DE19607279A1 - Durch Festkörper unterstützte Membran-Biosensoren - Google Patents
Durch Festkörper unterstützte Membran-BiosensorenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue Membran-Biosensoren, die aus einem Festkörper als
Träger, einer Lipiddoppelschicht als Membran, welche über einen Spacer an den
Festkörper gebunden ist, und einem in die Lipiddoppelschicht eingelagerten Re
zeptor, der den Festkörper nicht berührt, bestehen. Die neuen Membran-
Biosensoren sind vor allem durch ihre speziellen Spacer, die ein Oligopeptid in
Helix- oder Faltblattstruktur enthalten, gekennzeichnet.
Membran-Biosensoren des oben bezeichneten prinzipiellen Aufbaus können u. a.
zwei Aufgaben erfüllen:
- - Liganden, die eine spezifische biologische Wechselwirkung mit dem einge bauten Rezeptor aufweisen, können als Analyten in Flüssigkeiten biologi schen Ursprungs detektiert werden, woraus medizintechnische Teststäbchen oder andere medizinische oder biologische Analysenmethoden entwickelt werden können; und
- - verschiedene Liganden in geeigneten Lösungsmitteln können auf ihre Eig nung zur Paarbildung (spezifische Wechselwirkung) mit einem vorgegebe nen Rezeptor überprüft werden, woraus beispielsweise die Entwicklung von chemisch-biologischen Bausteinen für neue Wirkstoffe auf dem Gebiet der Pharmazeutika und der Pflanzenschutzmittel erkannt und gezielt entwickelt werden können.
Rezeptoren können die genannten Wirkungen in biologischen Systemen nur entfal
ten, wenn sie sich innerhalb einer Zellmembran befinden. Solche Zellmembranen
bestehen im allgemeinen aus einer Lipiddoppelschicht. Beispielsweise kann die
Anbindung eines zum vorliegenden Rezeptor spezifischen Liganden eine Öffnung
des Ionenkanals dieses Rezeptors bewirken, so daß ein elektrisches Signal durch
die Lipiddoppelschicht in das Innere einer biologischen Zelle oder aus dem Inne
ren einer solchen biologischen Zelle heraus möglich ist. Künstliche Membran-
Biosensoren, die für die obengenannten analytischen und sonstigen Zwecke
einsetzbar sein sollen, müssen jedoch zur besseren Handhabbarkeit und Haltbarkeit
durch einen Festkörper unterstützt sein. Eine darauf angebrachte Lipiddoppel
schicht bedeutet sodann die Nachstellung der für die Einlagerung des Rezeptors
notwendigen Zellmembran. Für die Sicherstellung der Wirksamkeit des Rezeptors,
der in Zellen biologischen Ursprungs in das Zellinnere hineinreicht und dort nur
Kontakt mit der Zellflüssigkeit hat, ist es notwendig, einen Kontakt des Rezeptors
mit dem unterstützenden Festkörper zu vermeiden.
Zur Vermeidung der Berührung der unterstützenden Festkörper durch den Rezeptor
wurde daher die Lipiddoppelschicht auf ihrer dem Träger zugewandten Seite mit
einem Spacer aus Polyoxyethylen-(Polyoxyalkylen-)Gruppen versehen (EP
441 120-A; WO 93/21528; Langmuir 10 (1994), 197-219). Biosensoren der ge
nannten Art scheinen jedoch bei ihrer Herstellung und ihrem praktischen Gebrauch
schwierig zu sein, da die Polyoxyalkylen-Brückenglieder (Spacer) in Self-
Assembly-(SA-)Verfahren keine ausreichend stabilen Ordnungszustände ergaben,
wodurch Gebrauch und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse stark eingeschränkt
wurden.
Es wurde nunmehr gefunden, daß die genannten Nachteile überwunden werden
können, wenn Oligopeptid enthaltende Spacer-Gruppen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft durch Festkörper unterstützte Membran-Biosensoren, beste
hend aus einem Festkörper A als Träger, eine Lipiddoppelschicht B als Membran
mit zwischen A und B eingebauten Spacern C und einem in die Lipiddoppel
schicht eingelagerten Rezeptor D, wobei
- a) A auf seiner D zugewandten Oberfläche aus einem korrosionsfesten Mate rial mit einem Abgriff eines elektrischen Signals besteht,
- b) die untere Lipidmonoschicht von B zu 1-40% aller Lipidmoleküle aus Di- (C₈-C₃₀-acyl)-phosphatidyl-Verbindungen mit einer natürlich vorkom menden Kopfgruppe und zu 60-99% aus einem Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phospha tid, das jedoch an Stelle der Kopfgruppe den Spacer C trägt, besteht und dessen obere Lipidmonoschicht zu 100% aus Di-(C₈-C₃₀-acyl) phosphatidyl-Verbindungen mit einer natürlich vorkommenden Kopfgruppe besteht, wobei alle Acylgruppen einer Schicht im wesentlichen gleich lang sind, jedoch die Acylgruppen der unteren Lipidmonoschicht gleich oder verschieden lang wie die der oberen Lipidmonoschicht sind,
- c) C aus 1 Molekül Ethanolamin, das eine Esterbindung zur Phosphatgruppe von B ausbildet, einem Oligopeptid in Helix- oder Faltblattstruktur aus 4-20 C₂-C₁₀-α-Aminosäuren und einer Ankergruppe, die eine chemische oder physikochemische Bindung mit A eingeht, besteht, wobei alle C des Biosensors gleich sind, und
- d) D keinen Berührungskontakt mit A hat.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines durch Festkörper
unterstützten Membran-Biosensors, wie oben beschrieben, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man entweder
- (1) eine Lösung von 1 Teil mit einem Spacer versehenen Lipids und 1-10⁶ Teilen nicht gespacerten Lipids in Wasser, einem organischen Lösungsmit tel aus der Gruppe der C₁-C₄-Alkanole und C₃-C₆-Ketone oder einer Mischung mehrerer von ihnen auf einen Träger A bringt, wobei sich spontan eine untere Lipidmonoschicht, bestehend aus 60-99% mit dem Spacer versehenen Lipidmolekülen und aus 1-40% nicht gespacerten Lipidmolekülen, ausbildet, wobei sich
- (1a) aus wäßrigen Lösungen spontan zusätzlich auch die obere Lipid monoschicht ausbildet, oder
- (1b) bei aus nicht Wasser enthaltenden Lösungen sich nur die untere Lipidmonoschicht ausbildet, die nach einem Spülvorgang mit dem verwendeten organischen Lösungsmittel durch Aufbringen einer Lösung von nicht gespacerten Lipidmolekülen in Wasser zur Lipiddoppelschicht vervollständigt wird,
und eine Micellösung einer Rezeptorsuspension auf die nach (1a) oder (1b)
gebildete Lipiddoppelschicht bringt, wobei sich der Rezeptor D spontan in
die Lipiddoppelschicht einordnet, oder
- (2) eine Lösung von mit einem Spacer versehenen Lipid in einem der obigen Lösungsmittel auf einen Träger A bringt, nach Ausbildung einer Submono lage des Lipids diese Lösung wieder vom Träger entfernt, die auf dem Träger gebildete Submonolage mit einem der obigen Lösungsmittel spült und dann eine micellare Lösung aus Wasser, nicht gespacertem Lipid, Tensid und Rezeptor D auf die Submonolage bringt, wobei sich die Lipiddoppelschicht spontan vervollständigt und sich der Rezeptor D spontan in die Lipiddoppelschicht einordnet, oder
- (3) auf die auf dem Träger A gebildete Submonolage eine Vesikellösung, bestehend aus Rezeptormolekülen und Lipiden, aufbringt, wobei die Vesikel spontan auf der Submonolage fusionieren und sich der Rezeptor D spontan in die Lipiddoppelschicht einordnet.
Als Träger A kommen beliebige dimensionsstabile Festkörper in Frage, die aus
einem keramischen Stoff, einem Metall oder einem duroplastischen oder thermo
plastischen Polymer bestehen können, der auf seiner dem Rezeptor D zugewandten
Oberfläche aus einem korrosionsfesten Material mit einem Abgriff eines elek
trischen Signals besteht. Für den Fall, daß der Träger aus einem korrosionsfesten
metallischen Werkstoff besteht, braucht er an seiner Oberfläche nicht weiter ver
ändert oder beschichtet zu werden. Dies trifft zu beispielsweise für (Halb)Edel
metalle wie Gold, Silber, Platin, Palladium, Rhodium, Ruthenium, Iridium oder
Kupfer. Besteht der Träger aus einem nicht korrosionsfesten Metall, muß er auf
seiner D zugewandten Oberfläche mit einem der genannten korrosionsfesten
(Halb)Edelmetalle plattiert oder anderweitig (z. B. naßchemisch oder elektrolytisch)
beschichtet werden.
Ein korrosionsfestes Trägermaterial, das zugleich den Abgriff eines elektrischen
Signals ermöglicht, ist weiterhin dotiertes Silizium.
Bei nicht korrosionsfesten metallischen Werkstoffen oder bei duroplastischen oder
thermoplastischen Polymeren muß die Oberfläche, die dem Rezeptor D zugewandt
ist, durch eines der genannten korrosionsfesten (Halb)Edelmetalle plattiert oder
anderweitig beschichtet werden.
Auf dem Träger A wird eine Lipiddoppelschicht B angeordnet. Diese Lipiddoppel
schicht besteht aus einer Vielzahl von Molekülen von Di-(C₈-C₃₀-acyl)
phosphatidyl-cholin, die mit den Kohlenwasserstoffenden der Acylgruppen
zueinander gerichtet sind und eine hoch ausgerichtete Struktur aufweisen. Während
die obere Schicht dieser Doppelschicht zu 100% aus solchen Phosphatidyl-cholin-
Molekülen besteht, ist die untere Schicht der Doppelschicht B nur zu 1-40% aller
Lipidmoleküle aus Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phosphatidyl-cholin aufgebaut und zu 60-99%
aus einem Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phosphatid, bei dem an Stelle des Cholins ein Spacer
C tritt. In bevorzugter Weise bestehen die erfindungsgemäßen Biosensoren in der
unteren Lipidmonoschicht von B zu 10-30% aller Lipidmoleküle aus Di-(C₈-C₃₀-
acyl)-phosphatidyl-cholin und zu 70-90% aus einem Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phosphatid,
das jedoch anstelle des Cholins den Spacer C trägt, und in der oberen Schicht zu
100% aus Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phosphatidyl-cholin. In weiterhin bevorzugter Weise
enthalten die Acylgruppen 10-24 C-Atome.
Die beiden langkettigen Fettsäuren, deren Acylgruppen mit dem Glycerin verestert
sind, haben in Form der Acylgruppen 8-30 C-Atome, bevorzugt 10-24 C-Atome.
Ein typischer Acylrest ist der Myristylrest -CO-(CH₂)₁₂-CH₃ mit insgesamt 14 C-
Atomen. Andere Beispiele für Acylgruppen, die erfindungsgemäß geeignet sind,
sind der Caprylylrest -CO-(CH₂)₆-CH₃ mit 8 C-Atomen, der Capronylrest -CO-
(CH₂)₈-CH₃ mit 10 C-Atomen, der Laurylrest, der Palmitylrest, der Stearylrest, der
von der n-Eicosancarbonsäure abgeleitete Arachinylrest (C₂₀), der von der Tetra
cosan-carbonsäure abgeleitete Lignocerylrest (C₂₄) und der von der Triacontan
carbonsäure abgeleitete Acylrest (C₃₀). Alle in Frage kommenden Acylreste sind
geradkettig. Außer den bereits aufgeführten Acylresten mit geradzahliger C-Atom
zahl sind auch die mit ungeradzahliger C-Atomzahl einsetzbar, beispielsweise der
Acylrest der Tridecan-carbonsäure (C₁₃), der Acylrest der Pentadecan-carbonsäure
(C₁₅), der Acylrest der Heptadecancarbonsäure (Margarinsäure; C₁₇), der Acylrest
der Heneicosan-säure (C₂₁) und andere. Außer den gesättigten Acylresten mit
geradzahliger oder ungeradzahliger C-Atomzahl kommen ungesättigte Acylreste in
Frage, wie Oleyl (C₁₈), Elainidyl (C₁₈), Linolyl (C₁₈), Linolenyl (C₁₈) oder ihre
Homologen mit abweichender C-Atomzahl. Lediglich aus Gründen der besseren
Verfügbarkeit bevorzugt man Acylreste mit geradzahligen C-Atomzahlen.
In der Lipiddoppelschicht B des erfindungsgemäßen Membran-Biosensors stehen
sich die beiden Lipidmonoschichten mit den Kohlenwasserstoffresten der Acyl
gruppen gegenüber.
Innerhalb jeder Lipidmonoschicht haben alle darin vorhandenen Acylgruppen im
wesentlichen die gleiche Kettenlänge. Dies bedeutet, daß in Acylgruppen einer
vorgesehenen Kettenlänge innerhalb des oben genannten Bereichs für eine Lipid
monoschicht auch bis zu 30 Mol-% solche der anschließenden Kettenlängen mit
bis zu 2 C-Atomen weniger bzw. mehr vorhanden sein können. Bei einer vor
gesehenen Kettenlänge von 16 C-Atomen können also bis zu insgesamt 30 Mol-%
solche mit 14, 15, 17 bzw. 18 C-Atomen oder Gemische hiervon vorliegen. Aus
Gründen der vereinfachten Handhabung kann es sinnvoll und vorteilhaft sein, in
beiden Lipidmonoschichten Acylgruppen gleicher Kettenlänge einzubauen. Dies ist
auch in den oben beschriebenen Herstellungsverfahren zur Ausbildung des
erfindungsgemäßen Membran-Biosensors gemäß (1a) und (2), bei denen sich die
Lipiddoppelschicht selbst organisiert, notwendig, um im wesentlichen gleiche Ket
tenlängen in den jeweiligen Lipidmonoschichten sicherzustellen. Die Herstellungs
variante (1b), bei der sich gezielt zunächst nur die untere Lipidmonoschicht her
stellen läßt, ermöglicht es jedoch, die separat aufgetragene obere Lipidmonoschicht
mit Acylgruppen, die eine gegenüber der unteren Lipidmonoschicht verschiedene
Zahl von C-Atomzahlen hat, aufzutragen. Innerhalb der aufgetragenen oberen
Lipidmonoschicht haben jedoch wiederum alle Acylgruppen die gleiche Ketten
länge.
Der Spacer C besteht aus einem Molekül Ethanolamin, das esterartig an die
Phosphatgruppe des Diacylphosphatids gebunden ist. An das N-Atom des
Ethanolamins ist sodann ein Oligopeptid aus 4-20 α-Aminosäuren gebunden. In
bevorzugter Weise handelt es sich um ein Oligopeptid aus 4-10 α-Aminosäuren.
Die α-Aminosäuren enthalten 2-10 C-Atome, bevorzugt 2-4 C-Atome, besonders
bevorzugt handelt es sich um Glycin mit 2 C-Atomen. Oligopeptid-Spacer eines
solchen Aufbaus liegen in einer Helix- oder Faltblattstruktur vor und ermöglichen
dadurch eine hohe Ordnung im Verhältnis zwischen der unteren Monoschicht der
Lipiddoppelschicht und dem Träger A. Diese hohe Ordnung ermöglicht einerseits
eine der natürlichen Zellmembran nachempfundene Umgebung für den Rezeptor D
und vermeidet andererseits einen Kontakt dieses Rezeptors D mit dem Träger A.
Die Variabilität dieses Spacers im erfindungsgemäßen Membran-Biosensor erlaubt
es, auf die Größe und den Raumbedarf des Rezeptors D gezielt einzugehen. Der
Spacer trägt schließlich mit Bindung an das N-Atom der terminalen α-Aminosäure
eine Ankergruppe, die es erlaubt, die gespacerte untere Lipidmonoschicht der
Lipiddoppelschicht B auf der Oberfläche des korrosionsfesten Materials mit dem
Träger A, der den Abgriff eines elektrischen Signals erlaubt, zu fixieren. Wie oben
bereits dargestellt wurde, ist die korrosionsfeste Oberfläche des Trägers A, die den
Abgriff eines elektrischen Signals erlaubt, ein (Halb)Edelmetall, so daß als Anker
gruppe eine solche in Frage kommt, die beispielsweise eine Thiol- oder Disulfid
gruppe hat. Eine Thiol- oder Disulfidgruppe kommt insbesondere bei einem der
(Halb)Edelmetalle, besonders bei Gold oder bei Platin in Frage. Für den Fall, daß
die korrosionsfeste und den Abgriff eines elektrischen Signals erlaubende Ober
fläche beispielsweise dotiertes Silizium ist, kommt als Ankergruppe auch eine mit
einer Silan-Gruppierung in Frage.
Solche Thiol-, Disulfid- oder Silan-Gruppen stellen eine chemische oder physiko
chemische Bindung mit dem Träger A her. Weitere Ankergruppen sind: Carboxyl
gruppen, Isocyanate, Säureanhydride. Der Aufbau der erfindungsgemäß vorhande
nen beiden Lipidschichten der Lipiddoppelschicht B ist den natürlich vorkommen
den Phosphatiden Sphingomyelinen und Chloesterol in Zellmembranen
nachgestellt. Phosphatide, die natürlich vorkommen, sind solche, bei denen an das
Glycerin zwei langkettige Fettsäuren und ein Phosphorsäurerest gebunden sind
(Phosphatidsäure), wobei an den Phosphorsäurerest eine weitere Verbindung aus
der Gruppe der natürlich vorkommenden Kopfgruppen von Phospholipiden
gebunden ist; solche Kopfgruppen sind beispielsweise: Cholin, Glycerin,
Ethanolamin, Serin und Inositol. In allen genannten Fällen stellen diese Verbin
dungen Amphiphile dar; bevorzugt sind solche, die die Aktivität des Rezeptors
erhalten. In den nicht gespacerten Lipidschichten ist diese Base in bevorzugter
Weise das bereits genannte Cholin. Weitere Basen außer Cholin sind die oben
genannten. In den mit einem Spacer ausgerüsteten Lipideinheiten tritt in der oben
beschriebenen Weise an die Stelle des Cholins der Spacer mit dem Ethanolamin
und dem sich daran anschließenden weiteren, oben beschriebenen Aufbau des
gesamten Spacers einschließlich der Ankergruppe.
Damit stehen nunmehr auf dem Träger A fixierte Lipiddoppelschichten B zur Ver
fügung, die mit Hilfe der in die untere Lipidmonoschicht eingebauten Spacer C
einen vorausbestimmbaren Abstand zum Träger A haben. Diese Lipiddoppel
schichten simulieren eine natürliche Zellmembran. In diese Lipiddoppelschichten
kann nunmehr ein Rezeptor D eingebracht werden. Solche Rezeptoren D haben
einen hydrophoben membrandurchspannenden Teil mit hydrophilen Domänen
unterschiedlicher Größe. Solche Rezeptoren können außerdem unterschiedliche
Längen aufweisen. Das Einbringen dieser Rezeptoren D in die Lipiddoppelschicht
B erfolgt spontan durch Selbstorganisation von D in B. Durch den Aufbau der
Lipiddoppelschicht B mit unterschiedlich langen Acylresten und mit unterschied
lich langen Spacergruppen C kann auf den Raumbedarf unterschiedlich langer
Rezeptoren D Rücksicht genommen werden, ohne daß solche Rezeptoren D Kon
takt mit dem Träger A erhalten. Durch die im Herstellungsverfahren (2) zunächst
aufgetragene Submonolage kann weiterhin der gezielte Prozentsatz an unterer
Lipidmonoschicht eingestellt werden, die einen Spacer und eine Ankergruppe
tragen.
Die beigefügten Fig. 1, 2, 3 und 4a bis 4c verdeutlichen den Aufbau und eine Her
stellungsvariante der erfindungsgemäßen Membran-Biosensoren. In Fig. 1 bedeutet
A die Oberfläche des als Träger dienenden Festkörpers, die aus einem korro
sionsfesten Material mit einem Abgriff eines elektrischen Signals besteht, B die
Lipiddoppelschicht, in der beide Lipidmonoschichten mit ihren langkettigen
Kohlenwasserstoffresten der Acylgruppen zueinander stehen, C in stilisierter Weise
den Spacer, mit dem einzelne Lipidmoleküle der unteren Lipidmonoschicht an die
Oberfläche des Trägers A gebunden sind, und D einen eingelagerten Rezeptor. In
Fig. 2 wird der Aufbau nicht gespacerter Lipidmoleküle gezeigt, die von oben
nach unten angeordnet folgende Bestandteile aufweisen: zwei gleich lange
Acylreste (in Fig. 1, Fig. 2 und der noch folgenden Fig. 3 jeweils am Beispiel des
Myristylrestes (C₁₄) demonstriert), den Glycerinrest, den Phosphorsäurerest und
den Cholinrest. Fig. 3 zeigt den Aufbau eines mit einem Spacer C versehenes
Lipidmolekül mit den von oben nach unten wie folgt angeordneten Resten: zwei
gleich lange Acylreste, den Glycerinrest, den Phosphorsäurerest, den Ethanolamin
rest, vier Glycinreste, die den Oligopeptid-Spacerteil verkörpern und das Mer
captopropionsäureamid als Ankergruppe. Fig. 4a bis 4c zeigt schließlich den
schrittweisen Aufbau der erfindungsgemäßen Membran-Biosensoren im Sinne der
oben beschriebenen Herstellungsvariante (3). Fig. 4a zeigt hierbei das Aufbringen
von mit Spacern C einschließlich Ankergruppen versehenen Lipidmolekülen (ge
wellte Linie stellt den gesamten Spacer C dar, der innen weiße Kreis stellt den
Phosphorsäure-Glycerin-Teil des Lipids dar, die beiden vom innen weißen Kreis
abgehenden Linien stellen die beiden Acylreste dar. Der von Fig. 4a nach Fig. 4b
weisende Pfeil stellt den nächsten Schritt dar, nämlich die Zugabe einer ver
sikulären Lösung, die aus nicht gespacerten Phospholipiden mit einem analogen
Aufbau zu Fig. 4a, jedoch ohne Spacer C und Rezeptoren zusammengesetzt ist.
Der von Fig. 4b nach Fig. 4c zeigende Pfeil stellt sodann die spontane Selbst
organisation der weiter oben beschriebenen Lipiddoppelschicht mit eingelagerten
Rezeptoren dar. Es ist erkennbar, daß die in Fig. 4a hergestellte Submonoschicht
mit nicht gespacerten Lipidmolekülen aufgefüllt wird und daß die obere Lipid
monoschicht nur aus nicht gespacerten Lipidmolekülen besteht.
Das zu bedampfende Substrat, in der Regel Glas oder Silizium, wird in
heißer 2%iger Detergenzlösung (70°C) unter Ultraschall 15 min gereinigt
und anschließend 20 min mit Reinstwasser gespült, um restliches Detergenz
zu entfernen. Das Substrat wird in einem Agronplasma von anhaftenden
Adsorbaten befreit und in einer Aufdampfanlage mit einer dünnen
Chromschicht von ca. 10-20 nm und anschließend mit einer Goldschicht
von 100-200 nm bedampft. Der elektrische Abgriff erfolgt direkt an der
Goldschicht.
Zur Präparation einer Lipidmonoschicht bestehend aus einem Di
myristylphopshatidylethanolamin, welches einen Spacer aus fünf
Glycinresten und eine endständige Thiolgruppe trägt, wird das Argon-
Plasma-gereinigte Goldsubstrat mit einer 0,1-1 mM ethanolischen Lösung
dieses Spacerlipids inkubiert. Der self assembly Prozeß wird nach 1-5 min
abgebrochen, so daß eine unvollständige Lipidmonoschicht mit einem
Belegungsgrad von etwa 70% erhalten wird. Anschließend wird das
beschichtete Goldsubstrat intensiv mit Ethanol gespült.
Ausgehend von isolierten Membranfragmenten aus Ropedo marmorata wird
der nikotrinische Acetylchlolinrezeptor in Versikel mit Hilfe der Detergenz-
Verdünnungsmethode rekonstituiert. Mambranfragmente mit 1 nmol α-
Bungarotoxin-Bindungsstellen, 5 mg 1-Palmityl-2-oleyl-phosphatidylcholin
und 2% Natriumcholat werden in einem Tris-Puffer suspendiert und im
Ultraschallbad bis zu einer klaren micellaren Lösung beschallt. Die
Lösung wird 12 h gegen reinen Puffer dialysiert.
Die aus 1.3 erhaltenen Versikel mit rekonstrituiertem Rezeptorprotein
werden zu der hydrophoben trägerfixierten Monoschicht in einem Tris-
Puffer gegeben und die Fusion der Versikel mit der Oberfläche bei 30-
40°C eingeleitet. Nach Beendigung des Fusionsprozesses, der in der Regel
nach ein bis zwei Stunden abgeschlossen ist, wird die Versikellösung gegen
reine Pufferlösung ausgetauscht.
Claims (8)
1. Durch Festkörper unterstützte Membran-Biosensoren, bestehend aus einem
Festkörper A als Träger, einer Lipiddoppelschicht B als Membran mit zwi
schen A und B eingebauten Spacern C und einem in die Lipiddoppel
schicht eingelagerten Rezeptor D, wobei
- a) A auf seiner D zugewandten Oberfläche aus einem korrosionsfesten Material mit einem Abgriff eines elektrischen Signals besteht,
- b) die untere Lipidmonoschicht von B zu 1-40% aller Lipidmoleküle aus Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phosphatidyl-Verbindungen mit einer natürlich vorkommenden Kopfgruppe und zu 60-99% aus einem Di-(C₈-C₃₀ acyl)-phosphatid, das jedoch an Stelle der Kopfgruppe den Spacer C trägt, besteht und dessen obere Lipidmonoschicht zu 100% aus Di- (C₈-C₃₀-acyl)-phosphatidyl-Verbindungen mit einer natürlich vorkommenden Kopfgruppe besteht, wobei alle Acylgruppen einer Schicht im wesentlichen gleich lang sind, jedoch die Acylgruppen der unteren Lipidmonoschicht gleich oder verschieden lang wie die der oberen Lipidmonoschicht sind,
- c) C aus 1 Molekül Ethanolamin, das eine Esterbindung zur Phosphat gruppe von B ausbildet, einem Oligopeptid in Helix- oder Faltblatt struktur aus 4-20 C₂-C₁₀-α-Aminosäuren und einer Ankergruppe die eine chemische oder physikochemische Bindung mit A eingeht, besteht, wobei alle C des Biosensors gleich sind, und
- d) D keinen Berührungskontakt mit A hat.
2. Verfahren zur Herstellung eines durch Festkörper unterstützten Membran-
Biosensors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder
- (1) eine Lösung von 1 Teil mit einem Spacer versehenen Lipid und 1-10⁶ Teilen nicht gespacerten Lipids in Wasser, einem organischen Lösungsmittel aus der Gruppe der C₁-C₄-Alkanole und C₃-C₆- Ketone oder einer Mischung mehrerer von ihnen auf einen Träger A bringt, wobei sich spontan eine untere Lipidmonoschicht, bestehend aus 60-99% mit dem Spacer versehenen Lipidmolekülen und aus 1-40% nicht gespacerten Lipidmolekülen, ausbildet, wobei sich
- (1a) aus wasserhaltigen Lösungen spontan zusätzlich auch die obere Lipidmonoschicht ausbildet, oder
- (1b) bei aus nicht Wasser enthaltenden Lösungen sich nur die untere Lipidmonoschicht ausbildet, die nach einem Spül vorgang mit dem verwendeten organischen Lösungsmittel durch Aufbringen einer Lösung von nicht gespacerten Lipid molekülen in Wasser zur Lipiddoppelschicht vervollständigt wird,
und eine Micellösung einer Rezeptorsuspension auf die nach (1a) oder (1b)
gebildete Lipiddoppelschicht bringt, wobei sich der Rezeptor D spontan in
die Lipiddoppelschicht einordnet, oder
- (2) eine Lösung von mit einem Spacer versehenen Lipid in einem der obigen Lösungsmittel auf einen Träger A bringt, nach Ausbildung einer Submonolage des Lipids diese Lösung wieder vom Träger entfernt, die auf dem Träger gebildete Submonolage mit einem der obigen Lösungsmittel spült und dann eine micellare Lösung aus Wasser, nicht gespacertem Lipid, Tensid und Rezeptor D auf die Submonolage bringt, wobei sich die Lipiddoppelschicht spontan vervollständigt und sich der Rezeptor D spontan in die Lipid doppelschicht einordnet, oder
- (3) auf die auf dem Träger A gebildete Submonolage eine Versikellösung, bestehend aus Rezeptormolekülen und Lipiden, auf bringt, wobei die Versikel spontan auf der Submonolage susionieren und sich der Rezeptor D spontan in die Lipiddoppelschicht einordnet.
3. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Lipid
monoschicht von B zu 10-30% aller Lipidmoleküle aus Di-(C₈-C₃₀-acyl)
phosphatidyl-cholin und zu 70-90% aus einem Di-(C₈-C₃₀-acyl)-phospha
tid, das jedoch an Stelle des Cholins den Spacer C trägt, besteht.
4. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppen
10-24 C-Atome enthalten.
5. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als α-Amino
säuren für das Oligopeptid solche mit 2-4 C-Atomen, bevorzugt das Glycin,
eingesetzt werden.
6. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die D zuge
wandte Oberfläche von A aus Gold oder Platin besteht.
7. Biosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankergruppe
zum Eingehen einer chemischen Bindung mit der aus Gold oder Platin
bestehenden Oberfläche von A eine Thiol- oder Disulfidgruppe enthält.
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