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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erstellung eines
Teststreifens zur Durchführung von Analysen mittels Dünnschichtchromatographie,
wobei der Teststreifen mindestens zwei Separationsstrecken für
ein zu analysierendes Fluid aufweist, wobei die Separationsstrecken
von einem mikroporösen Material gebildet werden, das strukturiert auf
einem Träger aufgebracht ist.
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Für
derartige Analysen sind kommerziell erhältliche Einweg-Teststreifen
bekannt, die als fluidisches Laufmedium ein flächiges Substrat
aus porösem Zellulosenitrat aufweisen. Die bekannten „Vor-Ort"
Analyseverfahren haben jedoch den Nachteil, dass jeweils nur einzelne
Substanzen nachgewiesen werden können. Da sich diese Art
der Dünnschichtchromatographie als einfaches und effektives Verfahren
in der biomedizinischen Diagnostik etabliert hat, ist eine Parallelisierung
und die damit verbundene gleichzeitige Detektion mehrerer Analyte aus
Serum, Plasma oder Vollblut wünschenswert. Dazu ist jedoch
ein fluidisches Netzwerks nötig, das mehrere unabhängige
Analyse- oder Separationsstrecken aufweist. Bedauerlicherweise lassen
sich jedoch die für diese Anwendungen etablierten Materialien,
wie insbesondere das oben genannte Zellulosenitrat, mit den „klassischen"
Techniken nur begrenzt strukturieren, um derart parallele oder auch
in mehreren Ebenen angeordnete Separationsstrecken zu erzeugen.
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Diese
porösen Trägermaterialien haben eine fest eingestellte
Porengröße und können ausschließlich
großflächig auf einem ebenen Substrat aufgebracht
werden. Es ist nicht möglich, sie räumlich aufgelöst
auf einem Substrat aufzubringen, ohne dass der poröse Charakter
der zu erzielenden Membranschicht verloren geht. Eine bekannte Möglichkeit
der Strukturierung ist die aus der
WO 2004/086042 A1 bekannte
Laserablation, mit der in einem Schreibvorgang gezielt Bereiche
eines Zellulosenitrat-Substrates zerstört und damit fluidisch
abgetrennte Bereiche erstellt werden. Dieses Verfahren ist jedoch
nur für die Erstellung kleiner Serien tauglich. Eine Massenproduktion
von Teststreifen ist nicht möglich.
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Aufgabe
der Erfindung ist es somit, einfach durchzuführende und
für die Massenfertigung geeignete Verfahren zur Erstellung
solcher Teststreifen vorzuschlagen, mit denen sich flächige
poröse Membranstrukturen mit den gewünschten Strukturen
erstellen lassen, so dass dadurch Separationsstrecken realisiert
werden können.
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Diese
Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und das Verfahren
nach Anspruch 7 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen
sind in den jeweiligen Unteransprüchen genannt.
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Der
wesentliche Kerngedanke des ersten Verfahrens ist die gezielte Aufbringung
einer hydrophoben Substanz auf die flächig ausgedehnte
und auf eine stabile Substratschicht aufgebrachte Dünnschicht
aus mikroporösem Material. Die flächige Dünnschicht
aus mikroporösem Material wird dadurch in ausgesuchten
Bereichen gezielt „verstopft", so dass die verbleibenden
freien Bereiche die Separationsstrecken ausbilden können.
Die behandelten Bereiche werden dann undurchlässig für
die zur Analyse wichtigen Flüssigkeiten.
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Dabei
besitzt die Dünnschicht wichtige biochemische Eigenschaften,
wie die Porösität, die Eignung biochemische Reagenzien
aufzunehmen sowie die Fähigkeit, diese Reagenzien an sich
chemisch zu binden. Als Dünnschicht eignet sich beispielseise
ein Flies aus Glasfasern, Zelluloseazetat oder insbesondere Zellulosenitrat,
wobei als „Dünnschicht" alles bezeichnet werden
soll, was eine Stärke von weniger als 500 Mikrometer und
insbesondere von etwas 100 Mikrometern aufweist. Durch die gezielte
Aufbringung der hydrophoben Substanz wird die Dünnschicht
strukturiert. Dabei zeichnet sich die hydrophobe dadurch aus, dass
sie beim Aufbringen flüssig ist und somit in die Poren
der Dünnschicht eindringen kann. Nach Eindringen in die
Poren, respektive dem Durchdringen der porösen Schicht
erstarrt die Substanz.
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Die
Substanz wird vorteilhafterweise je nach der Art der Aufbringung
ausgewählt. So können beispielsweise zum einen
relativ dünnflüssige Lacke oder etwas viskosere
Wachse, die im erwärmten Zustand zu verarbeiten sind, verwendet
werden. Für die Verarbeitung der Lacke bietet sich die
Technik des Siebdruckes an, bei der eine Schablone, das Sieb, auf
die Dünnschicht aufgelegt und dann der Lack auf die Schablone
aufgebracht wird. Der Lack fließt dann durch die Öffnungen
der Schablone in die Poren und verstopft diese nach dem Trocknen
respektive nach dem Aushärten. Ein wichtiger Gesichtspunkt
bei der Siebdrucktechnik ist, dass der Lackübertrag in
der Menge über weite Bereiche angepasst werden kann. Die
mittels Siebdruck behandelten Bereiche werden so hydrophobisiert,
dass sich voneinander fluidisch getrennte Analysestrecken ergeben.
Die Siebdrucktechnik eignet sich dabei insbesondere für
Kleinserien.
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In
einer anderen Ausführungsform wird erwärmtes flüssiges
Wachs mit einer Hochdrucktechnik, insbesondere mit einem Stempelverfahren,
auf die Dünnschicht aufgebracht, wobei das Wachs beim Abkühlen
erstarrt. Dafür wird zunächst der Druckstock,
respektive der Stempel, mit dem Wachs benetzt und dann auf die Dünnschicht
aufgedrückt. Wie der Lack, läuft in diesem Fall
das Wachs gezielt in die Poren der insbesondere aus Zellulosenitrat
bestehenden Dünnschicht und verstopft diese nach dem Abkühlen.
Dieses Verfahren lässt sich besonders gut für
eine massenproduktionstaugliche Strukturierung großflächiger,
poröser Substrate einsetzen.
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Sowohl
im Falle des Lackes, als auch im Falle des Wachses ist es vorteilhaft,
wenn die Schritte der Aufbringung der hydrophoben Substanz mehrfach
wiederholt werden. Dadurch kann ein vollständiges Verschließen
der porösen Dünnschicht garantiert werden.
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In
einer besonderen Ausführungsform kann die hydrophobe Substanz
mit einem Schreibverfahren, ähnlich einem Tintenstrahldrucker,
das die flüssige Substanz über eine Düse
aufspritzt, auf die Dünnschicht aufgebracht werden. Auf
diese Art ist es möglich, bei der Strukturierung besonders
differenzierte Geometrien zu erzeugen.
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Wie
schon angedeutet, lassen sich solche Strukturen aus porösem
Zellulosenitrat nicht dadurch herstellen, dass Zellulosenitrat aufgelöst
und in anderer Geometrie wieder angeordnet wird. Schließlich verliert
Zellulosenitrat mit dem Auflösen seine Porosität.
Dennoch ist Zellulosenitrat wegen seiner oben beschriebenen biochemischen
Eigenschaften eine bevorzugte Substanz für die fraglichen
Teststreifen. Das nachfolgend beschriebene Verfahren behebt dieses
Problem. Es ermöglicht es, poröse Strukturen insbesondere
unter Verwendung von Zellulosenitrat herzustellen, die für
die fraglichen Analysezwecke eingesetzt werden können.
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Dazu
wird erfindungsgemäß zunächst eine Materialzusammensetzung
erzeugt, die Mikropartikel einer Größenordnung
zwischen 5 Mikrometer und 250 Mikrometer enthält. Diese
Mikropartikel, die vorteilhafterweise Glaspartikel sind, werden
mit einem flüssigen Verbundmaterial benetzt oder in flüssiges Verbundmaterial
gegeben, so dass sich eine Suspension bildet. Die benetzten Mikropartikel
respektive die Suspension werden auf einen Träger beispielsweise
aus Plastik oder Glas aufgebracht. Nach dem Aufbringen erstarrt
die Materialzusammensetzung durch Trocknen oder Aushärten,
so dass sich eine poröse Struktur aus zusammengehaltenen
Mikropartikeln ergibt, deren Porosität von der Kugelpackung
bestimmt wird. Die Oberflächen der Mikropartikel sind von
dem nach dem Trocknen oder Aushärten verbleibenden Verbundmaterial
bedeckt, wobei eine wichtige Eigenschaft des Verbundmaterials neben
der klebenden Wirkung auch die biologische Wirksamkeit ist. Das
Verbundmaterials kann auch mit Hilfsstoffen (Reagenzien) versehen
sein, die für die Analyse wichtig sind. Ein besonders vorteilhaftes flüssiges
Verbundmaterial bildet in organischem Lösungsmittel gelöstes
Zellulosenitrat.
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Auf
diese Weise lassen sich poröse Strukturen herstellen, die
für die genannten analytischen Zwecke taugen. Mit der Materialzusammensetzung lassen
sich beispielsweise mit einem Schreibverfahren, das die Materialzusammensetzung über
eine Düse aufspritzt, auf der Oberfläche eines
glatten Trägers Laufstrecken ausbilden. Diese Vorgehensweise bietet
eine große Flexibilität bezüglich der
Strukturierung, ist jedoch für die Massenfertigung nur
bedingt tauglich.
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Besonders
vorteilhaft ist es jedoch, wenn die Materialzusammensetzung in rinnenartige
Strukturen eingefüllt wird, die sich in der Oberfläche
des Trägers befinden, respektive vorher in diese eingebracht
wurden. Insbesondere können die Rinnen in die Oberfläche
beispielsweise mit einem Stempel eingeprägt werden. Um
eine definierte Füllhöhe und damit eine definierte
Stärke der Separationsstrecken zu erhalten, ist es vorteilhaft,
wenn die den Rand der rinnenartige Strukturen überragende
Materialzusammensetzung nach dem Befüllen mittels eines über
die Oberfläche des Trägers gezogenen Rakels oder
einem Wischblatt abgezogen wird.
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Bei
diesem zweiten Verfahren spielt demnach folgender Grundgedanke eine
entscheidende Rolle: Als Membranmaterial wird ein Verbund aus Mikro-
oder Nanopartikeln und in Lösung befindlichem Zellulosenitrat
verwendet. Dieses Verbundmaterial kann auf einem ebenen oder bereits
strukturierten Substrat aufgebracht werden und bildet die poröse
Membranstruktur. Über die Größe der Mikropartikel
wird die Porengröße der Membran definiert. Mit dem
gelösten Zellulosenitrat beschichtete Mikropartikel werden
eingesetzt, um biochemische Oberflächeneigenschaften der
Mikropartikel zur Verfügung zu stellen, die zu den klassischen
Teststreifensystemen auf Zellulosenitratbasis vergleichbar sind.
Dabei kann die Lösung aus Mikropartikeln und Zellulosenitrat,
wie beschrieben, durch ein dispensierendes (schreibendes) Verfahren
auf einem ebenen Substrat für „Lab-on-a-chip"-Anwendungen
aufgebracht werden. Es ist auch ein ganzflächiges Abscheiden
auf einem bereits mikrostrukturierten Substrat und anschließendem
Rakeln (Abziehen) des überschüssigen Materials
möglich. Zudem kann die Aufbringung durch ein dispensierendes
Verfahren auf einem bereits mikrostrukturierten Substrat geschehen,
wobei sich dann Fluidikkanäle, zur Analyse wichtige Filter- und
Versorgungspads in mehreren Ebenen erzielen lassen. Dabei ist der
Herstellungsprozess so flexibel, dass mit einer Technik alle Fluidikkomponenten
gefertigt werden können.
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Mit
den beschriebenen Verfahren stehen einfache und für die
Massenproduktion taugliche Fertigungstechniken für biochemische
Sensorkarten zur Verfügung, die sich gegenüber
den bekannten Systemen insbesondere dadurch auszeichnet, dass sich die
Strukturierung und die Probenvorbereitung in einem Arbeitsschritt
vereinen lassen. Als Resultat der vorgeschlagenen Vorgehensweisen
ergeben sich Substrate mit einem oder mehreren abgegrenzten Arealen,
die als Analysestrecken dienen. Dabei besteht jeweils die Möglichkeit,
in einem einzigen Arbeitsgang das poröse Material zu strukturieren
und auch den Prozessschritt der Probenvorbereitung durchzuführen.
Dabei kann die Probenvorbereitung dadurch erreicht werden, dass
im Druckvorgang die zur Analyse wichtigen Hilfsstoffe (Reagenzien)
auf das poröse Material aufgetragen werden. Damit ermöglicht
die Erfindung eine besonders kostengünstige Herstellung
von Einwegsensorkarten.
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Diese
Erfindung ermöglicht die Entwicklung handlicher und preiswerter
Analysegeräte beispielsweise zur schnellen umfassenden
Blutdiagnose vor Ort, wobei auch mehrere Analyten parallel analysiert werden
können. Die Parallelisierung der Analyseverfahren erweitert
den Einsatzbereich der Analysesysteme, beispielsweise für
die Schnelldiagnostik in der Notfallmedizin oder den breiten Einsatz
in der Allgemeinmedizin, da sich zeitintensive Laboruntersuchungen
bereits vor Ort durchführen lassen und zu einen direkten
Ergebnis führen. Parallelisierte Analysesysteme setzen
eine vollständige Integration der Prozessschritte wie Probenaufgabe,
Vorfiltration und Rezeptorbindung) auf einer kostengünstigen
Einwegsensorkarte voraus. Die Detektion, Messdatenverarbeitung und
-anzeige erfolgt dann in einem portablen Gerät zur mehrfachen
Verwendung.
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Die
Möglichkeit der Fertigung in mehreren Ebenen, also neben
Mikrofluidikstrukturen auch „Filterpads" zur Probenaufgabe
und Probenvorbereitung auf den Substraten aufzubringen, unterscheidet
sich deutlich von der Strukturierung vorgefertigter Zellulosenitratmembranen
ab.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand der 1 bis 4 näher
erklärt. Es zeigen:
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1 ein
Design einer mit Siebdruck erstellten Karte,
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2 eine
elektronenmikroskopische Aufnahme verfüllter Kanalstrukturen,
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3 eine
Prinzipskizze eines Fluidikkonzeptes und
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4 Querschnittsskizzen
verschiedener Ausführungsbeispiele.
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Als
massenproduktionstaugliches Verfahren kann 100 Mikrometer dickes
Zellulosenitrat auf einer PMMA-Trägerfolie mittels Siebdruck
mit hydrophobem Lack bedruckt werden, so dass sich separate Trennstrecken
ergaben. Das in 1 dargestellte Design in den
Maßen von 20 mm × 80 mm enthält Linien
in der Breite von 0,5 mm und wurde auf ein Sieb mit 90 Fäden/mm übertragen.
Als Druckfarbe kann polyscreen (Sericol, Bottrop, Deutschland) PS001 mit
dem Verzögerer ZE 574 und dem Katalysator PS 386 im Verhältnis
25:5:3 (v/v/v) verwendet werden. Um den Farbübertrag in
das poröse Zellulosenitrat zu erhöhen, kann der
Druckvorgang mehrmals, insbesondere vier mal, durchgeführt
werden. Daraus resultiert eine hydrophobe Beschichtung des porösen Materials,
ohne das das Zellulosenitrat komplett verfüllt wird. Lauftests
zeigen, dass sich damit separate Trennstrecken, die fluidisch isoliert
sind, herstellen lassen.
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Bei
dem Design nach 1 ist ein zentraler Aufgabebereich 1 zu
sehen, von dem jeweils sechs Separationsstrecken 2 in jede
Richtung abgehen. Am Ende der Separationsstrecken 2 sind
jeweils Detektionszonen 3, wobei alle Separationsstrecken
in einem gemeinsamen Saugpad 4 enden. Die minimale Strukturbreite
von in diesem Fall 375 Mikrometer wird durch die Höhe des
Siebes und damit durch die Fadenstärke limitiert. Um in
einem Druckvorgang eine möglichst großen Menge
an Zweikomponentenlack in das poröse Material zu übertragen,
eignen sich Siebe mit größerer Fadenstärke
eher und verringern dabei prinzipbedingt die Strukturauflösung.
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Derartige
Strukturen lassen sich auch über Stempeltechniken replizieren.
Zunächst wurde Parafinwachs über seinen Schmelzpunkt
erhitzt. Dabei wurde zuerst ein Stempel aus einer Standard-Platine mit
35 Mikrometer Kupferauflage durch Mikrofräsen gefertigt.
Alternativ lassen sich Stempel, mit denen die gewünschte
Struktur auf das poröse Material repliziert wird, aus PDMS
mit softlithografischen Techniken fertigen. Danach wurde das Parafinwachs (L4132;
TM = 56°C, Agar Scientific, Cambridge,
GB) ganzflächig über den auf 70°C erhitzten
Stempel gegeben, bis das Wachs den Stempel gleichmäßig
bedeckte. Dann wurde der Stempel abgekühlt und auf das
vorgewärmte Zellulosenitrat aufgewalzt.
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Bei
dem anderen Verfahren zur Herstellung paralleler Strukturen wird
eine zuvor heißgeprägte Struktur anschließend
mit einer organischen Lösung verfüllt, die einerseits
zur Vergrößerung der Oberfläche und zur
Erzeugung der Porosität Glaskügelchen (SiO2-Beads) und zur Beschichtung der Beads Zellulosenitrat
enthält.
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Ausgangsmaterial
kann dabei ein PMMA-Substrat sein, das mit einem mikrogefrästem Messingstempel
heißgeprägt wird und regelmäßige, offene
Kanalstrukturen von 200 Mikrometer × 200 Mikrometer enthält.
Anschließend werden 0,2 g Zellulosenitrat (AE 98 Schleicher &; Schüll,
Dassel, Deutschland) in 2 ml Aceton und 8 ml Ethanol gelöst. Dieser
Lösung werden 1,5 g SiO2-Beads
(Durchmesser 5–50 Mikrometer, Duke Scientific, Palo Alto,
USA) zugegeben und der Verbund für 15 min im Magnetrührer
bei 40°C durchmischt, bis das Aceton vollständig
verdampft ist. Dieser Verbund aus gelöstem Zellulosenitrat
und SiO2-Beads in Ethanol wird danach auf
das PMMA-Substrat gegeben und mit einem Rakel abgezogen. Damit sind
verfüllte Kanalstrukturen als Trennstrecken gefertigt.
Die Partikel sind durch das Zellulosenitrat oberflächenbeschichtet,
so dass sich ihre (bio-)chemischen Eigenschaften von denen kommerziell
erhältlicher Zellulosenitratschichten nicht unterscheiden.
In 2 ist eine Rasterelektronenaufnahme verfüllter
Kanalstrukturen im Querschnitt gezeigt.
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In 3 ist
eine Prinzipskizze des Fluidikkonzeptes dargestellt. Auf einer Trägerkarte 5 befindet
sich eine 100 Mikrometer starke chromatografische Schicht. Diese
weist hydrophobe Bereiche 6 und hydrophile Fluidkanäle 7 auf.
Die Karte enthält zusätzlich Zonen zur Konditionierung,
Aufbereitung und Detektion des Analyten. Dabei ist eine zentrale Aufgabestelle 8 für
das zu analysierende Blut, Plasma oder Serum vorgesehen, von der
die Fluidkanäle 7 abgehen. Diese haben eine Abfangzone 9,
in die für die spezifische Analyse biochemische Rezeptoren
eingebracht werden, sowie eine Detektionszone 10, in der
das Analyt über die externen Sensoren detektiert werden
können. An jedem Rand der Trägerkarte sind Saugpads 11 vorgesehen,
die das überschüssige Laufmedium aufnehmen können.
Die Komponenten der Sensorik und Auswertung befinden sich außerhalb
der Karte.
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In 4 sind
Querschnittsskizzen für verschiedene Anwendungsbeispiele:
In 4(a) ist im Querschnitt ein strukturiertes
Trägermaterial 12 dargestellt, auf dem ganzflächig
das (flüssige) Verbundmaterial 13 aufgetragen
wurde. Anschließend wurde die Oberfläche abgezogen
und so das überschüssige Material entfernt. Nach
Trocknung verbleibt in den Kanalvertiefungen die poröse
Membranstruktur. Der Vorteil dieser Anwendung besteht darin, dass
sich die Kanalabmessungen unabhängig vom Materialauftrag definieren
lassen und durch den Heißprägeschritt vorgegeben
sind. Die minimalen Kanalabmessungen von typischerweise 200 Mikrometer
sind damit auch geringer als im Anwendungsbeispiel nach 4(b), bei dem die Kanalstrukturen aus
dem Verbundmaterial auf einem ebenen Substratträger durch
ein schreibendes (dispensierendes) Verfahren direkt aufgebracht
wurden.
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Zusätzlich
kann lokal aufgebrachtes poröses Material auf schon zuvor
erzeugten porösen Kanalstrukturen aufgebracht werden (4c).
Damit lassen sich in einem Technologieschritt gleichzeitig Filterpads
zur Probenaufgabe und Vorbereitung schaffen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 2004/086042
A1 [0003]