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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Hydrogel-Mikrostruktur.
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Die Untersuchung neuronalen Wachstums wird in Collagenisierten Petrischalen, sogenannten Campenot-Kammern durchgeführt, die ein Tefloninsert als Dreikammervorrichtung umfassen (Campenot R. B. (1977). Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 4516–4519). In die getrocknete Collagenschicht der Schale werden feine, parallele Kratzer mit einer kammartigen Vorrichtung eingefügt. Die Kratzer dienen den wachsenden Fortsätzen von Neuronen als Leitstruktur. Nachteilig sind die Kratzer als Leitstrukturen nicht reproduzierbar im Mikrometerbereich herstellbar.
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Aus Taylor et al. (Anne M. Taylor, Seog Woo Rhee, Christina H. Tu, David H. Cribbs, Carl W. Cotman, and Noo Li Jeon (2003). Microfluidic Multicompartment Device for Neuroscience Research. Langmuir 19, 1551–1556) ist ein anderes Verfahren zur Herstellung einer mikrofluidischen Zellkulturvorrichtung bekannt. Das Verfahren umfasst die Herstellung einer aus Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellten Kammer mittels eines photolithographisch hergestellten Masters. Die PDMS-Kammer weist verschiedene Kompartimente auf, die als Wachstumsareal für Zellen dienen und über Mikrokanäle miteinander verbunden sind. Die Oberfläche des Substrats ist mit Poly-L-Lysin beschichtet. Es ist bekannt, dass die Axone in Zellkulturen besonders gut auf Unterlagen wachsen, die vorab aus Polykationen wie Poly-L-Lysin oder Polyornithin bestehen. In der PDMS-Kammer werden Zellversuche unternommen, um die Axone entlang der Mikrokanäle gerichtet wachsen zu lassen. Die Zellen wachsen entlang der PDMS-Strukturen. Nachteilig erlauben die nach diesem Verfahren hergestellten Kammern nur eine eingeschränkte Untersuchung der Zellen.
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US 2003/0134129 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Hydrogelstruktur.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein reproduzierbares Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels mit Mikrostrukturen für die Zellkultur auf einem Substrat bereit zu stellen.
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Die Aufgabe wird gelöst nach dem Verfahren nach Patentanspruch 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
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Das Verfahren zur Herstellung einer als Zellkulturvorrichtung dienenden Hydrogel-Struktur mit Mikrometerabmessungen auf einem Substrat ist gekennzeichnet durch die nachfolgenden Schritte. Eine mindestens einen Kanal umfassende Gussform aus einem Elastomer, vorzugsweise aus einem polymerisierten Polydimethylsiloxan (PDMS), wird auf dem Substrat angeordnet, wobei der über seine Länge halboffene, das heißt angeschnittene Kanal mit der offenen Seite gegen das Substrat gepresst und abgedichtet wird. Die Gussform weist mindestens zwei miteinander über den Kanal verbundene Öffnungen für die Befüllung der Gussform bzw. des Kanals mit Hydrogel auf. Die Öffnungen stehen hierzu vorzugsweise senkrecht vom Kanal ab. Sodann wird ein flüssiges Hydrogel über eine der Öffnungen in den Kanal eingebracht. Dabei füllt sich der Kanal mit Hydrogel und das Gel wird in dem Kanal in Form eines Stegs unmittelbar auf dem Substrat angeordnet. Die mit Gel gefüllte Gussform und das Substrat werden eingefroren. Dies kann auch unmittelbar nach dem Einfüllen des flüssigen Hydrogels oder in teilpolymerisiertem Zustand erfolgen. Die Gussform wird nach dem Einfrieren von dem noch gefrorenen Hydrogel abgelöst. Da das Hydrogel im halboffenen Kanal der Gussform unmittelbar auf dem Substrat angeordnet wurde, verbleibt dieses im tief gefrorenen Zustand als stegartige Mikrostruktur entsprechend dem Abbild des Kanals der Gussform unmittelbar auf dem Substrat. Der Querschnitt des Stegs ist etwa halbkreisförmig.
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In den Bereichen der Gussform, die einen Zugang sowohl zu den Öffnungen als auch unmittelbar an die Oberfläche des Substrats aufweisen, wird nach dem Einfüllen des flüssigen Gels ein Abdruck aus polymerisiertem Hydrogel auf dem Substrat ausgebildet. Durch den Einfriervorgang und durch das Ablösen der Gussform vom tief gefrorenen Hydrogel wird vorteilhaft bewirkt, dass auch sehr kleine Strukturen wie z. B. Stege, welche einen kleinen Durchmesser aufweisen, ohne Bruchgefahr beim Ablösen der Gussform hergestellt werden können.
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Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die Verfahren zur Herstellung von Mikrostrukturen auf einem Substrat das Problem aufweisen, dass die Strukturen mit Durchmessern im Mikrometerbereich nicht reproduzierbar auf einem Substrat hergestellt werden können. Nach dem Polymerisieren der Hydrogel-Mikrostruktur in einer Gussform reißen kleinste Strukturen regelmäßig an den Kanten der Gussform ab und machen die Hydrogele als Zellkulturvorrichtung damit unbrauchbar.
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Als kleiner Durchmesser gilt für das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere ein Durchmesser von etwa 100 μm bis etwa 300 μm. Die Öffnungen sind vorzugsweise senkrecht bzw. im stumpfen Winkel zum Kanal angeordnet, so dass bei Befüllen der Öffnung die Hydrogellösung in den Kanal eindringt und diesen befüllt.
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Es können selbstverständlich vom Durchmesser her größere Strukturen hergestellt werden, z. B. Strukturen von 300 bis 1000 μm Durchmesser oder noch größer. Das Verfahren selbst ist aber im Wesentlichen für die Herstellung kleiner Strukturen entwickelt worden.
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Die Gussform weist in an sich bekannter Weise zwei Öffnungen auf, die einerseits mit dem Kanal und andererseits über den Kanal auch miteinander in Verbindung stehen. Da der Kanal einen in Richtung der Oberfläche des Substrats angeschnittenen, geöffneten Querschnitt aufweist, wird das flüssige Hydrogel direkt auf dem Substrat angeordnet.
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Die flüssige Hydrogellösung wird in eine mikrostrukturierte (PDMS-)Gussform, welches ein Negativ der herzustellenden Hydrogel-Mikrostruktur umfasst, eingebracht und sodann tief gefroren. Nach dem Aushärten der Hydrogelstruktur wird die PDMS-Gussform in tief gefrorenem Zustand der Mikrostruktur von dieser abgelöst.
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Die flüssige Hydrogellösung kann vorzugsweise bei etwa 4°C unter Verwendung einer Mikropipette, deren Pipettenspitze bei der Befüllung das Befüllloch luftdicht abdichtet, in die Gussform eingebracht werden
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Als Hydrogele gelten Wasser enthaltende Gele auf der Basis hydrophiler, aber wasserunlöslicher Polymere, die als Netzwerke ausgebildet vorliegen. In Wasser quellen diese Netzwerke unter weitgehender Formerhaltung bis zu einem Gleichgewichtsvolumen auf. Die Netzwerkbildung erfolgt vorwiegend über chemische Verknüpfung der einzelnen Polymerketten. Sie ist aber auch physikalisch durch elektrostatische, hydrophobe oder Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen einzelnen Segmenten der Polymerketten möglich. Über die Wahl der zum Polymeraufbau verwendeten Monomeren, die Art der Vernetzung und die Vernetzungsdichte können die gewünschten Eigenschaften der Hydrogele gezielt eingestellt werden. Die notwendige Hydrophilie der Polymere vermitteln unter anderem Hydroxy-, Carboxylat-, Sulfonat- oder Amid-Gruppen. Synthetische Hydrogele basieren z. B. auf Poly(meth)acrylsäuren, Poly(meth)acrylaten, Polyvinylpyrrolidon oder Polyvinylalkohol. Hydrogele sind vorteilhaft gut verträglich mit lebenden Geweben. Besonders vorteilhaft wird als Hydrogel Collagen, insbesondere Collagen Typ II und IV verwendet.
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Vorteilhaft wird eine Gussform aus Polydimethylsiloxan (PDMS) für die Herstellung der Stege verwendet. Ein Polymer der allgemeinen Formel
wird dabei als Polydimethylsiloxan bezeichnet. Eine Vielzahl an unterschiedlichen Siloxanen kann je nach Art und Konzentration der Grundsubstanz und des Copolymers gebildet werden. Die chemische Natur des PDMS ist im Sinne der Erfindung aber nicht bedeutsam. Vielmehr ist die innere dreidimensionale Struktur der Gussform und der durch Kontakt mit dem Substrat vorgesehenen Fläche, die zur Ausbildung der Hydrogelstruktur vorgesehen und geeignet ist, relevant.
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Die flüssige Hydrogellösung in der mikrostrukturierten PDMS-Gussform ist vorteilhaft vor Austrocknung geschützt und auf Grund der Transparenz des Hydrogels und des Substrats gut mikroskopierbar.
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Vorteilhaft wird durch die Wahl von Collagen als Hydrogel ein besonders biomimetisches Material reproduzierbar in den genannten Größen und Durchmessern bereit gestellt. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass Hydrogelstege durch interne Porenbildung beim Polymerisieren vorteilhaft besonders geeignet zum gerichteten Wachstum von Axonen innerhalb der Poren sind.
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Hierzu wird in einer Ausgestaltung der Erfindung eine flüssige Collagenlösung mit einer Konzentration von bevorzugt 2,5–3,5 mg·ml–1 zum Einfüllen in die Öffnung der Gussform ausgewählt. Diese Konzentration bewirkt besonders vorteilhaft, dass das polymerisierte Collagen Porendurchmesser enthält, die das gerichtete Wachstum von Axonen und Dendriten der Nervenzellen ermöglichen. Die Poren sind für die auswachsenden Fortsätze, das heißt für Axone und Dendriten nicht aber für die Zellkörper, den Soma durchlässig. Damit können die Axone und Dendriten von einem Ende des Stegs zum anderen Ende des Stegs wachsen.
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Die am Eingang der Stege ausgesäten Neuronen können Axone bzw. Dendriten ausbilden, die durch die Poren wachsen. Durch das Beimischen selektiv wirkender neurotropher Faktoren können die Axone besonders bevorzugt durch die Poren des polymerisierten Collagens hindurch von einem Ende des Stegs zum anderen Ende des Stegs wachsen.
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Die Gussform wird vorteilhaft im tief gefrorenen Zustand des Hydrogels abgelöst. Als tief gefroren wird insbesondere eine Temperatur des Hydrogels von etwa –8 bis etwa –50°C, bevorzugt von etwa –10°C bis –30°C und besonders bevorzugt –20°C beim Ablösen der Gussform angesehen. Selbstverständlich können Zwischengrößen wie z. B. –19°C und alle anderen Temperaturen im genannten Bereich gewählt werden. Erst bei diesen Temperaturen ist vorteilhaft gewährleistet, dass die in Bezug auf Länge und Durchmesser kleinsten Strukturen, wie die angegebenen Stege beim Ablösen der Gussform nicht brechen. Ein Brechen dieser Strukturen macht die Hydrogelstruktur als Zellkulturvorrichtung unbrauchbar. Die Gussform kann durch Abnehmen von der gefrorenen Hydrogelstruktur getrennt werden.
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Um eine komplexe Hydrogelstruktur herzustellen, kann eine Gussform gewählt werden, bei der mindestens ein Kanal eine Länge von bis zu 10 mm bei entsprechendem Durchmesser aufweist.
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Es hängt von der Art der Zellkultur und des Experiments ab, welche Strukturen exakt gebildet werden. Hierzu wird die entsprechende Gussform hergestellt und verwendet.
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Im Falle, dass ein gerichtetes Wachstum von Axonen und/oder Dendriten gewünscht ist, sollte der Steg auf dem Substrat einen Durchmesser von 200 bis 300 Mikrometer und eine Länge von etwa 500 Mikrometer nicht überschreiten, da dies die Abmessungen sind, über die Axone in vitro nachweislich wachsen können. Größere Durchmesser veranlassen die Axone nicht mehr gerichtet zu wachsen. Zu lange Strukturen verhindern ein vollständiges Durchwachsen des Axon bis an das andere Ende des Kanals.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch sehr lange Stege bis zu 100 mm und mehr bei einem Durchmesser von nur 100 bis 300 μm gebildet werden, ohne das diese beim Ablösen der Gussform brechen.
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Da das flüssige Hydrogel in die Eintrittsöffnung der Gussform eingefüllt wird und von dort ausgehend den mit der Öffnung verbundenen Kanal füllt, verbleiben nach dem Ablösen der Gussform gefrorene Hydrogelreste am vormaligen Ort der Einfüllöffnung(en) unmittelbar auf dem Substrat. Diese Reste werden entfernt, z. B. durch Einsatz eines Skalpells. Mit Ausnahme des dünnen Stegs werden also die verfahrensbedingt entstandenen Reste an verfestigtem Hydrogel entfernt. Daher verbleibt lediglich der fertig gestellte Steg auf dem Substrat. Dieser kann für die Verwendung verkürzt werden.
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Das Substrat, auf dem das Hydrogel angeordnet wird, soll vorzugsweise transparent sein, z. B. aus Glas oder Plexiglas bestehen. Dann lassen sich die in Kultur befindlichen Zellen sehr gut mikroskopisch untersuchen. Es eignen sich beispielweise Deckgläschen als Substrat.
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Nachdem die Reste an Hydrogel auf dem Substrat entfernt wurden, können besonders vorteilhaft an mindestens einem Ende des Stegs weitere Hydrogelstrukturen angeordnet werden. Es werden vorzugsweise an beiden Enden des Stegs auf dem Substrat jeweils punktförmige flüssige Hydrogelstrukturen angeordnet, welche bereits die Zellen beinhalten. Die punktförmigen Strukturen können vorzugsweise bis zu 5 mm Durchmesser aufweisen. Sie polymerisieren z. B. bei Raumtemperatur. Die kreisrunden Hydrogelstrukturen sind mit den Stegen unmittelbar verbunden. Dann wird vorteilhaft bewirkt, dass ein Axon ausgehend von der punktförmigen Struktur auf dem Hydrogel in den Steg gerichtet wachsen kann. Der Steg kann aus einem anderen Hydrogel hergestellt werden, als die weiteren punktförmige(n) Hydrogelstruktur(en).
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Die Gussform sollte selbstverständlich mehr als nur einen einzigen Kanal aufweisen. Insbesondere soll die Gussform etwa 5 bis 10 Kanäle umfassen. Es kann somit eine Gussform gewählt werden, bei der während des Verfahrens über die Einfüllöffnung etwa 5 bis 10 Kanäle gleichzeitig befüllt und entsprechend 5 bis 10 Stege gleichzeitig hergestellt werden können. Die Gussform weist dann die zum Substrat hin halboffenen, angeschnittenen 5 bis 10 Kanäle auf, die mit der Einfüllöffnung verbunden sind und über diese befüllt werden können. Durch das Anpressen der Gussform an das Substrat, wird die Gussform und die zum Substrat gerichteten über ihre Länge halboffenen Kanäle gegen das Substrat abgedichtet. Die Gussform weist zu diesem Zweck vorzugsweise einen Young-Modulus von 1 bis 3 MPa auf. Besonders geeignet sind Gussformen mit einem Young-Modulus zwischen 1,6 bis 2,6 MPa. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Gussform eine Elastizität aufweist, bei der sie sich gut gegen das angrenzende Substrat abdichten lässt.
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Sodann wird das flüssige Hydrogel in die Öffnung bzw. Kanäle gefüllt. Da die Einfüllöffnung im rechten Winkel auf den Kanal bzw. auf die Kanäle zuläuft, kann das flüssige Hydrogel in den bzw. die Kanäle fließen und diese(n) auffüllen.
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Die auf diese Weise hergestellten Stege weisen entsprechend der Abstände der Kanäle in der Gussform einen Abstand von etwa 200 μm von Zentrum zu Zentrum zueinander auf. Die Kanäle der Gussform weisen einen entsprechenden Abstand von ebenfalls 200 μm zueinander auf.
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Die vorteilhafte Verwendung einer auf diese Weise hergestellten Hydrogelstruktur liegt nach dem Auftauen der Strukturen in der Kultivierung von Neuronen und dem sogenannten gerichteten Wachstum in biomimetischer Hydrogelumgebung. Hierzu werden Neuronen auf die punktförmige(n) Hydrogelstruktur(en) vorzugsweise mit dieser vereinzelt ausgesät. Durch das Beimischen von Wachstumsfaktoren und Leitmolekülen wird vorteilhaft bewirkt, dass die Axone und/oder die Dendriten der Soma durch die in den Stegen angeordneten Poren des Hydrogels zu einer von dieser Zelle räumlich getrennten Zelle wachsen. Eine Untersuchung der Zellen während des Wachstums ist besonders vorteilhaft möglich, z. B. durch Patch-Clamp-Verfahren.
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Die gefrorene Struktur ist als Vorläufer der eigentlichen Hydrogelstruktur herstellbar.
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Die Struktur weist in gefrorenen und im ungefrorenen Zustand erfindungsgemäß mindestens einen Steg mit einem Durchmesser von 100 bis 300 μm auf. Derartig kleine Durchmesser in Stegen von Hydrogelen sind aus dem Stand der Technik nicht reproduzierbar auf dem Substrat herstellbar.
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Als besonders geeignet hat sich Collagen als Hydrogel mit einer Konzentration von 2,5–3,5 mg·ml–1 herausgestellt. Diese Konzentration des Collagen ist besonders unanfällig gegenüber der angesprochenen Bruchgefahr beim Ablösen der Gussform und bildet bei der Polymerisation die für das gerichtete Auswachsen eines Axon im Steg notwendigen Poren aus.
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Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispiels und der beigefügten Figuren näher beschrieben.
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1 zeigt: Abdichten der PDMS-Gussform gegen das Substrat (Querschnitt) und Herstellung der Stege.
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2 zeigt: Einzelne Phasen des Verfahrens.
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3 zeigt: Hergestellte Strukturen.
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4 zeigt: Verwendung der Hydrogelstruktur für das gerichtete Wachstum von Axonen.
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Erstes Ausführungsbeispiel
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1. Herstellung der Gussform aus Polydimethylsiloxan (PDMS)
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A. Photolithographie
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Die PDMS-Kammer wird mittels gängigem Photolithographie-Verfahren hergestellt. Zunächst wird in eine transparente Maske eine Struktur mit 5 Mikrokanälen und einer Breite von jeweils 200 μm und einer Länge von jeweils 90 mm geschrieben. Die 200 μm breiten Mikrokanäle sind in einem Abstand von jeweils 200 μm zueinander angeordnet. Die Kanäle gehen an beiden Enden in einen Zulaufbereich und einen Ablaufbereich über. Diese sind in der 2B) mit Bezugszeichen 12a und 12b gekennzeichnet. An der Basis der Kanäle sind die Bereiche 12a und 12b je 3 mm breit. Die Bereiche 12a, 12b enden blind in einer sich verjüngenden Spitze. Die Bereiche 12a (Zulauf) und 12b bilden daher je ein gleichseitiges Dreieck mit einer Seitenlänge von 3 mm. In der PDMS-Struktur 7 wird oberhalb des Bereichs 12a und 12b je eine zylinderartige Einfüllöffnung 9 bzw. Austrittsöffnung 11 ausgebildet. Durch die Öffnung 9 werden die Kanäle befüllt, wobei an der Austrittsöffnung 11 vorzugsweise ein Unterdruck anliegt.
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Zur Herstellung wird negativer Photolack (SU8-100) mit einer Dicke von etwa 100 μm auf einen Siliziumwafer geschleudert. Die Drehzahl der Anlage wird auf 3000 U/min eingestellt. Anschließend wird der Wafer bei 10 min, 65°C gebacken und nachfolgend noch einmal für 30 min bei 95°C. Der Wafer wird belichtet (MA1 Belichter, 35 sec, 7 mW; Softvakuum und anschließend erneut gebacken (1 min bei 65°C; 10 min bei 95°C). Der Wafer wird unter Verwendung eines SU8 Entwicklers im Ultra-Schallbad (ca. 2 min.) entwickelt. Die Entwicklungsreaktion wird mittels Propanol gestoppt und der Wafer getrocknet. Anschließend wird der Wafer mit Trichlorsilan (Tridecafluor-1,1,2,2 Tetrahydrooctyl) beschichtet, um das spätere Ablösen der gegossenen PDMS-Kammer zu erleichtern. Eine runde Gussform aus Teflon (Durchmesser von 2,5 cm; 0,5 cm hoch) mit geschlossenem Boden wird angefertigt und genau mittig über der geschriebenen Struktur im Wafer platziert.
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Für das PDMS wird Sylgard 184 von Dow Corning angesetzt. Als Polymer bzw. Base wird Dimethyl- und Trimethylsiloxan (Cas. Nr. 68988-896) verwendet. Als Quervernetzer bzw. Crosslinker wird Tetramethyltetravinylcyclotetrasiloxan (Cas. Nr.: 2554-06-5) verwendet.
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Das PDMS wird im Mischungsverhältnis 10:1 Polymer: Quervernetzer angesetzt und innerhalb der Teflongussform etwa 0,5 cm hoch über den Wafer gegossen. Kunststoffstifte aus Teflon mit einem Durchmesser von etwa 0,3 mm und einer Höhe von etwa 1 cm werden sodann über und in den blind endenden Bereichen 12a und 12b angeordnet. Sie werden senkrecht zum Wafer bis zum Boden in das flüssige Polymer getaucht. Sie bilden als Aussparung der nachfolgend gegossenen PDMS-Kammer die Einfüll- und Austrittsöffnung 9, 11, über die das Collagen in die PDMS-Kammer gegossen werden kann. Das PDMS wird zum Polymerisieren für 1 h bei 70°C aufbewahrt. Nach dem Polymerisieren wird die PDMS-Kammer von der Teflonform und dem Wafer abgelöst. Die PDMS-Kammer wird vor dem Befüllen mit Collagen mit 70% Ethanol über 20 min. sterilisiert.
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Es ist selbstverständlich, dass ein anderes Elastomer auf diese Weise hergestellt werden kann, sofern es sich auf Grund der Elastizität gut gegen die Unterlage pressen und abdichten lässt.
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B. Alternativverfahren
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In einem ersten Schritt wird eine Struktur mit Kanälen in eine Aluminiumscheibe gefräst. Sodann erfolgt eine Politur der Scheibe. Die Scheibe wird auf etwa 140°C erhitzt und gegen eine Polymethylmethacrylat-Scheibe gepresst. Dabei entsteht eine reliefartige Struktur mit Stegen durch Zerfließen des PMMA. Das PMMA wird dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
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Durch die unterschiedlichen Ausdehnungskoeffizienten lassen sich die beiden Scheiben aus PMMA und Aluminium leicht voneinander trennen. Die PMMA-Scheibe wird in eine Gussform eingebaut und das mit Kreuzvernetzer versehene PDMS hineingegossen. Einbringen der Stifte zur Ausbildung der Öffnungen erfolgt wie unter 1.A. beschrieben. Nach 3 Stunden bei 65°C kann das verfestigte PDMS mit Kanälen abgenommen werden.
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2. Herstellung der Collagenlösung
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Zur Herstellung der Collagenlösung wird wie folgt vorgegangen. Benötigt werden eine Collagenstocklösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml, 10 × Medium 199; steriles bidest., sowie 1 N NaOH. Alle Komponenten werden auf Eis gestellt und im Weiteren auf Eis weiter behandelt.
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Es wird aus diesen Komponenten eine Collagenlösung angesetzt, die die folgenden Komponenten in den angegebenen Endkonzentrationen enthalten: 1 × Medium, 3 mg·ml–1 Collagen, 15 mM NaOH.
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Für eine 300 μl Collagenlösung werden folgende Mengen pipettiert: 85,50 μl dH2O, 30 μl 10 × Medium, 180 μl Collagen-Stocklösung, 4,5 μl 1 Normale NaOH. Alle Komponenten werden mit der Pipette vermischt. Sollte das Medium noch nicht von gelb zu pink umgeschlagen sein, werden weitere Tropfen 1 N NaOH zugeben. Die Lösung wird bei 4°C angesetzt.
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3. Herstellung der Collagenstruktur
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1 zeigt schematisch einen Ausschnitt der Gussform 7 aus Polydimethylsiloxan (PDMS), hergestellt wie unter Ziffer 1 angegeben. Gezeigt ist ein Ausschnitt im Bereich der nach unten zum Substrat geöffneten Kanäle 8. Nur der rechte halboffen Kanal ist mit Bezugszeichen 8 versehen. Durch Anpressen der Gussform 7 an das Deckglas 5 als Substrat werden die Kanäle über ihre gesamte Länge zum Deckglas 5 hin abgedichtet. Nach luftdichtem Einfüllen der unter Ziffer 2 hergestellten, flüssigen Collagenlösung in die Eintrittsöffnung 9 der Gussform 7 (2B) füllen sich die Kanäle 8 mit der Collagenlösung unter Anlegen eines Vakuums an der Austrittsöffnung 11. Nach dem Einfrieren bei –20°C und dem Abnehmen der Gussform 7 von dem noch bei dieser Temperatur gefrorenen Collagen verbleiben die Stege 2 nebeneinander auf dem Substrat 5. Jeder Steg 2 weist einen Durchmesser von exakt 230 μm bei einer Länge von 90 mm auf. Dargestellt sind fünf Stege, von denen nur der oberste mit Bezugszeichen 2 versehen ist.
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2A zeigt in der Seitenansicht die Gussform 7, welche insgesamt 5 Kanäle entsprechender Länge und Durchmessers aufweist. Die PDMS-Gussform 7 wird im ersten Schritt auf das Deckglas 5 angepresst.
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In 2B ist gezeigt, dass mit Hilfe einer nicht dargestellten Pipette in die linke Eintrittsöffnung 9 das flüssige Collagen (4°C) in die Kanäle der Gussform 7 eingefüllt wird. Hierzu wird die Pipettenspitze bündig an die Eintrittsöffnung 9 angepresst, so dass unter Druck die Collagenlösung in die Kanäle der Gussform 7 eingespritzt werden kann. Eine zweite Pipettenspitze wird bündig in die Austrittsöffnung 11 gepresst und unter Erzeugen des Vakuums die Collagenlösung durch die Kanäle bis zur rechten Austrittsöffnung 11 gezogen. Die Pipetten werden abgenommen und dem Collagen wird Zeit gegeben, für etwa eine ¾ Stunde bei 37°C zu polymerisieren. Anschließend wird die gesamte Struktur aus der Gussform 7, darin polymerisierter Collagenlösung und Substrat 5 bei –20°C eingefroren. Die Lösung wird dabei etwa 2 Stunden auf –20°C abgekühlt.
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Die PDMS-Gussform 7 wird anschließend bei dieser Temperatur des Collagens von Hand durch Abnehmen abgelöst. Nachdem die Gussform 7 abgelöst ist, werden Reste verfestigten Collagens am Ort der Einfüllöffnung 9 und der Austrittsöffnung 11 vor den Collagenstegen 2 mit dem Skalpell entfernt. Es verbleiben dann nur noch die fünf Stege 2 (2C).
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Die Collagenstege 2 werden bis zur Aussaat der Zellen mit Puffer überschichtet und gelagert. Die Lagerung kann bei 4°C für Wochen erfolgen.
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Zur Zellkultur und nachfolgenden Untersuchung der Zellen werden auf dieselbe Weise wie für die Herstellung der Stege 2 angegeben eine Collagenlösung hergestellt, in die dissoziierte Neuronen gemischt wurde, und zwei punktförmige Hydrogelstrukturen 10 an beide Enden der Stege angeordnet (3b). Die Punkte berühren die Stege 2.
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4 zeigt schematisch, dass durch jeweils einen Steg 2 Axone 6 der Zellen hindurch wachsen. Gezeigt ist in 4, dass von der rechten Zelle ausgehend Axone ausgehen. Die Zelle 1 links im Bild bildet lediglich ein Axon 6 aus. Nur die linke Zelle ist mit Bezugszeichen versehen. Dieses trifft sich mit dem Axon der rechten Zellen etwa in der Bildmitte des mittleren Stegs 2.
