DE19823660C1 - Verfahren und Vorrichtung zur Fixierung fester Mikro- und/oder Nanoobjekte - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Fixierung fester Mikro- und/oder Nanoobjekte

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Fixierung fester Mikro- und/oder Nanoobjekten. DOLLAR A Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, preiswertes und für eine Massenfertigung geeignetes Verfahren einschließlich einer dazugehörigen Vorrichtung zu schaffen, die eine exakte und reproduzierbare Positionierung und Fixierung einer großen Anzahl von biochemisch aktivierten als Formkörper ausgebildete Mikro- und/oder Nanoobjekten wie Mikrokugeln auf einem gemeinsamen Träger erlauben. DOLLAR A Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß mehrere, feste Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) enthaltende flüssige Phasen in je eine weite Einfüllöffnung (8) sich konusartig verengende Rohre (4) eingefüllt und in Richtung je einer engen Austrittsöffnung (7) der Rohre (4) befördert werden, wobei die engen Austrittsöffnungen (7) durch ihre Form und Größe eine Durchlässigkeit von mehr als einem Objekt (2) verhindert, daß die engen Austrittsöffnungen (7) der Rohre (4) vor dem Austreten der Objekte (2) relativ zu einer Trägerebene (11) dreidimensional (in x-, y- und z-Richtung) positioniert werden und das die Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) nach dem Austreten aus der Austrittsöffnung (7) in der vorgegebenen Position physikalisch und/oder chemisch und/oder mechanisch auf den Träger (1) fixiert werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Fixierung fester Mikro- und/oder Nanoobjekten mit den Merkmalen der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und 15 genannten Gattung.
Für die Durchführung komplexer biochemischer Analysen, wie z. B. DNA-, Virus- oder Genanalysen ist die Untersuchung und Auswertung einer großen Anzahl von Einzelreaktionen erforderlich. Stand der Technik ist die parallele Durchführung von einigen 10...100 Analysen in sog. Mikrotiterplatten. Dabei wird die zu untersuchende Substanz in Platten mit regelmäßig angeordneten Vertiefungen mit verschiedensten Analysesubstanzen zur Reaktion gebracht. Das Einbringen der Probe- und Analysesubstanzen kann vollautomatisch mit sog. Pipettierrobotern erfolgen, wobei Stoffmengen von einigen 10...100 Mikrolitern verwendet werden. Dieses Verfahren und die anschließenden umfangreichen Bearbeitungsschritte zur Auslösung und Auswertung der gewünschten chemischen Reaktionen erfordern einen sehr hohen apparativen und zeitlichen Aufwand, so daß derartige Untersuchungen nur in speziellen Labors durchgeführt werden.
Nach einem Verfahren gemäß dem US-Patent 5.445.934 erfolgt eine Miniaturisierung und Parallelisierung der Untersuchungen dadurch, daß auf einem Trägerchip durch Verwendung der vier Nukleotid-Grundbausteine und der aus der Halbleitertechnik bekannten Maskentechnologien beliebige Nukleotidketten (Oligonukleotide) synthetisiert werden. Auf diese Weise können auf einem Chip einige Millionen verschiedene Oligonukleotide erzeugt und nach Reaktion mit der Probesubstanz mittels bekannter Verfahren (z. B. Fluoreszenzanalyse) ausgewertet werden. Dem Vorteil der hohen Parallelität steht eine sehr geringe Flexibilität gegenüber, da für jede neu zu detektierende Substanz (z. B. Gen oder Genabschnitt) ein neuer Maskensatz mit entsprechend hohen Kosten gefertigt werden muß.
Ein weiteres, bekanntes Verfahren der biochemischen Analytik verwendet Kugeln aus Glas, Metall oder Kunststoff mit einem Durchmesser von einigen Mikrometern bis einigen hundert Mikrometern als Träger für Analysesubstanzen. Damit lassen sich z. B. Oligonukleotide direkt oder durch sog. Linker an die Kugeln anlagern. Dieses Verfahren wird insbesondere für in-vivo-Analysen eingesetzt, indem diese Kugeln in einer wäßrigen Lösung direkt in Zellen, Gefäße etc. eingespritzt werden.
In der EP 0 040 943 B1 werden in einem Träger Löcher eingebracht, in die käfigartige Aufnahmevorrichtungen aus Draht o. ä. eingehängt werden. Mehrere Kugeln werden dann in einer nicht näher beschriebenen Weise in diese Käfige positioniert und fixiert.
Die Herstellung derartiger Strukturen dürfte extrem aufwendig sein. Eine Realisierung ist nicht bekannt. Der Miniaturisierbarkeit sind hier Grenzen gesetzt.
Außerdem würde so ein Gebilde mechanisch sehr instabil sein und damit für einen praktischen Einsatz kaum zu gebrauchen sein. Die Positionierung und Fixierung der Kugeln ist nicht gelöst.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, preiswertes und für eine Massenfertigung geeignetes Verfahren einschließlich einer dazugehörigen Vorrichtung zu schaffen, die eine exakte und reproduzierbare Positionierung und Fixierung einer großen Anzahl von biochemisch aktivierten als Formkörpern ausgebildete Mikro- und/oder Nanoobjekten wie Mikrokugeln auf einem gemeinsamen Träger erlauben.
Die erfindungsmäßige Lösung zeichnet sich dadurch aus, daß die Anzahl der Formkörper und damit der zu untersuchenden Substanzen sehr einfach den Erfordernissen der durchzuführenden Analyse angepaßt werden kann. Das bedeutet, daß vorteilhafterweise von einigen wenigen bis einigen zehntausend Substanzen bestimmbar sind. Weiterhin läßt sich die Anordnung der Formkörperbeschichtungen hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung als auch die Plazierung auf einem Träger sehr einfach den Erfordernissen anpassen. Insbesondere können auch Formkörper mit gleicher Beschichtung mehrfach auf einem Träger vorhanden sein. Durch diese Redundanz läßt sich eine Erhöhung der Auswertesicherheit erreichen. Damit wird das Analyseverfahren äußerst flexibel und sehr gut miniaturisierbar (z. B. einige zehntausend Kugeln auf einem Quadratzentimeter). Weiterhin besteht die Beschichtung einer Kugel aus Bruchteilen eines Pikoliters der Analysesubstanz. Damit wird der Verbrauch an teilweise sehr teuren Analysesubstanzen gegenüber dem Mikrotiterverfahren um mehrere Größenordnungen gesenkt.
Als Formkörper können erfindungsgemäß an sich bekannte kugelförmige Objekte eingesetzt werden, die mit einer bestimmten Analysesubstanz beschichtet sind und die in einer wäßrigen, gepufferten Lösung dispergiert sind. Sie werden in ein Kapillarrohr - vorzugsweise aus Glas - gegeben, das am oberen Ende eine Einfüllöffnung mit einem Innendurchmesser besitzt, der ein Befüllen mit herkömmlichen Pipetten oder Pipettierrobotern ermöglicht. Das Kapillarrohr verjüngt sich nach unten zu einer Austrittsöffnung, so daß sie im letzten Abschnitt auf eine bestimmte Länge einen Innendurchmesser besitzt, der größer als der Kugeldurchmesser, aber kleiner als der zweifache Kugeldurchmesser ist. Bei genügend kleinem Kapillardurchmesser verhindern die Kapillar- und Adhäsionskräfte ein Austreten der Flüssigkeit und damit der Kugeln aus der Austrittsöffnung. Durch Einwirkung einer Kraft auf die flüssige Phase im Kapillarrohr - z. B. durch Anlegen einer Druckdifferenz zwischen oberer Kapillareinfüllöffnung und unterer Kapillaraustrittsöffnung (entweder Überdruck oben oder Unterdruck unten), durch elektrostatische, magnetische oder andere physikalische Kraftwirkungen - erfolgt ein Austreten der flüssigen Phase, die die Formkörper dispergiert enthält, am unteren Ende des Kapillarrohres.
Erfindungsgemäß werden mehrere solcher Kapillarrohre, gefüllt mit Formkörpern unterschiedlicher Beschichtung und Beschaffenheit, regelmäßig zu einem Positionierkopf angeordnet, vorzugsweise hexagonal oder in einem rechtwinkligen Raster, so daß mindestens die Austrittsöffnungen und auch die Einfüll-Öffnungen sich in einer Ebene senkrecht zur Kapillarachse befinden. Diese Ebene wird im weiteren als Austrittsebene bezeichnet.
Ordnet man nunmehr einen Träger parallel unterhalb der Austrittsebene in einem Abstand an, der kleiner als der Formkörperdurchmesser ist und stellt die erwähnte Druckdifferenz her, so wird aus allen Kapillaren sowohl die flüssige Phase austreten als auch aus jeder Kapillare genau eine Kugel, wenn der Formkörper eine Kugel ist, auf dem Träger aufsetzen. Der Träger kann hierbei eben oder strukturiert sein.
Bevor Positionierkopf und Träger nach Beendigung des Positionvorganges wieder voneinander entfernt werden, müssen die ausgetretenen Kugeln am Träger fixiert werden, da andernfalls beim Abreißen des Flüssigkeitsfilms dessen Oberflächenspannung die Kugeln wieder zurück in die Kapillaren ziehen würde.
Die Fixierung der ausgetretenen und aufgesetzten Kugeln kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise ist die Verwendung von Kugeln mit magnetischem Kern und das Anlegen eines Magnetfelds sowie die Verwendung einer elektrostatischen Ladung möglich. Vorteilhaft ist es, sofort eine dauerhafte Fixierung herzustellen. Das erfolgt erfindungsgemäß so, daß der Träger vor der Positionierung der Kugeln mit einer geeigneten Substanz beschichtet wird oder der Träger unmittelbar aus dieser Substanz besteht, die eine chemische Bindung mit den Kugeln, ihrer Beschichtung oder Teilen davon eingeht. Beispielsweise kann als Beschichtung ein photopolymerisierbares Vorpolymer oder ein Crosslinker verwendet werden, die die Fixierung der Formkörper unter dem Einfluß von UV-Licht ermöglicht.
Die ausgetretene Flüssigkeit kann nach verschiedenen an sich bekannten Verfahren, wie Verdunsten, über Drainageelemente im Träger oder auch durch Verwendung zusätzlicher Hilfskapillaren zum Absaugen der Flüssigkeit, entfernt werden. Ein Teil der Flüssigkeit tritt wegen der Oberflächenspannung beim Entfernen des Positionierkopfs spontan in die Kapillare zurück. Diesen Effekt kann man dadurch verstärken, indem man die Materialpaarung Pufferflüssigkeit - Trägerbeschichtung so wählt, daß im wesentlichen keine Benetzung erfolgt.
Nach der Fixierung werden Positionierkopf und Träger über geeignete Stellantriebe voneinander entfernt. Danach kann der nächste Positioniervorgang erfolgen.
Bei der Bewegung der Kugeln in den Kapillaren kann es vorkommen, daß diese sich aufgrund von Koagluation- und/oder Adhäsionserscheinungen zu Clustern formieren (agglutinieren), was den Positioniervorgang unmöglich machen würde.
Erfindungsgemäß wird dieses Problem gelöst, indem die Kugeln gleichsinnig elektrostatisch aufgeladen werden - entweder durch Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes oder vorzugsweise durch Modifizierung der Beschichtung mit polaren Gruppen gleicher Polarität. In diesem Falle kann der Prozeß des "Herausdrückens" der Kugel aus der Austrittsöffnung sehr effektiv dadurch unterstützt werden, daß auf den Träger zeitweilig eine Ladung entgegengesetzter Polarität aufgebracht wird.
Nach Abschluß des Positionier- und Fixiervorgangs werden die Kugeln mit einem geeigneten Gel bedeckt, um ein völliges Austrocknen zu vermeiden, was zu einer biochemischen Degradation der Analysesubstanzen führen würde. Anschließend erfolgt ein Abdecken mit einer mechanischen Schutzschicht, z. B. einer Folie. Damit ist die Herstellung des Analysechips abgeschlossen.
Die Erfindung wird beispielhaft an Hand von Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen
Fig. 1 eine schematische stufenförmige Darstellung eines Positionier- und Fixierungsvorganges,
Fig. 2 eine Draufsicht der Austrittsebene,
Fig. 3 ein Blockschaltbild der Vorrichtung und
Fig. 4 eine Ansicht der beladenen Trägerebene.
In Fig. 1 ist in vier Stufen das erfindungsgemäße Verfahren schematisch dargestellt.
Hier werden Formkörper 2 in Form von Polystyrolkugeln von 10 Mikrometern Durchmesser und Kapillarrohre 4 aus Glas mit einem Innendurchmesser einer Austrittsöffnung 7 von 16 Mikrometern eingesetzt. Nach oben erweitern sich die Kapillarrohre 4 auf einen Durchmesser einer Einfüllöffnung 8 von 5 mm.
Jeweils 19 Kapillarrohre 4 sind hexagonal mittels eines Bindemittels 20 zu einer Positionierzelle 3 zusammengefaßt. Die Kaskadierung mehrerer Positionierzellen 3, wiederum in hexagonaler Anordnung, ergibt einen Positionierkopf 5.
In einer Austrittsebene 9 befinden sich Abstandshalter 6 mit einer Länge von 12 Mikrometern, jeweils zwischen den Kapillarrohren 4 angeordnet, zur Abstandshaltung zwischen der Austrittsebene 9 des Positionierkopfes 5 und einer Trägerebene 11 eines Trägers 1. Der Positionierkopf 5 ist über einen Stellantrieb 15 in senkrechter Richtung bewegbar. Stellantriebe 16 und 17 dienen der Bewegung des Positionierkopfes 5 in x- bzw. y-Richtung (Fig. 3). Der Positionierkopf 5 ist in den drei Achsen elastisch aufgehängt (in Richtung der z-Achse sowie drehbar um die x- und y-Achse). Durch die Elastizität in z-Richtung kann der Positionierkopf 5 zerstörungsfrei direkt auf den Träger 1 aufgesetzt werden, wobei die Abstandshalter 6 den gewünschten Abstand zwischen Trägerebene 11 und Austrittsebene 9 garantieren. Die elastische Lagerung um die x- und y- Achse führt zum automatischen Ausgleich von Winkelfehlern zwischen Austritts- und Trägerebene 9 und 11.
Als Träger 1 wird ein Plättchen von ca. 1 cm2 aus glasklarem Polystyrol verwendet, das auf der Trägerebene 11 mit einer wenige Nanometer dicken Fotopolymerschicht 12 versehen ist. In Fig. 1 ist der Träger 1 ohne Vertiefungen dargestellt. Damit entfällt die Notwendigkeit einer Positionierung in x- und y-Richtung im Mikrometerbereich. Einige 10...100 Mikrometer Positioniergenauigkeit sind ausreichend.
Nach Positionierung des Trägers 1 mittels zusätzlicher Stellantriebe 18 und 19 unter dem Positionierkopf 5 erfolgt dessen Abwärtsbewegung bis zum Aufsetzen der Abstandshalter 6 auf den Träger 1. Auf die zuvor mit der flüssigen Phase befüllten Kapillarrohre 4, die zusätzlich mit Ultraschall behandelt werden können, wird nun einfüllseitig ein geringer Überdruck aufgebracht, der zum Austreten und Aufsetzen der hier als Kugeln ausgebildeten Formkörper 2 auf der Trägerebene 11 führt. Die Ultraschallbehandlung dient u. a. der Vereinzelung der Kugeln.
Eine auf den Träger 1 gerichtete UV-Lampe 13 (Fig. 1) wird nunmehr kurzzeitig eingeschaltet. Die durch das UV-Licht induzierte Polymerisation fixiert die Kugeln 2 dauerhaft am Träger 1 (Fig. 4). Anschließend wird der Positionierkopf 5 mittels des Stellantriebes 15 wieder angehoben. Als UV-Lampe 13 wird eine Ringleuchte verwendet, die um eine Kamera mit Mikroskopobjektiv angeordnet ist. Koppelt man zusätzlich Weißlicht seitlich in den Träger 1 ein, lassen sich die Aufsetzvorgänge von Abstandshaltern 6 und Kugeln 2 von unten beobachten und mittels bekannter Methoden der industriellen Bildverarbeitung zur Prozeßsteuerung nutzen. Eine Regelungseinrichtung 14 regelt und steuert die Stellantriebe 15, 16, 17, 18 und 19, die für die Bewegung des Positionierkopfes 5 und des Trägers 1 zuständig sind. Die dafür erforderlichen Daten werden durch Sensoren 10 ermittelt und der Regelungseinrichtung 14 zugeführt.
Bezugszeichenliste
1
Träger
2
Formkörper, Kugel
3
Postitionierzelle
4
Kapillarrohr
5
Positionierkopf
6
Abstandshalter
7
Austrittsöffnung
8
Einfüllöffnung
9
Austrittsebene
10
Sensoren
11
Trägerebene
12
Photopolymerschicht
13
UV-Lampe
14
Regelungseinrichtung
15
Stellantrieb
16
Stellantrieb
17
Stellantrieb
18
Verstellantrieb
19
Verstellantrieb
20
Bindemittel

Claims (18)

1. Verfahren zur Fixierung fester Mikro- und/oder Nanoobjekte, die in einer flüssigen Phase enthalten sind, auf einem Träger,
dadurch gekennzeichnet, daß
mehrere, feste Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) enthaltende flüssige Phasen in je eine weite Einfüllöffnung (8) sich konusartig verengende Rohre (4) eingefüllt und in Richtung je einer engen Austrittsöffnung (7) der Rohre (4) befördert werden, wobei die engen Austrittsöffnungen (7) durch ihre Form und Größe eine Durchlässigkeit von mehr als einem Objekt (2) verhindert,
daß die engen Austrittsöffnungen (7) der Rohre (4) vor dem Austreten der Objekte (2) relativ zu einer Trägerebene (11) dreidimensional (in x-, y- und z- Richtung) positioniert werden und das die Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) nach dem Austreten aus der Austrittsöffnung (7) in der vorgegebenen Position physikalisch und/oder chemisch und/oder mechanisch auf den Träger (1) fixiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beförderung der flüssigen Phase einschließlich der festen Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) durch die Rohre (4) mittels einer angelegten Druckdifferenz zwischen der weiten Einfüllöffnung (8) und der engen Austrittsöffnung (7) erfolgt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl Austritt als auch Positionierung und Befestigung der Mikro- und/oder Nanoobjekte im wesentlichen gleichzeitig erfolgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine vorhergehende reaktive Beschichtung der Trägerebene (11) erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung der Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) elektrostatisch und/oder photochemisch erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung der Mikro- und/oder Nanoobjekte mit mechanischen Mitteln erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung der Mikro- und/oder Nanoobjekte nach deren vorhergehender Magnetisierung durch magnetische Kräfte erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß nach erfolgter Fixierung der Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) auf die Träger (1) eine Beschichtung mit einem Gel erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verhinderung einer Koagulation der Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) in der flüssigen Phase die Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) gleichsinnig elektrostatisch und die Trägerebene (11) gegensinnig elektrostatisch aufgeladen werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Rohr (4) befindlichen Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) mit biologisch-chemisch aktiven Substanzen einer Art in unterschiedlichen Rohren (4) die Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) mit mindestens teilweise unterschiedlichen Substanzen beschichtet sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gleichzeitige Anordnung verschiedener biologisch-chemischer Substanzen zur Detektion von Nukleotidsequenzen genutzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion von Nukleotidsequenzen eine Probenflüssigkeit auf den mit den Mikro- und/oder Nanoobjekte (2) versehenen Träger (1) gebracht und über bekannte chemische Reaktionen eine makroskopische oder mikroskopisch beobachtbare Veränderung der Eigenschaften der Objektoberflächen insbesondere farbliche Veränderungen oder Veränderungen der Fluoreszenzeigenschaften nachgewiesen werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verhinderung von Koagulation und Adhäsion der Mikro- und/oder Nanoobjekte in der flüssigen Phase Stabilisierungsmittel, insbesondere Tenside, eingesetzt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Rohre (4) Kapillaren eingesetzt werden.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Ansprüche 1 bis 14
bestehend aus einem dreidimensional verschiebbaren Positionierkopf (5) der eine bündelartige Anordnung von konusartig sich verengenden Rohren (4) aufweist, die je eine weite Einfüllöffnung (8) und eine enge Austrittsöffnung (7) besitzen,
aus einem Träger (1) mit einer Trägerebene (11), die parallel zu einer Austrittsebene (9) der Rohre (4) angeordnet ist und
Stellantrieben (15, 16, 17) zur Positionierung der Austrittsöffnungen (7) oberhalb der Trägerebene (11) und Stellantrieben (18, 19) zur Positionierung des Trägers (1).
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Positionierkopf (5) aus mehreren Positionierzellen (3) besteht.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß an der Austrittsebene (9) Abstandshalter (6) angeordnet sind.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohre (4) Kapillaren sind.
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