KORPER MIT EINER KULTURFLÄCHE ZUR IN VITRO VERMEHRUNG VON ZELLEN
Die Erfindung liegt auf dem Gebiete von in vitro Zellkulturen und betrifft einen Körper nach dem Oberbegriff des unabhängigen Patentanspruchs. Der Körper weist mindestens bereichsweise eine Oberfläche auf, die als Kulturfläche ausgebildet ist, das heisst, die derart beschaffen ist, dass in einem Kulturmedium darauf ausgesäte Zellen daran haften und sich vermehren können.
Die in vitro Vermehrung von Gewebezellen, die nicht in Suspension, sondern nur an einer Kulturfläche anhaftend wachsen und sich vermehren können, wird gemäss dem Stande der Technik durchwegs von hochqualifiziertem Personal im wesentlichen manuell durchgeführt. Dabei werden die Zellen auf einer Kulturfläche, die relativ glatt ist oder auch strukturiert sein kann (z.B. gemäss US-6306646), ausgesät und in Kultur vermehrt, bis sie beispielsweise konfluent sind. Dann werden sie mit Hilfe von Trypsin oder anderen Enzymen von der Kulturfläche abgelöst und voneinander getrennt, gewaschen, in frischem Medium suspendiert und auf einer entsprechend grösseren Kulturfläche wieder ausgesät. Die reduzierte Zelldichte, mit der die Zellen wieder ausgesät werden, ermöglicht dann auch eine weitere Zellvermehrung. Die Reihe der meist manuell durchgeführten Arbeitsschritte vom Ablösen der Zellen von der Kulturfläche bis zum Wiederaussäen auf der grösseren Kulturfläche ist als „Passagieren" oder „Splitten" bekannt. Auch die notwendige periodische Erneuerung (ganz oder teilweise) des Kulturmediums erfolgt üblicherweise manuell.
Die Nachteile einer solchen Zellkultur nach dem Stand der Technik sind vielfältig. Besonders nachteilig für die Zellen ist die Behandlung mit Trypsin und Enzymen allgemein, weil dadurch die Zellen im allgemeinen irreversibel und in der Regel auch in unbekanntem Ausmass geschädigt werden. Ferner verursachen alle manuell durchgeführten Arbeitsschritte hohe Personalkosten und verlangen eine aufwendige Qualitätssicherung. Zusätzlich führen alle manuell durchgeführten Arbeitsschritte immer auch zu einer Erhöhung des Infektionsrisikos für die Zellkulturen und damit indirekt im Fall einer klinischen Anwendung auch für den Patienten. Ferner besteht bei allen manuellen Arbeiten mit humanen Zellkulturen ein Infektionsrisiko auch für das Laborpersonal.
Zur Kultivierung von Zellen, die auf einer Kulturfläche wachsen, sind auch Bioreaktoren bekannt. In diesen Bioreaktoren steht den Zellen eine zweidimensionale Kulturfläche (z.B. beschrieben in WO-96/40860) oder ein dreidimensionales Gerüst (z.B. beschrieben in FR-2768783-A1 oder in WO-01/14517-A1) zur Verfügung. Die Zellen werden auf der zweidimensionalen Kulturfläche ausgesät, zur Vermehrung kultiviert und dann für die Autotransplantation geerntet. Die dreidimensionalen Gerüste, in welchen die Zellen ebenfalls ausgesät und vermehrt werden, werden üblicherweise direkt als sog. ex vivo Organeinheiten weiter verwendet. Die Bioreaktoren sind mit Regelsystemen ausgerüstet, welche das Kulturmedium, den Gasaustausch und andere Kulturparameter innerhalb von vorgegebenen Grenzwerten halten.
Mit den oben beschriebenen Bioreaktoren können gegenüber dem manuellen Vorgehen Kosten gespart werden, sowohl beim Personal als auch bei der Qualitätssicherung. Die Vermehrung der Zellen ist aber auch hier durch die den Zellen zur Verfügung stehende Kulturfläche begrenzt. Dasselbe gilt auch für die Bioreaktoren gemäss EP-0725134 und WO-0066706, die flexible Wände und Kulturflächen aufweisen, und für die Bioreaktoren gemäss WO-00/12676 mit elastischen Wänden. Sollen also die in derartigen Bioreaktoren nur beschränkt vermehrten Zellen weiter vermehrt
werden, müssen sie notwendigerweise passagiert werden, was auch hier den für die Biologie der Zellen wesentlichen Nachteil der Ablösung mit Trypsin und/oder anderen Enzymen und der damit verbundenen Zellschädigungen mit sich bringt.
In der Publikation WO-03/020871 wird zur Vermeidung des Passagierens oder min- destens zur Reduktion der zur Erreichung einer vorgegebenen Vermehrung durchzuführenden Passagierschritte vorgeschlagen, die Kulturfläche derart auszugestalten, dass sie entsprechend der wachsenden Zahl der darauf anhaftenden Zellen vergrossert werden kann. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, als Kulturfläche die Oberfläche einer dehnbaren Membran zu verwenden und die Kulturfläche entsprechend der wachsenden Zahl der daran anhaftenden Zellen kontinuierlich oder schrittweise durch Dehnung der Membran zu vergrössern. Dabei wird vorteilhafterweise dafür gesorgt, dass die Zellen auch während der Vergrösserung der Kulturfläche nicht aus dem Kulturmedium entfernt werden müssen.
Die Erfindung stellt sich nun die Aufgabe, einen Körper zu schaffen, der mindestens bereichsweise eine als Kulturfläche ausgebildete Oberfläche aufweist, wobei diese Kulturfläche es möglich machen soll, das aus der Publikation WO-03/020871 bekannte Verfahren der in vitro Vermehrung von an einer Kulturfläche anhaftenden Zellen mit an die wachsende Zellenzahl angepasster Vergrösserung der Kulturfläche, das heisst ohne Passagieren oder mit einer relevant reduzierten Zahl von Passagier- schritten, in sehr einfacher und vorteilhafter Weise durchzuführen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch den Körper, wie er in den Patentansprüchen definiert ist.
Der als Kulturfläche ausgerüstete Oberflächenbereich des erfindungsgemässen Körpers weist Öffnungen mit vorteilhafterweise steilen Seitenwänden auf und der Körper ist derart dehnbar ausgestaltet, dass die Öffnungen durch Dehnung das Körpers oder eines entsprechenden Körperteils aufgeweitet und dadurch vergrossert werden. Die Öffnungen sind derart ausgestaltet und dimensioniert, dass sie für eine Zellbesiedlung zu eng sind, wenn der Körperteil nicht oder nur wenig gedehnt ist (ungedehnter Zustand der Kulturfläche), und dass Zellen sich darin ansiedeln können, wenn der Körperteil mindestens in einer Richtung über einen vorgegebenen Dehnungsgrad gedehnt wird (erster Dehnungszustand der Kulturfläche).
Die Zellen werden auf der ungedehnten Kulturfläche des erfindungsgemässen Körpers ausgesät und in einer ersten Kulturphase darauf vermehrt. Da in diesem ungedehnten Zustand der Kulturfläche die Zellen die dafür zu engen Öffnungen nicht besiedeln können, vermehren sie sich auf der Kulturfläche zwischen den Öffnungen und wachsen über die Öffnungen hinweg. Sobald eine vorgegebene Zelldichte auf dieser ungedehnten Kulturfläche erreicht ist, wird (anstelle einer Passagierung) die Kulturfläche bzw. der darunter liegende Körperteil derart gedehnt, dass die Öffnungen in diesem ersten Dehnungszustand der Kulturfläche eine Grosse aufweisen, die eine Zellbesiedlung der Seitenwände und gegebenenfalls der Grundfläche der Öffnungen zulässt, wodurch die Kulturfläche relevant vergrossert wird. Wenn die Zell- dichte auf der neuen, die Seiten- und Grundflächen der Öffnungen mit einbeziehenden Kulturfläche wiederum angestiegen ist, kann (anstelle eines weiteren Passagierschrittes) die Kulturfläche weiter gedehnt werden (weiterer Dehnungs zustand der Kulturfläche), wodurch Bereiche zwischen den Öffnungen und gegebenenfalls die Grundflächen der Öffnungen (kontinuierlich oder schrittweise) weiter vergrossert und somit den Zellen wiederum mehr Kulturfläche zur Verfügung gestellt wird.
Der die oben kurz beschriebene Kulturfläche aufweisende Körper ist beispielsweise eine Membran, wobei die Kulturfläche beispielsweise die eine Oberfläche der Mem-
bran darstellt und die Öffnungen nicht durchgehend sind. Die Membran kann aber auch durchgehende Öffnungen aufweisen und beide Membranseiten können als Kulturflächen ausgerüstet sein. Die Membran wird für die Kultur in eine entsprechende Dehnvorrichtung eingesetzt, wofür sie eine vorgegebene Form und gegebe- nenfalls Randbereiche aufweist, die für eine Befestigung in der Dehnvorrichtung ausgestaltet sind. Die Membran kann aber auch grösserflächig sein und für die Anwendung in verschiedenen Dehnvorrichtungen entsprechend zugeschnitten werden. Der erfindungsgemässe Körper kann auch als Ballon ausgebildet sein, dessen Au- ssenseite als Kulturfläche ausgebildet ist (Öffnungen nicht durchgehend) und der durch Vergrösserung des Innendruckes gedehnt wird. Eine weitere, beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemässen Körpers ist eine flache Schale (wie Petri- Schale), deren innere Bodenfläche als Kulturfläche ausgebildet ist (Öffnungen nicht durchgehend) und die mit einer an ihrer Seitenwand angreifenden Dehnvorrichtung während der Kultur gedehnt wird.
Der erfindungsgemässe Körper besteht mindestens im Bereich der Kulturfläche beispielsweise aus einem Elastomer (vorteilhafterweise aus einem Silikon-Elastomer), dessen Oberfläche durch Dehnung beispielsweise hundert mal (linear: 10 mal) vergrossert werden kann. Die Öffnungen weisen mindestens in einer Richtung eine Breite auf, die im ungedehnten Zustand etwa 5μm oder weniger beträgt, so dass die Öffnungen in diesem Zustand für die Zellen geschlossen sind. Zum Öffnen der Öffnungen wird die Kulturfläche derart gedehnt, dass die genannte Breite mindestens lOμm beträgt. Damit die durch das Öffnen der Öffnungen erreichbare Kulturflächen- vergrösserung möglichst hoch ist, sind die Öffnungen möglichst nahe beieinander angeordnet und möglichst tief.
Beispielhafte Ausführungsformen der als Kulturfläche ausgebildeten Oberfläche des erfindungsgemässen Körpers werden anhand der folgenden Figuren im Detail beschrieben. Dabei zeigen:
Figur 1 eine sehr schematisch dargestellte, beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemässen Körpers in einer Zellkultur (senkrecht geschnitten);
Figur 2 eine beispielhafte Ausführungsform der als Kulturfläche ausgebildeten Oberfläche des erfindungsgemässen Körpers in drei Dehnungszuständen (geschnitten);
Figuren 3 bis 5 beispielhafte, weitere Ausführungsformen der Kulturfläche in verschiedenen Dehnungszuständen (Draufsicht);
Figur 6, eine weitere beispielhafte Ausführungsform der Kulturfläche, die mit Zusatzstoffen ausgerüstet ist.
Figur 1 zeigt in einer sehr schematischen Weise einen in einem Kulturmedium angeordneten, erfindungsgemässen Körper 1, der die Form einer Membran hat, wobei nur die obere Membranseite als Kulturfläche 2 ausgebildet ist und nicht durchgehende Öffnungen aufweist oder wobei beide Membranseiten als Kulturflächen 2 ausgebildet sind und die Membran durchgehende Öffnungen aufweist. Für die Vermeh- rung von Zellen auf der Kulturfläche 2 wird die Membran in eine Dehnvorrichtung 3 eingebaut. Diese Dehnvorrichtung weist beispielsweise eine Mehrzahl von in einem Randbereich an der Membran befestigbaren Befestigungsmitteln 4 auf, die mit Hilfe von geeigneten Führungen 5 von einer inneren Position (ungedehnter Zustand der Membran, ausgezogen dargestellt) in mindestens eine äussere Position (gedehnter Zustand der Membran, strichpunktiert dargestellt) bringbar und in mindestens diesen beiden Positionen arretierbar sind. Befestigungsmittel und Führungen sind derart ausgebildet, dass die Membran unabhängig von ihrem Dehnungszustand in einem Gefäss 6, das mit einem Kulturmedium 7 gefüllt ist, untergebracht werden kann.
Figur 2 zeigt eine erste, beispielhafte Ausführungsform der als Kulturfläche 2 ausgebildeten Oberfläche. Die Kulturfläche ist in ungedehntem Zustand a, in einem ersten Dehnungszustand b und in einem weiteren Dehnungszustand c dargestellt, welche Zustände während der Kultur in auf die Zellvermehrung abgestimmten Zeitab- ständen nacheinander durch stufenweise oder kontinuierliche Dehnung eingestellt werden. Die Kulturfläche weist schlitzförmige Öffnungen 10 auf, die parallel zueinander angeordnet sind und die im ungedehnten Zustand a eine Breite von etwa 5μm oder weniger aufweisen. Auf der ungedehnten Kulturfläche kultivierte Zellen 11 wachsen zwischen den Öffnungen und über die Öffnungen hinweg. Durch Dehnung der Kulturfläche quer zu den schlitzförmigen Öffnungen (erster Dehnungszustand b) werden die Öffnungen (10') geöffnet und zwar in einem solchen Masse, dass sie für die Besiedlung mit Zellen 11 breit genug werden. Die schlitzförmigen Öffnungen 10' sind in diesem Zustand mehr als ca. lOμm breit, beispielsweise 10 bis 20μm. Die durch eine solche Dehnung erreichte Vergrösserung der Kulturfläche entspricht etwa der Fläche der Seitenwände der Öffnungen und kann eine Vergrösserung der Kulturfläche um einen Faktor von beispielsweise vier bis zehn darstellen. Um bei dieser ersten Dehnung der Kulturfläche eine noch höhere Kulturflächenvergrösserung zu erreichen, könnten die Öffnungen gegebenenfalls hinterschnitten sein, so dass sie im ungedehnten Zustand nur an ihrer äusseren Seite geschlossen sind.
Wenn die Kulturfläche in derselben Richtung weiter gedehnt wird (weiterer Dehnungszustand c), vergrössern sich im wesentlichen die Grundflächen der Öffnungen (10") und gegebenenfalls die Kulturflächenbereiche zwischen den Öffnungen, was nochmals eine Vergrösserung um einen Faktor vier bis zehn ausmachen kann, insbesondere, wenn die Kulturfläche nicht wie in der Figur 2 dargestellt nur in einer Richtung, sondern in zwei Richtungen gedehnt wird.
Figur 3 zeigt die Kulturfläche 2 gemäss Figur 2 als Draufsicht in den Dehnungszuständen a und b.
Die schlitzförmigen Öffnungen 10 der Kulturfläche 2, die in den Figuren 2 und 3 dargestellt ist, haben beispielsweise eine Tiefe von 5 bis 500μm und einen Abstand voneinander, der mindestens 10 bis 20μm beträgt. Dabei ist die Tiefe der Öffnungen 10 vorteilhafterweise möglichst gross und deren Abstand voneinander möglichst klein, wobei Tiefe und Abstand derart an die Eigenschaften des verwendeten Materials anzupassen sind, dass die sich zwischen den Öffnungen erhebenden Bereiche genügend stabil, sind, um in gedehntem Zustand der Kulturfläche und insbesondere im Kulturmedium aufrecht stehen zu bleiben und die Öffnungen nicht durch Deformation zu schliessen.
Eine Struktur für eine Kulturfläche 2, die in den Figuren 2 und 3 dargestellt ist und die Öffnungen 10 mit den oben angegebenen Abmessungen aufweist, lässt sich als Oberfläche einer beispielsweise 0,1 bis 1mm dicken Membran aus einem Elastomer erzeugen beispielsweise durch Aufgiessen des verflüssigten Elastomers auf eine entsprechend strukturierte Form. Diese Form besteht beispielsweise aus einem Metall oder aus Silizium, dessen Oberfläche durch entsprechende Strukturierung einer photosensitiven Schicht und darauffolgende Ätzung zu einem der gewünschten Struktur entsprechenden Negativ strukturiert wird.
Versuche haben gezeigt, dass Membrane mit den oben beschriebenen Strukturen herstellbar sind beispielsweise aus Polydimethylsiloxan oder aus einem auf Dimethyl- siloxan basierenden Polymer. Die Fläche von Membranen aus diesen Materialien mit einer Dicke von ca. 1 bis 2 mm sind durch Dehnung um einen Faktor von ca. 4 ver- grösserbar.
Die Membranen aus Polydimethylsiloxan wurden hergestellt durch Polymerisation auf einer Siliziumoberfläche, auf der eine Photoresistschicht aufgebracht und dann entsprechend strukturiert wurde. Es wurde der unter dem Handelsnamen SU-8 von
MicroChem Corp. (Massachusetts, USA) erhältliche Photoresist verwendet, der sich eignet für die Herstellung von Schichten mit einer Dicke von bis zu 200 μm und von Strukturen mit sehr senkrechten Wänden.
Die Membrane aus dem Dimethylsiloxan wurden hergestellt durch Polymerisation auf einer durch Plasmaätzung entsprechend strukturierten Siliziumoberfläche.
Figur 4 zeigt als Draufsicht eine weitere Kulturfläche 2 mit Öffnungen 10.1 und 10.2. Die Öffnungen sind wiederum parallel zueinander angeordnet und schlitzförmig, wobei sich ein Teil der Öffnungen (10.1) senkrecht zum anderen Teil der Öffnungen (10.2) über die Kulturfläche erstreckt. Die Kulturfläche 2 ist im ungedehnten Zustand a dargestellt, in dem alle Öffnungen 10.1 und 10.2 für die Zellbesiedlung geschlossen sind (Breite kleiner oder gleich 5μm). Sie ist ferner in einem ersten Dehnzustand b.l dargestellt, in dem sie senkrecht zu den Öffnungen 10.1 gedehnt ist und diese für die Zellbesiedlung also offen, die Öffnungen 10.2 aber noch geschlossen sind, sowie in einem zweiten Dehnzustand b.2, in dem die Kulturfläche 2 zusätz- lieh auch quer zu den weiteren Öffnungen 10.2 gedehnt ist, so dass alle Öffnungen für die Zellbesiedlung offen sind. Auch diese Kulturfläche 2 kann durch weitere Dehnung in weitere, nicht dargestellte Dehnzustände gebracht und dadurch weiter vergrossert werden.
Figur 5 zeigt eine weitere Kulturfläche mit lochförmigen Öffnungen 10.3, deren Abmessungen im ungedehnten Zustand a der Kulturfläche in allen Richtungen derart sind, dass die Öffnungen für eine Zellbesiedlung zu eng, also geschlossen sind. Zur Öffnung der Öffnungen 10.3 wird die Kulturfläche beispielsweise in ihrem Randbereich gehalten und in allen Richtungen gedehnt. Der in der Figur 5 dargestellte Körper 1 mit der Kulturfläche 2 ist beispielsweise ein rundes Stück einer Membran mit einem für die Befestigung in einer Dehnvorrichtung verdickten Randbereich 20. Die
Membran ist dabei entweder auf nur einer Seite als Kulturfläche ausgebildet und auf dieser Seite mit nicht durchgehenden Öffnungen versehen. Die Membran kann aber auch auf beiden Seiten als Kutlurfläche ausgebildet und mit durchgehenden Öffnungen ausgebildet sein, wodurch sich eine weitere Kulturflächenvergrösserung ergibt.
Auf einer Membran mit durchgehenden Öffnungen werden die Zellen beispielsweise im ungedehnten Zustand der Membran auf der oberen Membranseite ausgesät. Wenn sie genügend konfluent sind, wird die Membran gedehnt, so dass die Öffnungen für die Zellen geöffnet werden und sie nicht nur die Seitenwände der Öffnungen sondern auch die untere Membranseite besiedeln können. Für eine weitere Vergrösserung der Kulturfläche wird auch diese Membran in einen weiteren Dehnungs zustand gebracht.
Der Randbereich 20 des in der Figur 5 dargestellten Körpers 1 kann auch in einer Richtung derart stark über die Kulturfläche 2 vorstehen, dass der Körper eine flache Schale bildet, in die direkt Kulturmedium eingefüllt werden kann.Figur 6 zeigt anhand einer Kulturfläche 2, die mit schlitzförmigen Öffnungen 10 ausgebildet ist wie die Kulturfläche gemäss Figuren 2 und 3, dass in den Öffnungen 10 auch Wirkstoffe 21, beispielsweise in einem biodegradablen Material eingebettet vorgesehen werden können. Diese Wirkstoffe bleiben für die Zellen während der ersten Phase der Zellkultur (ungedehnter Zustand a der Kulturfläche) für die Zellen unwirksam und entwickeln ihre Wirkung erst in der folgenden Phase der Zellkultur (erster Dehnungszu- stand b). Solche Wirkstoffe sind beispielsweise Nährstoffe, Differenzierungsfaktoren oder andere Faktoren, die auf die Entwicklung und/oder Vermehrung der Zellen einen gewünschten, positiven Einfluss nehmen.