminoácidos, factores de crecimiento y hormonas. Los medios de cultivo definidos para el cultivo de células de la invención se describen en la patente de los EE.UU. número 5.712.163 concedida a Parenteau y en la publicación internacional PCT número WO 95/31473, cuyas descripciones se incorporan como referencia al presente documento. Se conocen otros medios en la técnica tales como los descritos en Ham y McKeehan, Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979) o para otros medios definidos químicamente apropiados, en Bottenstein et al, Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979). En la realización preferida, el medio base se complementa con los siguientes componentes conocidos por los expertos en la técnica del cultivo de células animales: insulina, transferrina, triyodotironina (T3) y cualquiera o ambos de etanolamina y o-fosforil-etanolamina, en las que las concentraciones y sustituciones para los aportes complementarios pueden determinarse por la persona experta.

La insulina es una hormona polipeptídica que fomenta la captación de glucosa y aminoácidos para proporcionar beneficios a largo plazo durante múltiples pases. El aporte complementario de insulina o factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) es necesario para el cultivo a largo plazo ya que habrá una reducción final en la capacidad de las células para captar glucosa y aminoácidos y la posible degradación del fenotipo celular. La insulina puede derivarse de fuentes animales, por ejemplo bovina, humanas o por medios recombinantes como insulina recombinante humana. Por tanto, la insulina humana se clasificaría como un componente definido químicamente no derivado de una fuente biológica no humana. El aporte complementario de insulina es aconsejable para el cultivo en serie y se proporciona a los medios en un amplio intervalo de concentraciones. Un intervalo de concentración preferido es de entre aproximadamente 0,1 \mug/ml y aproximadamente 500 \mug/ml, más preferiblemente de aproximadamente 5 \mug/ml a aproximadamente 400 \mug/ml y lo más preferiblemente de aproximadamente 375 \mug/ml. Las concentraciones apropiadas para el aporte complementario de factor de crecimiento similar a la insulina, tal como IGF-1 o IGF-2, puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica para los tipos de células elegidos para el cultivo.

La transferrina está en el medio para la regulación del transporte de hierro. El hierro es un oligoelemento esencial que se encuentra en el suero. Dado que el hierro puede ser tóxico para las células en su forma libre, en suero se suministra a las células unido a transferrina a un intervalo de concentración de preferiblemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 50 \mug/ml, más preferiblemente a aproximadamente 5 \mug/ml.

La triyodotironina (T3) es un componente básico y es la forma activa de la hormona tiroidea que se incluye en el medio para mantener las tasas del metabolismo celular. La triyodotironina se aporta como complemento al medio a un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 400 \rhoM, más preferiblemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 200 \rhoM y lo más preferiblemente a aproximadamente 20 \rhoM.

Se añaden cualquiera o ambas de etanolamina y o-fosforil-etanolamina, que son fosfolípidos, cuya función es un importante precursor en la ruta del inositol y el metabolismo de los ácidos grasos. El aporte complementario de lípidos que se encuentran normalmente en el suero es necesario en un medio sin suero. La etanolamina y o-fosforil-etanolamina se proporcionan al medio a un intervalo de concentración de entre aproximadamente 10^{-6} y aproximadamente 10^{-2} M, más preferiblemente a aproximadamente 1 x 10^{-4} M.

En toda la duración del cultivo, el medio base de complementa adicionalmente con otros componentes para inducir la síntesis o diferenciación o para mejorar el crecimiento celular, tales como hidrocortisona, selenio y L-glutamina.

Se ha demostrado que la hidrocortisona en el cultivo de queratinocitos fomenta el fenotipo de los queratinocitos y, por tanto, fomenta características diferenciadas tales como el contenido en transglutaminasa de los queratinocitos e involucrina (Rubin et al., J. Cell Physiol., 138:208-214 (1986)). Por tanto, la hidrocortisona es un aditivo deseable en los casos en los que estas características son beneficiosas, tal como en la formación de injertos de láminas de queratinocitos o constructos de piel. La hidrocortisona puede aportarse en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,01 ug/ml a aproximadamente 4,0 \mug/ml, lo más preferiblemente entre aproximadamente 0,4 \mug/ml y 16 ug/ml.

Se añade selenio a los medios sin suero para volver a complementar los oligoelementos de selenio proporcionados normalmente por el suero. El selenio puede aportarse en un intervalo de concentración de aproximadamente 10^{-9} M a aproximadamente 10^{-7} M; lo más preferiblemente a aproximadamente 5,3 x 10^{-8} M.

El aminoácido L-glutamina está presente en algunas bases de nutrientes y puede añadirse en los casos en los que no hay ninguna cantidad presente o cantidades insuficientes. La L-glutamina también puede aportarse en forma estable tal como la vendida con la marca, GlutaMAX-1^{MR} (Gibco BRL, Grand Island, NY). GlutaMAX-1^{MR} es la forma de dipéptido estable de L-alanil-L-glutamina y puede utilizarse de manera intercambiable con L-glutamina y se aporta en concentraciones equimolares como un sustituto de la L-glutamina. El dipéptido facilita estabilidad a la L-glutamina frente a la degradación con el tiempo en almacenamiento y durante la incubación que puede conducir a incertidumbre en la concentración eficaz de L-glutamina en el medio. Normalmente, el medio base se complementa con preferiblemente entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 6 mM, más preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 5 mM, y lo más preferiblemente L-glutamina o GlutaMAX-1^{MR} 4 mM.

También pueden añadirse factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) al medio para ayudar en el establecimiento de los cultivos mediante ampliación a escala celular y siembra. Puede utilizarse EGF en forma nativa o en forma recombinante. Las formas humanas, nativa o recombinante, de EGF se prefieren para su uso en el medio cuando se fabrica un equivalente a la piel que contiene componentes biológicos no humanos. El EGF es un componente opcional y puede aportarse en una concentración entre aproximadamente 1 y 15 ng/ml, más preferiblemente entre 5 y 10 mg/ml.

El medio descrito anteriormente se prepara normalmente tal como se expone a continuación. Sin embargo, debe entenderse que los componentes de la presente invención pueden prepararse y ensamblarse utilizando la metodología convencional compatible con sus propiedades físicas. Se conoce bien en la técnica sustituir ciertos componentes por un agente apropiado análogo o que actúa de manera funcionalmente equivalente para los fines de disponibilidad o economía y la llegada a un resultado similar. Los factores de crecimiento que se producen de manera natural pueden sustituirse por factores de crecimiento recombinantes o sintéticos que tienen cualidades y resultados similares cuando se utilizan en la realización de la invención.

Los medios según la presente invención son estériles. Los componentes estériles se adquieren estériles o se hacen estériles mediante procedimientos convencionales, tales como filtración, tras su preparación. Se utilizaron procedimientos asépticos apropiados en todos los ejemplos siguientes. Se combinaron en primer lugar DMEM y F-12 y luego se añadieron los componentes individuales para completar el medio. Las soluciones madre de todos los componentes pueden almacenarse a -20ºC, con la excepción de la fuente de nutrientes que puede almacenarse a 4ºC. Todas las soluciones madre se preparan a 500 X las concentraciones finales enumeradas anteriormente. Se prepara una solución madre de insulina, transferrina y triyodotironina (todas de Sigma) tal como sigue: se disuelve inicialmente la triyodotironina en etanol absoluto en ácido clorhídrico (HCl) 1 N a una razón de 2:1. La insulina se disuelve en HCl diluido (aproximadamente 0,1 N) y la transferrina se disuelve en agua. Las tres se mezclan luego y se diluyen con agua hasta una concentración 500 X. Se disuelven la etanolamina y o-fosforil-etanolamina en agua hasta una concentración 500 X y se esterilizan por filtración. La progesterona se disuelve en etanol absoluto y se diluye con agua. La hidrocortisona se disuelve en etanol absoluto y se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El selenio se disuelve en agua hasta una concentración 500X y se esteriliza por filtración. El EGF se adquiere estéril y se disuelve en PBS. La adenina es difícil de disolver pero puede disolverse mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Puede añadirse albúmina sérica a ciertos componentes con el fin de estabilizarlos en solución y se deriva actualmente de fuentes humanas o animales. Por ejemplo, puede añadirse albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA) durante el almacenamiento prolongado para mantener la actividad de las soluciones madre de progesterona y EGF. El medio puede utilizarse inmediatamente tras la preparación, o almacenarse a 4ºC. Si se almacena, EGF no debe añadirse hasta el momento de su uso.

Con el fin de formar la capa de matriz celular mediante el cultivo de células productoras de matriz, el medio se complementa con agentes adicionales que promuevan la síntesis de matriz y la deposición mediante las células. Estos agentes complementarios son compatibles con las células, definidos hasta un alto grado de pureza y carecen de contaminantes. El medio utilizado para producir la capa de matriz celular se denomina "medio de producción de la matriz"

Para preparar el medio de producción de la matriz, el medio base se complementa con un derivado de ascorbato tal como ascorbato sódico, ácido ascórbico, o uno de sus derivados más estables químicamente, tal como la sal de magnesio del fosfato del ácido L-ascórbico n-hidratada. El ascorbato se añade para promover la hidroxilación de la prolina y la secreción de procolágeno, un precursor soluble de las moléculas de colágeno depositado. El ascorbato también ha demostrado ser un importante cofactor para el procesamiento postraduccional de otras enzimas así como un regulador por incremento de la síntesis de colágeno tipo I y tipo III.

Aunque no se desea limitarse a ninguna teoría, el aporte complementario del medio con aminoácidos que participan en la síntesis de proteínas conserva la energía celular al no requerir que las células produzcan los aminoácidos ellas mismas. Se prefiere la adición de prolina y glicina ya que, además de la forma hidroxilada de la prolina, la hidroxiprolina, son aminoácidos básicos que forman parte de la estructura del colágeno.

Aunque no se requiere, el medio de producción de la matriz se complementa opcionalmente con un polímero neutro. Los constructos de matriz celular de la invención pueden producirse sin un polímero neutro, pero de nuevo sin querer limitarse a una teoría, su presencia en el medio de producción de la matriz puede dar lugar al procesamiento y la deposición de colágeno de manera más sistemática entre las muestras. Un polímero neutro preferido es el polietilenglicol (PEG), que se ha demostrado que promueve in vitro el procesamiento del procolágeno precursor soluble producido por las células cultivadas para dar colágeno depositado en la matriz. Se prefiere el PEG de calidad para cultivo tisular dentro del intervalo entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 4000 de PM (peso molecular), más preferiblemente entre aproximadamente 3400 y aproximadamente 3700 de PM, en los medios de la invención. Las concentraciones de PEG preferidas son para su uso en el método y puede estar a concentraciones de aproximadamente el 5% p/v o menos, preferiblemente de aproximadamente el 0,01% p/v a aproximadamente el 0,5% p/v, más preferiblemente entre aproximadamente el 0,025% p/v y aproximadamente el 0,2% p/v, lo más preferiblemente de aproximadamente el 0,05% p/v. Pueden utilizarse otros polímeros neutros de calidad para cultivo tales como dextrano, preferiblemente dextrano T-40, o polivinilpirrolidona (PVP), preferiblemente en el intervalo de 30.000-40.000 de PM, en concentraciones de aproximadamente el 5% p/v o menos, preferiblemente entre aproximadamente el 0,01% p/v y aproximadamente el 0,5% p/v, más preferiblemente entre aproximadamente el 0,025% p/v y aproximadamente el 0,2% p/v, lo más preferiblemente de aproximadamente el 0,05% p/v. Pueden determinarse otros agentes de calidad para cultivo celular y compatibles con las células que potencien el procesamiento y la deposición de colágeno por el experto rutinario en la técnica del cultivo de células de mamíferos.

Cuando las células productoras de células son confluentes, y el medio de cultivo se complementa con componentes que ayudan en la síntesis, secreción u organización de la matriz, las células se dice que se estimulan para forman un constructo de tejido compuesto por células y la matriz sintetizada por esas células.

Por tanto, una formulación de medio de producción de la matriz preferido comprende: una mezcla 3:1 base de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina) y medio F-12 de Ham complementado con cualquiera de L-glutamina 4 mM o equivalente, factor de crecimiento epidérmico 5 ng/ml, hidrocortisona 0,4 \mug/ml, etanolamina 1 x 10^{-4} M, o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M, insulina 0,5 \mug/ml, transferrina 5 \mug/ml, triyodotironina 20 \rhoM, selenio 6,78 ng/ml, ácido L-ascórbico 50 ng/ml, L-prolina 0,2 \mug/ml y glicina 0,1 \mug/ml. Al medio de producción, pueden añadirse otros agentes farmacológicos al cultivo para alterar la naturaleza, cantidad o tipo de matriz extracelular secretada. Estos agentes pueden incluir factores de crecimiento polipeptídicos, factores de transcripción o sales inorgánicas para regular por incremento la transcripción del colágeno. Ejemplos de factores de crecimiento polipeptídicos incluyen el factor transformante beta 1 (TGF-\beta1) y activador del plasminógeno tisular (TPA), que se sabe que regulan ambos por incremento la síntesis del colágeno. Raghow et al., Journal of Clinical Investigation, 79:1285-1288 (1987); Pardes et al, Journal of Investigative Dermatology, 100:549 (1993). Un ejemplo de una sal inorgánica que estimula la producción de colágeno es el cerio. Shivakumar et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology 24:775-780 (1992).

Los cultivos se mantienen en una incubadora para garantizar condiciones ambientales suficientes de temperatura, humedad y mezcla de gases controladas para el cultivo de las células. Las condiciones preferidas son de entre aproximadamente 34ºC y aproximadamente 38ºC, más preferiblemente de 37 \pm 1ºC con una atmósfera entre aproximadamente 5-10 \pm 1% de CO_{2} y una humedad relativa (HR) de entre aproximadamente el 80-90%.

El constructo de matriz celular es un constructo dérmico formado por fibroblastos dérmicos y su matriz secretada. Preferiblemente, se utilizan fibroblastos dérmicos humanos, derivados como células primarias de la dermis o más preferiblemente procedentes de bancos o reservas de células establecidas subcultivadas o con pases en serie, que se han seleccionado contra la contaminación viral y bacteriana y que se han probado para determinar su pureza. Las células se cultivan en condiciones suficientes en medio de crecimiento para hacer que proliferen hasta un número apropiado, para sembrar la células en el sustrato de cultivo sobre el que se forma un constructo de matriz celular. Alternativamente, las células procedentes de reservas de células congeladas pueden sembrarse directamente en el sustrato de cultivo.

Una vez que se ha obtenido un número suficiente de células, las células se recogen y siembran sobre una superficie de cultivo adecuada y se cultivan en condiciones de crecimiento apropiadas para formar una lámina confluente de células. En la realización preferida, las células se siembran sobre una membrana porosa que se sumerge para permitir el contacto con el medio desde debajo del cultivo a través de los poros y directamente por encima. Preferiblemente, las células se suspenden en cualquier medio base o de crecimiento y se siembran sobre la superficie de cultivo celular a una densidad de entre aproximadamente 1 x 10^{5} células/cm^{2} y aproximadamente 6,6 x 10^{5} células/cm^{2}, más preferiblemente entre aproximadamente 3 x 10^{5} células/cm^{2} y aproximadamente 6,6 x 10^{5} células/cm^{2} y lo más preferiblemente a aproximadamente 6,6 x 10^{5} células/cm^{2} (células por área de un centímetro cuadrado de la superficie). Los cultivos se cultivan en medio de crecimiento para establecer el cultivo y se cultivan hasta entre aproximadamente el 80% y el 100% de confluencia, momento en el que se inducen químicamente cambiando el medio al medio de producción de la matriz, con el fin de regular por incremento la síntesis y secreción de la matriz extracelular. En un método alternativo, las células se siembran directamente en medio de producción para eliminar la necesidad de cambiar del medio básico al medio de producción, pero es un método que requiere densidades de siembra superiores.

Durante el cultivo, los fibroblastos organizan las moléculas de la matriz secretada para formar un constructo tridimensional similar a tejido pero no muestran fuerzas contráctiles significativas que hagan que el constructo de matriz celular en formación se contraiga y se despegue él mismo del sustrato de cultivo. Los cambios de medios se hacen cada dos o tres días por nuevo medio de producción de la matriz y con el tiempo, la matriz secretada aumenta en espesor y organización. El tiempo necesario para crear un constructo de matriz celular depende de la capacidad de la densidad de siembra inicial, el tipo de célula, la edad de la línea celular y la capacidad de la línea celular para sintetizar y secretar la matriz. Cuando se forman completamente, los constructos de la invención tienen un espesor en volumen debido a la matriz fibrosa producida y organizada por las células; no son cultivos celulares confluentes ordinarios ni demasiado confluentes, en los que las células pueden ser adherentes de manera suelta entre sí. La calidad fibrosa facilita al constructo propiedades cohesiva similares a las del tejido a diferencia de los cultivos ordinarios debido a que resisten el daño físico, tal como el rasgado o al agrietamiento, con el manejo rutinario en una práctica clínica. En la fabricación de un constructo dérmico cultivado, las células formarán una matriz organizada alrededor de ellas mismas sobre la superficie de cultivo celular, preferiblemente al menos de aproximadamente 30 micras de espesor o más, más preferiblemente entre aproximadamente 60 y aproximadamente 120 micras de espesor a lo largo de la superficie de la membrana; sin embargo, se han obtenido espesores superiores a 120 micras y son adecuados para su uso en aplicaciones clínicas o de prueba en las que se necesitan tales mayores espesores.

Se aplica una capa de células epiteliales de queratinocitos a una superficie, preferiblemente la superficie superior que da hacia arriba del constructo de matriz celular. En el constructo de matriz celular, pueden sembrarse células epiteliales y cultivarse sobre el mismo para formar un constructo de varias capas. Se hacen crecer queratinocitos derivados de piel sobre el constructo celular para formar un constructo de piel de la invención.

Los métodos para proporcionar células epidérmicas a un sustrato dérmico, y métodos para su cultivo, incluyendo la inducción de diferenciación y queratinización para formar una capa de queratinocitos diferenciados se conocen en la técnica y se describen en la patente de los EE.UU. número 5.712.163 concedida a Parenteau, et al. y en la patente de los EE.UU. número 5.536.656 concedida a Kemp, et al., cuyo contenido se incorpora como referencia al presente documento. Normalmente, para realizar la epidermización del constructo de matriz celular, se siembran queratinocitos en el constructo de matriz celular y se cultivan sobre el mismo hasta que la capa es de aproximadamente una a tres capas de células de espesor. Los queratinocitos se inducen entonces a que se diferencien para formar una epidermis de varias capas y luego se inducen a que se queratinicen para formar un estrato córneo.

En el método de formación de una capa epidérmica diferenciada, se toman queratinocitos subcultivados de la reserva celular y se expande su número de células. Cuando se ha obtenido el número de células necesario, se sueltan del sustrato de cultivo, se suspenden, se cuentan, se diluyen y se siembran luego en la superficie superior del constructo de matriz celular a una densidad de entre aproximadamente 4,5 x 10^{3} células/cm^{2} y aproximadamente 5,0 x 10^{5} células/cm^{2}, más preferiblemente entre aproximadamente 1,0 x 10^{4} células/cm^{2} y aproximadamente 1,0 x 10^{5} células/cm^{2}, y lo más preferiblemente a aproximadamente 4,5 x 10^{4} células/cm^{2}. Los constructos se incuban entonces durante aproximadamente de 60 a aproximadamente 90 minutos a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2}, para permitir que se unan los queratinocitos. Tras la incubación, los constructos se sumergen en el medio de epidermización. Tras una duración de tiempo suficiente, los queratinocitos proliferan y se dispersan para formar una monocapa confluente a lo largo del constructo de matriz celular. Una vez que es confluente, la formulación de medios celulares se cambia a medio de diferenciación para inducir la diferenciación celular. Cuando se ha formado un epitelio de varias capas, se utiliza entonces medio de queratinización y el cultivo se lleva a la interfase aire-líquido. Para la diferenciación y queratinización de los queratinocitos, las células se exponen a una interfase aire-líquido seca o de baja humedad. Una interfase aire-líquido seca o de baja humedad puede caracterizarse probando por duplicado los bajos niveles de humedad de la piel. Con el tiempo, los queratinocitos expresarán la mayor parte o todas las queratinas y otras características halladas en la piel nativa cuando se expone a estas condiciones.

Opcionalmente, pueden cultivarse juntas poblaciones celulares mixtas de dos o más tipos de células durante la formación de un constructo de piel de la invención siempre que al menos uno de los tipos de células utilizados pueda sintetizar la matriz extracelular. El segundo tipo de células puede ser el necesario para realizar otras funciones tisulares o para desarrollar características estructurales particulares del constructo de tejido. En la producción de un constructo de piel de la invención, pueden cultivarse células de la papila dérmica o células epiteliales procedentes de anejos, con las células productoras de la matriz para permitir la formación de apéndice epiteliales o sus componentes. Pueden formarse apéndices epidérmicos tales como estructuras o componentes de glándulas sudoríparas o sebáceas o estructuras o componentes del folículo piloso cuando se cultivan junto con las células productoras de la matriz. Pueden derivarse células epiteliales de las estructuras de apéndice de glándula y pelo localizadas en la dermis profunda, tal como mediante microdisección, e incluyen células ecrinas, células mioepiteliales, células secretoras glandulares, células madre del folículo piloso. También pueden añadirse otros tipos de células que se encuentran normalmente en la piel, que constituyen la piel tales como melanocitos, células de Langerhans y células de Merkel. De manera similar, pueden cocultivarse células endoteliales vasculares para producir componentes rudimentarios para la formación de nueva vasculatura. También pueden cultivarse adipocitos con las células productoras de la matriz para formar un constructo utilizado para la cirugía plástica. Como modo alternativo de suministro de este segundo tipo celular, las células pueden sembrarse localmente como un punto o como una disposición de cualquier número de puntos de células sobre o dentro de una matriz de tejido celular formada por completo o en formación para el desarrollo localizado de estas estructuras. Para sembrar las células dentro del constructo de matriz celular, las células pueden inyectarse entre las superficies superior e inferior, dentro de la matriz celular, para que las células crezcan, formen estructuras especializadas y realicen su función especializada.

Para producir un constructo de tejido de tres capas, una primera siembra de células que comprenden un tipo celular productor de matriz o un tipo celular que no es productor de matriz se siembra sobre el sustrato de cultivo durante un tiempo suficiente para producir un constructo de matriz celular o una capa de células. Una vez que se forma el primer constructo de matriz celular o capa celular, una segunda siembra de células que comprenden un tipo celular productor de matriz se siembra sobre la superficie superior del primer constructo de matriz celular o capa celular y se cultiva durante un tiempo en condiciones suficientes para producir un segundo constructo de matriz celular sobre el primer constructo. Sobre el segundo constructo de matriz celular, una tercera siembra de un tercer tipo celular se siembra y se cultiva en condiciones suficientes para producir la tercera capa. Como ejemplo, para producir un constructo corneal de tres capas, la célula del primer tipo celular puede estar compuesta por células de origen corneal, tales como células endoteliales corneales; el segundo tipo celular puede comprender células con origen en el tejido conjuntivo, tales como queratocitos corneales; y el tercer tipo celular puede comprender células de origen epitelial, tales como células epiteliales cornales. Como otro ejemplo de un constructo de piel de tres capas, la célula de la primera siembra puede ser de origen vascular para proporcionar componentes para la vascularización, las células de la segunda siembra pueden comprender fibroblastos dérmicos para formar un constructo de matriz celular que sirva como constructo dérmico y las células de la tercera siembra pueden ser queratinocitos epidérmicos para formar una capa epidérmica.

Los constructos de tejido de la invención pueden almacenarse a temperaturas criogénicas cuando se emplean métodos de vitrificación o crioconservación. Los métodos para la vitrificación de tejido se describen en la patente de los EE.UU. número 5.518.878 y los métodos para la crioconservación se describen en las patentes de los EE.UU. números 5.689.961 y 5.891.617 y en la solicitud internacional PCT WO 96/24018, cuyas descripciones se incorporan como referencia al presente documento.

Los constructos de piel de la invención pueden utilizarse en sistemas de prueba de tejidos para pruebas de toxicología in vitro. Los sistemas de prueba que incorporan constructos de piel para fines de prueba se describen en la patente de los EE.UU. número 4.835.102, cuya descripción se incorpora como referencia al presente documento. Debido a que el constructo de piel producido por las células tiene una estructura similar y, lo que es más importante, una organización similar a la piel, puede ser un sistema de prueba valioso como alternativa o sustituto para pruebas en seres humano o animales vivos para determinar la absorción, toxicidad y, en muchos casos, la eficacia de los productos. La producción de la matriz ha demostrado que imita varios de los procesos que se presentan en la producción de la matriz, así como de la reparación de la matriz, in vivo. Debido a esto, el sistema descrito puede ser una herramienta valiosa en el análisis de la reparación de heridas y la generación de tejido y además para la prueba y el análisis de estimulantes químicos y/o físicos de la reparación de heridas.

Los constructos de piel de la invención son adecuados para su injerto o implantación en un huésped mamífero para reconstituir o reparar la piel debido a una lesión o enfermedad. Las indicaciones para el injerto de un constructo de piel incluyen, pero no se limitan a, cirugía plástica o reparadora, heridas cutáneas, quemaduras, psoriasis, úlceras venosas y diabéticas y carcinoma de células basales. Los constructos de piel de la invención son útiles tanto para proteger el tejido lesionado como para servir luego como una estructura para el crecimiento de tejido del huésped. Se cree que el nivel de organización del tejido producido en esta invención también serviría para facilitar y posiblemente acelerar las acciones de reparación de heridas.

Los constructos de matriz celular de la invención tienen propiedades cohesivas. "Cohesivo" tal como se utiliza en el presente documento, significa que puede mantener una integridad unitaria física y propiedades de manejo similares a las del tejido. Las propiedades físicas que facilitan principalmente a los constructos de la invención propiedades cohesivas son el espesor en volumen y la estructura de matriz fibrosa. La matriz extracelular fibrosa se forma a partir de colágeno y otros componentes de la matriz sintetizados por las células, principalmente colágeno fibrilar dispuesto en fibrillas y haces de fibrillas, y facilita a los constructos su volumen. Los constructos de matriz celular de la invención son manejables, es decir, pueden despegarse manualmente de su sustrato de cultivo, sin un soporte de vehículo o herramientas especializadas, y aplicarse al paciente o a un aparato de prueba. Puede resistir daños tales como rasgado o estiramiento de la manipulación ordinaria en la clínica sin detrimento de la estructura o función. Cuando se aplica a un paciente, puede sujetarse en su sitio mediante suturas o grapas.

Para injertar el constructo de piel de la presente invención a un paciente, la zona de injerto se prepara según la práctica habitual. Para indicaciones de quemaduras, los sitios de herida quemados que van a injertarse han de prepararse para el injerto, de modo que la zona de piel quemada se extirpe por completo. Los lechos extirpados aparecerán limpios y clínicamente sin infección antes del injerto. Para heridas de espesor parcial profundo debidas a la escisión quirúrgica, la zona preoperatoria se afeita, si es necesario, se limpia con un limpiador cutáneo antiséptico y antimicrobiano y se enjuaga con solución salina normal. La anestesia local normalmente consiste en la administración intradérmica de lidocaína o epinefrina o ambas. Una vez que se consigue la anestesia, se utiliza un dermátomo para eliminar la piel hasta una profundidad apropiada, creando una herida de espesor parcial profundo. Puede conseguirse la hemostasia mediante compresión con epinefrina que contiene lidocaína y mediante un electrocauterio. El constructo de piel se aplica entonces al lecho de la herida y, si es necesario, se sujeta mediante suturas o grapas en su sitio, luego se refuerza y venda con apósitos apropiados.

El constructo de piel de la presente invención también puede formarse como un malla antes del injerto a un paciente. La formación como una malla mejora la conformación del constructo de piel al lecho del la herida y proporciona un medio para drenar el exudado de la herida desde debajo del injerto. El término "formación de una malla" se define como un método mecánico mediante el cual se perfora un tejido con rendijas para formar una disposición de tipo red. La formación de la malla se obtiene preferiblemente mediante el uso de un formador de malla ("mesher") de piel convencional (ZIMMER®, BIOPLASTY®). También podrían hacerse cortes o perforarse manualmente un tejido con un escalpelo o una aguja. La piel formada como malla puede expandirse estirando la piel, de modo que se abran las rendijas y luego aplicándolo al lecho de la herida. El tejido formado como malla expandido proporciona a la zona de la herida una cobertura máxima. Alternativamente, puede aplicarse piel formada como malla sin expansión, simplemente como una lámina con una disposición de rendijas sin expandir. El constructo de piel formado como una malla puede aplicarse solo o con la propia piel del paciente de otra zona del cuerpo. Los constructos de tejido también pueden tener perforaciones o fenestraciones y poros facilitados por otros medios. Las fenestraciones pueden aplicarse manualmente utilizando un láser, punzón, escalpelo, aguja o alfiler.

El constructo de piel de la invención puede aplicarse a heridas distintas a las heridas quirúrgicas o zonas quemadas. Otras heridas tales como úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras de decúbito pueden experimentar un beneficio de cicatrización mediante la aplicación del constructo de piel descrito. También pueden beneficiarse otras enfermedades cutáneas congénitas tales como la epidermólisis ampollosa.

Los siguientes ejemplos se facilitan para explicar mejor la práctica de la presente invención y no debe considerarse que limitan en modo alguno el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Formación de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio neonatal humano

Se sembraron fibroblastos de prepucio neonatal humano (originados en Organogenesis, Inc. Canton, MA) a 5 x 10^{5} células/matraz tratado de cultivo tisular de 162 cm^{2} (Costar Corp., Cambridge, MA, nº de cat. 3150) y se hicieron crecer en medio de crecimiento. El medio de crecimiento consistió en: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con un 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2}. El medio se sustituyó por medio recién preparado cada dos o tres días. Tras 8 días en cultivo, las células habían crecido hasta confluencia, es decir, habían formado una monocapa empaquetada a lo largo del fondo del matraz de cultivo tisular y el medio se aspiró del matraz de cultivo. Para enjuagar las monocapa, se añadió solución salina tamponada con fosfato, filtrada de manera estéril al fondo de cada matraz de cultivo y luego se aspiró de los matraces. Las células se soltaron del matraz añadiendo 5 ml de tripsina-verseno-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada matraz y sacudiéndolo suavemente para garantizar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se devolvieron a la incubadora. Tan pronto como las células se soltaron, se añadieron 5 ml de SBTI (inhibidor de tripsina extraído de la semilla de soja) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión celular para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión celular se extrajo de los matraces y se dividió equitativamente entre tubos de centrífuga cónicos y estériles. Las células se recogieron mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos.

Las células se resuspendieron utilizando medio nuevo hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml, y se sembraron en insertos tratados de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro (TRANSWELL® Corning Costar), en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/inserto (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2} y se alimentó medio de producción nuevo cada 2 ó 3 días durante 21 días . El medio de producción comprendía: una mezcla base 3:1 de DMEM y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), GlutaMAX-1^{MR} 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos hasta una concentración resultante de: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 2% de suero de ternero recién nacido (Hyclone, Logan, Utah), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY, calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Chemicals USA, Inc. nº 013-12061), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de polietilenglicol (PEG) de 3400-3700 de PM (calidad para cultivo celular) (Sigma, St. Louis, MO).

Se tomaron muestras para análisis histológico en los días 7, 14, 21 y se fijaron en formalina, luego se incluyeron en parafina. Las muestras fijadas con formalina se incluyeron en parafina y se tiñeron 5 secciones micrométricas con hematoxilina-eosina (H&E) según procedimientos conocidos en la técnica. Utilizando cortes teñidos con H&E, se realizaron mediciones de espesor en diez campos microscópicos seleccionados aleatoriamente utilizando una lente ocular 10X cargada con un retículo micrométrica de 100 mm/100.

Los resultados para dos cepas celulares diferentes de fibroblastos dérmicos humanos se resumen en la tabla 1, que muestra el espesor del constructo de matriz celular a medida que se desarrolla.

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TABLA 1

Espesor (micras)
	Día 0	Día 7	Día 14	Día 21
B119 Promedio	0	30,33 \pm 2,61	63,33 \pm 4,40	84,00 \pm 4,67
(n = 3)
B156 Promedio	0	42,00 \pm 5,14	64,85 \pm 4,50	76,25 \pm 8,84
(n = 4)

También se presentaron muestras para el análisis de la concentración de colágeno en los días 7, 14 y 21. El contenido de colágeno se calculó empleando un ensayo colorimétrico para el contenido de hidroxiprolina conocido en la técnica (Woessner, 1961). En esos mismos puntos temporales se determinó también el número de células.

La tabla 2 es un resumen de la concentración de colágeno y la tabla 3 es un resumen de los datos celulares procedentes de los constructos de matriz celular producidos a partir de dos cepas celulares diferentes (B156 y B119) utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

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TABLA 2

Colágeno (\mug/cm^{2})
	Día 0	Día 7	Día 14	Día 21
B119 Promedio	0	93,69 \pm 22,73	241,66 \pm 21,08	396,30 \pm 29,38
(n = 3)
B156 Promedio	0	107,14 \pm 17,16	301,93 \pm 23,91	457,51 \pm 25,00
(n = 3)

TABLA 3

Células (células/cm^{2})
	Día 0	Día 7	Día 14	Día 21
B119 Promedio	6,6 x 10^{5}	11,8 \pm 4,4 x 10^{5}	11,4 \pm 1,7 x 10^{5}	13,9 \pm 1,2 x 10^{5}
(n = 3)
B156 Promedio	6,6 x 10^{5}	13,1 \pm 0,5 x 10^{5}	14,0 \pm 2,1 x 10^{5}	17,1 \pm 1,7 x 10^{5}
(n = 4)

Se analizaron muestras de matriz dérmica derivada de células humanas de los días 7, 14 y 21 mediante SDS-PAGE de reducción retardada para determinar la composición de colágeno que muestra bandas alfa de colágeno tipo I y tipo III en las muestras.

Se determinaron las características bioquímicas de la matriz dérmica utilizando métodos inmunohistoquímicos. La identificación de fibronectina se llevó a cabo en secciones fijadas en parafina utilizando el sistema de estreptavidina - biotina Zymed Histostain (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA). Se determinó la presencia de tenascina mediante la tinción con anticuerpo primario anti-tenascina (Dako, Carphinteria, CA) seguido por anticuerpo anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano (Calbiochem) como anticuerpo secundario. Las muestras se visualizaron aplicando diaminobenceno (Sigma St. Louis, MO) y se sometieron a contratinción con rojo nuclear rápido.

La cuantificación de glucosaminoglucano (GAG) se realizó con muestras del día 21 utilizando el método descrito previamente (Fandale, 1986). El ensayo mostró la presencia de 0,44 gramos de GAG por cm^{2} en una muestra de matriz dérmica derivada de células humanas tomada 21 días después de la siembra.

Ejemplo 2 Constructo de piel de espesor total

Utilizando un constructo dérmico formado usando el método descrito en el ejemplo 1, se cultivaron en placa queratinocitos epidérmicos normales de prepucio neonatal humano (originados en Organogenesis, Inc. Canton, MA) sobre el constructo de matriz celular para formar la capa epidérmica del constructo de piel.

El medio se extrajo asépticamente del inserto de cultivo y sus alrededores. Se ampliaron a escala queratinocitos epidérmicos humanos normales hasta el pase 4 a partir de una reserva celular de subcultivo congelada hasta confluencia. Las células se separaron entonces de las placas de cultivo utilizando tripsina-verseno, se reunieron, se centrifugaron para formar un sedimento celular, se resuspendieron en medio de epidermización, se contaron y sembraron sobre la parte superior de la membrana a una densidad de 4,5 x 10^{4} células/cm^{2}. Los constructos se incubaron entonces durante 90 minutos a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} para permitir que se unieran los queratinocitos. Tras la incubación, los constructos se sumergieron en medio de epidermización. El medio de epidermización está compuesto por: una mezcla base 3:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), O-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO), selenio 6,78 ng/ml (Aldrich), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0,3% de suero de ternero recién nacido quelado (Hyclone, Logan, Utah), progesterona 0,628 ng/ml (Amersham Arlington Heights, IL), sal sódica del ácido L-ascórbico 50 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), factor de crecimiento epidérmico 10 ng/ml (Life Technologies Inc., MD) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham Arlington Heights, IL). Los constructos se cultivaron en el medio de epidermización durante 2 días a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2}.

Después de 2 días, el constructo se sumergió en un medio compuesto por una mezcla 3:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0,3% de suero de ternero recién nacido quelado (BioWhittaker, Walkersville, MD), progesterona 0,628 ng/ml (Amersham Arlington Heights, IL), ascorbato sódico 50 \mug/ml, cloruro de calcio 265 \mug/ml (Mallinckrodt, Chesterfield, MO) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham Arlington Heights, IL). De nuevo, el constructo se incubó a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} durante 2 días.

Tras los 2 días, el vehículo que contiene el constructo se transfirió asépticamente a nuevas bandejas de cultivo con una cantidad suficiente de medio de queratinización, 9 ml, para alcanzar un nivel de líquido justo hasta la superficie de la membrana de vehículo para mantener una interfase seca que permita la estratificación de la capa epitelial. Los constructos se incubaron a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} y baja humedad, en medio con cambios de medio cada 2-3 días durante 7 días. Este medio se compone de una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO), selenio 6,78 ng/ml (Aldrich), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2% de suero de ternero recién nacido (BioWhittaker, Walkersville, MD), ascorbato sódico 50 \mug/ml y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham Arlington Heights, IL). Tras 7 días, el constructo se alimentó durante 10 días más, con cambios cada 2-3 días con un medio de mantenimiento. Este medio de mantenimiento se componía de una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), 1% de suero de ternero recién nacido (BioWhittaker, Walkersville, MD) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham Arlington Heights, IL).

Se sometieron muestras finales a tratamiento con hematoxilina y eosina tal como se describió en el ejemplo 1 para determinar el aspecto macroscópico bajo microscopio óptico. El constructo resultante consistió en una capa inferior (dérmica) que consistía en fibroblastos rodeados por una matriz que tiene las características descritas en el ejemplo 1, y estaba completamente recubierta por una capa bien diferenciada, estratificada, de varias capas de queratinocitos que mostraba una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo similar a las de la piel in situ. El constructo de piel tiene una membrana basal bien desarrollada presente en la unión dermo-epidérmica, tal como se demuestra mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). La membrana basal parece ser más gruesa alrededor de los hemidesmosomas, marcado por fibrillas de anclaje que están compuestas por colágeno tipo VII, tal como se visualiza mediante TEM. Tal como se esperaba, estas fibrillas de anclaje pueden observarse fácilmente saliendo de la membrana basal y atrapando las fibrillas de colágeno. La presencia de laminina, una glucoproteína de la membrana basal, se demostró utilizando la técnica inmunoenzimática con avidina-biotina descrita previamente (Guesdon, 1979).

Ejemplo 3 Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio neonatal humano en medio definido químicamente

Se expandieron fibroblastos de prepucio neonatal humano utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Las células se resuspendieron entonces hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml y se sembraron sobre insertos de membrana tratados de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro, en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/TW (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Estas células se mantuvieron como en el ejemplo 1 con el suero de ternero recién nacido omitido del medio en todo el experimento. Más especialmente, el medio contenía: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY, nº cat. 02400, calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Chemicals USA, Inc.), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de polietilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO). Se comprobaron muestras en el día 7, 14 y 21 para determinar la concentración de colágeno y el número de células utilizando los procedimientos descritos. Los resultados se resumen en las tablas 4 (número de células) y 5 (colágeno). Las muestras también se fijaron con formalina y se trataron para la tinción con hematoxilina y eosina, para su análisis con el microscopio óptico descrito en el ejemplo 1. La evaluación histológica demostró que los constructos que se hicieron crecer en medio definido fueron similares a los que se hicieron crecer en presencia de un 2% de suero de ternero recién nacido. Las muestras también se tiñeron positivamente para fibronectina, utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1.

TABLA 4

Colágeno (\mug/cm^{2})
	Día 0	Día 7	Día 14	Día 21
Cantidad promedio de colágeno	0	107,63 \pm 21,96	329,85 \pm 27,63	465,83 \pm 49,46
en cada constructo (n= 3)

TABLA 5

Células (células/cm^{2})
	Día 0	Día 7	Día 14	Día 21
Número promedio de células	6,6 x 10^{5}	7,8 \pm 2,2 x 10^{5}	9,6 \pm 2,5 x 10^{5}	1,19 \pm 2,1 x 10^{5}
en cada constructo (n = 3)

Además del colágeno fibrilar producido endógenamente, también estaban presentes decorina y glucosaminoglucano en el constructo de matriz celular.

Ejemplo 4 Constructo de piel de espesor total formado utilizando medios definidos químicamente

Utilizando un constructo dérmico de 25 días formado mediante fibroblastos dérmicos humanos en condiciones definidas químicamente similares a las del método descrito en el ejemplo 3, se sembraron queratinocitos normales de prepucio neonatal humano sobre la parte superior del constructo de matriz celular para formar la capa epidérmica del constructo de piel.

El medio se extrajo asépticamente del inserto de cultivo y sus alrededores. Se ampliaron a escala queratinocitos epidérmicos humanos normales hasta el pase 4 a partir de una reserva celular de subcultivo congelada hasta confluencia. Las células se separaron entonces de las placas de cultivo utilizando tripsina-verseno, se reunieron, se centrifugaron para formar un sedimento celular, se resuspendieron en medio de epidermización, se contaron y sembraron sobre la parte superior de la membrana a una densidad de 4,5 x 10^{4} células/cm^{2}. Los constructos se incubaron entonces durante 90 minutos a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} para permitir que se unieran los queratinocitos. Tras la incubación, los constructos se sumergieron en medio de epidermización. El medio de epidermización está compuesto por: una mezcla base 3:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (que no contiene glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD) y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), O-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO), selenio 6,78 ng/ml (Aldrich), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), sal sódica de L-ascorbato 50 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), ácido linoleico 16 \muM (Sigma, St. Louis, MO), acetato de tocoferol 1 \muM (Sigma, St. Louis, MO) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham Arlington Heights, IL). Los constructos se cultivaron en el medio de epidermización durante 2 días a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2}.

Después de 2 días, el medio se cambió por nuevo medio compuesto como anteriormente, y se devolvió a la incubadora fijada a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} durante 2 días. Tras los 2 días, el vehículo que contiene el constructo se transfirió asépticamente a nuevas bandejas de cultivo con medio suficiente para alcanzar un nivel de líquido justo hasta la superficie de la membrana de vehículo para mantener el constructo en desarrollo en la interfase aire-líquido. El aire que está en contacto con la superficie superior de la capa epidérmica en formación permite la estratificación de la capa epitelial. Los constructos se incubaron a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} y baja humedad, en medio con cambios de medio cada 2-3 días durante 7 días. Este medio contenía una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (que no contiene glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 5 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 5 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO), selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), cloruro de calcio 2,65 \mug/ml (Mallinckrodt, Chesterfield, MO), ácido linoleico 16 \muM (Sigma, St. Louis, MO), acetato de tocoferol 1 \muM (Sigma, St. Louis, MO), serina 1,25 mM (Sigma, St. Louis, MO), cloruro de colina 0,64 mM (Sigma, St. Louis, MO) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham Arlington Heights, IL). Los cultivos se alimentaron cada 2-3 días, durante 14 días.

Se sometieron muestras, por triplicado, durante 10, 12 y 14 días una vez elevado el constructo hasta la interfase aire-líquido para tratamiento con hematoxilina y eosina tal como se describió en el ejemplo 1, para determinar el aspecto macroscópico bajo microscopio óptico. El constructo resultante consistió en una capa inferior (dérmica) que consistía en fibroblastos rodeados por una matriz que tiene las características descritas en el ejemplo 3, y estaba completamente recubierta por una capa queratinocitos, estratificados y diferenciados.

Ejemplo 5 Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de tendón de Aquiles humano

Se formaron constructos de matriz celular utilizando el mismo método descrito en el ejemplo 1 sustituyendo los fibroblastos de prepucio neonatal humano por fibroblastos de tendón de Aquiles humano (HATF). Tras 21 días en medio de producción, las muestras se sometieron a la tinción con H&E y la determinación del espesor utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1. El constructo resultante se visualizó como un constructo similar a tejido de matriz celular con un espesor de 75,00 \pm 27,58 micras (n = 2). En el constructo, también estaban presentes colágeno fibrilar producido endógenamente, decorina y glucosaminoglucano.

Ejemplo 6 Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio neonatal humano transfectados

Se produjeron fibroblastos dérmicos humanos transfectados utilizando el siguiente procedimiento. Se descongeló un vial de productores virales de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) jCRIP-43 (Morgan, J. et al.) y se sembraron las células a 2 x 10^{6} células/matraz de 162 cm^{2} (Corning Costar, Cambridge, MA). Estos matraces se alimentaron con un medio de crecimiento, y se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10 \pm 1% de CO_{2}. El medio de crecimiento consistió en: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con un 10% de suero de ternero recién nacido (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD). El mismo día, también se descongeló un vial de fibroblastos de prepucio neonatal humano (HDFB156) y se cultivó en placa a 1,5 x 10^{6} células/matraz de 162 cm^{2} (Corning Costar, Cambridge, MA). Después de tres días, los productores virales jCRIP PDGF-43, se alimentaron con nuevo medio de crecimiento. Los HDFB156 se alimentaron con el medio de crecimiento anterior más Polybrene 8 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO). Al día siguiente, se infectaron las células de HDFB156 tal como sigue. El medio agotado por los productores virales jCRIP PDGF-43 se recogió y filtró a través de un filtro de 0,45 micras. Se añadió Polybrene 8 \mug/ml a este medio agotado filtrado. El medio agotado se situó entonces con los HDF. En los dos días siguientes, se alimentaron los HDF con nuevo medio de crecimiento. El día después, los HDF se pasaron de p5 a p6 y se sembraron a una densidad de 2,5 x 10^{6} células/matraz de 162 cm^{2} (Corning Costar, Cambridge, MA). Las células se pasaron tal como sigue; el medio agotado se eliminó mediante aspiración. Los matraces se enjuagaron entonces con solución salina tamponada con fosfato para eliminar cualquier cantidad residual de suero de ternero recién nacido. Las células se soltaron del matraz añadiendo 5 ml de tripsina-verseno a cada matraz y sacudiéndolo suavemente para garantizar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se devolvieron a la incubadora. Tan pronto como las células se liberaron, se añadieron 5 ml de SBTI (inhibidor de tripsina extraído de la semilla de soja) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión celular para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión de células/trisina/SBTI se extrajo de los matraces y se dividió equitativamente entre tubos de centrífuga cónicos y estériles. Las células se recogieron mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en el medio de crecimiento para su siembra a la densidad citada anteriormente. Después de dos días, las células se alimentaron con nuevo medio de crecimiento. Al día siguiente, las células se recogieron como anteriormente, y se diluyeron hasta una densidad de 1,5 x 10^{6} células/ml con medio de crecimiento que contenía un 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS) con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO). Las células se congelaron entonces a 1 ml/criovial a aproximadamente -80ºC.

La producción de la matriz colagenosa para este ejemplo utiliza el mismo procedimiento que los ejemplos 1 y 3, sustituyendo los fibroblastos de prepucio neonatal humano por fibroblastos de prepucio neonatal humano transformados para producir altos niveles de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) tal como se describió anteriormente. Se tomaron muestras para la tinción con H&E tal como se describió anteriormente en el día 18 tras la siembra. También se tiñeron muestras utilizando los métodos con avidina-biotina para determinar la presencia de fibronectina citada en el ejemplo 10. Se tomaron muestras en el día 18 tras la siembra para la tinción con H&E tal como se describió en el ejemplo 1 y mostraron un aspecto macroscópico de matriz celular similar al descrito en el ejemplo 1, con un espesor medido de 123,6 micras (N = 1). Se midió que la producción de PDGF de las células transfectadas en el constructo de matriz celular era de 100 ng/ml, mediante ELISA en toda la duración del cultivo (18 días) mientras que la producción control de PDGF fue indetectable.

Ejemplo 7 Uso del constructo dérmico como un material de injerto

Se prepararon constructos de matriz celular según los métodos del ejemplo 1, utilizando fibroblastos dérmicos humanos derivados de prepucio de neonatos y se injertaron en heridas de extirpación completa creadas en ratones atímicos desnudos. Los ratones se injertaron según los métodos descritos por Parenteau, et al. (1996), cuya descripción se incorpora en el presente documento. Los injertos se examinaron a los 14, 28 y 56 días para determinar signos de adhesión al lecho de la herida, evidencia de contracción de la herida, zonas de pérdida del injerto y presencia de vascularización (color). Las zonas del injerto se fotografiaron mientras estaban intactas sobre los ratones. Varios ratones se sacrificaron en cada punto temporal, y las zonas de injerto y sus alrededores se extirparon junto con un borde circundante de piel murina hasta al menos el panículo carnoso. En cada muestra, se conservaron las uniones entre el injerto y la piel murina. Las muestras de tejido explantado se fijaron entonces en formalina al 10% tamponada con fosfato y fijación en metanol. Las muestras fijadas con formalina se trataron para tinción con H&E según el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Los injertos pudieron integrarse con la piel de ratón, observándose una contracción mínima. En el plazo de 14 días desde el injerto, la epidermis de ratón había migrado completamente sobre el injerto. Utilizando las muestras teñidas con H&E, eran evidentes vasos dentro del injerto a los 14 días, y durante todo el experimento. Mediante la observación macroscópica y mediante las muestras teñidas con H&E, se determinó que el injerto continuaba y persistía con aspecto sano conteniendo células vivas, sin anomalías macroscópicas de la matriz, etc., durante toda la duración del experimento.

Ejemplo 8 Uso de constructo de piel de espesor total como injerto de piel

Se prepararon constructos de piel de dos capas tal como se describe en el ejemplo 2, utilizando fibroblastos dérmicos humanos derivados de prepucio de neonato en la capa dérmica y queratinocitos humanos derivados de un prepucio de neonato diferente en la capa epidérmica. Los constructos de piel pudieron separarse manualmente de la membrana, manejarse sin soporte de vehículo y colocarse en el sitio de injerto. Los constructos de piel de dos capas se injertaron en heridas de extirpación completa creadas en ratones atímicos desnudos según los métodos descritos por Parenteau, et al. (1996), cuya descripción se incorpora al presente documento. Los puntos temporales para tomar las muestras fueron a los 7, 14, 28, 56 y 184 días tras el injerto. Las zonas del injerto se fotografiaron mientras estaban intactas sobre los ratones. Se sacrificaron varios ratones en cada punto temporal, y las zonas de injerto y sus alrededores se extirparon junto con un borde circundante de piel de ratón hasta al menos el panículo carnoso. En cada muestra se conservaron uniones entre el injerto y la piel murina. Las muestras de tejido explantado se fijaron entonces en formalina al 10% tamponada con fosfato y fijación en metanol. Las muestras fijadas con formalina se trataron para tinción con H&E según el procedimiento descrito en el ejemplo 1.

Los injertos se integraron con el tejido huésped en un plazo de 7 días mediante observación macroscópica, así como mediante el aspecto histológico. Mediante tinción con H&E se visualizaron los vasos que crecían en el injerto del tejido huésped en el plazo de 7 días desde el injerto. Los injertos continuaron sanos y persistieron durante todo el experimento, observándose una contracción mínima. Utilizando la tinción con anti-involucrina humana, se demostró la persistencia de las células epidérmicas humanas durante la totalidad del periodo de injerto.

Ejemplo 9 Formación in vitro de una matriz mediante queratocitos corneales humanos

Se utilizaron células de queratocitos corneales humanos (originadas en Organogenesis, Inc. Canton, MA) en la producción de un constructo de estroma de córnea. Se soltaron cultivos confluentes de queratocitos humanos de sus sustratos de cultivo utilizando tripsina-verseno. Cuando se soltaron, se utilizó el inhibidor de tripsina extraído de la semilla de soja para neutralizar la tripsina-verseno, la suspensión celular se centrifugó, el sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron entonces en medio base hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml. Las células se sembraron en placas Transwell tratadas de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro, en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/TW (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Estos cultivos se mantuvieron durante toda la noche en medio de siembra. El medio de siembra estaba compuesto por: una mezcla base 3:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD cat.), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF) 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI). Después de esto, estos cultivos se alimentaron con medio de producción nuevo. El medio de producción estaba compuesto por: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 2% de suero de ternero recién nacido (Hyclone, Logan, Utah), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Pure Chemical Company), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de polietilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, calidad para cultivo celular).

Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2} y se alimentaron con medio de producción nuevo cada 2-3 días durante 20 días (durante un total de 21 días en cultivo). Tras 21 días en cultivo, los queratocitos habían depositado una capa de matriz de aproximadamente 40 micras de espesor, medido mediante el método descrito en el ejemplo 1. En el constructo de matriz celular también estaba presente colágeno fibrilar producido endógenamente, decorina y glucosaminoglucano.

Ejemplo 10 Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio neonatal humano sembrados en medios de producción

Los fibroblastos de prepucio neonatal humano (originados en Organogenesis, Inc. Canton, MA) se sembraron en 1 x 10^{5} células/vehículos tratados de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro en una bandeja de seis pocillos (TRANSWELL®, Costar Corp. Cambridge, MA) y se hicieron crecer en medio de crecimiento. El medio de crecimiento consistió en: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero recién nacido (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2}. El medio se sustituyó cada dos o tres días. Tras 9 días en cultivo, el medio se aspiró de la placa de cultivo y se sustituyó por medio de producción. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2} y se alimentaron con medio de producción nuevo cada 2-3 días durante 21 días. El medio de producción estaba compuesto por: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 2% de suero de ternero recién nacido (Hyclone, Logan, Utah), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Pure Chemical Company), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de polietilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, calidad para cultivo celular).

Se tomaron muestras en el día 21 y se fijaron en formalina, después se incluyeron en parafina. Las muestras fijadas con formalina se incluyeron en parafina y se tiñeron 5 secciones micrométricas con hematoxilina-eosina (H&E) según las técnicas utilizadas habitualmente en la técnica. Utilizando cortes teñidos con H&E, se realizaron mediciones en diez campos microscópicos seleccionados aleatoriamente utilizando una lente ocular 10X (Olympus America Inc., Melville, NY) cargada con un retículo micrométrico de 100 mm/100 (Olympus America Inc., Melville, NY). Los constructos creados utilizando este método son similares en estructura y composición bioquímica a los creados con el ejemplo 1, y tienen un espesor medido de 82,00 \pm 7,64 micras.

Ejemplo 11 Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos dérmicos de cerdo

Se sembraron fibroblastos dérmicos de cerdo (originados en Organogenesis, Inc. Canton, MA) en a 5 x 10^{5} células/matraz tratado de cultivo tisular de 162 cm^{2} (Costar Corp, Cambridge, MA, nº cat. 3150) y se hicieron crecer en medio de crecimiento tal como se describe a continuación. El medio de crecimiento consistía en: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación con alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero bovino fetal (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2}. El medio se sustituyó cada dos o tres días. En la confluencia, es decir, cuando las células habían formado una capa empaquetada en el fondo del matraz de cultivo tisular, el medio se aspiró de la placa de cultivo. Para enjuagar la monocapa se añadió solución salina tamponada con fosfato filtrada de manera estéril a la monocapa y después se aspiró de la placa. Las células se soltaron del matraz añadiendo 5 ml de tripsina-verseno-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada matraz y sacudiéndolo suavemente para garantizar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se devolvieron a la incubadora. Tan pronto como las células se soltaron, se añadieron 5 ml de SBTI (inhibidor de tripsina extraído de la semilla de soja) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión celular para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión se extrajo de los matraces y se dividió equitativamente entre tubos de centrífuga cónicos y estériles. Las células se recogieron mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron y se diluyeron hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml, y se sembraron en placas Transwell tratadas de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro, en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/TW (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Las células se mantuvieron durante toda la noche en medio de siembra. El medio de siembra consistía en: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD cat.), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY, calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Pure Chemical Company), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2} y se alimentaron con medio de producción nuevo cada 2-3 días durante 7 días. El medio de producción estaba compuesto por: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 2% de suero de ternero recién nacido (Hyclone, Logan, Utah), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Pure Chemical Company), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de polietilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, calidad para cultivo celular). Tras 7 días, los medios se sustituyeron por medio de producción sin suero de ternero recién nacido. Estos medios se alimentaron nuevos a las células cada 2-3 días durante 20 días más, durante un total de 28 días en cultivo.

Se tomaron muestras en el día 21 y se fijaron en formalina, después se incluyeron en parafina. Las muestras fijadas con formalina se incluyeron en parafina y se tiñeron 5 secciones micrométricas con hematoxilina-eosina (H&E) según las técnicas utilizadas habitualmente en la técnica. Utilizando cortes teñidos con H&E, se realizaron mediciones en diez campos microscópicos seleccionados aleatoriamente utilizando una lente ocular 10X (Olympus America Inc., Melville, NY) cargada con un retículo micrométrico de 10 mm/100 (Olympus America Inc., Melville, NY). La muestra mostró una estructura compuesta por células y matriz con un espesor medido de 71,20 \pm 9,57 micras. Además del colágeno fibrilar producido endógenamente, también estaban presentes decorina y glucosaminoglucanos en el constructo de matriz celular.

Ejemplo 12 Formación in vitro de un constructo de piel de dos capas que contiene células de la papila dérmica

Se preparó una matriz celular según el método del ejemplo 1 utilizando fibroblastos de prepucio neonatal humano como un primer tipo celular productor de matriz. La matriz celular se sembró localmente con puntos de células de la papila dérmica como una segunda población celular que, a su vez, se sembró con queratinocitos como una tercera población celular, para formar una capa epidérmica continua sobre la matriz celular y las células de la papila dérmica.

En primer lugar, se formó un constructo de matriz celular utilizando fibroblastos dérmicos humanos (HDF) derivados de prepucio neonatal. Los HDF se ampliaron a escala sembrándolos a 5 x 15^{5} células/matraz tratado de cultivo tisular de 162 cm^{2} (Costar Corp., Cambridge, MA) en medio de crecimiento que consistía en: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación de alto contenido en glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD). En la confluencia, los HDF se soltaron de la placa utilizando tripsina-verseno y se resuspendieron utilizando medio nuevo hasta una concentración de 3,0 x 10^{6} células/ml, y se sembraron en insertos tratados de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro (TRANSWELL®, Corning Costar) en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/inserto (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Los cultivos de HDF se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera del 10% \pm 1% de CO_{2} y se alimentaron con medio de producción nuevo cada 2 ó 3 días durante 23 días según el método detallado en el ejemplo 1.

Una vez que se hubo formado el constructo de matriz celular, se sembró con puntos de células de papila dérmica como una segunda población celular. Las células de papila dérmica son una población diferenciada de fibroblastos especializados rodeados por el bulbo piloso de los folículos pilosos que desempeñan un papel de soporte en el crecimiento del pelo. Las papilas dérmicas pueden aislarse mediante microdisección de los folículos pilosos y se cultivaron in vitro utilizando el método descrito anteriormente por Messenger, A.G., The Culture of Dermal Papilla Cells from Human Hair Follicles. Br. J. Dermatol. 110: 685-9 (1984), método que se incorpora al presente documento. Cuando un cultivo de células de papila dérmica alcanza la confluencia, forma agregados que pueden volverse a sembrar en matraces de cultivo para formar nuevos agregados. Las papilas dérmicas se aislaron a partir de una biopsia de piel obtenida de un cerdo de 4 semanas de edad. Las células de la papila dérmica (PDP) se cultivaron en serie en DMEM que contenía un 20% de NBCS hasta el pase 8. Tras 3 semanas en cultivo, las células de la PDP volvieron a formar estructuras similares a la papila dérmica, o agregados, teniendo cada uno un diámetro de aproximadamente entre 90 y 210 micras. Los agregados se extrajeron entonces de la placa de cultivo mediante pipeteo vigoroso del medio contra ellos, y después se sembraron sobre la matriz colagenosa humana a la densidad de 200 agregados por cm^{2}. Los agregados se cultivaron sumergidos durante 15 días adicionales en DMEM con un 20% de NBCS cambiando el medio agotado por medio nuevo cada 2-3 días.

Los cultivos de matriz celular que contenían células de la papila dérmica sobre ellos se sembraron con queratinocitos y se cultivaron para formar una capa epidérmica continua sobre la matriz celular y las papilas dérmicas. Se obtuvieron dos constructos diferentes: el primero con queratinocitos humanos, el segundo con queratinocitos de cerdo. Se aislaron queratinocitos epidérmicos normales del prepucio neonatal humano (HEP) o de los queratinocitos de cerdo (PEP) utilizando excrescencia de explante para establecer los cultivos primarios. Estas células se cultivaron entonces y se expandieron hasta el pase 3 para la estirpe de cerdo, o hasta el paso 4 para la estirpe humana. Tras aproximadamente de 5 a 6 días en cultivo, las células se soltaron de las placas de cultivo utilizando tripsina-verseno, se agruparon, se centrifugaron para formar un sedimento celular, se resuspendieron en medio de epidermización, se contaron y se sembraron sobre la parte superior de la membrana a una densidad de 4,5 x 10^{4} células/cm^{2} para las células HEP o de 1,6 x 10^{5} células/cm^{2} para las células PEP. Los cultivos epidermizados se cultivaron durante 12 días tal como se describió anteriormente en el ejemplo 2.

Se sometieron muestras finales a tratamiento con hematoxilina y eosina para microscopía óptica. Los constructos de piel resultantes mostraron la organización morfológica básica similar a la piel: una capa dérmica que consiste en fibroblastos rodeada por matriz producida endógenamente, incluyendo colágeno producido endógenamente, decorina y glucosaminoglucanos, zonas localizadas de células de papila dérmica y una capa continua y estratificada de queratinocitos a través del constructo de matriz celular y las papilas dérmicas. En ambos constructos de tejido, recubiertos con queratinocitos humanos o de cerdo, la papila dérmica mantenía una estructura empaquetada que inducía pequeñas ondulaciones del epitelio recubierto. Las células epiteliales diferenciadas a menudo están presentes cerca de las células de la papila dérmica.

Ejemplo 13 Medición de ácido hialurónico mediante ELISA de intercalación ("tipo sándwich")

El ácido hialurónico (HA) se midió en los constructos de matriz celular formados por los fibroblastos dérmicos en medio que contiene suero y medio definido químicamente según los métodos de los ejemplos 1 y 3, respectivamente.

Se formaron constructos de matriz celular sobre vehículos circulares de 75 mm que incorporaban una membrana porosa (TRANSWELL®, Corning Costar). Se prepararon extractos a partir de los constructos de matriz celular añadiendo 10 ml de tampón acetato de amonio y proteinasa K 0,5 mg/ml a un tubo de ensayo que contenía un constructo de matriz celular. La mezcla se incubó a 60ºC durante la noche. Tras completarse la digestión, la mezcla se centrifugó y el extracto del sobrenadante se transfirió a un tubo separado para el ensayo del ácido hialurónico. Se recubrió una placa de 96 pocillos con 50 \mul de proteína de unión a HA 20 \mug/ml en solución de NaHCO_{3} 0,1 M y se almacenó durante la noche a 4ºC. La placa se lavó entonces tres veces con NaCl al 0,85% que contenía un 0,05% de Tween 20. A cada pocillo se le añadieron entonces 250 \mul de solución de bloqueo (tampón fosfato de sodio, 10 mmol, pH = 7,4 que contenía un 3% de BSA y un 0,9% de NaCl, PBS + 3% de BSA) y la placa se incubó a TA (temperatura ambiente) durante 2 horas. La placa se lavó entonces tres veces con NaCl al 0,85% que contenía un 0,05% de Tween 20. A la placa se añadieron entonces 50 \mul de soluciones patrón de HA y extractos procedentes de ambas condiciones experimentales, incluyendo diversas diluciones de esas condiciones. La placa se incubó a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC) durante 2 horas. La placa se lavó entonces tres veces con NaCl al 0,85% que contenía un 0,05% de Tween 20 y a cada pocillo se le añadieron 50 \mul de HA biotinilado (dilución 1:2000) y después se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó entonces tres veces con NaCl al 0,85% que contenía un 0,05% de Tween 20 y después se añadieron a cada pocillo 50 \mul de HRP (peroxidasa de rábano)-avidina D (dilución 1:3000). La placa se incubó entonces durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó entonces tres veces con NaCl al 0,85% que contenía un 0,05% de Tween 20 y a cada pocillo se añadieron 100 \mul de solución sustrato de orto-fenilendiamina. La placa se incubó a 37ºC durante 10 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de HCl 1 M. Finalmente, utilizando un lector de placas, se leyó la absorbancia a 492 nm y se registró.

Las mediciones de la absorbancia se promediaron y se convirtieron en medidas de la cantidad. Se determinó que los constructos de matriz celular circulares (75 mm de diámetro) formados en un medio que contenía suero contenían cada uno aproximadamente 200 \mug de ácido hialurónico, mientras que los formados en medio definido químicamente contenían cada uno aproximadamente 1,5 mg de ácido hialurónico.

Ejemplo 14 Pruebas físicas y propiedades mecánicas de los constructos de matriz celular producidos

Las propiedades mecánicas de los constructos de tejido del ejemplo 1 (constructo de matriz celular), el ejemplo 2 (constructo de matriz celular con una capa de queratinocitos sobre ella) y el ejemplo 3 (constructo de matriz celular formado en medio definido) se cuantificaron mediante pruebas de inflación de membrana. Estas pruebas son similares a los ensayos utilizados clínicamente (por ejemplo, Dermaflex®, Cyberderm Inc., Media, PA, y Cutameter®, Courage Khazaka, Cologne, Alemania) pero suponen presiones más altas incluyendo presiones que pueden romper la membrana. El constructo de matriz celular de muestra se extendió plano sobre un bloque de policarbonato centrado sobre un pocillo cilíndrico de 10 mm de diámetro lleno con solución salina normotónica. Una placa metálica con un orificio circular correspondiente al diámetro del pocillo cilíndrico se colocó sobre la muestra y se sujetó al bloque. Las muestras se inflaron entonces mediante la infusión de solución salina adicional en el pocillo con una bomba de jeringa. La presión resultante se midió con un transductor de presión. La presurización se llevó a cabo hasta el fallo del dispositivo, la resistencia a la rotura, que fue en promedio de 439,02 mm Hg para el constructo de matriz celular generado mediante el método del ejemplo 1; 998,52 mm Hg para las muestras de constructo de matriz celular con una capa de queratinocitos generado mediante el método del ejemplo 2; y, 1542,26 mm Hg para las muestras de constructo de matriz celular formado en medio definido generado según el método del ejemplo 3.

Para determinar el punto de fusión térmico de la matriz dérmica, se prepararon muestras (constructo de matriz celular), tomadas a los 21 días utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se determinó la temperatura de desnaturalización de las muestras mediante análisis con un calorímetro diferencial de barrido Mettler Toledo (Highston, NJ) (producto DSC nº DSC12E). Para los fines de la invención, se determinó la temperatura de fusión calentando la muestra desde 45 y 80ºC a una velocidad de 1ºC/minuto. La temperatura de desnaturalización promedio para las muestras es de 60,8 \pm 1,2ºC (n = 3).

Se midieron la retención de la sutura y la resistencia a la tracción de la matriz epidermizada creada utilizando los procedimientos de los ejemplos 1 (constructo de matriz celular) y 3 (constructo de matriz celular formado en medio definido) para determinar la capacidad de sutura del constructo en ciertas situaciones clínicas. La resistencia a la retención de la sutura de la matriz dérmica humana de 21 días se determinó utilizando el método descrito en la American Nacional standards publication for Vascular Graft Prosthesis (publicación de criterios nacionales americanos para las prótesis de injerto vascular) (Instruments, 1986) utilizando el sistema de prueba Mini-Bionex 858 (MTS Systems Corporation, Minneapolis, Minn.).

Para las muestras del ejemplo 1 (constructo de matriz celular), se determinó que la resistencia a la tracción era de 365 N/m; para las muestras preparadas según el ejemplo 2 (constructo de matriz celular con una capa de queratinocitos), la resistencia a la tracción fue de 2720 N/m.

La resistencia a la retención de la sutura para las muestras preparadas según el ejemplo 1 fue de 0,14 N; para las preparadas según el ejemplo 2, de 0,22 N.

Los constructos creados tal como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se han preparado con diámetros de 24 mm y 75 mm. Los constructos preparados mediante las técnicas de cultivo para los 3 métodos son estructuras similares a tejido cohesivas, se separan fácilmente de la membrana con una fuerza mínima, por lo que son "despegables" y pueden manejarse y manipularse físicamente para su uso y para las pruebas sin que se produzca daño.

Ejemplo 15 Formación in vitro de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de prepucio neonatal humano en medio definido químicamente

Se expandieron fibroblastos de prepucio neonatal humano utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Las células se resuspendieron entonces hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml, y se sembraron sobre insertos de membrana tratados de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/TW (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Las células en este ejemplo se cultivaron en medio definido químicamente durante todo el experimento.

El medio contenía: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY nº cat. 02400, calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Chemicals USA, Inc), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO).

Al medio básico anterior se añadieron otros componentes en estas condiciones separadas:

1.: Insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), 0,05% de polietilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO).

2.: Insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO).

3.: Insulina 375 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), hidrocortisona 6 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO).

Las muestras se fijaron con formalina y se trataron para tinción con hematoxilina y eosina, para análisis con microscopio óptico. La evaluación histológica visual demostró que en la condición 2 que carecía de PEG, la matriz demostraba ser comparablemente similar a la de la condición 1 que contenía PEG. El análisis bioquímico con que se midió el contenido de colágeno del constructo mostró casi la misma cantidad de colágeno en ambos: 168,7 \pm 7,98 \mug/cm^{2} para la condición 1 con PEG, en comparación con 170,88 \pm 9,07 \mug/cm^{2} para la condición 2 sin PEG. La condición 3 que contenía altos niveles de insulina e hidrocortisona mostró una expresión superior de matriz, incluyendo colágeno, en un punto temporal anterior al de las otras dos condiciones. Además del colágeno fibrilar producido endógenamente, también estuvieron presentes decorina y glucosaminoglucano en los constructos de matriz celular en todas las condiciones. El constructo dérmico cultivado formado mediante el método de la condición 2 de este ejemplo se muestra en la figura 2. En la figura 2 se muestra una fotomicrografía de una sección fijada, incluida en parafina y teñida con hematoxilina y eosina de un constructo de matriz celular formado a partir de fibroblastos dérmicos humanos cultivados en medio químicamente definido a los 21 días. La membrana porosa aparece como una fina banda translúcida por debajo del constructo y puede observarse que las células crecen sobre la superficie de la membrana y no participan en integrar la membrana con la matriz.

La figura 3 muestra imágenes de microscópico electrónico de transmisión (TEM) de dos ampliaciones de constructo dérmico cultivado formado mediante el método de la condición 2 de este ejemplo a los 21 días. La figura 3A es una ampliación 7600X que muestra la alineación de las fibras de colágeno endógenas entre los fibroblastos. La figura 3B es una ampliación 19000X de fibras de colágeno endógenas completamente formadas que demuestran la disposición y el empaquetamiento de las fibrillas.

En todas las condiciones de este ejemplo, los constructos dérmicos cultivados formados comprenden fibroblastos dérmicos y matriz producida endógenamente. Todos tienen fibrillas de colágeno completamente formadas en organización empaquetada dispuestas entre las células. Sus calidades fibrosas, espesor e integridad cohesiva dan al constructo una resistencia considerable para permitir que pueda separarse de manera despegable de la membrana de cultivo y se manejen como si se transfirieran a un paciente que va a tratarse con el constructo, como en un injerto o implante.

Ejemplo 16 Constructo de piel de espesor completo

Utilizando un constructo dérmico de 21 días formado mediante fibroblastos dérmicos humanos en condiciones definidas químicamente según el método de la condición 2 (sin PEG) descrito en el ejemplo 15 anteriormente, se sembraron queratinocitos epidérmicos normales de prepucio neonatal humano sobre la superficie superior del constructo de matriz celular para formar la capa epidérmica del constructo de piel.

El medio se extrajo asépticamente del inserto de cultivo y sus alrededores. Los queratinocitos epidérmicos humanos normales se ampliaron a escala hasta el pase 4 a partir de una reserva de células de subcultivo congeladas hasta la confluencia. Las células se soltaron entonces de las placas de cultivo utilizando tripsina-verseno, se agruparon, se centrifugaron para formar un sedimento celular, se resuspendieron en medio de epidermización, se contaron y se sembraron sobre la parte superior de la membrana a una densidad de 4,5 x 10^{4} células/cm^{2}. Los constructos se incubaron entonces durante 90 minutos a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} para permitir que se unieran los queratinocitos. Tras la incubación, los constructos se sumergieron en medio de epidermización. El medio de epidermización está compuesto por: una mezcla base 3:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (que no contenía glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD) y medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD) complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO), selenio 6,78 ng/ml (Aldrich), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), sal sódica de L-ascorbato 50 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), ácido linoleico 16 \muM (Sigma, St. Louis, MO), acetato de tocoferol 1 \muM (Sigma, St. Louis, MO) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham, Arlington Heights, IL). Los constructos se cultivaron en el medio de epidermización durante 2 días a 37 \pm 1ºC, 10% \pm 1% de CO_{2}.

Tras 2 días, el medio se cambió por medio nuevo compuesto como anteriormente; y se devolvió a la incubadora fijada a 37 \pm 1ºC, 10% \pm 1% de CO_{2} durante 2 días. Tras los 2 días, el vehículo que contenía el constructo se transfirió asépticamente a nuevas bandejas de cultivo con medios suficientes para alcanzar un nivel de líquido justo hasta la superficie de la membrana de vehículo para mantener el constructo en desarrollo en la interfase aire-líquido. El aire en contacto con la superficie superior de la capa epidérmica en formación permite la estratificación de la capa epitelial. Los constructos se incubaron a 37 \pm 1ºC, 10% de CO_{2} y baja humedad, en medio con cambios de medio cada 2-3 días durante 7 días. Este medio contenía una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (que no contenía glucosa ni calcio, BioWhittaker, Walkersville, MD), medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD) complementado con hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), etanolamina 5 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY), o-fosforil-etanolamina 5 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO), selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), adenina 24,4 \mug/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), L-glutamina 4 mM (BioWhittaker, Walkersville, MD), cloruro de calcio 2,65 \mug/ml (Mallinckrodt, Chesterfield, MD), ácido linoleico 16 \muM (Sigma, St. Louis, MO), acetato de tocoferol 1 \muM (Sigma, St. Louis, MO), serina 1,25 mM (Sigma, St. Louis, MO), cloruro de colina 0,64 mM (Sigma, St. Louis, MO) y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml (Amersham, Arlington Heights, IL). Los cultivos se alimentaron cada 2-3 días, durante 14 días.

Se sometieron muestras, por triplicado, durante 10, 12 y 14 días una vez elevado el constructo hasta la interfase aire-líquido para el tratamiento con hematoxilina y toxina, tal como se describió en el ejemplo 1, para determinar el aspecto macroscópico con microscopía óptica. El constructo resultante fue un constructo de piel de dos capas que consistía en una capa dérmica inferior que consistía en fibroblastos dérmicos rodeados por matriz recubierta por una capa epidérmica superior de queratinocitos estratificados y diferenciados. El constructo de piel de dos capas de este ejemplo se muestra en la figura 4. La figura 4 es una fotomicrografía de una sección fijada, incluida en parafina y teñida con hematoxilina y eosina de un constructo de piel cultivado formado en medio químicamente definido en ausencia de componentes de la matriz exógenos que comprende un constructo de matriz celular formado a partir de fibroblastos dérmicos humanos cultivados en medio definido químicamente con una epidermis diferenciada, de varias capas formada a partir de queratinocitos humanos cultivados en medio definido químicamente.

Ejemplo 17 Formación de una matriz colagenosa mediante fibroblastos de la boca humanos

El fin de este experimento es producir un constructo de matriz celular a partir de fibroblastos de la boca aislados de tejido de mejilla humana. Los fibroblastos de la boca se cultivaron en matraces T-150 en DMEM que contenía un 10% de medio NBCS. Tras 7 días, para expandir el número de células adicionalmente, las células de la boca se recogieron y se pasaron a nueve matraces T-150 a 4,0 x 10^{6} células en DMEM que contenía un 10% de medio NBCS y se cultivaron hasta la confluencia, momento en el cual se recogieron las células.

Para recoger las células, el medio se aspiró del matraz de cultivo. Para enjuagar la monocapa se añadió solución salina tamponada con fosfato filtrada de manera estéril al fondo de cada matraz de cultivo y después se aspiró de los matraces. Las células se soltaron del matraz añadiendo 5 ml de tripsina-verseno-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada matraz y sacudiéndolo suavemente para garantizar la cobertura completa de la monocapa. Los cultivos se devolvieron a la incubadora. Tan pronto como las células se soltaron, se añadieron 5 ml de SBTI (inhibidor de tripsina extraído de la semilla de soja) a cada matraz y se mezclaron con la suspensión celular para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión se extrajo de los matraces y se dividió equitativamente entre tubos de centrífuga cónicos y estériles. Las células se recogieron mediante centrifugación a aproximadamente 800-1000 x g durante 5 minutos.

Las células se resuspendieron utilizando medio nuevo hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml, y se sembraron en insertos tratados de cultivo tisular de 24 mm de diámetro y 0,4 micras de tamaño de poro (TRANSWELL®, Corning Costar) en una bandeja de seis pocillos a una densidad de 3,0 x 10^{6} células/inserto (6,6 x 10^{5} células/cm^{2}). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 \pm 1ºC con una atmósfera de 10 \pm 1% de CO_{2} y se alimentaron con medio que contenía: una mezcla base 3:1 de DMEM, medio F-12 de Ham (Quality Biologics Gaithersburg, MD cat.), GlutaMAX 4 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) y aditivos: factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 5 ng/ml (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), hidrocortisona 0,4 \mug/ml (Sigma St. Louis, MO), etanolamina 1 x 10^{-4} M (Fluka, Ronkonkoma, NY nº cat. 02400, calidad ACS), o-fosforil-etanolamina 1 x 10^{-4} M (Sigma, St. Louis, MO), insulina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), transferrina 5 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), triyodotironina 20 \rhoM (Sigma, St. Louis, MO) y selenio 6,78 ng/ml (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), ácido L-ascórbico 50 ng/ml (WAKO Chemical USA, Inc.), L-prolina 0,2 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) glicina 0,1 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05% de polietilenglicol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO).

En el día 1 tras la siembra, el medio se sustituyó por medio de producción sin suero, y se cambió cada 2-3 días durante 21 días. En el día 21, las muestras se fijaron en formalina para la histología. Se utilizaron tres muestras para el análisis de producción de proteínas y colágeno.

La producción de colágeno para los constructos de 24 mm de diámetro fue en promedio de 519 \mug por constructo tras 21 días de cultivo. La producción de proteínas total para los constructos de 24 mm de diámetro fue en promedio de 210 \mug por constructo tras 21 días de cultivo. Morfológicamente, el constructo de matriz celular de fibroblastos de la boca, un constructo de tejido cultivado de tejido conjuntivo oral, mostró fibroblastos de la boca rodeados por matriz mientras que físicamente, el constructo tenía integridad y voluminosidad física.

Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y los ejemplos con fines de claridad y comprensión, será obvio para el experto en la técnica que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Constructo de piel cultivada que tiene al menos dos capas, que comprende:

(i): colágeno tipo I y tipo III que muestra una organización empaquetada de las fibrillas y mostrando los haces de fibrillas un modelo de bandas de 67 nm escalonadas un cuarto de su longitud;

(ii): decorina;

(iii): fibronectina;

(iv): tenascina; y

(v): glucosaminoglucanos;

2. Constructo según la reivindicación 1, en el que las células de fibroblastos cultivados se modifican genéticamente para que produzcan componentes de la matriz extracelular.

3. Constructo según la reivindicación 2, en el que las células de fibroblastos cultivados se modifican genéticamente para que produzcan un factor de crecimiento, hormona, péptido o proteína.

4. Método para producir un constructo de piel cultivada de dos capas que comprende una capa dérmica y una capa epidérmica dispuesta sobre la misma en ausencia de una estructura de soporte estructural o componentes de la matriz exógenos, en el que el método comprende las etapas de:

(b) cultivar las células de fibroblastos de la etapa (a) en el primer medio de cultivo celular definido químicamente hasta una confluencia de entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 100%;

en el que la matriz extracelular comprende:

(ii): decorina;

(iii): tenascina; y

(iv): glucosaminoglucanos;

: en el que la capa de células epidérmicas es una capa diferenciada, estratificada, de varias capas de queratinocitos que muestran una capa basal, una capa suprabasal, una capa granular y un estrato córneo;

: y en el que el constructo de piel cultivada de dos capas tiene presente una membrana basal en la unión de la primera y segunda capas.

5. Constructo de tejido cultivado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el trasplante o implantación de tejido cultivado.

6. Constructo de tejido cultivado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el constructo es cohesivo, al tener propiedades de integridad unitaria física y de manejo similares a las del tejido.