DE3317550C2

DE3317550C2 - Verfahren zum Züchten einer lückenlosen Zellschicht und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE3317550C2
Application number: DE3317550A
Authority: DE
Inventors: Stephan Priv.Doz.Dr.rer.nat.Dr.med.habil. 8000 München Nees
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-05-13
Filing date: 1983-05-13
Publication date: 1985-08-22
Also published as: DE3317550A1; US4608342A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten einer lückenlosen Zellschicht auf einer Seite einer eben aufgespannten porösen oder semipermeablen Unterlage, die in einer Halte- und Spanneinrichtung befestigt ist, in einem die erforderlichen Nährstoffe enthaltenden Medium. Dabei wird die Halte- und Spanneinrichtung derart auf eine Platte aufgesetzt, daß die der Zellschicht gegenüberliegende Seite der Unterlage auf der ihr zugewandten Oberfläche der Platte aufliegt.

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten einer lückenlosen Zellschicht auf einer Seite einer eben ausgespannten porösen oder semipermeablen Unterlage nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 und eine Ha Ite-und Spanneinrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens nach dem Patentanspruch 6.

Zur Untersuchung verschiedener gerichteter Vorgänge an einer auf einer Unterlage angezüchteten lückenlosen (konfluenten) Zellschicht ist. es erforderlich, sowohl die an der apikalen Seite der Zellschicht als auch die an der basalen Seite der Zellschicht ablaufenden Vorgänge zu erfassen. Zu diesem Zweck müssen beide Seiten einer auf der porösen bzw. semipermeablen Unterlage angezüchteten lückenlosen Zellschicht in einer Doppelperfusionskammer bespült werden.

Um eine Unterlage mit einer darauf gezüchteten lükkenlosen Zellschicht in einer Doppelperfusionskammer anordnen zu können, ist es erforderlich, die gesamte Unterlage in einer Halte- und Spanneinrichtung zu befestigen, die dann zusammen mit der Unterlage und der durch mitotische Zellteilung ausgesäter Zellen im Laufe einer bestimmenten Wachstumszeit en eichteten von ihr getragenen lückenlosen Zellschicht in die Doppelperfusionskammer eingesetzt wird.

Es ist bekannt eine lückenlose Zellschicht dadurch auf einer porösen oder semipermeablen Unterlage zu züchten, daß zunächst die Unterlage auf dem Boden einer sogenannten Petri-Schale eben ausgebreitet wird, wobei sie ein die zum Züchten erforderlichen Nährstoffe enthaltendes Medium einseitig überschichtet Anschließend werden die Zellen dann auf der Unterlage ausgesät und durch viele Zellteilungsprozesse bis zur Lückenlosigkeit vermehrt Bisher ist es jedoch nicht gelungen, in einer Petri-Schale auf einer Seite einer in einer Halte- und Spanneinrichtung eingespannten und damit von beiden Seiten mit Medium umgebenen Unterlage eine lückenlose Zeüschicht zu züchten. Es ist auch nicht möglich, eine Unterlage, auf der nach dem beschriebenen bekannten Verfahren eine lückenlose Zellschicht gezüchtet wurde, nachträglich in einer Halte- und Spanneinrichtung anzuordnen und zu spannen, weil bei diesem Vorgang auf die Zellschicht Kräfte ausgeübt werden, die eil ? Beschädigung der Zellschicht bewirken, so daß die für die Untersuchungen unbedingt erforderliche Lückenlosigkeit der Zellschicht nicht mehr gegeben ist.

Da die Anordnung der üblicherweise verwendeten, hauchdünnen (10—100 pm) Unterlage und der darauf gezüchteten lückenlosen Zellschichl in einer Halte- und Spanneinrichtung aber unbedingt erforderlich ist um eine ebene Anordnung der Unterlage in einer Doppelperfusionskammer überhaupt zu ermöglichen, war es bislang im »in vitro«-Versuch (außerhalb pflanzlicher, tierischer oder menschlicher Körper) nicht möglich, in einer derartigen Kammer gerichtete 'i'ologische. physiologische, biochemische und pharmakologische Prozesse einer Zellschicht zu beobachten bzw. zu studieren, die physiologischerweise Grenzflächen mit entsprechenden Aktivitäten bilden. Dabei handelt es sich bei derartigen Prozessen um enzymatische Prozesse, die Abgabe von Stoffen an die Umgebung der Zellen der lückenlosen Zellschicht. die Aufnahme von Stoffen aus der Umgebung dieser Zellen und der Transport von Stoffen von der apikalen Seite der Zellen durch die Zellschicht hindurch auf die basale Seite der Zellen und umgekehrt. In einer zur Untersuchung dieser Pro/esse geeigneten Doppelperfusionskammer werden beide Seiten der Unterlage und der darauf befindlichen luk kenlosen Zellschicht gleichmäßig und wirkungsvoll bc spült, so daß die aus beiden Kammern /vr Mcüsciic gelangenden Perfusionsstrome getrennt beobachtet b/w. untersucht werden können

Da es bisher nicht möglich war. auf eine in einer Hai te- und Spanneinrichtung befindlmhen Unterlage eine lückenlose Zellschicht zu züchten, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren /um Züchten einer lückenlosen Zellschicht auf einer in einer Halte- und Spanneinrichtung angeordneten Unterlage, die bis zur Etablierung des Zellrasens zunächst in eine große Petri-Schale gebracht wird und dann in eine Doppelperfusionskammer einsetzbar ist, anzugeben und gleichzeitig eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens zu schaffen.
Diese Aufgabe wird durch ein wie eingangs bereits

genanntes Verfahren gelöst, das durch die in dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruches 1 angegebenen Merkmale gekennzeichnet ist Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist durch die in dem Anspruch 6 angegebenen Merkmale gekennzeichnet

Die Ansprüche 2 bis 5 und 7 bis 9 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Durch die vorliegende Erfindung wird es vorteilhafterweise erstmals ermöglicht, auf einer Seite einer porösen bzw. semipermeablen Unterlage, die sich in einer Halte- und Spanneinrichtung befindet, eine lückenlose Zellschicht anzuzüchten. Somit wird die Untersuchung gerichteter, biologischer Prozesse an Zelischichten erstmal in vitro ermöglicht.

Das erfindungsgemäß Verfahren zeichnet sich fernerhin dadurch aus, daß es äußerst einfach und kostengünstig durchführbar ist.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß auch die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Halte- und .'Spanneinrichtung billig und einfach herstellbar ist.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einer durchsichtigen Unterlage eine lückenlose Zellschicht aufgezüchtet werden kann und so direkt vor dem Einsatz mikroskopisch auf die erforderliche Lückenlosigkeit kontrollierbar ist

Im folgenden wird die Erfindung im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 eine in eine Petri-Schale eingesetzte Halte- und Spanneinrichtung; und

Fig.2 bis 9 Darstellungen zur Erläuterung der Durchführung des vorliegenden Verfahrens.

Zu der Erfindung führten die folgenden Überlegungen.

Es wurde beobachtet, daß Zellen auf einer Seite einer ausgespannten porösen oder semipermeablen Unterlage sich nicht verankern können und daher — ohne Kontakt /ur Unt.rlage — bald absterben.

Der Grund hierfür dürfte wahrscheinlich darin liegen, daß Zellen an ihrer jeweiligen basalen Seite Stoffe synthetisieren, die sich anreichern müssen, um den Zellen eine Orientierungsmöglichkeit zur Ausrichtung und anschließenden Verankerung auf der Unterlage zu geben. Beim Aussäen von Zellen auf einer Ii einem durch ihre Haitcrungs- und Spannvorrichtung im Wachstumsmedium ausgespannien p< >rösen oder semipermeablen Unterlage können sich o<e synthetisierten Stoffe aber nicht anreichern, weil sie i'i d\it unterhalb der Zelten liegenden Flüssigkctsraurr¹ abwandern und sich dort zu sehr verdünnen bzw. durch im (seium-reichen) Wachstumsmediuni durch Enzy'he abgebaut bzw. verändert werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die die Unterlage enthaltende Halte- und Spanneinrichtung derart auf eine beispielsweise aus Glas bestehende Platte aufgesetzt, daß die den Zellen gegenüberliegende Seite der Unterlage auf der Oberfläche der Glasplatte aufliegt. Auf diese Weise wird zwischen den eineinander zugewandten Flächen der Unterlage und der Einrichtung ein Bereich gebildet, in dem sich die von den basalen Seiten der einzelnen Zellen wahrscheinlich synthetisierten Stoffe, die durch die poröse Unterlage hindurchgclangcn, anreichern können. Die aufwachsenden Zellen können sich daher derart orientieren, daß sie ihre jeweiligen basalen Seiten der porösen Unterlage zuwenden und s:ich anschließend verankern. Auf diese Weise etabliert sich im Laufe einer bestimmten Wachstumszeit durch ständige Zellteilung der verankerten Mutterzellen allmählich ein konfluenter (= lückenloser» Zellrasen.

In der F i g. 1 ist der zuvor beschriebene Vorgang schematisch dargestellt Die Etablierung des konfluenten Zellrasens wird in einer mit 1 bezeichneten Petrischale mit Deckel, in der das für das Züchten der Zellen erforderliche Nährmedium enthalten ist durchgeführt

ίο Am Boden der Petri-Schale 1 befindet sich vorzugsweise eine scheibenförmig geschliffene Glasplatte 2. Die poröse Unterlage 3 wird von einer ringförmigen Halte- und Spanneinrichtung 51, 52 gehalten, die nachfolgend noch näher erläutert werden wird. Dabei ist die Halteis und Spanneinrichtung so ausgebildet, daß sie den Randbereich der Unterlage 3 etwa in der Mitte ihrer Dicke festlegt. Der Innendurchmesser der ringförmigen Halte- und Spanneinrichtung 51, 52 ist so bemessen, daß er geringfügig größer ist als der Außendurchmesser der Glasplatte 2. Die Halte- und Spanneinrichtung 51, 52 kann daher so auf die Glasplatte 2 i·.. igeschoben bzw. aufgesetzt werden, daß die der Glasplatte 2 zugewandte Fläche der Unterlage 3 auf der Oberfläche der Glasplatte 2 aufliegt Die dargestellten aufwachsenden Ze"en 6 orientieren si<*h beim Aufwachsen so, daß ihre basalen Seiten (uunkle Fläche) immer der Oberfläche der Unterlage zugewandt sind. Die von den basalen Seiten der Zellen 6 synthetisierten Stoffe können durch die poröse Unterlage hindurchtreten und sich in dem Raum zwisehen der Unterlage 3 und der Glasplatte 2 anreichern.

Im folgenden wird die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert Wie dies aus der F i g. 2 ersichtlich ist besteht diese Vorrichtung vorzugsweise aus zwei Ringen 51 und 52. Der Ring 52 weist an seinem innerer. Rand eine Nut 53 auf, die sich von der Oberfläche des Ringes 53 vorzugsweise etwa bis zur Hälfte seiner Dicke nach innen erstreckt und die vom inneren Rand des Ringes 52 aus vorzugsweise etwa bis zur Hälfte der Erstreckung des Ringes in radialer Richtung verläuft. Dabei ist die Nut 53 etwa so beimessen, daß sie den Ring 51 mit einem geringen Spiel aufnehmen kann. Die Ringe 51 und 52 bestehen vorzugsweise aus einem autoklavierbaren Material. Beispielsweise bestehen die Ringe aus Teflon ode·" Delerin.

Wie dies aus der F i g. 3 ersichtlich ist wird der Ring 51 zunächst auf eine Grundplatte 54 aufgesetzt die so beschaffen ist, daß ihr erhabener Teil 55 den Innenraum des Ringes 51 ausfüllt. Dieser Zustand ist in der Fig. 4 dargestellt.

Wie dies aus der F i g. 5 ersichtlich ist, wird nun das Unterlagenmaterial auf die Oberfläche des erhabenen Teiles 55 und des Ringes 51 aufgelegt. Bei dieser Unterlage handelt es sich beispielsweise um ein poröses Filtermaterial, das auch Celluloseacetat oder Polycarbonat besteht und eine Porosität bis zu 0,5 μιπ aufweist. Als Unterlage kann auch eine Dialysemembran verwendet werden.

Von oben her wird nun in Richtung der der F i g. 6 entnehmbaren P<r!e der Ring 52 auf die in der F i g. 5 dargestellte Anordnung aufgepreßt, so daß sich die Unterlage 3, die zwischen den Ringen 51 und 52 in der Nut 53 festgeklemmt wird, in dem von den Ringen umschlossenen Raum oberhalb des erhabenen Bereiches 55 der Grundplatte 54 plan spannt, wie dies in der F i g. 7 dargestellt ist.

Die aus den Ringen 51,52 und der Unterlage 3 bestehende Anordnung kann nun von der Grundplatte 54 abgehoben werden (Fig.8). Der über die Ringe 51, 52

nach außen überstehende Bereich der Unterlage wird entfernt, vorzugsweise abgeschnitten.

Nach dem Sterilisieren wird die Anordnung in die im Zusammenhang mit der F i g. 1 bereits beschriebene Petri-Schale 1 derart eingesetzt, daß die Unterlage 3 auf der Glasplatte 2 aufliegt.

Bei einem weiteren Schritt werden in der aus der F i g. 9 ersichtlichen Weise Zellen beispielsweise unter Anwendung einer Pipette 56, direkt auf die Unterlage aufgesät. Unter üblichen Kulturbedingungen entsteht dann in Abhängigkeit von der Menge der eingesäten Zellen und von der Zellenart innerhalb von beispielsweise 2 Tagen bis 8 Wochen auf der Unterlage 3 eine geschlossene Zellschicht.

Die so erhaltene lückenlose Zellschicht kann nun durch direktes Einsetzen der Halte- und Spanneinrichtung in eine Doppelperfusionskammer in dieser untersucht werden.

Somit ermöglicht die Erfindung erstmalig die Erzeugung von lückenlosen Zellschichten auf in Halte- und Spanneinrichtungen angeordneten Substraten. Die Halte- und Spanncinrichtungen können, ohne daß eine Beschädigung der in ihnen enthaltenen Zellschichten zu befürchten ist, gehandhabt werden.

Hierzu I Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren 2um Züchten einer lückenlosen Zellschicht auf einer Seite einer eben angespannten po- s rösen oder semipermeablen Unterlage, die in einer Halte- und Spanneinrichtung befestigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die Halte- und Spanneinrichtung derart auf einer Platte aufsetzt, daß die der Zellschicht gegenüberliegende Seite der Unterlage auf der ihr zugewandten Oberfläche der Platte aufliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Platte eine Glasplatte am Boden einer Petri-Schale einsetzt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Unterlage ein als Celluloseacetat oder Polycarbonat bestehendes poröses Filter verwendet wird.

4. Verfahr·: η nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, ^"^5 HaQ Filter eine Porosität von bis zu 0,5 μπι aufweist

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß als Unterlage eine Dialysemembran verwendet wird.

6. Halte- und Spanneinrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß sie aus einem ersten Ring (51) und einem zweiten Ring (52) besteht daß der zweite Ring (52) an seinem inneren Rand eine Nut (53) aufweist, deren Größe so bemessen ist, daß sie den ersten Ring (51) und den Randbereich einer Unterlage (3) aufnehmend ist, ö.c /wischen dem ersten Ring (51) und dem zweiien Ring (52) angeordnet ist.

7. Halte- und Spanneinrichtung nach Anspruch 6. dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ring (51) und der zweite Ring (52) kreisringförmig ausgebildet sind.

8. Halte- und Spanneinrichtung nach Anspruch 6 oder 7. dadurch gekennzeichnet daß die Nut (53) ein Viertel der Fläche des Querschnittes des zweiten Ringes (52) bedeckend bemessen ist.

9. Halte- und Spanneinrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Innendurchmesser des zweiten und/oder des ersten Ringes so bemessen ist, daß er geringfügig größer ist als der Außendurchmesser einer Platte (2).