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Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zur Bestimmung der Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf Strukturen aus einem Polymer. Dieses Verfahren ist insbesondere zur Durchführung so genannter Hochdurchsatz-Screenings geeignet, um verschiedene Polymere und deren chemische Modifikationen hinsichtlich der Ansiedlung von Zellen testen zu können. Mithilfe derartiger Tests können Strukturen gefunden werden, welche für das Tissue Engineering geeignet sind. Im Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Struktur zur Ansiedlung biologischer Zellen, insbesondere für das Tissue Engineering.
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Die
DE 10 2004 062 573 A1 zeigt Funktionselemente, welche auf einem Träger angeordnete Mikrostrukturen umfassen, die aus biofunktionalisierbaren oder biofunktionalisierten Nanopartikeln bestehen. Diese Funktionselemente sind für die Verwendung in Screening- und Analytiksystemen vorgesehen.
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Die
DE 697 05 841 T2 zeigt Materialien und Verfahren zur Immobilisierung von bioaktiven Spezien auf polymerischen Unterlagen. Diese Materialien weisen einen Trägerbestandteil und eine erste Schicht auf, die aus mindestens einer Art eines polymeren oberflächenaktiven Mittels besteht, welches an den Trägerbestandteil gebunden ist. Weiterhin verfügen die Materialien über eine zweite Schicht, die aus mindestens einer Art eines hydrophilen Polymers besteht. Eine Art von bioaktiver Spezies ist an die zweite Schicht gebunden.
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Die
DE 602 20 671 T2 zeigt eine Kulturvorrichtung mit einer Kammer zur Aufnahme von Zellen, welche eine innere Querschnittsabmessung zwischen 0,1 µm und 500 µm aufweist. Die Kammer hält die Zellen unter Bedingungen, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vivo zur Verfügung stellen, welcher mit mindestens einem in vivo gebundenen pharmakokinetischen Parameterwert vergleichbar ist. Weiterhin weist die Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom auf.
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Die
DE 10 2009 025 007 A1 zeigt eine Vorrichtung zur schwerkraftsunabhängigen Überführung von Fluidproben in regelmäßige Probensequenzen. Diese Vorrichtung umfasst eine von einem Trägerfluid durchströmten Mikrokanal, welcher mit einer in einem Behälter befindlichen Fluidprobe in Kontakt gebracht wird. Der Mikrokanal weist im Kontaktbereich der Fluidproben mit dem Trägerfluid eine Düsenöffnung auf, wobei der Querschnitt der weitesten Düsenöffnung den hydrodynamischen Querschnitt des Mikrokanals nicht überschreitet.
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Die
DE 10 2009 044 113 A1 zeigt einen teilweise perforierten mikrostrukturierten Formkörper zur Kultivierung von biologischen Zellen. Dieser Formkörper umfasst eine Folie, die in unverformte Bereiche und verdünnte Verstreckungsbereiche geteilt ist. Zumindest in einigen der verdünnten Verstreckungsbereiche sind Mikrostrukturen ausgebildet. Weiterhin sind Poren zumindest in einem der verdünnten Verstreckungsbereiche ausgebildet.
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In dem Artikel von Anderson, D. G. et al.: „Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells" in Nature Materials, 9 (2010) ist ein Hochdurchsatz-Ansatz für eine schnelle Synthese von Biomaterialien im Nanoliterbereich und für eine Charakterisierung von deren Wechselwirkungen mit Zellen beschrieben.
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Der Artikel von Derda, R. et al.: „High-Throughput Discovery of Synthetic Surfaces That Support Proliferation of Pluripotent Cells" in Journal of the American Chemical Society, 132 (2010), 1289–95 zeigt ein spezielles Phage-Display-Verfahren zur Identifikation neuartiger, an die Oberfläche von pluripotenten Zellen anbindender Peptide. Es wurden sieben Peptide mit Zellbindungseigenschaften identifiziert.
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Die
DE 10 2005 008 434 A1 zeigt ein Verfahren zur Modifizierung eines Substrates, um biofunktionale Oberflächenstrukturen bereitzustellen. Bei diesem Verfahren wird ein Substrat mittels einer Modifizierungslösung mit mindestens einem Derivat der Aminocellulose und/oder mit mindestens einem Derivat eines NH
2-(Organo)polysiloxan in Kontakt gebracht, sodass sich ein Substratverbundmaterial aus dem Substrat und Aminocellulosederivat und/oder dem Substrat und NH
2-(Organo)polysiloxan bildet.
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In dem Artikel von Anderson, D. G. et al.: „Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells" in Nature Biotechnology, 22 (2004), 863–66 ist die Idee formuliert, kombinatorische Verfahren zum Screening von Biomaterial im Mikroarray-Format einzusetzen. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren kann die Eignung oberflächengebundener bioaktiver Moleküle zur Einstellung optimierter Bedingungen für eine Stammzellenkultur untersucht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ausgehend vom Stand der Technik darin, die Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf Strukturen aus einem Polymer zu verbessern. Hierfür sind ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf solchen Strukturen sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Strukturen bereitzustellen.
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Die genannte Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf Strukturen aus einem Polymer gemäß dem beigefügten Anspruch 1 sowie durch ein Verfahren zur Herstellung einer Struktur für die Ansiedlung biologischer Zellen gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 2.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf Strukturen aus einem Polymer ist es möglich, unterschiedlichste synthetische Polymere und deren chemischen Modifikationen auf ihre Eignung für das Tissue Engineering zu testen. Dieses Verfahren umfasst zunächst einen Schritt, in welchem ein Träger aus einem Polymer, insbesondere aus einem synthetischen Polymer bereitgestellt wird. Der Träger weist eine Trägerfläche auf, auf welcher die Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen getestet werden kann. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird weiterhin eine versprühbare Substanz bereitgestellt, welche zumindest einen Stoff zur chemischen Modifikation des Polymers enthält. Dabei muss es sich um einen Stoff handeln, welcher mit dem ausgewählten Polymer chemisch reagiert. In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Maske vor dem Träger angeordnet. Die Maske wird insbesondere vor der Trägerfläche angeordnet, bevorzugt parallel zu dieser Trägerfläche. Die Maske weist zumindest eine Öffnung auf, durch welche chemisch zu modifizierende Bereiche des Trägers festgelegt sind, indem übrige Bereiche maskiert sind. Die Maske wird bevorzugt unmittelbar und ohne Abstand vor dem Träger angeordnet. Im folgenden Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Träger durch die Maske hindurch mit der versprühbaren Substanz besprüht. Da die versprühbare Substanz nur durch die Öffnungen in der Maske hindurch auf den Träger gelangt, wird die versprühbare Substanz nur auf den chemisch zu modifizierenden Bereichen des Trägers aufgetragen, sodass bevorzugt nur diese Bereiche chemisch modifiziert werden. In diesen Bereichen kommt es zu chemischen Reaktionen zwischen dem Polymer des Trägers und dem in der versprühbaren Substanz enthaltenen Stoff zur chemischen Modifikation. In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden biologische Zellen auf die chemisch modifizierten Bereiche aufgebracht. Die chemische Modifikation des Polymers erfolgt mit dem Ziel, dass die biologischen Zellen an dem Träger dort anhaften und sich ansiedeln. Da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere dazu dient, verschiedene Polymere und Stoffe zur chemischen Modifikation zu testen, ist vorab nicht vollständig bekannt, in welchem Maße die biologischen Zellen an den chemisch modifizierten Bereichen anhaften. Daher erfolgt in einem weiteren Schritt ein Bestimmen der Adhäsion der biologischen Zellen auf den mit den biologischen Zellen versehenen, chemisch modifizierten Bereichen des Trägers.
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Bevorzugt wird hierfür bestimmt, wie groß der Anteil derjenigen zuvor aufgebrachten biologischen Zellen ist, welche nach einer Beanspruchung noch am Träger haften. Im Ergebnis ist jedenfalls bekannt, ob das gewählte Polymer und die gewählte chemische Modifikation geeignet sind, um darauf die gewählten biologischen Zellen anzusiedeln, damit diese dort beispielsweise wachsen und ein Gewebe bilden.
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Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass durch die Maskierung aufwandsarm eine Vielzahl an Aufbringungsbereichen für die biologischen Zellen geschaffen werden kann, um eine große Anzahl an Tests zur Ansiedlung der Zellen durchführen zu können, was für eine Bewertung des ausgewählten Polymers und der ausgewählten chemischen Modifikation erforderlich ist. Die erfindungsgemäß vorgenommene Maskierung erlaubt einen Verzicht auf aufwändige Lösungen zur Schaffung vieler Aufbringungsbereiche, wie beispielsweise roboterbasierte Liquidhandlinglösungen und drucktechnische Lösungen.
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Vor dem Bestimmen der Adhäsion der biologischen Zellen auf den chemisch modifizierten Bereichen des Trägers lässt man bevorzugt eine Zeitdauer verstreichen, um ein Wachstum der biologischen Zellen auf den chemisch modifizierten Bereichen abzuwarten. Hierdurch wird sichergestellt, dass bei der anschließenden Bestimmung der Adhäsion der biologischen Zellen auch die beim Wachstum auftretenden Wechselwirkungen zwischen den biologischen Zellen und den chemisch modifizierten Bereichen berücksichtigt werden.
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Die biologischen Zellen werden während ihres Wachstums bevorzugt mit den hierfür notwenigen Stoffen versorgt.
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Das Bestimmen der Adhäsion der biologischen Zellen auf den chemisch modifizierten Bereichen des Trägers wird bevorzugt im Rahmen eines Hochdurchsatz-Screenings durchgeführt. Da das erfindungsgemäße Verfahren eine aufwandsarme Durchführung vieler Tests zur Eignung von Polymeren und deren chemischen Modifikationen erlaubt, kann mithilfe eines Hochdurchsatz-Screenings eine aufwandsarme Bewertung dieser Polymere und chemischen Modifikationen vorgenommen werden.
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Die Schritte des Verfahrens zur Bestimmung der Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf Strukturen aus einem Polymer werden bevorzugt wiederholt, wobei ein anderes Polymer und/oder ein anderer Stoff zur chemischen Modifikation des Polymers und/oder andere biologische Zellen gewählt werden, um ein geeignetes Polymer einschließlich eines geeigneten Stoffes für die chemische Modifikation zur Ansiedlung der gewählten biologischen Zellen zu finden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Struktur für die Ansiedlung biologischer Zellen umfasst zunächst einen Schritt, in welchem ein Träger aus einem Polymer bereitgestellt wird. Der Träger aus dem synthetischen Polymer weist eine Trägerfläche auf, auf welcher die biologischen Zellen aufgebracht werden können.
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In einem weiteren Schritt wird eine versprühbare Substanz bereitgestellt, die zumindest einen Stoff zur chemischen Modifikation des ausgewählten Polymers enthält. Die chemische Modifikation des Polymers führt zu chemischen Stoffen, welche eine mittelbare oder unmittelbare Anbindung, d. h. eine Adhäsion von biologischen Zellen an dem Polymer ermöglichen. In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Maske vor dem Träger angeordnet, welche mindestens eine Öffnung aufweist, durch welche chemisch zu modifizierende Bereiche des Trägers festgelegt sind, indem übrige Bereiche maskiert sind. Die Maske wird bevorzugt unmittelbar und abstandslos vor der Trägerfläche angeordnet. Im nächsten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Träger durch die Maske hindurch mit der versprühbaren Substanz besprüht, wodurch die versprühbare Substanz auf den chemisch zu modifizierenden Bereichen des Trägers aufgetragen wird und diese Bereiche chemisch modifiziert werden. Es entstehen die chemischen Stoffe, welche eine mittelbare oder unmittelbare Anbindung von biologischen Zellen an dem Polymer ermöglichen. Die von der Maske maskierten Bereiche auf dem Träger werden nicht chemisch modifiziert, sodass dort keine Anbindung biologischer Zellen erleichtert wird. Folglich definieren die chemisch modifizierten Bereiche diejenigen Orte auf dem Träger, welche für eine Ansiedlung der biologischen Zellen vorgesehen und geeignet sind. Mithilfe der Maske können aufwandsarm viele solcher Bereiche geschaffen werden. Auch können durch die Maske diese Bereiche eine besondere Ausformung erhalten, um das Ansiedeln der biologischen Zellen zu beeinflussen bzw. zu erleichtern.
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Die beiden beschriebenen Verfahren werden bevorzugt nacheinander ausgeführt, wobei für das Verfahren zur Herstellung einer Struktur für die Ansiedlung biologischer Zellen solche Polymere und chemischen Stoffe zur Modifikation ausgewählt werden, für welche durch die Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der Ansiedelbarkeit von biologischen Zellen auf Strukturen aus einem Polymer eine ausreichende Adhäsion der biologischen Zellen festgestellt wurde.
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Die nachfolgenden Erläuterungen und Beschreibungen bevorzugter Ausführungsformen beziehen sich auf beide der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren.
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Die chemische Modifikation des Polymers stellt eine chemische Aktivierung des Polymers für die Ansiedlung von biologischen Zellen dar. Die chemische Modifikation ist durch chemische Reaktionen zwischen dem Polymer und dem Stoff zur chemischen Modifikation gebildet, wobei die chemischen Reaktionen zu chemischen Stoffen als Reaktionsprodukte auf der Oberfläche des Trägers führen. Diese chemischen Stoffe ermöglichen mittelbar oder unmittelbar die Anbindung der biologischen Zellen an das Polymer. Bevorzugt führt die chemische Modifikation des Polymers zur Hydrophilie des Polymers innerhalb der chemisch modifizierten Bereiche.
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Bevorzugt weisen die chemisch modifizierten Bereiche unmittelbar oder mittelbar nach dem chemischen Modifizieren bioaktive Moleküle auf, die vorzugsweise mit den infolge der chemischen Modifikation des Polymers auf der Oberfläche des Trägers entstandenen chemischen Stoffen eine chemische Verbindung eingegangen sind.
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Bei bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren werden nach dem chemischen Modifizieren der chemisch zu modifizierenden Bereiche weiterhin bioaktive Moleküle auf die chemisch modifizierten Bereiche aufgebracht. Die bioaktiven Moleküle gehen mit den im Ergebnis der chemischen Modifikation gebildeten chemischen Stoffen auf der Oberfläche des Trägers eine chemische Verbindung ein. Die bioaktiven Moleküle dienen der unmittelbaren Anbindung der biologischen Zellen.
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Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die versprühbare Substanz weiterhin bioaktive Moleküle, welche mit dem Stoff zur chemischen Modifikation des Polymers eine chemische Verbindung eingehen oder bereits eingegangen sind. Folglich werden die bioaktiven Moleküle gemeinsam mit dem Stoff zur chemischen Modifikation des Polymers auf die chemisch zu modifizierenden Bereiche aufgesprüht. Nach der chemischen Modifikation des Polymers sind die bioaktiven Moleküle mittelbar mit dem Polymer verbunden, sodass die bioaktiven Moleküle zur Anbindung der biologischen Zellen zur Verfügung stehen.
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Die bioaktiven Moleküle sind bevorzugt durch Moleküle gebildet, die mit Bestandteilen der biologischen Zellen mechanische, elektrostatische und/oder chemische Wechselwirkungen eingehen, wodurch es zu einer Adhäsion der biologischen Zellen an den bioaktiven Molekülen und folglich mittelbar auch zu einer Adhäsion an dem Träger kommt.
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Bevorzugt werden biologische Zellen auf die chemisch modifizierten Bereiche aufgebracht, wobei diese mittelbar oder unmittelbar an dem Träger anhaften.
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Bei den biologischen Zellen handelt es sich bevorzugt um tierische oder menschliche Zellen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den biologischen Zellen um embryonale Stammzellen, auf deren Basis unterschiedliche Gewebearten hergestellt werden können.
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Bei dem Polymer handelt es sich bevorzugt um Polyaktid, Polyethylenglykol, Polycaprolacton, Polyglykolsäure oder Polyurethan. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Polymer um Polycarbonat.
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Der Stoff zur chemischen Modifikation des Polymers ist bevorzugt durch aliphatische Amine, insbesondere durch aliphatische Diamine gebildet. Die Amine sind besonders gut geeignet, um bioaktive Moleküle an Polycarbonat zu koppeln.
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Die versprühbare Substanz enthält bevorzugt weiterhin ein flüssiges Lösungsmittel zum Lösen des Stoffes zur chemischen Modifikation des Polymers, sodass dieser Stoff als Flüssigkeit versprühbar ist.
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Der Träger ist bevorzugt durch eine ebene Platte gebildet. Die Kantenlängen der Platte betragen bevorzugt zwischen 1 cm und 50 cm. Die Platte ist bevorzugt durch eine Folie gebildet.
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Der Träger ist bevorzugt als Platte ausgebildet, in welche Ausformungen eingebracht sind. Die Ausformungen sind bevorzugt durch Mulden im Träger gebildet. Die Mulden erleichtern die Ansiedlung der biologischen Zellen. Außerdem weist der Träger innerhalb der Ausformungen bevorzugt poröse Bereiche auf, welche einen Stoffaustausch mit den biologischen Zellen ermöglichen. Die Ausformungen werden bevorzugt mittels Mikrothermformen, Heißprägen und/oder lithografischer Verfahren in den Träger eingebracht.
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Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird nicht lediglich ein ebener Träger bzw. lediglich ein ebener Träger mit Ausformungen verwendet, sonders es werden auch weitere Träger verwendet, um die zu schaffende Struktur dreidimensional auszubilden. Hierfür sind zunächst weitere Träger aus dem Polymer bereitzustellen. Ebenso wie bei dem zuerst genannten Träger wird auch bei den weiteren Trägern jeweils eine weitere Maske vor dem jeweiligen der weiteren Träger angeordnet, durch welche chemisch zu modifizierende Bereiche des jeweiligen weiteren Trägers festgelegt sind. Statt der weiteren Maske bzw. statt der weiteren Masken kann es sich auch jeweils um dieselbe Maske handeln. Ebenso wie der zuerst genannte Träger werden auch die weiteren Träger jeweils durch die davor angeordnete Maske hindurch mit der versprühbaren Substanz besprüht, wodurch die versprühbare Substanz auf den chemisch zu modifizierenden Bereichen des jeweiligen weiteren Trägers aufgetragen wird und diese Bereiche chemisch modifiziert werden. Weiterhin werden biologische Zellen auf die chemisch modifizierten Bereiche des Trägers aufgebracht. Schließlich werden die Träger mit den aufgebrachten biologischen Zellen zu einer dreidimensional ausgebildeten Struktur aufgestapelt. Die Träger können durch geeignete Mittel fest miteinander verbunden werden.
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Mit der dreidimensional ausgebildeten Struktur zur Ansiedlung von Zellen können komplexe Zusammenhänge innerhalb eines natürlichen Gewebe oder Organs nachgebildet werden. Hierfür sind die Träger bevorzugt mit Öffnungen versehen, welche nach dem Stapeln der Träger Kanäle innerhalb der dreidimensional ausgebildeten Struktur bilden. Die Kanäle ermöglichen insbesondere einen stofflichen Austausch zwischen den einzelnen Zellen sowie zwischen den Zellen mit dem Äußeren der Struktur.
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Die Maske sowie ggf. die weiteren Masken weisen bevorzugt eine Vielzahl an Öffnungen auf, um eine Vielzahl an chemisch zu modifizierenden Bereichen auf den Träger zu definieren. Die Öffnungen sind bevorzugt regelmäßig, besonders bevorzugt matrixartig angeordnet. Bei einer besonderen Ausführungsform weist die eine Maske bzw. weisen die mehreren Masken jeweils nur eine Öffnung auf, beispielsweise wenn die Maske zwischen einzelnen Sprühvorgängen relativ zum Träger bewegt wird.
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Die Öffnungen sind in ihrem Querschnitt bevorzugt jeweils zwischen 10 µm und 10 mm groß.
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Die Öffnungen sind bevorzugt Querschnitten von Öffnungen oder von Hohlräumen einer extrazellulären Matrix eines biologischen Gewebes nachgebildet, um die natürlichen Bedingungen für das Wachstum der biologischen Zellen nachzuahmen.
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Bei aufwandsarm durchzuführenden Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Maske und der dahinter befindliche Träger gleichmäßig mit der versprühbaren Substanz besprüht. Hierfür kann beispielsweise eine Sprühdüse verwendet werden, durch welche die versprühbare Substanz hindurch gepresst wird, um einen homogenen Sprühnebel zu erzeugen, welcher auf die gesamte Maske strömt, durch die Öffnungen in der Maske hindurch tritt und schließlich auf den Träger gelangt.
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Bei bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren wird die versprühbare Substanz im versprühten Zustand gerichtet auf bestimmte Orte innerhalb der chemisch zu modifizierenden Bereiche des Trägers aufgetragen. Diese Ausführungsformen umfassen zunächst einen Schritt, bei welchem eine erste Elektrode in einen Bereich, in welchem die versprühbare Substanz beim Versprühen einen Sprühnebel bildet, angeordnet wird. Eine zweite Elektrode wird gegenüber einem ausgewählten Ort innerhalb einer der chemisch zu modifizierenden Bereiche des Trägers angeordnet. Die zweite Elektrode kann an oder unmittelbar benachbart zu diesem Ort angeordnet werden. Bevorzugt wird die zweite Elektrode auf der Rückseite des Trägers unmittelbar hinter dem ausgewählten Ort innerhalb des chemisch zu modifizierenden Bereiches des Trägers angeordnet. Es wird eine elektrische Spannung an die erste Elektrode und die zweite Elektrode angelegt, wenn der Träger mit der versprühbaren Substanz besprüht wird. Dies führt zu einer Elektrodeposition, wodurch die versprühbare Substanz nur an den gewählten Ort innerhalb des jeweiligen chemisch zu modifizierenden Bereiches des Trägers gelangt. Um die versprühbare Substanz an einem weiteren ausgewählten Ort in einem der chemisch zu modifizierenden Bereiche aufzutragen, ist die zweite Elektrode relativ gegenüber dem Träger zu bewegen. Anschließend ist wiederum die Spannung an die erste Elektrode und die zweite Elektrode anzulegen und der Träger ist durch die Maske hindurch mit der versprühbaren Substanz zu besprühen, wobei die Substanz nun an dem anderen Ort innerhalb des chemisch zu modifizierenden Bereiches des Trägers aufgetragen wird. Der Schritt des relativen Bewegens der zweiten Elektrode gegenüber dem Träger und der Schritt des Besprühens des Trägers bei angelegter Spannung zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode sind zu wiederholen, bis sämtliche chemisch zu modifizierenden Orte innerhalb der chemisch zu modifizierenden Bereiche des Trägers durch die versprühbare Substanz chemisch modifiziert sind. Diese Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren erlauben eine chemische Modifikation des Trägers mit einer hohen örtlichen Auflösung.
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Bevorzugt wird nicht lediglich die zweite Elektrode, sondern auch die Maske relativ gegenüber dem Träger bewegt, bevor der Träger an einem der Orte innerhalb einer der chemisch zu modifizierenden Bereiche mit der versprühbaren Substanz besprüht wird. Hierdurch kann die Selektivität beim Besprühen der chemisch zu modifizierenden Bereiche erhöht werden.
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Die zweite Elektrode ist bevorzugt nadelartig ausgebildet. Sie wird mit ihrer Spitze bevorzugt unmittelbar hinter dem Träger, nämlich hinter dem zu modifizierenden Ort innerhalb des jeweiligen chemisch zu modifizierenden Bereiches des Trägers angeordnet.
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Das Bewegen der zweiten Elektrode relativ gegenüber dem Träger erfolgt bevorzugt innerhalb einer Ebene, die parallel zu der Trägerfläche des Trägers ausgerichtet ist.
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Besonders bevorzugt erfolgt das Bewegen der zweiten Elektrode relativ gegenüber dem Träger in allen drei Raumrichtungen, um die versprühbare Substanz auf verschiedene Orte auch innerhalb von Ausformungen des Trägers gezielt auftragen zu können.
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Das Bewegen der Maske gegenüber dem Träger erfolgt bevorzugt innerhalb einer Ebene, welche parallel zu der Trägerfläche des Trägers ausgerichtet ist. Besonders bevorzugt erfolgt das Bewegen der Maske gegenüber dem Träger in allen drei Raumrichtungen, um die versprühbare Substanz mit einer hohen Selektivität auf verschiedene Orte auch innerhalb von Ausformungen des Trägers gezielt aufzutragen.
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Die versprühbare Substanz bildet beim Versprühen Tropfen, welche bevorzugt jeweils ein Volumen zwischen 1 pl und 1 nl aufweisen.
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Bei besonderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren werden segmentierte Tröpfchen einer weiteren Flüssigkeit über einen mikrofluidischen Kanal in die zu versprühende Substanz eingeleitet, wobei über die weitere Flüssigkeit besondere chemische Modifikationen oder auch andere Anpassungen in den chemisch zu modifizierenden Bereichen des Trägers erzielt werden können.
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Bevorzugt wird die Trägerfläche des Trägers außerhalb der chemisch zu modifizierenden Bereiche oder außerhalb der bereits chemisch modifizierten Bereiche mit einer weiteren Substanz behandelt, durch welche die Bereiche der Trägerfläche außerhalb der chemisch zu modifizierenden Bereiche bzw. außerhalb der chemisch modifizierten Bereiche derart modifiziert werden, dass dort eine Ansiedlung von biologischen Zellen in einem höheren Maße verhindert ist. Bevorzugt führt die weitere Substanz zur Hydrophobie des Polymers außerhalb der chemisch zu modifizierenden Bereiche bzw. außerhalb der chemisch modifizierten Bereiche.
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Weitere Einzelheiten, Weiterbildungen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen:
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1: eine einfache Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren in einer Prinzipdarstellung;
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2: eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren in einer Prinzipdarstellung;
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3: eine Abwandlung der in 2 gezeigten Ausführungsform;
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4: weitere Schritte der in 3 gezeigten Ausführungsform;
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5: eine chemische Modifikation von Polycarbonat gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren;
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6: eine chemische Modifikation von Polycarbonat gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform;
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7: das Prinzip einer chemischen Modifikation von Polycarbonat;
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8: das Prinzip der Anbindung von bioaktiven Molekülen mithilfe der Klick-Chemie;
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9: die Verwendung von Glycin-artigen Molekülen auf Polycarbonat zur Abstandshaltung; und
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10: die Verwendung von Glycin-artigen Molekülen auf Polycarbonat mit unterschiedlichen Oberflächendichten.
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1 zeigt den Ablauf einer einfachen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren in einer Prinzipdarstellung. Zunächst wird ein Träger 01 aus einem Polymer bereitgestellt. Bei dem Träger 01 kann es sich beispielsweise um eine Folie aus Polycarbonat handeln. Vor dem Träger 01 wird eine Maske 02 positioniert, welche eine Vielzahl an Öffnungen 03 aufweist. Die Maske 02 überdeckt den gesamten Träger 01, wobei die Öffnungen 03 chemisch zu modifizierende Bereiche 04 auf dem Träger 01 definieren. Die Maske 02 wird gleichmäßig mit einer versprühbaren Substanz 06 besprüht, wobei die versprühbare Substanz 06 durch die Öffnungen 03 der Maske 02 hindurch gelangt und auf den chemisch zu modifizierenden Bereichen 04 des Trägers 01 aufgetragen wird. Der Vorgang des Versprühens ist durch eine Sprühflasche 07 symbolisiert, wobei der Fachmann eine geeignete Methode zum Versprühen der versprühbaren Substanz 06 auswählen kann. Die versprühbare Substanz 06 enthält einen Stoff zur chemischen Modifikation des verwendeten Polymers des Trägers 01, sodass es in den chemisch zu modifizierenden Bereichen 04 des Trägers 01 zur chemischen Modifikation kommt. Im Ergebnis liegen chemisch modifizierte Bereiche 08 auf dem Träger 01 vor.
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In einem weiteren Schritt werden bioaktive Moleküle auf den Träger 01 aufgebracht, damit diese bioaktiven Moleküle eine chemische Verbindung mit dem chemisch modifizierten Polymer in den chemisch modifizierten Bereichen 08 des Trägers 01 eingehen. Die bioaktiven Moleküle können beispielsweise in Form einer Lösung 09 vorliegen, in welche der Träger 01 mit den chemisch modifizierten Bereichen 08 eingetaucht wird. Dieser Vorgang ist durch ein mit der Lösung 09 gefülltes Behältnis 11 symbolisiert. Der Fachmann kann eine geeignete Methode zum Aufbringen der bioaktiven Moleküle auswählen. Im Ergebnis liegt der Träger 01 mit Bereichen 12 vor, die chemisch modifiziert und mit den bioaktiven Molekülen versehenen sind. Die chemisch modifizierten und mit den bioaktiven Molekülen versehenen Bereiche 12 eignen sich zur Ansiedlung biologischer Zellen.
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2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren in einer Prinzipdarstellung. Im Gegensatz zur 1 ist lediglich der Schritt der chemischen Modifikation der chemisch zu modifizierenden Bereiche 04 des Trägers 01 dargestellt. Wie auch bei der in der 1 gezeigten Ausführungsform wird die Maske 02 vor dem Träger 01 angeordnet. Der Maske 02 wird durch eine bewegliche Haltevorrichtung 16 gehalten, sodass die Maske 02 in alle drei Raumrichtungen bewegt werden kann. Der Träger 01 und die Maske 02 befinden sich innerhalb einer Sprühvorrichtung 17, welche ebenfalls in alle drei Raumrichtungen bewegt werden kann. Die Sprühvorrichtung 17 umfasst eine Sprühdüse 18, mit welcher die versprühbare Substanz 06 versprüht wird. Zwischen der Maske 02 und der Sprühdüse 18 ist eine erste Elektrode 19 angeordnet, durch welche die versprühbare Substanz 06 hindurchgesprüht wird. Eine zweite Elektrode 21 ist unmittelbar hinter dem Träger 01 angeordnet. Die erste Elektrode 19 und die zweite Elektrode 21 sind fest mit der Sprühvorrichtung 17 verbunden, sodass sie gemeinsam mit der Sprühvorrichtung 17 in alle drei Raumrichtungen bewegt werden. Während des Versprühens der versprühbaren Substanz 06 wird eine Spannung an die erste Elektrode 19 und an die zweite Elektrode 21 angelegt, sodass es zur Elektrodeposition der versprühbaren Substanz 06 kommt. Folglich wird die versprühbare Substanz 06 nur an demjenigen Ort auf den Träger 01 aufgetragen, welcher sich unmittelbar vor der zweiten Elektrode 21 befindet. Folglich kann die versprühbare Substanz 06 auch auf Bereiche des Trägers 01 aufgetragen werden, welche kleiner als die Öffnungen 03 innerhalb der Maske 02 sind. Nachdem ein Ort auf dem Träger 01 mit der versprühbaren Substanz 06 besprüht wurde, ist die Sprühvorrichtung 17 zu bewegen, um die zweite Elektrode 21 hinter einen anderen Ort auf dem Träger 01 zu bewegen. Auch kann die bewegliche Haltevorrichtung 16 bewegt werden, um die Maske 02 neu gegenüber dem Träger 01 zu positionieren. Anschließend ist erneut die versprühbare Substanz 06 zu versprühen, damit diese auf den nunmehr ausgewählten Ort auf dem Träger 01 aufgetragen wird. Da die Sprühvorrichtung 17 und die bewegliche Haltevorrichtung 16 in alle drei Raumrichtungen bewegt werden können, sind diese auch zum Besprühen von Trägern geeignet, welche nicht eben sind, sondern bereits Ausformungen aufweisen. Es können Orte innerhalb der sich räumlich erstreckenden Ausformungen des Trägers 01 gezielt mit der versprühbaren Substanz 06 besprüht werden. Im Ergebnis liegt wiederum der Träger 01 mit chemisch modifizierten Bereichen 08 vor, wobei im Vergleich zu der in 1 gezeigten Ausführungsform die chemisch modifizierten Bereiche 08 auch deutlich kleinere Abmessungen aufweisen können.
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3 zeigt eine Abwandlung der in 2 gezeigten Ausführungsform. Die Abwandlung besteht insbesondere in der Verwendung des Trägers 01, welcher bereits Ausformungen 23 und Öffnungen 24 aufweist. Da die bewegliche Haltevorrichtung 16 und die Sprühvorrichtung 17 in alle drei Raumrichtungen bewegt werden können, können Bereiche innerhalb der Ausformungen 23 des Trägers 01 gezielt mit der versprühbaren Substanz 06 besprüht und dadurch chemisch modifiziert werden.
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Eine weitere Abwandlung zu der in 2 gezeigten Ausführungsform besteht darin, dass weitere Träger 26 (gezeigt in 4) in chemisch zu modifizierenden Bereichen chemisch modifiziert werden. Dies erfolgt in gleicher Weise wie bei dem Träger 01. Die weiteren Träger 26 werden einzeln nacheinander mithilfe der Sprühvorrichtung 17 mit der versprühbaren Substanz 06 besprüht.
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4 zeigt weitere Schritte der in 3 gezeigten Ausführungsform. In einem ersten Schritt liegt der Träger 01 in Form einer ebenen Folie 28 vor. In einem zweiten Schritt werden die Ausformungen 23 und die Öffnungen 24 in den Träger 01 eingebracht, beispielsweise durch eine Thermoverformung. Anschließend erfolgt die in 3 gezeigte chemische Modifikation der chemisch zu modifizierenden Bereiche 04, sodass im Ergebnis der Träger 01 mit den chemisch modifizierten Bereichen 08 innerhalb der Ausformungen 23 vorliegt. Ergänzend zu der in 3 gezeigten chemischen Modifikation wurden auf die chemisch modifizierten Bereiche 08 bioaktive Moleküle 31 (gezeigt in 5) aufgebracht, woraufhin biologische Zellen (nicht gezeigt) auf den chemisch modifizierten und mit bioaktiven Molekülen 31 versehenen Bereichen 12 angesiedelt wurden. Dies wurde in gleicher Weise wie für den Träger 01 auch für die weiteren Träger 26 vorgenommen. Im Ergebnis liegen der Träger 01 und die weiteren Träger 26 mit darauf angesiedelten biologischen Zellen vor. In einem weiteren Schritt werden der Träger 01 und die weiteren Träger 26 übereinander gestapelt und miteinander verbunden. Die Öffnungen 24 in dem Träger 01 und in den weiteren Trägern 26 bilden nach dem Stapeln Kanäle aus, durch welche Flüssigkeiten zu und von den biologischen Zellen fließen können. Die Ausformungen 23 und die Öffnungen 24 bilden nach dem Stapeln des Trägers 01 und der weiteren Träger 26 eine räumliche Struktur aus, welche bevorzugt der extrazellulären Matrix eines biologischen Gewebes nachgebildet ist. Bei dem nachgebildeten Gewebe kann es sich beispielsweise um das Gewebe einer Leber handeln, sodass Leberzellen als biologische Zellen innerhalb der Struktur angesiedelt werden können.
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5 verdeutlicht das Prinzip einer chemischen Modifikation gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren. Bei dieser Ausführungsform dienen aliphatische Diamine als Stoff zur chemischen Modifikation des Polymers Polycarbonat PC. Der Träger 01 (gezeigt in 1) aus Polycarbonat wird mit der versprühbaren Substanz 06 (gezeigt in 1) besprüht, welche die aliphatischen Diamine enthält. Die aliphatischen Diamine reagieren mit dem Polycarbonat an dessen Oberfläche, sodass diese an die Oberfläche gebunden werden. Im Ergebnis liegt eine Amino-funktionalisierte Polycarbonatoberfläche vor. In einem nächsten Schritt werden bioaktive Moleküle 31 auf die Polycarbonatoberfläche gebracht, welche eine Bindung mit den bereits an die Polycarbonatoberfläche gebundenen Diaminen eingehen, sodass die bioaktiven Moleküle 31 mittelbar an die Polycarbonatoberfläche gebunden sind. Im Ergebnis befinden sich in den chemisch modifizierten Bereichen 08 des Trägers 01 die bioaktiven Moleküle 31, sodass dort biologische Zellen angesiedelt werden können, welche über die bioaktiven Moleküle 31 an das Polycarbonat gebunden werden. In einem weiteren Schritt werden Blockiermoleküle 32 auf den Träger 01 aufgebracht, welche jedoch außerhalb der chemisch modifizierten Bereiche 08 an der Polycarbonatoberfläche gebunden werden, sodass dort keine biologischen Zellen angesiedelt werden können.
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6 zeigt das Prinzip einer chemischen Modifikation gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren. In Abwandlung zu der in 5 gezeigten chemischen Modifikation werden zunächst die Diamine an die bioaktiven Moleküle 31 gebunden, woraufhin die Diamine eine Bindung mit der Polycarbonatoberfläche eingehen.
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7 verdeutlicht das Prinzip der chemischen Modifikation von Polycarbonat. Beispielhaft ist die Struktur der Biomoleküle 31 dargestellt. Primäre Amine fungieren als Nukleophil Nu. Diese Nukleophile ermöglichen die Anbindung an die Polycarbonatoberfläche des Trägers 01.
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8 zeigt das Prinzip der Anbindung der bioaktiven Moleküle 31 an das Polycarbonat mithilfe der Klick-Chemie. Diese Reaktion kann ohne einen Kupferkatalysator ablaufen, sodass dessen toxische Wirkungen vermieden sind.
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9 zeigt die Verwendung von Glycin-artigen Molekülen 34 auf Polycarbonat zur Abstandshaltung. Die Glycin-artigen Moleküle 34 werden an ein adhäsionsförderndes Peptid auf der Oberfläche des Trägers 01 angefügt. Es können Glycin-artige Moleküle 34 mit einer unterschiedlichen Anzahl von Aminosäureresten verwendet werden, sodass die Glycin-artigen Moleküle 34 unterschiedlich große Abstände zu den anzusiedelnden biologischen Zellen gegenüber dem Träger 01 realisieren. Glycin-artige Moleküle mit einer großen Anzahl an Aminosäureresten, beispielsweise mit einer Anzahl von neun Aminosäureresten, fungieren als große Abstandshalter und verringern die Anbindung biologischer Zellen an den Träger 01.
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10 zeigt die Verwendung von Glycin-artigen Molekülen 34 mit unterschiedlichen Oberflächendichten auf dem Träger 01. Die unterschiedlichen Oberflächendichten führen zu unterschiedlichen Beweglichkeiten der angesiedelten biologischen Zellen auf dem Träger 01.
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Bezugszeichenliste
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- 01
- Träger
- 02
- Maske
- 03
- Öffnungen in der Maske
- 04
- chemisch zu modifizierende Bereiche
- 05
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- 06
- versprühbare Substanz
- 07
- Sprühflasche
- 08
- chemisch modifizierte Bereiche
- 09
- Lösung
- 10
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- 11
- Behältnis
- 12
- mit bioaktiven Molekülen versehene Bereiche
- 13
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- 14
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- 15
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- 16
- bewegliche Haltevorrichtung
- 17
- Sprühvorrichtung
- 18
- Sprühdüse
- 19
- erste Elektrode
- 20
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- 21
- zweite Elektrode
- 22
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- 23
- Ausformungen
- 24
- Öffnungen im Träger
- 25
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- 26
- weitere Träger
- 27
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- 28
- Folie
- 29
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- 30
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- 31
- bioaktive Moleküle
- 32
- Blockiermoleküle
- 33
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- 34
- Glycin-artige Moleküle
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102004062573 A1 [0002]
- DE 69705841 T2 [0003]
- DE 60220671 T2 [0004]
- DE 102009025007 A1 [0005]
- DE 102009044113 A1 [0006]
- DE 102005008434 A1 [0009]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Anderson, D. G. et al.: „Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells“ in Nature Materials, 9 (2010) [0007]
- Derda, R. et al.: „High-Throughput Discovery of Synthetic Surfaces That Support Proliferation of Pluripotent Cells“ in Journal of the American Chemical Society, 132 (2010), 1289–95 [0008]
- Gosalia, D. N. und Diamond, S. L.: “Printing chemical libraries on microarrays for fluid phase nanoliter reactions" in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100 (2003), 8721–26 [0010]
- Anderson, D. G. et al.: „Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells“ in Nature Biotechnology, 22 (2004), 863–66 [0011]
