WO2017092859A1 - Mikrostrukturierter polymerkörper, mikrobioreaktor und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

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structuring
microstructured
post
polymer
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Christof Niemeyer
Ann-Kathrin SCHNEIDER
Bastian Rapp
Stefan Giselbrecht
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Karlsruher Institut für Technologie
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    • B81C2201/019—Bonding or gluing multiple substrate layers

Definitions

  • Step (3) has the advantage of imparting mechanical stability to the microstructured polymer body through the substrate.
  • the microstructured polymer body is preferably bonded to a glass surface of the substrate, preferably the substrate is made of glass.
  • a glass surface has the advantage that it can be chemically modified in a variety of ways. For example, various ligands can be bound to glass surfaces.
  • Step (3) is not subject to any particular restriction and can in principle be effected in any desired manner, for example by pressing or gluing.
  • step (3) preferably comprises the steps
  • the glass surface is brought into contact with a plasma, in which case preferably also the surface of the microstructured polymer body to be bonded is brought into contact with a plasma.
  • a plasma in which case preferably also the surface of the microstructured polymer body to be bonded is brought into contact with a plasma.
  • Suitable for this purpose is, for example, the plasma system PlasmaFlecto 10 from the company Plasma Technology.
  • Step (3b) is not particularly limited. In principle, it is sufficient to place the substrate and the microstructured polymer body on top of each other and allow to stand for at least 5 minutes at room temperature (20 ° C).
  • step (3b) is carried out at a temperature of 30 to 150 ° C, particularly preferably 80 to 140 ° C, for example at 120 ° C.
  • the duration of step (3b) is preferably 5 to 120 minutes, more preferably 15 to 60, for example 30 minutes.
  • the method for producing a microstructured polymer body according to the present invention further comprises the step
  • Step (4) ablating a portion of the microstructured polymer body to form vias from the pre-pattern.
  • Step (4) is preferably carried out after step (3), because the removal is particularly easy to perform when the mechanical stability of the polymer body is increased by bonding to a substrate. If step (4) takes place after step (3), the polymer-body-side surface of the substrate is exposed in the region of the pre-structuring, ie accessible from the outside.
  • Through holes or through holes are recesses in the polymer body which extend over a respective part of two opposite surfaces of the polymer body and over the entire thickness of the polymer body in the region of the two surfaces.
  • step (4) a uniformly thick layer of the microstructured polymer body is removed, so that the pre-patterning forms through openings, and the post-structuring does not form through-openings.
  • step (3) has previously taken place, the pre-structuring is opened by step (4), that is to say the pre-structuring is accessible from the side opposite the substrate, the post-structuring remaining closed, that is completely enclosed by the polymer body or the glass substrate , If the pre-structuring of cavities and the post-structuring of channels connecting the cavities is formed, then an externally accessible system can be made available from cavities which are connected to one another via channels.
  • Such a system can be used as a micro (bio) reactor.
  • the unilaterally open and interconnected structures of such a micro (bio) reactor are suitable, inter alia, for cell culture experiments. For example, the influence of concentration gradients on the behavior of cells introduced into the cavities can be investigated.
  • the present invention relates to a composite body comprising a substrate and a microstructured polymer body, wherein the polymer body has at least one surface with a pre-structuring and a post-structuring and wherein the polymer body is bonded to the substrate via the surface with a pre-structuring and a post-structuring.
  • the composite is obtainable from the process of the invention comprising steps (1) to (3).
  • the statements relating to the method according to the invention apply correspondingly.
  • the present invention relates to the use of the microbioreactor described above for the cell-based screening of pharmaceutical agents, for example antibiotics, growth factors, hormones and biofunctional molecules.
  • the present invention relates to the use the above-described microbioreactor for the cultivation of cells, preferably of isolated cell populations of the same or different cell types.
  • Such a use for cultivation may include the introduction of cells into the wells of the microbioreactor and optionally the supply of the introduced cells with a nutrient solution.
  • interactions between the cells introduced into the cavities can be investigated.
  • Such interactions include transport mechanisms and communication mechanisms between cells, especially between neurons, as well as filamentous transport.
  • the present invention relates to a method for cell-based screening of pharmaceutical agents, comprising the steps
  • cells of the same type or different types of cells can be introduced into the cavities.
  • the cells can be incubated with in each case the same or with different pharmaceutical active ingredients in respectively the same or in different concentrations / amounts.
  • a single cell is introduced into each of the cavities.
  • Suitable pharmaceutical agents are, for example, antibiotics, growth factors, hormones, and biofunctional molecules.
  • the detection of the effect can in principle be carried out in any desired manner, suitable processes are known to the person skilled in the art.
  • the present invention relates to a method for producing a master for soft lithography.
  • the method comprises the steps
  • Hot-molding of the microstructured polymer body With regard to steps (1) and (2), the above statements apply accordingly.
  • the method of hot embossing can be used. For this purpose, first, as described above, by means of soft and subsequent UV lithography, for example, a two-dimensionally structured polymer body is produced.
  • step (5) comprises the steps
  • thermoplastic material heating the thermoplastic material and / or the microstructured polymer body.
  • thermoplastic material softens and, by the action of gravity, takes on the shape of the microstructured polymer body.
  • Polyethylene, polypropylene, a blend thereof, or an ethylene-propylene copolymer are preferably used as the thermoplastic material.
  • polypropylene it is preferable to heat to 150 to 180 ° C, more preferably 160 to 170 ° C, for example, 166 ° C.
  • the thermoplastic material is in the form of a film.
  • FIG. 2 shows schematically the production method according to the invention given in example 1.
  • FIG. 3 shows the results from example 2.
  • Hoechst 33345 (means for staining the DNA (cell nucleus)) is shown in blue, green neurofilament H (stained with a corresponding antibody against neurofilament H) appears green.
  • FIG. 5 shows the results obtained from Example 3.
  • Figure 5A shows the result of labeling with cF1 -STV-batto647 conjugate
  • Figure 5B shows the result of labeling with cF1 -STV-batto650 conjugate
  • Figure 5C shows the result of co-labeling with cF1 -STV-batto647 conjugate and cF1 -STV -batto650 conjugate.
  • FIG. 6 shows a photomicrograph of the surface of the microstructured silicone body obtained in Example 1 with pre- and post-structuring after bonding to the glass substrate and after cutting by means of a vibratome.
  • FIG. 7 schematically shows a preferred embodiment of the method according to the invention for producing a master for soft lithography.
  • C PDMS chip 2 made by means of polypropylene mask.
  • Channel 3.0 m deep; 9.5 ⁇ wide.
  • Cavity 59.7 ⁇ deep, 239, 5 ⁇ wide.
  • Example 1 Preparation of a microstructured polymer body
  • the master used was an SU-8 photoresist master, with which the cavities of the pre-structuring were molded by pouring out, and a gold mask consisting of a plate of synthetic quartz glass (50 ⁇ 50 ⁇ 2 mm; J-plasma), coated with a 1 nm thick titanium adhesive layer and a 30 nm thick gold layer applied thereto, with recesses (channels) corresponding recesses used.
  • a polymer body with pre-patterning, consisting of the individual cavities, of polydimethylsiloxane (PDMS) was cast.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the elastomeric kit Sylgard 1 84 (Dow Corning) was used, which was mixed in a ratio of nine (Sylgard 1 84 Base) to one (Hardener, Curing Agent, Dow Corning).
  • Sylgard 1 84 Low Corning
  • the solution was evacuated and incubated in vacuo until free of bubbles.
  • the solution thus prepared was poured onto the SU-8 mask and incubated at 40 ° C in a drying oven for about one hour until the polymer was completely cured.
  • the channels were introduced between the individual cavities by means of UV lithography (post-structuring).
  • the pre-structured polymer bodies were placed on the gold mask after curing, so that the pre-structured surface abutted against the gold mask.
  • Their gold coating had 5 ⁇ wide recesses for generating the post-structuring.
  • the arrangement of gold mask with the pre-structured polymer body placed thereon became two and a half Irradiated hours with UV light of wavelength 185 nm at a distance of about 5 cm (irradiance: 280 pW-cnr 2 ).
  • a UV lamp with the name Heraeus GPH212T5VH Peschl Ultraviolet GmbH was used. After that, the gold mask was removed.
  • the subsequent development of the post-structuring was carried out by coating the polymer body with developing solution in a beaker and subsequent sonication (sonic device from Elma, type T220, HF-Freq 42 Hz) in the developing solution in an ultrasonic bath for four minutes. Thereafter, the polymer body was taken out of the developing solution and cleaned with distilled water.
  • sonication sonic device from Elma, type T220, HF-Freq 42 Hz
  • the resulting microstructured silicone body was bonded to a glass slide (substrate).
  • the surface of the substrate to be bonded and the microstructured surface of the silicone body were activated by means of oxygen plasma.
  • a glass fragment (3 ⁇ 3 cm) was cut from a microscope slide (76 ⁇ 26 ⁇ 1 mm) with a glass cutter and then cleaned with acetone. Both the silicone body and the glass fragment were treated in a Plasma Technology PlasmaFlecto 10 plasma system for two minutes (for parameters used, see Table 1 below).
  • all parts of the plant were removed and placed the silicone body with downwardly facing prestructured surface on the activated glass surface.
  • the obtained glass-supported polymer body was incubated in a drying oven at 120 ° C for about one hour.
  • the cavities were cut using a VT10005 vibratome from Leica Biosystems.
  • VT10005 vibratome from Leica Biosystems.
  • two strips of cut glass from a slide were first glued to the glass bottom of the microbioreactor using superglue (Pattex glass from Henkel) as bars.
  • superglue Pigtex glass from Henkel
  • the attachment of the polymer body supported on glass to the vibrating table of the vibrato was then carried out by means of these two bars by means of LOCTITE 414 superglue from Henkel.
  • the stepwise removal of the uppermost layers of the polymer body was carried out by cutting in a water bath. During the cutting process, all sections obtained were checked under the microscope to determine if the cavities were already fully exposed. After this was done, the resulting microbial reactor was carefully removed from the cutting table with a razor blade.
  • Example 2 Cell Culturing Murine neuroblastoma cells (Neuro2a) were pipetted directly into the wells of the array in a volume of 10 ⁇ l of medium. After the cells had adhered to the surface, sufficient medium (Eagle's Minimum Essential Me- medium (EMEM) + 10% FBS + 1% penicillin streptomycin).
  • EMEM Minimum Essential Me- medium
  • step (4) After cutting the wells (step (4)), hybridization of the corresponding DNA-STV conjugates was possible. For this, all wells were filled with a buffer solution containing one or two covalent DNA-streptavidin conjugates labeled with biotinylated fluorescent dyes (batto647 and batto550, respectively).
  • Figure 5A was obtained by applying only cF1 -STV-batto647 conjugate.
  • the red fluorescence signals are generated by specific hybridization with the complementary cF9-STV-bAtto647 conjugate, which binds only to the F9 spots (see FIG. 4).
  • Figure 5B only the conjugate cF9-STV-batto550 was applied, which can be detected as green dots on the F9-functionalized spots.
  • Figure 5C a mixture of the conjugates cF1 -STV-batto647 (red) and cF9-STV-batto550 (green) was applied.
  • the left-hand column shows images of a polymer body (chip 1) which was produced by molding the SU-8 master and subsequent UV lithography.
  • the images in the middle column show the polypropylene master molded therefrom which was produced using chip 1 by hot embossing.
  • the right column shows images of the polymer body (chip 2) obtained by soft-lithographic imaging (without UV lithography) from the polypropylene master (shown in the middle column).
  • microstructured polymer bodies microstructured composite bodies and, in particular, microbioreactors, which can be used as a valuable tool for a wide variety of investigations, in a cost-effective, simple and efficient manner.
  • microbioreactors Such systems may be particularly useful in the chemical and pharmaceutical industries.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikrobioreaktor, einen Verbundkörper, einen mikrostrukturierten Polymerkörper, einen Master für die Softlithographie und Verfahren zu ihrer Herstellung. Das Verfahren zur Herstellung des mikrostrukturierten Polymerkörpers umfasst einen Schritt zur Vorstrukturierung durch Softlithographie und einen Schritt zur Nachstrukturierung durch UV-Lithographie.

Description

Mikrostrukturierter Polymerkörper, Mikrobioreaktor und Verfahren zu ihrer
Herstellung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikrobioreaktor, einen Verbundkörper, einen mikrostrukturierten Polymerkörper, einen Master für die Softlithographie und Verfahren zu ihrer Herstellung. Das Verfahren zur Herstellung des mikrostrukturierten Polymer- körpers umfasst einen Schritt zur Vorstrukturierung durch Softlithographie- und einen Schritt zur Nachstrukturierung durch UV-Lithographie.
Mikro- und nanoskalige Strukturen aus Polymermaterialien wie beispielsweise Silikon finden eine breite Anwendung im Bereich der Lebenswissenschaften. Geschätzt wird Silikon vor allem wegen seiner leicht einstellbaren mechanischen, chemischen und optischen Eigenschaften sowie seiner ausgezeichneten Biokompatibilität. Die elastische Eigenschaft dieses Materials wird bei der Erzeugung selbst-dichtender mikroflu- idischer Strukturen genutzt (siehe Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., and Whitesides, G. M. (2002) Components for integrated poiy(dimethylsiloxane) microfluidic Systems, Electrophoresis 23, 3461-3473). Im Bereich der Mikrofluidik wird die chemische Inertheit von Silikon gegenüber vielen gängigen organischen Lösungsmitteln sowie verdünnten Säuren und Laugen ausgenutzt (siehe McDonald, J. C, and Whitesides, G. M. (2002) Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices, Acc Chem Res 35, 491 -499). Trotz dieser guten Beständigkeit gibt es dennoch eine ganze Reihe mikrotechnischer Verbindungsverfahren, die beispielsweise eine irreversible Deckelung von Kanalstrukturen einfach und zuverlässig ermöglichen (siehe Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., and Whitesides, G. M. (2002) Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic Systems, Electrophoresis 23, 3461-3473 und Hui, A. Y. N., Wang, G., Lin, B., and Chan, W.-T, (2005) Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices, Lab on a Chip 5, 1173- 1177). Die hohe Transparenz vieler Silikone erlaubt ferner die Integration von optisch arbeitenden Sensoren und Detektionssystemen in den Aufbau von Mikrosystemen (siehe Whitesides, G. M. (2006) The origins and the future of microfluidics, Nature 442, 368-373).
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Strukturierung von Polymermaterialien zur Bildung mikrostrukturierter Polymerkörper bekannt. Ungehärtete Poly- merharze, wie beispielsweise unvernetztes Silikon, lassen sich aufgrund ihrer Eigenschaften (relativ niedrige Viskosität) sehr einfach und gut gießen. Daher wird in den meisten Fällen zunächst eine Masterstruktur ("Master"), welche eine Gussform darstellt (z. B. aus Silicium oder dem Fotoresist SU-8 (Fotolack der Firma Microchem Corp.)), hergestellt und danach durch Ausgießen mit Silikon repliziert (siehe Kumar, A., Biebuyck, H. A. , and Whitesides, G. M. ( 1994) Patterning Self-Assembled Monolay- ers: Applications in Materials Science, Langmuir 10, 1498-151 1 ). Derartige Herstellungsverfahren zählen zu den Verfahren, die allgemein als "Softlithographie" bezeichnet werden. Aufgrund der elastischen Eigenschaften von Silikonharzen können auch sehr komplexe Geometrien nach der Aushärtung des Silikons noch entformt werden. Das heißt, der Master kann auch bei der Erzeugung komplexer Geometrien noch entfernt werden, ohne die Mikrostrukturierung zu beschädigen. Die Herstellung des Masters kann mit vielen (mikrotechnischen) Strukturierungsverfahren, z. B. mikromechanisch oder litho- graphisch, erfolgen. Einige dieser Verfahren sind jedoch aufwendig und erfordern eine besondere instrumentelle Ausstattung, die nicht in jedem Labor verfügbar ist, was den Zugang zu solchen Strukturen begrenzt und den Aufwand zu deren Herstellung erhöht.
Insbesondere zweiskalige Mikrostrukturen sind mit herkömmlichen Herstellungsver- fahren nur schwer und unter besonders hohem Aufwand erhältlich. Hierbei werden unter "zweiskaligen Mikrostrukturen" Vertiefungen in der Oberfläche eines Polymerkörpers mit unterschiedlichen Tiefen verstanden. So weisen zweiskalige Mikrostrukturen beispielsweise erste Vertiefungen bis zu einer Tiefe von 200 μιτι und zudem zweite Vertiefungen bis zu einer Tiefe von lediglich 5 μιη auf. Aus den ersten Vertiefungen können beispielsweise Hohlräume ("Kavitäten") zur Aufnahme von Probenflüssigkeiten oder biologischen Zellen gebildet sein und aus den zweiten Vertiefungen beispiels- weise Kanäle bzw. Leitungen, welche die Hohlräume (fluidleitend) verbinden. Kavitä- ten weisen eine größere Tiefe als Kanäle auf. Zudem weisen die ersten ("großen") Mikro strukturen (insbesondere Vertiefungen, Kavitäten) üblicherweise laterale Abmessungen von mindestens 100 pm auf, wohingegen die Kanal strukturen üblicherweise eine Breite von höchstens 20 pm besitzen.
Die Herstellung einer zweiskaligen Masterstruktur mit unterschiedlich dimensionierten Mikrostrukturen für die Herstellung von zweiskaligen mikrostrukturierten Polymerkörpern ist mit hohem Aufwand verbunden und erfordert den Einsatz hochpreisiger Vor- richtungen, unabhängig davon, aus welchem Material der Master besteht.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers bereitzustellen, wodurch auf einfache Weise komplexe, beispielsweise zweiskalige, Strukturierungen des Polymerkör- pers erzeugt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers, umfassend die Schritte
(1 ) Erzeugen eines Polymerkörpers aus einem Polymerharz durch Softlithographie, wobei mindestens eine Oberfläche des Polymerkörpers eine durch Softlithographie erzeugte Vorstrukturierung aufweist; und
(2) Nachstrukturieren der vorstrukturierten Oberfläche mittels UV-Lithographie.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können insbesondere Polymerkörper mit zweiskaliger Mikrostrukturierung effizient und auf einfache Weise hergestellt werden. Ein mikrostrukturierter Polymerkörper ist ein Körper aus einem Polymer, der mindestens eine Oberfläche mit Vertiefungen mit Abmessungen (Höhe, Breite, Tiefe) von < 1000 μιτι aufweist. Der aus Schritt (1 ) erhaltene Polymerkörper, wovon mindestens eine Oberfläche eine Vorstrukturierung aufweist, wird nachfolgend auch als Polymerkörper mit vorstrukturierter Oberfläche bezeichnet.
Die Mikrostrukturierung des Polymerkörpers umfasst die Vorstrukturierung (erzeugt durch Schritt (1 )) und die Nachstrukturierung (erzeugt durch Schritt (2)). Wie bereits vorstehend erläutert, werden Vor- und Nachstrukturierung durch eine Mehrzahl von Vertiefungen in der Oberfläche des mikrostrukturierten Polymerkörpers gebildet. Die jeweilige Mehrzahl von Vertiefungen, welche die Vor- bzw. Nachstrukturierung bilden, wird von einer Mehrzahl einzelner Vor- beziehungsweise Nachstrukturierungsele- mente (Elemente der Vorstrukturierung/Nachstrukturierung) gebildet.
Vorzugsweise sind die Vor- und Nachstrukturierung fluidleitend zumindest teilweise miteinander verbunden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polymerharz, aus welchem der Polymerkörper hergestellt ist, ein Silikonharz. Entsprechend handelt es sich bei dem Polymerkörper vorzugsweise um einen Silikonkörper.
Die geometrische Form der Elemente der Vor- und Nachstrukturierung unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Die Elemente der Vor- und Nachstrukturierung können die Form eines Körpers mit Kanten (z. B. Quader oder Würfel) aufweisen, wobei ein Teil oder die Gesamtheit der Kanten auch abgerundet sein kann.
Vorzugsweise sind die Vorstrukturierungselemente halbkugelförmig, quader- oder würfelförmig oder kegel(stumpf)förmig, mit "scharfen" oder abgerundeten Kanten, besonders bevorzugt quader- oder würfelförmig mit abgerundeten Kanten (siehe Figur 6).
Die Nachstrukturierungselemente sind vorzugsweise quaderförmig oder halbzylinder- förmig, können aber auch prismaförmig (beispielsweise mit einem Dreieck als Grundfläche) sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt (1 ) Kavitäten als Vor- strukturierung und in Schritt (2) Kanäle, welche die Kavitäten verbinden, als Nachstruk- turierung erzeugt. Sowohl Kavitäten als auch Kanäle stellen Vertiefungen in dem Polymerkörper dar, wobei Kavitäten eine größere Tiefe als Kanäle aufweisen. Durch die Kavitäten und Kanäle umfassende Mikrostrukturierung kann ein mikro strukturierter Polymerkörper bereitgestellt werden, welcher beispielsweise als Mikro(bio)reaktor ver- wendet werden kann.
Unter der Tiefe eines Vor- bzw. Nachstrukturierungselementes wird der Abstand zwischen dem höchsten Punkt der mikrostrukturierten Oberfläche und dem tiefsten Punkt des Elementes verstanden. Die Länge und Breite der Vor- und Nachstrukturierungs- elemente werden an der Oberfläche des mikrostrukturierten Polymerkörpers, beispielsweise lichtmikroskopisch, vermessen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die Vorstrukturierungselemente eine Tiefe bis 200 pm auf. Die Tiefe der Vorstrukturie- rungselemente beträgt vorzugsweise mindestens 30 pm. Besonders bevorzugt weisen die Vorstrukturierungselemente eine Tiefe von 70 bis 190 pm, insbesondere 100 bis 180 pm auf. Zudem weisen die Vorstrukturierungselemente vorzugsweise eine Länge von 1 bis 400 pm, und eine Breite von 1 bis 400 pm, besonders bevorzugt 50 bis 300 pm, insbesondere 100 bis 250 pm, auf. Darüber hinaus beträgt der Abstand zwischen den Vorstrukturierungselementen vorzugsweise 50 bis 500 pm, besonders bevorzugt 150 bis 300 pm, beispielsweise 200 pm.
Vorzugsweise umfasst die in Schritt (1 ) erzeugte Vorstrukturierung Kavitäten mit einer Tiefe von 30 bis 200 pm, besonders bevorzugt 70 bis 190 pm, einer Länge von 100 bis 400 pm, besonders bevorzugt 200 bis 300 pm, und einer Breite von 100 bis 400 pm, besonders bevorzugt 200 bis 300 pm. Die Nachstrukturierungselemente weisen vorzugsweise eine Tiefe bis 5 pm auf. Die Tiefe der Nachstrukturierungselemente beträgt vorzugsweise mindestens 0, 1 pm, mehr bevorzugt mindestens 0,5 pm. Besonders bevorzugt weisen die Nachstrukturierungselemente eine Tiefe von 1 bis 4 pm, insbesondere 2 bis 3 pm auf. Zudem weisen die Nachstrukturierungselemente vorzugsweise eine Länge von 50 bis 500 pm, und eine Breite von bis 2 bis 100 pm auf.
Vorzugsweise umfasst die in Schritt (2) erzeugte Nachstrukturierung Kanäle mit einer Tiefe von 0,1 bis 5 pm, besonders bevorzugt 1 bis 3 pm, und einer Breite von höchs- tens 20 pm, besonders bevorzugt 2 bis 10 pm.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Schritt (1 ) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Schritte (1 a) bis (1 d):
(1 a) Bereitstellen eines Masters mit mikrostrukturierter Oberfläche;
(1 b) Ausgießen des Masters mit einem ungehärteten Polymerharz;
(1 c) Härten des Polymerharzes;
(1 d) Entfernen des Masters.
Das Material, aus dem der Master gefertigt ist, unterliegt keiner besonderen Einschrän- kung. Es kann jedes Material verwendet werden, das für die Softlithographie geeignet ist, beispielsweise Silicium oder der Fotoresist SU-8.
In Schritt (1 b) wird der Master mit einem ungehärteten Polymerharz ausgegossen. Das ungehärtete Polymerharz ist (zäh)flüssig und passt sich dadurch der Oberfläche des Masters an. Im Schritt (1 c) wird das Polymerharz gehärtet, so dass es dauerhaft die Oberflächenstruktur des Masters annimmt. Anschließend wird der Master entfernt (Schritt (1 d)).
Das verwendete ungehärtete Polymerharz unterliegt keiner besonderen Einschrän- kung. Grundsätzlich kann jede ungehärtete Polymerharzzusammensetzung, welche zur Erzeugung mikrostrukturierter Polymerkörper geeignet ist, verwendet werden. Ge- eignete Polymerharze sind beispielsweise in EP 2 246 740 A1 angegeben. Die ungehärtete Polymerharzzusammensetzung weist vorzugsweise eine Viskosität von 1 bis 5 Pa-s, besonders bevorzugt 2 bis 4 Pa s auf. Bevorzugt wird eine ungehärtete Silikonharzzusammensetzung verwendet, aus der durch das erfindungsgemäße Verfahren ein mikrostrukturierter Silikonkörper gefertigt wird. Der Hauptbestandteil der ungehärteten Silikonharzzusammensetzung ist vorzugsweise ein härtbares Polysiloxan oder ein Gemisch daraus. Geeignete härtbare Polysiloxane sind beispielsweise Polydimethylsiloxan (PDMS), und dessen Derivate. Ein besonders bevorzugtes Polysiloxan ist Sylgard® Kit 184 Base, welches von der Firma Dow Corning vertrieben wird. Daneben können im ungehärteten Silikonharz Zusatzstoffe, wie beispielsweise ein Vernetzungsmittel, enthalten sein. Ein besonders bevorzugtes Vernetzungsmittel ist Sylgard® Kit 184 Curing Agent, welches von der Firma Dow Corning vertrieben wird. Der Anteil des Vernetzungsmittels an der unge- härteten Silikonharzzusammensetzung beträgt vorzugsweise 5 bis 25 Gew.%, besonders bevorzugt 7,5 bis 15 Gew.-%.
Schritt (1 c) kann bei Normalbedingungen durchgeführt werden. Hinsichtlich der Temperatur wird vorzugsweise von Normalbedingungen abgewichen. Das Härten erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 90°C, besonders bevorzugt 35 bis 70°C, beispielsweise 40°C. Vorzugsweise wird für eine Zeit von 5 Minuten bis 4 Stunden, besonders bevorzugt 30 bis 90 Minuten, beispielsweise 60 Minuten, gehärtet.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst Schritt (2) des erfindungs- gemäßen Verfahrens die Schritte (2a) bis (2d):
(2a) Anlegen einer Maske an die vorstrukturierte Oberfläche;
(2b) Bestrahlen der maskenseitigen Oberfläche des Polymerkörpers mit UV-Licht;
(2c) Entfernen der Maske;
(2d) Entwickeln des bestrahlten Polymerkörpers.
Masken für die UV-Lithographie sind im Stand der Technik bekannt. Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann insbesondere wie in EP 2 246 740 A1 beschrieben durchgeführt werden.
Da die Maske UV-durchlässige und UV-undurchlässige Bereiche aufweist, wird die vorstrukturierte Oberfläche des Polymerkörpers selektiv mit UV-Licht bestrahlt. Hierfür geeignet ist beispielsweise eine Goldmaske, bestehend aus einer Platte synthetischen Quarzglases (50x50 x2 mm; J-Plasma), beschichtet mit einer 1 nm dicken Titanhaftschicht sowie einer darauf aufgebrachten 30 nm dicken Goldschicht. Die Goldschicht ist UV-undurchlässig und weist dem Muster der Nachstrukturierung entsprechende Aussparungen auf.
Das Bestrahlen erfolgt vorzugsweise mit UV-Licht mit einer Wellenlänge von 185 nm. Geeignete Bestrahlungsstärken reichen von 150 bis 500 pW-cnr2, beispielsweise 280 pW-cnr2. Eine geeignete Bestrahlungsvorrichtung sind UV-Lampen der Firma Pe- schl Ultraviolet GmbH, beispielsweise die UV-Lampe mit der Bezeichnung Heraeus GPH212T5VH.
Im bestrahlten Bereich wird die Struktur des Polymers soweit geschwächt, dass es in Schritt (2d ) im bestrahlten Bereich herausgelöst werden kann. Sofern als Polymer ein Silikonharz verwendet wird, kann Schritt (2d) durch Entwickeln in einer alkalischen Entwicklungslösung (vorzugsweise ein Gemisch aus einmolarer Natronlauge und Ethanol im Volumenverhältnis 2:1 bis :2, besonders bevorzugt 1 :1 ) erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Entwickeln im Ultraschallbad. Schritt (2d) kann bei Normalbedingungen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird für eine Zeit von 30 Sekunden bis 5 Stunden, besonders bevorzugt 2 Minuten bis 2 Stunden, insbesondere bevorzugt 3 Minuten bis 45 Minuten, beispielsweise 3 Minuten bis 20 Minuten, entwickelt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers gemäß der vorliegenden Erfindung weiter den Schritt (3) Binden der vor- und nachstrukturierten Oberfläche des mikro strukturierten Po- lymerkörpers an die Oberfläche eines Substrats.
Schritt (3) ist mit dem Vorteil verbunden, dass dem mikrostrukturierten Polymerkörper durch das Substrat mechanische Stabilität verliehen wird. Der mikrostrukturierte Polymerkörper wird vorzugsweise an eine Glasoberfläche des Substrats gebunden, vorzugsweise besteht das Substrat aus Glas. Eine Glasoberfläche weist den Vorteil auf, dass sie auf vielfältige Weise chemisch modifiziert werden kann. Beispielsweise können an Glasoberflächen verschiedenartige Liganden gebunden werden.
Schritt (3) unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann grundsätzlich auf beliebige Weise, beispielsweise durch Verpressen oder Kleben, erfolgen. Für den Fall, dass an eine Glasoberfläche gebunden wird, umfasst Schritt (3) vorzugsweise die Schritte
(3a) Aktivieren der zu bindenden Oberfläche des Substrats;
(3b) Inkontaktbringen der aneinander zu bindenden Oberflächen des Substrats und des mikrostrukturierten Polymerkörpers.
Die Oberfläche des Substrats wird vorzugsweise physikalisch oder chemisch aktiviert.
Bei einer physikalischen Aktivierung wird beispielsweise die Glasoberfläche in Kontakt mit einem Plasma gebracht, wobei in diesem Fall vorzugsweise auch die zu bindende Oberfläche des mikrostrukturierten Polymerkörpers in Kontakt mit einem Plasma gebracht wird. Hierfür geeignet ist beispielsweise die Plasmaanlage PlasmaFlecto 10 der Firma Plasma Technology.
Eine chemische Aktivierung kann beispielsweise durch Kopplung (kovalente Bindung) eines bifunktionalen Linkers an die Substrat- oder Polymerkörperoberfläche erfolgen. Vorzugsweise wird hierzu zunächst ein Linker mit endständiger Aminogruppe an die Oberfläche des Substrats kovalent gebunden. Dies kann mittels Silanchemie erfolgen; insbesondere dann, wenn das Substrat eine Glasoberfläche aufweist. In einem weiteren Schritt wird dann an den Linker ein homobifunktionaler Epoxy-Linker gebunden. In Schritt (3b) wird dann eine kovalente Bindung zwischen der (Glas)oberfläche und dem Polymerkörper erzeugt. Dem geht vorzugsweise eine Aktivierung der Oberfläche des mikrostrukturierten Polymerkörpers voraus, beispielsweise mittels Sauerstoffplasma, wodurch eine verbesserte Haftung zwischen Substratoberfläche und Polymerkörper erhalten werden kann.
Vorzugsweise umfasst Schritt (3) einen Schritt (3c) des Funktionalisierens der (Glas)oberfläche in den Bereichen, die nicht in Kontakt mit der Vor- und Nachstruktu- rierung des Polymerkörpers treten. Beispielsweise können funktionale Moleküle kova- lent an die Oberfläche gekoppelt werden. Dies kann entsprechend der vorstehenden chemischen Aktivierung (Schritt (3b)) erfolgen. Schritt (3c) bietet die Möglichkeit, dass in den Bereichen der Vor- und Nachstrukturierung des Polymerkörpers, die nicht in Kontakt mit dem Substrat treten, funktionale Moleküle kovalent gekoppelt werden können, und so ein (bio)molekular funktionalisiertes Substrat erhalten werden kann. Vor- zugsweise werden DNA Moleküle an die Oberfläche gebunden.
Des Weiteren kann eine strukturierende Funktionalisierung der Oberfläche mittels Adsorption, Physisorption und/oder Mikrodeposition erfolgen. Schritt (3b) unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Grundsätzlich ist es ausreichend, das Substrat und den mikrostrukturierten Polymerkörper aufeinander zu legen und für mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur (20°C) stehen zu lassen. Vorzugsweise erfolgt Schritt (3b) bei einer Temperatur von 30 bis 150°C, besonders bevorzugt 80 bis 140°C, beispielsweise bei 120°C. Die Dauer von Schritt (3b) beträgt vorzugs- weise 5 bis 120 Minuten, besonders bevorzugt 15 bis 60, beispielsweise 30 Minuten.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers gemäß der vorliegenden Erfindung weiter den Schritt
(4) Abtragen eines Teils des mikrostrukturierten Polymerkörpers, um aus der Vor- strukturierung Durchgangsöffnungen zu bilden. Schritt (4) erfolgt vorzugsweise nach Schritt (3), denn das Abtragen ist besonders einfach durchzuführen, wenn die mechanische Stabilität des Polymerkörpers durch Bindung an ein Substrat erhöht ist. Sofern Schritt (4) nach Schritt (3) erfolgt, wird die po- lymerkörperseitige Oberfläche des Substrates im Bereich der Vorstrukturierungen frei- gelegt, d. h. von außen zugänglich.
Durchgangsöffnungen bzw. Durchgangslöcher sind Aussparungen im Polymerkörper, die sich über jeweils einen Teil zweier gegenüberliegender Oberflächen des Polymerkörpers und über die gesamte Dicke des Polymerkörpers im Bereich der zwei Oberflä- chen erstrecken. Für die Durchgangsöffnungen gelten die vorstehenden Ausführungen bezüglich der Vorstrukturierung entsprechend, insbesondere hinsichtlich ihrer Geometrie und Abmessungen.
Vorzugsweise wird in Schritt (4) eine gleichmäßig dicke Schicht des mikrostrukturierten Polymerkörpers abgetragen, so dass die Vorstrukturierung Durchgangsöffnungen bildet, und die Nachstrukturierung keine Durchgangsöffnungen bildet. Sofern zuvor Schritt (3) erfolgt ist, wird durch Schritt (4) die Vorstrukturierung geöffnet, das heißt die Vorstrukturierung ist von der dem Substrat entgegengesetzten Seite zugänglich, wobei die Nachstrukturierung verschlossen, das heißt vollständig von dem Polymerkörper bzw. dem Glassubstrat umschlossen, bleibt. Sofern die Vorstrukturierung aus Kavitäten und die Nachstrukturierung aus die Kavitäten verbindenden Kanälen gebildet ist, kann so ein von außen zugängliches System aus über Kanäle miteinander verbundenen Kavitäten bereitgestellt werden. Ein derartiges System kann als Mikro(bio)reaktor genutzt werden. Die einseitig offenen und untereinander verbundenen Strukturen ei- nes derartigen Mikro(bio)reaktors eignen sich unter anderem für Zellkulturversuche. Beispielsweise kann der Einfluss von Konzentrationsgradienten auf das Verhalten von in die Kavitäten eingebrachten Zellen untersucht werden.
Besonders bevorzugt erfolgt Schritt (4) durch schichtweises Abtragen mit Hilfe eines Vibratoms, bis die Vorstrukturierung freigelegt ist. Ein geeignetes Vibratom ist VT 0005 der Firma Leica. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen mikrostrukturierten Polymerkörper, wobei der Polymerkörper zumindest eine Oberfläche mit einer Vorstrukturierung und einer Nachstrukturierung aufweist. Der mikrostrukturierte Polymerkörper ist aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, umfassend Schritte (1 ) und (2), er- hältlich. Bezüglich des mikrostrukturierten Polymerkörpers gelten die Ausführungen bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechend.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Verbundkörper, umfassend ein Substrat und einen mikrostrukturierten Polymerkörper, wobei der Polymerkörper zumindest eine Oberfläche mit einer Vorstrukturierung und einer Nachstrukturierung aufweist und wobei der Polymerkörper über die Oberfläche mit einer Vorstrukturierung und einer Nachstrukturierung an das Substrat gebunden ist. Der Verbundkörper ist aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, umfassend Schritte (1 ) bis (3), erhältlich. Bezüglich des Verbundkörpers und seiner Bestandteile (Substrat und mikrostrukturierter Polymerkör- per) gelten die Ausführungen bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechend.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikrobioreaktor, umfassend ein Substrat und einen mikrostrukturierten Polymerkörper, wobei der Poiymer- körper Durchgangsöffnungen und zumindest eine Oberfläche mit einer Nachstrukturierung aufweist und wobei der Polymerkörper über die Oberfläche mit einer Nachstrukturierung an das Substrat gebundenen ist. Der Mikrobioreaktor ist aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, umfassend Schritte (1 ) bis (4), erhältlich. Bezüglich des Mikrobioreaktors und seiner Bestandteile (Substrat und mikrostrukturierter Polymer- körper) gelten die Ausführungen bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechend.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des vorstehend beschriebenen Mikrobioreaktors für das zellbasierte Screening von pharmazeutischen Wirkstoffen, beispielsweise von Antibiotika, Wachstumsfaktoren, Hormonen und biofunktionalen Molekülen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwen- dung des vorstehend beschriebenen Mikrobioreaktors zur Kultivierung von Zellen, vorzugsweise von isolierten Zellpopulationen gleicher oder verschiedener Zelltypen. Eine derartige Verwendung zur Kultivierung kann das Einbringen von Zellen in die Kavitäten des Mikrobioreaktors und gegebenenfalls die Versorgung der eingebrachten Zellen mit einer Nährlösung umfassen. Auf derartige Weise lassen sich Wechselwirkungen zwischen den in die Kavitäten eingebrachten Zellen untersuchen. Zu derartigen Wechselwirkungen zählen unter anderem Transportmechanismen und Kommunikationsmechanismen zwischen Zellen, insbesondere zwischen Nervenzellen, sowie filamentoser Transport.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum zellbasierten Screenen pharmazeutischer Wirkstoffe, umfassend die Schritte
Einbringen von Zellen in die Durchgangsöffnungen des vorstehend beschriebenen Mikrobioreaktors;
gegebenenfalls Versorgen der eingebrachten Zellen mit einer Nährlösung;
Inkubieren der Zellen.mit einem pharmazeutischen Wirkstoff; und .
Erfassen der Wirkung des pharmazeutischen Wirkstoffs auf die Zellen.
Grundsätzlich können Zellen des gleichen Typs oder verschiedenartige Zellen in die Kavitäten eingebracht werden. Die Zellen können mit jeweils dem gleichen oder mit verschiedenen pharmazeutischen Wirkstoffen in jeweils der gleichen oder in verschiedenen Konzentrationen/Mengen inkubiert werden. Vorzugsweise wird in jede der Kavitäten eine einzige Zelle eingebracht. Geeignete pharmazeutische Wirkstoffe sind beispielsweise Antibiotika, Wachstumsfaktoren, Hormone, und biofunktionale Moleküle. Das Erfassen der Wirkung kann grundsätzlich auf beliebige Weise erfolgen, geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Masters für die Softlithographie. Das Verfahren umfasst die Schritte
(1 ) Erzeugen eines Polymerkörpers aus einem Polymerharz durch Softlithographie, wobei mindestens eine Oberfläche des Polymerkörpers eine durch Softlithographie erzeugte Vorstrukturierung aufweist; (2) Nachstrukturieren der vorstrukturierten Oberfläche durch UV-Lithographie, um einen mikrostrukturierten Polymerkörper zu erhalten; und
(5) Heißabformen des mikrostrukturierten Polymerkörpers. Bezüglich der Schritte (1 ) und (2) gelten die vorstehenden Ausführungen entsprechend. Um die Herstellung der Chips (mikrostrukturierter Polymerkörper) zu vereinfachen, kann die Methode des Heißabformens (hot embossing) angewendet werden. Hierzu wird zunächst, wie vorstehend beschrieben, mittels Soft- sowie nachfolgender UV- Lithographie ein beispielsweise zweiskalig strukturierter Polymerkörper hergestellt.
Von diesem zweiskalig strukturierten Polymerkörper wird nachfolgend eine Negativstruktur durch Heißabformung hergestellt. Üblicherweise wird auf ein thermoplastisches Material abgeformt. Vorzugsweise umfasst Schritt (5) die Schritte
(5a) Auflegen des thermoplastisches Materials auf die mikrostrukturierte Oberfläche des Polymerkörpers; und
(5b) Erwärmen des thermoplastisches Materials und/oder des mikrostrukturierten Polymerkörpers.
Vorzugsweise wird auf eine Temperatur erwärmt, bei der das thermoplastische Mate- rial erweicht und durch Einwirkung der Schwerkraft die Form des mikrostrukturierten Polymerkörpers annimmt. Vorzugsweise wird als thermoplastisches Material Polyethylen, Polypropylen, ein Blend daraus oder ein Ethylen-Propylen-Copolymer verwendet. Im Fall der Verwendung von Polypropylen wird vorzugsweise auf 150 bis 180°C, besonders bevorzugt auf 160 bis 170°C, beispielsweise auf 166°C erwärmt. Zudem ist bevorzugt, dass das thermoplastische Material in Form einer Folie vorliegt.
Weiter umfasst Schritt (5) vorzugsweise die Schritte
(5c) Absenken der Temperatur des thermoplastisches Materials auf eine Temperatur unterhalb der Erweichungstemperatur des thermoplastisches Materials; und (5d) Entformen des mikrostrukturierten thermoplastisches Materials (Master für Soft- lithographie) und des mikrostrukturierten Polymerkörpers. Durch Absenken auf eine unterhalb der Erweichungstemperatur des thermoplastisches Materials liegende Temperatur, vorzugsweise Raumtemperatur (20°C) oder darunter, nimmt das thermoplastische Material dauerhaft die Form (Mikrostruktur, beispielsweise zweiskalig) der Oberfläche des Polymerkörpers an. Dadurch kann ein Master (beispielsweise Polypropylenmaster) mit der kompletten Negativstruktur des Chips bereitgestellt werden. Dieser (Polypropylen)master kann anschließend zur Herstellung weiterer Chips durch übliche Softlithographie eingesetzt werden. Die erhaltenen Chips sind von hervorragender Qualität und von anderweitig erhaltenen erfindungsgemäßen mikrostrukturierten Polymerkörpern nicht zu unterscheiden. Durch die Verwendung dieses Masters kann der Schritt der Einbringung weiterer, beispielsweise kleinerer, Strukturen durch UV-Lithographie entfallen.
Der durch Verwendung des Masters erhaltene mikrostrukturierte Polymerkörper kann zur Herstellung des Verbundkörpers beziehungsweise Mikrobioreaktors der vorliegen- den Erfindung verwendet werden. So kann sich in bevorzugten Ausführungsformen ein Schritt (6) der Erzeugung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers durch Softlithographie unter Verwendung des aus Schritt (5) erhaltenen Masters anschließen. An Schritt (6) kann sich weiter Schritt (3), und darüber hinaus gegebenenfalls Schritt (4), anschließen.
Figur 1 zeigt schematisch einen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Mikrobioreaktor sowie vergrößerte Abschnitte davon. In der Vergrößerung sind nicht einschränkende, bevorzugte Dimensionen (Tiefe, Breite, Länge, Abstände) der Vor- und Nachstrukturierungselemente/Durchgangsöffnungen (Kavitäten mit quadratischer Grundfläche bzw. Kanäle) angegeben.
Figur 2 zeigt schematisch das in Beispiel 1 angegebene Herstellungsverfahren gemäß der Erfindung.
1 .: Gießen des Polymerharzes
2.: Auflegen des vorstrukturierten Polymerkörpers auf die Maske
3. : UV-Bestrahlung bei 185 nm für 2,5 Stunden
4. : Entwickeln 5. : Binden an das Substrat
6. : Abtragen am Vibratom
Figur 3 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 2. In blau dargestellt ist Hoechst 33345 (Mittel zur Färbung der DNS (Zellkern)), grün erscheint Neurofilament-H (angefärbt mit einem entsprechenden Antikörper gegen Neurofilament-H).
Figur 4 zeigt ein Spottingmuster mit dem eine Glasoberfläche mit zwei verschiedenen DNA-Oligonukleotiden (F1 (rot) und F9 (grün), jeweils aus 21 Nucleotiden) mikrostruk- turiert und funktionalisiert wurde (siehe Beispiel 3). Die individuellen Spots werden so auf dem Glasträger angeordnet, dass sie unterhalb der Kavitäten der Vorstrukturierung liegen.
Figur 5 zeigt die aus Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse. Figur 5A zeigt das Ergebnis der Markierung mit cF1 -STV-batto647-Konjugat, Figur 5B das Ergebnis der Markierung mit cF1 -STV-batto650-Konjugat und Figur 5C das Ergebnis der gleichzeitigen Markierung mit cF1 -STV-batto647-Konjugat und cF1 -STV-batto650-Konjugat.
Figur 6 zeigt eine iichtmikroskopische Aufnahme der Oberfläche des in Beispiel 1 er- haltenen mikrostrukturierten Silikonkörpers mit Vor- und Nachstrukturierung nach dem Binden an das Glassubstrat sowie nach dem Aufschneiden mittels Vibratom.
Figur 7 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Masters für die Softlithographie.
Figur 8 zeigt Resultate aus Beispiel 4 (Erzeugung eines Masters durch Heißabformen). Die obere Reihe zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen, die untere Reihe Höhenprofile. A PDMS-Chip 1 , hergestellt mittels SU-8 Master sowie nachfolgender UV- Lithographie. Kanal: 3,9 pm tief; 10,4 pm breit. Kavität: 66,7 μιτι tief, 233,6 pm breit.
B Polypropylenmaske, hergestellt mittels hot embossing unter Verwendung von PDMS-Chip 1 . Kanal: 2,8 pm tief; 8,5 pm breit. Kavität: 60,0 pm tief, 237,4 pm breit.
C PDMS-Chip 2, hergestellt mittels Polypropylenmaske. Kanal: 3,0 m tief; 9,5 μιτι breit. Kavität: 59,7μπη tief, 239, 5μιη breit. Die nachstehenden Beispiele dienen als weitere Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne darauf beschränkt zu sein.
Beispiel 1 : Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers Für die Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers wurden als Master ein SU-8 Photoresist-Master, womit die Kavitäten der Vorstrukturierung durch Ausgießen abgeformt wurden, und eine Goldmaske, bestehend aus einer Platte synthetischen Quarzglases (50 x50 x2 mm; Firma J-plasma), beschichtet mit einer 1 nm dicken Titanhaftschicht sowie einer darauf aufgebrachten 30 nm dicken Goldschicht, mit der Nach- strukturierung (Kanäle) entsprechenden Aussparungen verwendet.
Zunächst wurde unter Verwendung der SU-8 Maske ein Polymerkörper mit Vorstrukturierung, bestehend aus den einzelnen Kavitäten, aus Polydimethylsiloxan (PDMS) gegossen. Hierfür wurde das Elastomer Kit Sylgard 1 84 (Dow Corning) verwendet, welches im Verhältnis neun (Sylgard 1 84 Base) zu eins (Härter, Curing Agent, Dow Corning) gemischt wurde. Zur Entfernung der Luftblasen, die sich während des Mischvorgangs bildeten, wurde die Lösung evakuiert und so lange im Vakuum inkubiert, bis sie blasenfrei war. Nachfolgend wurde die so vorbereitete Lösung auf die SU-8 Maske gegossen und bei 40°C im Trockenschrank für etwa eine Stunde inkubiert, bis das Polymer vollständig ausgehärtet war.
Anschließend erfolgte die Einbringung der Kanäle zwischen den einzelnen Kavitäten mittels UV-Lithographie (Nachstrukturierung). Hierfür wurden die vorstrukturierten Polymerkörper nach dem Aushärten auf die Goldmaske gelegt, so dass die vorstruktu- rierte Oberfläche an der Goldmaske anlag. Deren Goldbeschichtung wies 5 μιη breite Aussparungen zur Erzeugung der Nachstrukturierung auf. Die Anordnung von Goldmaske mit dem darauf aufgelegten vorstrukturierten Polymerkörper wurde zweieinhalb Stunden mit UV-Licht der Wellenlänge 185 nm im Abstand von etwa 5 cm (Bestrahlungsstärke: 280 pW-cnr2) bestrahlt. Hierzu wurde eine UV-Lampe mit der Bezeichnung Heraeus GPH212T5VH der Firma Peschl Ultraviolet GmbH verwendet. Danach wurde die Goldmaske entfernt.
Die anschließende Entwicklung der Nachstrukturierung erfolgte durch Überschichten des Polymerkörpers mit Entwicklungslösung in einem Becherglas und nachfolgendem Beschallen (Beschallungsgerät der Firma Elma, Typ T220, HF-Freq 42 Hz) in der Entwicklungslösung im Ultraschallbad für vier Minuten. Danach wurde der Polymerkörper aus der Entwicklungslösung entnommen und mit destilliertem Wasser gereinigt.
Im Anschluss erfolgte das Binden des erhaltenen mikrostrukturierten Silikonkörpers an einen Objektträger aus Glas (Substrat). Dazu wurden die zu bindende Oberfläche des Substrats sowie die mikrostrukturierte Oberfläche des Silikonkörpers mittels Sauer- stoffplasma aktiviert. Hierzu wurde von einem Objektträger (76x26x1 mm) mit einem Glasschneider ein Glasfragment (3x3 cm) zugeschnitten und anschließend mit Aceton gereinigt. Sowohl der Silikonkörper als auch das Glasfragment wurden in einer Plasmaanlage PlasmaFlecto 10 der Firma Plasma Technology für zwei Minuten behandelt (verwendete Parameter siehe nachstehende Tabelle 1 ). Anschließend wurden alle Teile der Anlage entnommen und der Silikonkörper mit nach unten weisender vorstrukturierter Oberfläche auf die aktivierte Glasoberfläche gelegt. Im Folgenden wurde der erhaltene auf Glas geträgerte Polymerkörper im Trockenschrank bei 120°C für etwa eine Stunde inkubiert.
Tabelle 1
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Im letzten Schritt erfolgte das Aufschneiden der Kavitäten mit Hilfe eines Vibratoms des Typs VT10005 der Firma Leica Biosystems. Zu diesem Zweck wurden zunächst mit Sekundenkleber (Pattex Glas der Firma Henkel) zwei Streifen geschnittenes Glas aus einem Objektträger als Stege an die Glasunterseite des Mikrobioreaktors geklebt. Über diese zwei Stege erfolgte im Anschluss die Anbringung des auf Glas geträgerten Polymerkörpers auf dem Schneidetisch des Vibratoms mittels Sekundenkleber LOCTITE 414 der Firma Henkel.
Das schrittweise Abtragen der obersten Schichten des Polymerkörpers erfolgte durch Schneiden in einem Wasserbad. Während des Schneidevorgangs wurden alle erhaltenen Schnitte unter dem Mikroskop kontrolliert, um zu ermitteln, ob die Kavitäten be- reits vollständig freigelegt waren. Nachdem dies der Fall war, wurde der erhaltene Mik- robioreaktor vorsichtig mittels Rasierklinge vom Schneidetisch entfernt.
Beispiel 2: Zellkultivierung Murine Neuroblastomzellen (Neuro2a) wurden in einem Volumen von 10 pL Medium direkt auf die Kavitäten des Arrays pipettiert. Nachdem die Zellen sich an die Oberfläche angeheftet hatten, wurde ausreichend Medium (Eagle's Minimum Essential Me- dium (EMEM) + 10% FBS + 1 % Penicillin Streptomycin) hinzugegeben. Nach 24 Stunden Inkubationszeit erfolgte die Differenzierungsinitiation durch die Zugabe von 1 μΜ Retinsäure oder 1 mM Natrium N6,2'-0-Dibutyryladenosin-3',5'-zyklisches Monophos- phat (N6,2'-0-Dibutyryladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt; db-cAMP) in Kombination mit einer geringeren Konzentration an fötalem Kälberserum (0,5 Vol.-% FCS). Nachdem die Zellen über einen Zeitraum von 6 Tagen in Intervallen von 24 Stunden wie vorstehend beschrieben behandelt wurden, erfolgte die Fixierung sowie die Färbung der Zellen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt. Figur 3 zeigt das Axonwachstum der Zellen in die Kanäle hinein (Kultivierung sowie Differenzierung muriner Neuroblastomzellen (Neuro2a)). Somit ist prinzipiell der Zell- Zell-Kontakt zwischen den neuronalen Zellen unterschiedlicher Kavitäten möglich.
Dadurch, dass die Kavitäten von einer Seite zugänglich sind, ist die Zugabe von ent- sprechenden Agenzien zur Zellstimulation in spezifische Kavitäten möglich. Hierdurch und durch die gegebene hohe Auflösung ist z. B. die Beobachtung des axonalen Transports bestimmter Substanzen möglich.
Beispiel 3: Funktionalisierung
Um eine Funktionalisierung der Glasoberflächen innerhalb des Arrays, sowohl in den Kavitäten als auch in den Kanälen, zu erreichen, wurde die Glasoberfläche vor dem Binden des Polymerkörpers mittels Silanchemie (APTES: (3-Aminopropyl)triethoxy- silan) sowie Poly(ethylenglycol)diglycidylether funktionalisiert. Anschließend erfolgten das Spotten aminofunktionalisierter Oligonukleotide mit Hilfe eines Piezo-Spotters sowie das Binden des Polymerkörpers an ein Glassubstrat, sodass sich die funktionali- sierten Bereiche ("Spots") nach dem Binden innerhalb der Kavitäten befanden. Der Durchmesser der Spots betrug ca. 100 pm. Zum Binden des Polymerkörpers an den Glasträger wurden beide Teile mit Hilfe eines Sauerstoffplasmas aktiviert und zusam- mengefügt. Nach dem Aufschneiden der Kavitäten (Schritt (4)) war die Hybridisierung der entsprechenden DNA-STV Konjugate möglich. Dazu wurden alle Kavitäten mit einer Pufferlösung gefüllt, die ein oder zwei kovalente DNA-Streptavidin Konjugate enthielt, die mit biotinylierte Fluoreszenz-Farbstoffen (batto647 bzw. batto550) markiert waren.
Figur 5A wurde durch das Auftragen von lediglich cF1 -STV-batto647-Konjugat erhalten. Die roten Fluoreszenzsignale entstehen durch spezifische Hybridisierung mit dem komplementären cF9-STV-bAtto647 Konjugat, das lediglich an die F9 Spots bindet (siehe Figur 4). Um Figur 5B zu erhalten, wurde lediglich das Konjugat cF9-STV- batto550 aufgetragen, das als grüne Punkte auf den mit F9-funktionalisierten Spots detektiert werden kann. In Figur 5C wurde eine Mischung der Konjugate cF1 -STV- batto647 (rot) und cF9-STV-batto550 (grün) aufgetragen.
Das erhaltene rot-grüne Punktmuster beweist, dass die Konjugate spezifisch in den mit komplementärem Fängeroligonucleotid-modifizierten Kavitäten immobilisert wurden. Die Fluoreszenzsignale befinden sich erwartungsgemäß innerhalb der vorstrukturierten Kavitäten (in der jeweils rechten Abbildung von Figur 5 durch gestrichelte weiße Rahmenlinien hervorgehoben). Beispiel 4: Herstellung eines Masters durch Heißabformung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers
Um die Herstellung der Chips zu vereinfachen, wurde die Methode des Heißabformens (hot embossing) angewendet. Hierbei wurde zunächst, wie zu Beispiel 1 beschrieben, mittels Soft- sowie nachfolgender UV-Lithographie eine entsprechende Polymerstruktur (Sylgard184 Chip) hergestellt. Von diesem Chip (zweiskalig strukturierter Polymerkörper) wurde nachfolgend eine Negativstruktur durch Heißabformung einer Polypropylenfolie hergestellt. Hierzu wurde eine Polypropylenfolie auf den Polymerchip aufgelegt und die Temperatur des Chips auf 166°C erhöht. Dadurch wurde die zweiskalige Chipstruktur auf die Polypropylenfolie übertragen, sodass nach Reduzieren der Temperatur auf Raumtemperatur (20°C) und Entformen im Folgenden die komplette Ne- gativstruktur des Chips als Polypropylenmaster zur Verfügung stand. Dieser Polypropylenmaster wurde anschließend zur Herstellung weiterer Chips durch übliche Soft- lithographie eingesetzt.
5 Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt. Die linke Spalte zeigt Bilder eines Polymerkörpers (Chip 1 ), welcher über das Abformen des SU-8 Masters und nachfolgender UV- Lithographie hergestellt wurde. Die Bilder der mittleren Spalte zeigen den davon abgeformten Polypropylenmaster, der unter Verwendung von Chip 1 durch Heißabformen (hot embossing) hergestellt wurde. Die rechte Spalte zeigt Bilder des Polymeri e» körpers (Chip 2), der durch soft-lithographisches Abformen (ohne UV-Lithographie) vom Polypropylenmaster (abgebildet in der mittleren Spalte) erhalten wurde.
Durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren können mikrostrukturierte Polymerkörper, mikrostrukturierte Verbundkörper und insbesondere Mikrobioreaktoren, die 1 5 als wertvolles Werkzeug für unterschiedlichste Untersuchungen eingesetzt werden können, kostengünstig, einfach und effizient bereitgestellt werden. Derartige Systeme können insbesondere in der chemischen und pharmazeutischen Industrie von Nutzen sein.

Claims

Patentansprüche Verbundkörper, umfassend ein Substrat und einen mikrostrukturierten Polymerkörper, wobei der Polymerkörper zumindest eine Oberfläche mit einer Vorstrukturierung und einer Nachstruktuherung aufweist und wobei der Polymerkörper über die Oberfläche mit einer Vorstrukturierung und einer Nachstruktuherung an das Substrat gebunden ist. Verbundkörper nach Anspruch 1 , wobei der Polymerkörper ein Silikonkörper ist. Verbundkörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vorstrukturierung Kavitäten umfasst; und die Nachstrukturierung Kanäle, welche die Kavitäten verbinden, umfasst. Mikrobioreaktor, umfassend ein Substrat und einen mikrostrukturierten Polymerkörper, wobei der Polymerkörper Durchgangsöffnungen und zumindest eine Oberfläche mit einer Nachstrukturierung aufweist und wobei der Polymerkörper über die Oberfläche mit einer Nachstrukturierung an das Substrat gebunden ist. Verwendung des Mikrobioreaktors nach Anspruch 4 für das zellbasierte Screenen von pharmazeutischen Wirkstoffen. Verfahren zum zellbasierten Screenen pharmazeutischer Wirkstoffe, umfassend die Schritte Einbringen von Zellen in die Durchgangsöffnungen des Polymerkörpers eines Mikrobioreaktors nach Anspruch 4; gegebenenfalls Versorgen der eingebrachten Zellen mit einer Nährlösung; Inkubieren der Zellen mit einem pharmazeutischen Wirkstoff; und Erfassen der Wirkung des pharmazeutischen Wirkstoffs auf die Zellen. Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers, umfassend die Schritte
(1 ) Erzeugen eines Polymerkörpers aus einem Polymerharz durch Softlithographie, wobei mindestens eine Oberfläche des Polymerkörpers eine durch Softlithographie erzeugte Vorstrukturierung aufweist; und
(2) Nachstrukturieren der vorstrukturierten Oberfläche durch UV- Lithographie.
Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers nach Anspruch 7, weiter umfassend den Schritt
(3) Binden der vor- und nachstrukturierten Oberfläche des mikrostrukturierten Polymerkörpers an die Oberfläche eines Substrats.
Verfahren zur Herstellung eines mikrostrukturierten Polymerkörpers nach Anspruch 7 oder 8, weiter umfassend den Schritt
(4) Abtragen eines Teils des mikrostrukturierten Polymerkörpers, um aus der Vorstrukturierung Durchgangsöffnungen zu bilden.
Verfahren zur Herstellung eines Masters für die Softlithographie, umfassend die Schritte
(1 ) Erzeugen eines Polymerkörpers aus einem Polymerharz durch Softlithographie, wobei mindestens eine Oberfläche des Polymerkörpers eine durch Softlithographie erzeugte Vorstrukturierung aufweist;
(2) Nachstrukturieren der vorstrukturierten Oberfläche durch UV- Lithographie, um einen mikrostrukturierten Polymerkörper zu erhalten; und
(5) Heißabformen des mikrostrukturierten Polymerkörpers.
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