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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Lipidmembranen
auf einem Substrat nach den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie ein Substrat
mit Lipidmembranen nach den Merkmalen des Anspruchs 8. Weiterhin
betrifft die Erfindung eine Anordnung zur Erzeugung von Lipidmembranen
auf einem Substrat.
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Die
Lipidmembran wird durch Lipiddoppelschichten gebildet, die eine
dichte und gleichmäßige Anordnung
der Lipidmoleküle über eine
größere Fläche aufweisen
und eine ähnliche
Struktur besitzen wie die Membranen von biologischen Zellen. Demgemäß wird eine
solche Lipiddoppelschicht im folgenden als Lipidmembran bezeichnet.
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Lipidmembranen
spielen in der Biosensorik und -aktorik als auch in der Mikrosystemtechnik
und Biotechnologie eine wichtige Rolle. Ziel der technischen Anwendungen
ist die Herstellung von Lipidschichten, die ähnliche Eigenschaften wie natürliche Lipidmembranen
aufweisen und in der Lage sind, Trennfunktionen zu übernehmen
als auch Proteine in sich auf zunehmen. Die Funktion der Lipidmembran wird
wesentlich von einer gleichmäßigen und
dichten Anordnung der Lipidmoleküle
bestimmt. Die Lipiddoppelschicht darf weder Risse noch andere Störungen aufweisen,
die die charakteristischen Eigenschaften der Membran stark stören. Zudem
dürfen die
Lipidmoleküle
nur in Form einer Doppelschicht angeordnet sein. Dickere Schichten
zeigen in der Regel aufliegende Lipidvesikel oder bestehen aus Lipidmultischichten.
Es gibt verschiedene Verfahren, mit denen Lipiddoppelschichten auf
technischen Oberflächen
hergestellt werden können.
Bei diesen Verfahren wird die Lipiddoppelschicht fest mit der Oberfläche verankert.
Nachteilig ist, dass in diese Lipiddoppelschicht Membranproteine
kaum eingelagert werden können
bzw. ihre Funktionalität
verlieren, da die Membranproteine eine freistehende Lipidmembran
erfordern.
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Eine
Lipidmembran lässt
sich zum Beispiel in den Poren spezieller Polymerfolien erzeugen.
Dazu wird die poröse
Polymerfolie von einer Seite mit Lipid eingestrichen und das Lipid
von der anderen Seite in die Poren und Durchbrüche der Polymerfolie eingesaugt.
Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht zur Herstellung von Lipidmembranen,
wenn die Polymerfolie nur von einer Seite frei zugänglich ist.
Weiterhin zeigt sich, das nur in wenigen Poren eine Lipidmembran
entsteht. Nachteil an diesem Verfahren ist, dass mehr Lipidmoleküle, als
für die
Ausbildung der Membran erforderlich, aufgetragen werden müssen, damit in
einem kleinen Teil der Poren eine Lipidmembran entsteht. Zudem lässt sich
dieses Verfahren nicht anwenden, wenn die Poren der Polymerfolie
eine stark unterschiedliche Größe aufweisen
oder die Polymerfolie Mikrostrukturen in Form von Mikrokanälen aufweist.
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In
der Literatur wurden bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung
von dünnen,
molekularen Schichten mit einem Stempel beschrieben. Diese Verfahren
werden als Microcontact Printing bezeichnet. In dem Journal Langmuir
Band 10 (1994) wird auf den Seiten 1498 bis 1506 das Verfahren zur
Herstellung von Self-Assembly-Schichten
aus Silanen beschrieben. In dem gleichen Journal wird im Band 14
(1998) auf den Seiten 741–744
die Herstellung von Proteinschichten mittels Microcontact Printing beschrieben.
In beiden Fällen
werden vor dem Stempelprozess die Moleküle aus einer Lösung aufgenommen
und auf eine Oberfläche übertragen.
Die Stempeloberfläche
ist eben und weist kein Reservoir auf. Nicht beschrieben ist ein
Verfahren, wie freistehende Schichten auf nicht glatten Oberflächen erzielt werden
können.
Ebensowenig eignet sich das Verfahren zur Erzielung ausgedehnter,
vollständig
geschlossener Lipidmembranen.
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Die
Schrift
US 2005/0048648
A1 beschreibt ein Verfahren wie Defekte in einer suspendierten
Lipidmembran, zum Beispiel auf Sensorarrays, regeneriert und stabilisiert
werden können.
Das Verfahren kann für
Proteinarrays angewendet werden und beruht im Wesentlich auf der
Wechselwirkung zwischen einer speziellen Pufferlösung mit dem Lipid. Es wird aber
kein Verfahren zum Auftragen der Lipidmembran durch einen Stempel
beschrieben.
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Die
Schrift
WO 96/10178
A1 beschreibt eine Methode wie Lipidschichten auf festen
Trägern
durch Fusion und Aufschmelzen von Mizellen oder Lipidvesikeln hergestellt werden
können.
Damit eine stabile und gleichmäßige Lipidschicht
entsteht, ist es empfehlenswert die Oberfläche des Trägers mit einer dünnen Schicht,
zum Beispiel einer Self-assembly-Schicht, zu überziehen. Das Verfahren garantiert hingegen
nicht, das über
eine größere Fläche eine
Lipidmembran entsteht.
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In
der Schrift
WO
2004/010074 A2 wird eine Anordnung beschrieben mit der
Arrays aus Lipidmembranen hergestellt werden können. Damit die Arrayanordnung
in einer Fläche
durch die Eigenbewegung der Lipidmoleküle nicht zerstört wird,
sind zwischen den Arrayfeldern Diffusionsbarrieren für die Lipidmoleküle eingebracht.
Dadurch können
Abschnitte der Lipiddoppelschicht nicht miteinander verschmelzen.
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Die
Herstellung einer festkörperunterstützten Lipidmembran
wird in der Schrift
DE
196 07 279 A1 beschrieben. Ferner beschreibt die Schrift
ein Verfahren zur Herstellung geeigneter Festkörper. Die Lipidmembran wird
durch spezielle Spacermoleküle, die
zum Beispiel aus Oligopeptiden bestehen, mit der Oberfläche des
Festkörpers
verbunden. Dadurch besitzt die Lipidschicht einen gewissen Abstand
von dem Festkörper,
so dass auch Proteine in die Lipidschicht integriert werden können.
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In
dem Journal Langmuir, Band 14 (1998) wird ein Verfahren beschrieben,
mit dem Lipidmembranen auf einer homogenen Oberfläche aufgetragen werden
können.
Die Lipidmoleküle
werden von einer besonderen Schicht gestützt. Das Einbringen einer solchen
Schicht muss vor dem Auftragen der Lipidmoleküle geschehen. Diese auch als „tethered
lipid membrane” (angebundene
Lipidmembran) bezeichnete Anordnung eignet sich nicht zur Überspannung von
Mikrostrukturen und zur Aufnahme von Membranproteinen, die freistehende
Lipidmembranen erfordern.
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Darüber hinaus
ist aus der
US
2006/0014013 A1 bekannt, dass bei der Erzeugung von Lipidmembranen
ein Stempel als Handhabungsmittel herangezogen wird.
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Gemäß der
US 2005/0244487 A1 wird
eine Lipiddoppelschichtmembran auf ein Substrat mit einer mikrostrukturierten
Oberfläche
abgeschieden, um beispielsweise einen Ionenkanal gegenüber einem
Reservoir positionieren zu können.
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Aus „Softlithographie,
Angewandte Chemie (1998), 110, 568–594, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim
ist bekannt, dass zur Erzeugung von Mikrostrukturen die großflächige Abscheidung
von selbstorganisierten organischen Molekülen mittels Stempelverfahren
auf ebene bzw. nichtebene Substratoberflächen durchgeführt wird.
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In
WO 01/26800 A1 wird
ein Verfahren beschrieben, mit dem selbstorganisierende und auf Oberflächen fest
angebundene dünne
Schichten hergestellt werden können.
Die Schicht wird mit einem Stempel aufgetragen, jedoch beruht das
Verfahren wesentlich auf einer festen, im chemischen Sinne sogar
kovalenten, Bindung zwischen der Schicht und dem Substrat. Das in
der Druckschrift beschriebene Verfahren eignet sich nicht für die Herstellung
von Lipidmembranen, die sowohl eine Fläche von mehreren Quadratmillimetern überdecken
als auch Poren und Reservoirs überspannen.
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In „Kommunikationsoberfläche Membran-Vorbild
für moderne
Nanoanalytik, Vakuum in Forschung und Praxis 15 (2003), Nr. 3, 146–152, Wiley-VCH
Verlag GmbH, Weinheim” wird
ein Verfahren zur Modifizierung der Oberfläche eines Stempels beschreiben,
um eine hydrophile Oberfläche
zu erhalten. Durch Einwirkung eines Plasmas wird die Oberfläche allerdings
chemisch verändert,
rauer und zugleich geringfügig
abgetragen. Diese Oberfläche
eignet sich nicht zur Erzeugung von Lipidmembranen, da die entstandene
Rauhigkeit zu Heterogenitäten der
Lipidschicht führt
und damit keine stabilen und überspannenden
Lipidmembranen möglich
sind.
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Die
Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, eine Lösung anzugeben, mit der eine
geschlossene Lipiddoppelschicht auf einer homogenen oder beliebig
mikrostrukturierten Oberfläche
großflächig aufgebracht
werden kann. Dabei soll die Lipiddoppelschicht die typischen Merkmale
einer Lipidmembran aufweisen und auch als freistehende Lipidmembran aufgespannt
werden können.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch ein Verfahren zur Erzeugung von Lipidmembranen auf
einem Substrat mit einer homogenen oder mikrostrukturierten Oberfläche mit
den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Varianten sind
Gegenstand von Unteransprüchen.
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Weiterhin
erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch ein Substrat mit Lipidmembran, dessen Oberfläche homogen
oder mikrostrukturiert ist, mit den im Anspruch 8 genannten Merkmalen
gelöst. Vorteilhafte
Ausgestaltungen des Substrates sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.
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Weiterhin
erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch eine Anordnung zur Erzeugung von Lipidmembranen auf
einem Substrat mit einer homogenen oder mikrostrukturierten Oberfläche mit
den im Anspruch 13 genannten Merkmalen gelöst.
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Verfahrensgemäß werden
zur Herstellung einer Lipidmembran Lipidmoleküle aus einer Lösung von
einem Handhabungsmittel aufgenommen und auf die Oberfläche eines
Substrates übertragen.
Dabei ist die Oberfläche
des Handhabungsmittels so beschaffen, dass die Lipidmoleküle aus einer
Lösung aufgenommen
und an der Oberfläche
haften bleiben und ebenfalls die Lipidmoleküle von der Oberfläche auf
eine Substratoberfläche übertragen
werden können.
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Vorteilhaft
weist die Oberfläche
des Handhabungsmittels eine kleine Vertiefung auf, die als Reservoir
für Lipidmoleküle dient.
Aus diesem Reservoir werden bei der Selbstorganisation der Lipidmembran Moleküle für den Ausgleich
von Oberflächenunebenheiten
oder für
den Übergang
an Mikrostrukturen der Substratoberfläche entnommen.
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Eine
weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens besteht in der gleichzeitigen
Einbringung eines feinen Netzwerkes oder Geflechtes in die Lipidmembran.
Ein solches feines Geflecht dient der Stabilisierung der Membran,
insbesondere bei der Überspannung
von größeren Mikrostrukturen.
Das feine Geflecht wird vor der Aufnahme der Lipidmoleküle auf die
Oberfläche
des Handhabungsmittels aufgetragen. Es ist aber auch möglich, das
feine Geflecht auf die Oberfläche
des Substrates vor Übertragung
der Lipidmoleküle
aufzutragen. Ein solches feines Geflecht besteht aus quervernetzten
Strängen
synthetischer Polymere oder aus Biopolymeren und übernimmt
die stabilisierende Funktion des natürlichen Zytoskeletts.
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Damit
die Oberfläche
des Stempels Lipidmoleküle
aus der Lösung
so ausgerichtet aufnehmen kann, und dass ein Übertragen der Lipidmoleküle von der
Stempeloberfläche
auf das Substrat in wässriger Lösung erfolgen
kann, muss sie einen hydrophilen Charakter aufweisen. Es gibt eine
Reihe von Materialien die solche Merkmale aufweisen. Dazu zählen beispielsweise
verschiedene Glasorten als auch Metalloxide oder Polymere mit einem
polaren Oberflächencharakter.
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Um
die selbstorganisierende Ausbildung der Lipidmembran zu ermöglichen,
werden die Lipidmoleküle
vorteilhaft ständig
von einer wässrigen
Pufferlösung
umgeben.
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Zur
Ausbildung der Lipidmembran auf der Substratoberfläche ist
es erforderlich, dass die Substratoberfläche eine höhere Affinität zu den
polaren Kopfgruppen des Lipids aufweist als die Stempeloberfläche. Ebenso
müssen
beide Oberflächen
glatte Kontaktstellen aufweisen, da nur dann die Ausbildung einer
Lipidmembran möglich
ist.
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Aufgrund
der elektrostatischen Anziehungskräfte der Lipidmoleküle innerhalb
der Lipidmembran können
Strukturmerkmale bis zu mehreren Mikrometern überspannt werden. Für größere freistehende
Lipidmembranen ist die Einbringung eines feinen Geflechts als mechanischer
Stabilisator erforderlich.
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Gemäß der Ausbildung
des Substrates lassen sich sowohl homogene Substratoberflächen als auch
mikrostrukturierte Oberflächen
mit einer Lipidmembran beschichten, wobei die Lipidmembran im Bereich
der Mikrostrukturen als freistehenden Lipidmembran ausgebildet ist.
Eine Struktur der Lipidmembran lässt
sich vorteilhaft auch dadurch erzielen, wenn in der Oberfläche des
Handhabungsmittels eine Struktur eingebracht wurde, wobei die hervorstehenden
Strukturmerkmale Oberflächeneigenschaften
aufweisen müssen,
die eine bevorzugte Aufnahme der Lipidmoleküle ermöglichen.
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Der
Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sich ein Substrat mit
einer von einer Lipidmembran bedeckten Oberfläche herstellen lässt, wobei
vorhandene Mikrostrukturen in der Substratoberfläche unter Bildung von Mikrovolumina überspannt
werden.
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Nachfolgend
wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In
den Zeichnungen wird dargestellt:
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1 eine
schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Anordnung.
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2 eine
schematische Darstellung eines lipidbeladenen Stempels vor dem Aufbringen
auf das Substrat
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3 eine
schematische Darstellung der selbstorganisierten Ausbildung der
Lipidmembran in der elektrophysiologischen Pufferlösung, die
gemäß der Erfindung
auf eine hydrophile Substratoberfläche aufgetragen wird.
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4 eine
schematische Darstellung einer vollständig ausgebildeten Lipidmembran,
die erfindungsgemäß auf einem
hydrophilen glatten Substrat aufgestempelt wurde.
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5 eine
schematische Darstellung einer Lipidmembran, die gemäß der Erfindung über eine mikrostrukturierte
Oberfläche
aufgetragen wurde.
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6 ein
Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäß gestalteten
mikrostrukturierten Oberfläche
des Stempels.
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7 eine
schematische Darstellung der hydrophilen Oberfläche des Stempels mit feinem
Geflecht, dass auf die Oberfläche
des Stempels aufgetragen wurde und zur Stabilisierung der Lipidmembran
beiträgt.
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8 eine
schematische Darstellung einer mit Fluoreszenzfarbstoff markierten
Lipidmembran und deren Anregung zur Aussendung von Fluoreszenzlicht.
Die Lipidmembran überspannt
eine poröse Substratoberfläche.
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9 ein
fluoreszenzmikroskopisches Bild einer Lipidmembran die gemäß der Erfindung
auf eine homogene Oberfläche
aufgetragen wurde.
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In
der 1 ist eine erfindungsgemäße Anordnung schematisch dargestellt,
in der als Handhabungsmittel ein Stempel dargestellt ist. Der Stempel, der
eine glatte und hydrophile Oberfläche mit abgerundeten Kanten
aufweist, wird gezeigt, bevor er flach in eine Lipidlösung eingetaucht
wird. Die Eintauchtiefe sollte nicht oberhalb der gerundeten Kanten
des Stempels liegen.
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2 zeigt,
wie nach wenigen Minuten die Lipidmoleküle an der Stempeloberfläche selbstorganisiert
haften. Die Lipidmoleküle
ordnen sich auf der Stempeloberfläche entsprechend ihrer hydrophilen Kopfgruppen
und bilden mehrere Lipidschichten aus. Der Stempel wird auf ein
Substrat übertragen.
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In
der 3 ist eine erfindungsgemäße Anordnung schematisch dargestellt,
wie die Selbstorganisation der Lipidmembran nach dem Absetzten des Stempels
auf dem Substrat stattfindet. Die Stempeloberfläche und das Substrat sind parallel
angeordnet. Der Stempel wird auf das Substrat aufgedrückt, wobei
die Lipidmoleküle
auf das Substrat übergehen. Die
Zugabe der Elektrolytlösung
zum Substrat/Lipid/Stempel-System führt infolge elektrostatischer Kräfte zwischen
den Lipidmolekülen
zur Ausbildung der Lipidmembran und gestattet den Stempel ohne Destruktion
der gebildeten Lipidmembran abzulösen. Unebenheiten auf der Substratoberfläche werden durch
Lipidmoleküle
aus dem Reservoir des Stempels ausgeglichen.
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Die 4 zeigt
eine Lipidmembran, die gemäß der Erfindung
auf einer nicht strukturierten Substratoberfläche aufgetragen wurde. Die
Lipidmembran zeigt keine Lochdefekte.
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Die 5 zeigt
eine Lipidmembran, die gemäß der Erfindung
auf einer mikrostrukturierten Substratoberfläche aufgetragen wurde. Die
Lipidmembran überspannt
die Mikrostrukturelemente des Substrates. Eine solche Anordnung
ist für
Mikrostrukturelemente bis etwa 5 μm
geeignet.
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Die 6 zeigt
eine erfindungsgemäße Gestaltung
der Oberfläche
des Stempels zur Erzielung einer Lipidmembran mit Mikrostruktur
auf homogenen Substraten. Die Lipidmoleküle sammeln sich an den hervorstehenden
Strukturelementen. Dies kann durch eine Modifikation der Stempeloberflächen erreicht
werden.
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In
der 7 ist eine erfindungsgemäße Gestaltung der Anordnung
mit einem feinen Geflecht, das auf der hydrophilen Stempeloberfläche aufgetragen
wurde, dargestellt. Das feine Geflecht kann aus synthetischen Polymerketten
oder Biopolymeren bestehen. Es übernimmt
in der gestempelten Lipidmembran die Funktion des Zytoskeletts der
Lipidmembran in natürlichen
Zellen und stabilisiert die Lipidmembran.
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Die 8 zeigt
die schematische Darstellung einer Lipidmembran, welche zusätzlich mit
Fluoreszenzfarbstoffmolekülen
markiert wurde und eine mikrostrukrurierte Substratoberfläche überspannt. Die
Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge regt die Farbstoffmoleküle in der
Lipidmembran zur Fluoreszenz an. Anhand der Fluoreszenzemission
lassen sich Aussagen zur vollständigen Übertragung
auf die Substratoberfläche,
Homogenität
der Lipidmembran, Defektstellenbildung und Fluidität von Molekülen innerhalb
der Lipidmembran erhalten.
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Die 9 zeigt
ein fluoreszenz-mikroskopisches Bild einer gemäß der Erfindung auf einem mikrostrukturierten
Substrat gestempelten Lipidmembran. Damit die Lipidmoleküle erkennbar
werden, wurden sie vor dem Stempelprozess mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markiert. Das einfallende Licht führt zur Fluoreszenz des Farbstoffs.
Das Fluoreszenzlicht wird mit einem Fluoreszenzmikroskop detektiert
und als Bild der Lipidmembran angezeigt. Sichtbar sind auch Mikrovolumina,
die von der Lipidmembran überspannt
werden.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Handhabungsmittel
(Stempel)
- 1'
- Bewegungsrichtung
des Stempels
- 2
- hydrophile
und glatte Oberfläche
- 3
- Reservoir
- 4
- abgerundete
Stempelkante
- 5
- Lipidmoleküle bzw.
Lipidmembran
- 6
- Substrat
- 7
- Elektrolytlösung
- 8
- Mikrostruktur
im Substrat
- 9
- Stempelstruktur
- 10
- Lipid
mit Mikrostruktur
- 11
- feines
Geflecht zur Verstärkung
der Lipidmembran
- 12
- Fluoreszenzmarker
- 13
- Anregungslicht
- 14
- emittiertes
Fluoreszenzlicht
