EP1325334A2 - Verfahren zur immobilisierung von lipidschichten - Google Patents

Verfahren zur immobilisierung von lipidschichten

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EP1325334A2
EP1325334A2 EP01980432A EP01980432A EP1325334A2 EP 1325334 A2 EP1325334 A2 EP 1325334A2 EP 01980432 A EP01980432 A EP 01980432A EP 01980432 A EP01980432 A EP 01980432A EP 1325334 A2 EP1325334 A2 EP 1325334A2
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EP
European Patent Office
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lipid
solid surface
molecules
lipid layers
solid
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EP01980432A
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Joachim NÖLLER
Johannes Schmitt
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Nimbus Biotechnologie GmbH
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Nimbus Biotechnologie GmbH
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    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of lipid layers immobilized on surfaces of powdery solids as well as modified solid surfaces, immobilized lipid layers and a kit which is suitable for the production thereof.
  • bilayers Solid-supported lipid bilayers
  • solid-supported functional biomembranes with immobilized membrane proteins have gained in importance in the field of pharmaceutical screening, chromatography, biosensor technology and for lipid binding studies in recent years.
  • the first solid-supported bilayers described in the literature were only removed from the solid surface by a 1 to 2 nm thick water film (Tamm, LK; McConnell, HM Biophysical Journal 1985, 47, 105-113; Johnson, SJ; Bayerl, TM; McDermott, D. C; Adam, GW; Rennie, AR; Thomas, RK; Sackmann, E. Biophysical Journal 1991, 59, 289-294; Bayerl, TM; Bloom, M.
  • the hydrophilic spacer serves to decouple the bilayer formed from further lipid molecules from the substrate, in that the bound lipids act as "anchors" and thus specify the maximum distance between the bilayer and surface due to the length of the hydrophilic spacer.
  • the lipid molecules can be bound either to polymeric, oligomeric or low molecular weight spacers. Disadvantages are the high preparative effort involved in these strategies and the dependence of the properties of the bilayer on the lateral density of the anchor molecules, on the hydratability of the hydrophilic spacer material and on the dynamic properties of the spacer itself.
  • Another step towards a bilayer largely decoupled from the solid surface is the use of solid surfaces that have been modified by a hydrophilic polymer (e.g. dextran) and then coated with a bilayer (M. Kuhner, E. Sackmann, Langmuir, 1996 12 ( 20), 4866; G. Elender, M. Kuhner, E. Sackmann, Biosens. Bioelectron., 1996, 11, 565; E. Sackmann, Science, 1996, 271, 43; E. Györvary, B. Wetzer, UB Sieytr, A. Sinner, A. Offenpurser, W. Knoll, Langmuir 1999, 15, 1337).
  • a hydrophilic polymer e.g. dextran
  • the object of the invention is to provide a method which can be used universally to a large extent and which avoids the deficiencies described in the conventional strategies for immobilizing lipid layers and allows the lipid layers, in particular the lipid bilayers, to be decoupled from the membrane in a preparatively simple manner.
  • the aim of the new process is to optimize the surface of the solid so that the properties of the lipid layers supported by the solid are as close as possible to the properties of natural membrane systems with high stability against external forces.
  • solid surfaces are first modified in such a way that they offer optimal conditions for the gentle immobilization of a lipid layer applied over the modified surface, in particular a lipid bilayer or lipid membrane.
  • lipid layers for example membranes from native cells, are then immobilized on the modified surface in such a way that the properties of the immobilized lipid layers essentially correspond to those of non-immobilized lipid layers. This is preferably done Immobilization of the lipid layers by means of fusion of vesicles from buffer solutions.
  • a non-immobilized lipid layer in particular a lipid bilayer, is characterized in that the individual lipids and other components, for example proteins, can move relatively freely within the layer and, in the case of a bilayer, also between the two layers.
  • this diffusivity of the lipid layers is extremely reduced.
  • the possibility of movement of the lipids is significantly slowed down, especially in the lipid layer which is assigned to the surface of the substrate. This leads to a drastic change in the properties of the conventionally immobilized membrane.
  • the immobilization method according to the invention the possibility of movement within the lipid layer is not restricted, so that this characteristic property is retained in the lipid layers immobilized according to the invention.
  • the immobilization method according to the invention achieves a "soft" surface by modifying the solid surface, which on the one hand largely leaves the immobilized lipid layer unaffected and on the other hand also ensures a sufficient distance between the solid surface and the lipid layer, so that no denaturing effects of the solid surface on the surface any proteins, especially enzymes, contained in the lipid layer may occur. This ensures that activities of proteins embedded in the lipid layer are retained.
  • This feature of the invention is extremely important for the various applications of the invention.
  • immobilized membranes that retain their native properties e.g. enzymatic activities or channel activities, are extremely important. Such immobilization of membranes was not possible with conventional methods while maintaining the native properties.
  • the invention therefore opens up completely new possibilities in biosensor technology and, of course, in very different other areas, such as, for example, in diagnostics or in research in general.
  • polyions described in the following text generally describe polymers which carry ionic and / or ionizable functionalities either in the side chains and / or along the main chain.
  • polyions are to be understood as the molecular classes “polyelectrolytes”, “polyampholytes” and “polyzwitterions”.
  • Polyelectrolytes are polymers that have ionic or ionizable groups incorporated in the main or side chain. “Polyelectrolytes” in the The sense used below can also be copolymers of ionic / ionizable and nonionic monomer units. Polyelectrolytes can exist in both anionic and cationic form. Examples of anionic polyelectrolytes are poly (styrene sulfonic acid), polyvinyl (sulfonate), poly (acrylic acid),
  • Anionic polyelectrolytes are, for example, deoxyribonucleic acids (DNA) and ribonucleic acids (RNA).
  • Examples of cationic polyelectrolytes are poly (allylamine hydrochloride), poly (vinylamine), poly (ethyleneimine), poly (diallylammonium chloride), PAMAM dendrimers (amino-terminated, integer generation) and poly (2-vinylpyridine).
  • Examples of ionic copolymers are poly (acrylic acid-co-acrylamide) and poly (diallylammonium chloride-co-acrylamide).
  • Typical functional groups of anionic polyelectrolytes are carboxyl, sulfate, sulfonate, phosphate and phosphonate groups.
  • Typical cationic functionalities are primary, secondary, tertiary and quaternary amine, as well as R 3 S (+) groups.
  • Polymers related to the group of polyelectrolytes are polyampholytes which carry ionizable functional groups in the main or side chain and whose net charge state depends on the pH of the solution. Polyampholytes in the general sense are also to be understood as meaning proteins and enzymes.
  • ionic polymers are polyzwitterions, which carry permanent anionic and cationic charges in the main or side chain.
  • bilayer lipid membrane
  • lipid bilayer used in the following text are synonymous and refer to a lipid bilayer which consists of a hydrophobic inner region and a hydrophilic outer region and which, for example, arise spontaneously during the self-assembly of natural and synthetic lipids or lipid-like substances in an aqueous phase, or is generated by transfer techniques (Langmuir-Blodgett technique) can be.
  • vesicle refers to uni- and multilamellar forms of aggregates that form lipids and lipid-like substances spontaneously when swollen in the aqueous phase or under external influence, such as, for example, by treatment with ultrasound or by high pressure filtration (extrusion).
  • substrates used in the following text refers to solids insoluble in aqueous solution made of organic or inorganic material, which serve as sufficiently solid surfaces (solid surfaces) after optimization to support the lipid layers.
  • the invention describes a new method for optimizing the surface properties of powdered or particulate substrates of any geometry with the aim of approximating the properties of the lipid layers to be deposited thereon as closely as possible to those of a natural membrane and at the same time enabling immobilization of integral membrane proteins without a significant loss of their activity ,
  • the process according to the invention can be divided into two process steps. This is on the one hand (a) the modification of the solid surface (substrate surface) with molecules to form an essentially hydrophilic surface and (b) the deposition of the lipid layers on the modified solid surface.
  • This Process steps are shown schematically in FIG. 1, the powdery character of the solid body not being shown.
  • a suitable modification of the substrate surface is achieved by the first process step, which ensures a large decoupling of the lipid layer to be deposited in the second process step from the substrate with a simultaneous high morphological integrity and stability. This avoids the use of spacer elements covalently bonded to the substrate.
  • the immobilized lipid layer is therefore free, that is to say immobilized on the modified surface without any point connection to the substrate.
  • a hydrophilic surface which carries ionic groups, i.e. preferably functional groups that dissociate in an aqueous environment.
  • the resulting solid-supported lipid layer is very similar to the properties of its natural (solid-independent) analogue (e.g. the lipid vesicle in the case of pure lipids or the biomembrane in the case of natural lipid mixtures with proteins, especially transmembrane proteins).
  • its natural (solid-independent) analogue e.g. the lipid vesicle in the case of pure lipids or the biomembrane in the case of natural lipid mixtures with proteins, especially transmembrane proteins).
  • process step (a) Essentially two steps are necessary for the modification of the solid surface (process step (a)).
  • a further step (ab) interacting molecules are adsorbed / chemisorbed on the functionalized surface.
  • further molecules can be adsorbed or chemisorbed in a third step (ac).
  • These molecules can be identical to the molecules used in step (ab), or it can be a different molecular species for this further step be used.
  • the modification can also include further corresponding sub-steps. This can be useful if the distance between the lipid layer and the solid surface is to be particularly large. However, a modification in a few steps is often particularly advantageous and preferred in view of the preparation effort.
  • the corresponding molecules can be applied, for example, by deposition from a solution or from the gas phase.
  • the modification of the surface can also be carried out in one step, in particular if a suitable surface-modifying material is commercially available.
  • the hydrophilic surface is formed on the substrate by appropriate modification of the solid surface (process step (a)). This enables spontaneous formation of a lipid layer, in particular a bilayer, on the modified surface (process step (b)). This can preferably be achieved by a conventional vesicle fusion on the surface.
  • the result is a stable solid-supported lipid layer, preferably a bilayer or a solid-supported biomembrane with enzymatic activity of the proteins immobilized in it.
  • the topology of the lipid layer or bilayer or membrane surface is largely determined by that of the substrate, that is, the solid surface.
  • the method according to the invention is therefore preferably characterized in that inorganic and / or organic solid surfaces are chemically and / or physically modified such that a) the surface properties of the carrier material (substrate) can be influenced and set in a targeted manner; b) the application of a lipid layer to the modified solid surface is made possible; c) the lipid layer is bound by physical and / or chemical forces to the modified solid surface in such a way that it completely surrounds it, but without the diffusion of the lipid layer components within the layer being significantly impaired; d) the properties of the immobilized lipid layer, in particular a lipid membrane, are as close as possible to the properties of the non-immobilized lipid layer or the natural lipid membrane.
  • Criteria for comparing the properties of the immobilized lipid layer obtained by the process according to the invention with those of its solid-free analogs are, for example, measurements of the phase transition temperature by means of differential microcalorimetry (DSC), measurement of the fluidity and mobility by means of solid-state nuclear magnetic resonance (NMR) or determination of the functionality or Activity of immobilized membrane proteins.
  • DSC differential microcalorimetry
  • NMR solid-state nuclear magnetic resonance
  • partial step (aa) functional groups are introduced on the solid surface.
  • this is done by amino functionalization, epoxy functionalization, haloalkyl functionalization and / or thiofunctionalization.
  • This is done by treating the solid surface with appropriately functional molecules.
  • the Molecules containing the functional groups are dissolved in a solution, for example in an aqueous solution, and the surface material is added to this solution or the solution is applied to the surface material.
  • the incubation can take place for example at room temperature for a few hours.
  • other reaction conditions can of course also be selected.
  • the functionalities listed are only examples that can be expanded by a person skilled in the art to include additional suitable options.
  • silanes which have a corresponding functionality are used for the functionalization.
  • Mono-, di- or trifunctional silanes are particularly suitable for this. Consequently, it can therefore be an amino-functional, epoxy-functional, haloalkyl-functional and / or thiofunctional silane.
  • An example of a particularly suitable amino-functional silane is N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane (EDA).
  • Suitable epoxy-functional, haloalkyl-functional or thiofunctional silanes are [3- (2,3-epoxypropoxy) propyl] trimethoxysilane (EPOXY), [3-iodopropyljtrimethoxysilane or [3-thiopropyl] trimethoxysilane.
  • mercaptans and / or disulfides are used for the functionalization.
  • Functionalization with mercaptans is particularly preferable for metallic solid surfaces.
  • Alkyl disulfides are particularly suitable as disulfides.
  • the mercaptans and disulfides advantageously carry functional groups.
  • mercaptans of different functionality can be used.
  • cysteamine hydrochloride and / or cysteamine is used as the amino-functional mercaptan.
  • other mercaptans for example epoxy-functional or haloalkyl-functional mercaptans, can also be used successfully.
  • PES polyethyleneimine
  • interacting molecules are absorbed on the functionalized surface.
  • This absorption onto the functionalized surface takes place in particular through interaction with the functional groups that were applied to the surface in the first sub-step.
  • This can also be a so-called chemisorption, in which covalent bonds are formed between the interacting molecules and the functional groups attached to the surface.
  • chemisorption in which covalent bonds are formed between the interacting molecules and the functional groups attached to the surface.
  • there may also be other interactions between the interacting molecules and the functionalized surface, for example electrostatic interactions and also van der Waal forces.
  • polymers are used as interacting molecules. These can also be biopolymers. Of course, monomers can also be used. Polyelectrolytes, polyampholytes and / or poly-zwitterions are particularly suitable as polymers. Anionic polyelectrolytes are preferably used as polyelectrolytes Commitment. As is known, the polyampholytes also include proteins which can be very suitable for this substep of modifying the surface of the solid.
  • polyanions or anionic polyelectrolytes that are particularly suitable are polysulfates, polysulfonates, polycarboxylates, polyphosphates and their free acids, polystyrene sulfonic acid, polystyrene sulfonate (PSS), PAMAM dendrimers (carboxyl-terminated, half-numbered generation), polyacrylic acid, polyacrylate, polymethacrylate, polymethacrylate Polymethacrylate, dextran sulfate, deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid.
  • suitable polycations are polyamines and their salts, polyethyleneimine, polyallylamine, PAMAM dendrimers (amino-terminated, integer generation), polyvinylamine, polylysine, poly (vinylpyridine) and their salts and poly (diallyldimethylammonium chloride).
  • BSA bovine serum albumin
  • substances are used as interacting (reactive) molecules which enter into covalent interactions with the functionalized surface, so-called chemisorption taking place.
  • interacting (reactive) molecules which enter into covalent interactions with the functionalized surface, so-called chemisorption taking place.
  • Amino-reactive molecules which are used as interacting molecules for an amino-functionalized surface are particularly preferred.
  • PPMA Maleic anhydride
  • S.S ' ⁇ ' - benzophenonetetracarboxylic acid dianhydride S.S ' ⁇ ' - biphenyltetracarboxylic acid dianhydride.
  • the invention also encompasses other interacting or reactive molecules which are readily apparent to a person skilled in the art from what has been said so far.
  • the surface is provided with epoxy-functional groups in the first sub-step of the modification, and in the second sub-step
  • epoxy-reactive polymers are polyethyleneimine,
  • polyamines can be applied both as a functionalization layer in a one-step process and as an interacting layer in two-step processes. This is always advantageous if, in the first step, the original properties of the solid are to be changed by a covalent implementation of the surface functionalities.
  • proteins in particular enzymes, as interacting molecules is also suitable for an epoxy-functionalized surface.
  • Sodium thiosulfate, ethylenediamine hydrochloride or taurine are suitable as further epoxy-reactive substances.
  • the surface properties can be optimized to the extent that the undesirable charge effects inherent in the surface material are minimized.
  • An appropriate selection of the appropriate reagents is to be made depending on the desired test objective.
  • further molecules which in particular bring about a further functionality of the surface, are inserted between the solid surface and the lipid layer to be applied.
  • dyes in particular fluorescent dyes, nanoparticles or biomolecules, such as proteins, in particular enzymes, into the modified surface layer. This enables the incorporation of probe molecules into the system of solid-supported lipid layers or lipid membranes.
  • all powdered carrier materials known in the prior art can be used as solid surfaces, that is to say as carriers for the lipid layer or membrane to be immobilized.
  • these carrier materials can also be porous in order to provide an even larger surface.
  • Silicate surfaces or silicate particles are particularly suitable as solid surfaces. Furthermore, porous or non-porous aluminates, borates or zeolites can be used successfully. Colloidal solutions of precious metals, metals etc. are also suitable.
  • powdery and preferably porous polymer surfaces are used as solid surfaces.
  • magnetic carriers are used as solid surfaces, for example polymer spheres with a magnetic core. Core-shell polymer particles can furthermore advantageously be used as carrier material.
  • such materials are used as solid surface material which are usually used as packing material in chromatographic columns.
  • films made of powdery metals, semiconductors, noble metals and / or polymers can be used as surface materials, which are applied to or can be applied to largely largely planar carrier materials.
  • These carrier materials can, for example, be documents made of paper, glass, plastic or the like, with which the solid bodies are connected in a suitable manner, in particular by gluing or fusing.
  • the modification of the solid surface according to the method according to the invention makes the surface suitable for the immobilization of very different lipid layers.
  • This modified solid surface is particularly suitable for immobilizing lipid bilayers, and in particular for immobilizing lipid membranes.
  • Lipid bilayers or lipid membranes are also of particular interest for the various uses of the invention in research, diagnostics and, above all, in biosensor technology, it being possible to use the native properties of such layers as models for natural systems.
  • the lipid layers are composed of substances from the classes of lipids, lipid derivatives, lipid-like and / or lipid-analogous substances. Furthermore, the lipid layers can also have peptides, proteins, nucleic acids, ionic or nonionic surfactants and / or polymers. These additional components in the immobilized lipid layers allow natural systems to be imaged, for example by including channel proteins or enzymes in the lipid layers. These additional components can be located on the surface of the lipid layer or embedded in the lipid layer, that is to say integrally. Furthermore, the additional components can extend through the entire layer or membrane, that is to say transmembrane (spanning the layer).
  • proteins can be enzymes, receptors and / or ligands, the receptors and / or ligands preferably being at least partially oriented on the surface of the lipid layer facing away from the carrier.
  • the lipid membrane can be made up of proteoliposomes.
  • the lipid layers to be immobilized are at least partially membrane fragments from natural cells.
  • Corresponding artificial lipid layers or membranes can of course also be assembled from different components in vitro, so that a corresponding membrane model is thereby provided.
  • membranes are isolated from natural cells and deposited on the surfaces modified according to the invention.
  • the immobilized lipid layer in particular the lipid membrane, has proteins which are preferably arranged in a transmembrane and / or integral manner, these proteins being able to bind or have bound water-soluble proteins peripherally.
  • the lipid layers are preferably deposited on the modified solid surface by conventional fusion of lipid vesicles.
  • These vesicles can be vesicles of a defined composition composed of, for example, phospholipids.
  • membrane vesicles obtained from the sarcoplasmic reticulum are particularly suitable for this purpose.
  • the vesicles are prepared using methods that are known to the person skilled in the art.
  • a great advantage of the method according to the invention can be seen in the fact that such vesicles only have to be brought into contact with the surface modified according to the invention, as a result of which the vesicles fuse spontaneously and form a lipid layer. Therefore, the method according to the invention is an extremely easy-to-use system, which requires only little preparation effort.
  • the invention further comprises a modified solid surface as can be produced according to the method according to the invention. Furthermore, it comprises an appropriately immobilized lipid layer on a modified solid surface. With regard to the features of the modified solid surface or the immobilized lipid layer, reference is made to the above description.
  • the invention comprises a kit for the production of immobilized lipid layers on solid surfaces.
  • a kit comprises at least one modified solid surface as described above.
  • the kit comprises reagents for producing a correspondingly modified solid surface.
  • the kit additionally has reagents for depositing lipid layers on a modified solid surface.
  • these reagents are provided by the respective user himself. This is especially true when it comes to isolating membranes from natural systems and immobilizing them according to the invention.
  • Figure 1 shows schematically the procedure for the inventive method.
  • FIG. 2 shows DSC measurement curves of porous silicate particles coated with Dielaidoylphosphatidylcholine (DEPC) with and without an optimized surface in comparison with natural DEPC vesicles without a carrier material.
  • DEPC Dielaidoylphosphatidylcholine
  • FIG. 3 shows deuterium ( 2 H) NMR spectra of non-porous silicate particles coated with selectively chain-interpreted dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) -d ⁇ (7.7 , I 8.8'-D 2 ) with and without an optimized surface in comparison with natural DPPC -d8 (7.7 ', 8.8') - vesicles without carrier material.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • FIG. 4 shows DSC measurements of DEPC-coated, porous
  • Silicate particles on complex, optimized surfaces Silicate particles on complex, optimized surfaces.
  • a silane solution consisting of 1.05 ml of N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane (EDA) and 27 ⁇ l of concentrated acetic acid in 100 ml of deionized water was freshly prepared. After 5 minutes, 5 g of a porous silicate material (Nucleosil 4000-30 from Macherey-Nagel, Duren) was added to the silane solution and slurried with shaking. This dispersion was slowly rotated for three hours, after which the silicate material is sedimented and washed three times with deionized water. The success of the silanization is documented by means of infrared spectroscopy in diffuse reflection (DRIFT) on the dried silicate material.
  • DRIFT diffuse reflection
  • a porous silicate material (Nucleosil 4000-10 from Macherey-Nagel, Düren) and three were added to a polyethyleneimine (PEI) solution consisting of 250 mg PEI (50% solution in water, Aldrich, Steinheim) in 50 ml deionized water Hours rotated slowly. The silicate material was then sedimented and washed three times with deionized water. The success of the silanization was documented by means of infrared spectroscopy in diffuse reflection (DRIFT) on the dried silicate material. 1.1.3. Thiofunctionalization of powdery and porous silicate surfaces
  • a silane solution consisting of 1 ml mercaptopropyltrimethoxysilane (THIO) in 50 ml 2-propanol was freshly prepared. After 5 minutes, 5 g of a porous silicate material (Nucleosil 4000-30 from Macherey-Nagel, Duren) was added to the silane solution and slurried with shaking. This dispersion was slowly rotated for three hours, after which the silicate material was sedimented and the supernatant was removed. The material was first dried at 80 ° C and annealed at 100 ° C for one hour. It was then washed three times with 2-propanol. The success of the silanization was documented using DRIFT.
  • a silane solution consisting of 2 ml of [3- (2,3-epoxypropoxy) propyltrimethoxysilane (GPS) in 100 ml of 2-propanol was freshly prepared. After 5 minutes, 10 g of a porous silicate material (Nucleosil 4000-30 from Macherey-Nagel, Duren) was added to the silane solution and slurried with shaking. This dispersion was slowly rotated for three hours, after which the silicate material was sedimented and the supernatant was removed. The material was first dried at 80 ° C and annealed at 100 ° C for one hour. It was then washed three times with 2-propanol. The success of silanization is documented using DRIFT. 1.1.5. Amino functionalization of magnetic particles with polyethyleneimine (PEI)
  • PSS polystyrene sulfonate
  • PEI-functionalized silicate surfaces To a Na polystyrene sulfonate (PSS) solution, consisting of 25 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml deionized water, 1 g of a solution corresponding to Example 1.1.2. given amino-functionalized silicate material and shaken for three hours. The silicate material was then sedimented and washed three times with deionized water. The success of the adsorption was documented by means of DRIFT and the decrease in the PSS concentration in the solution.
  • PSS polystyrene sulfonate
  • PSPMA poly (styrene-co-maleic anhydride)
  • PSPMA poly (styrene-co-maleic anhydride)
  • Example 1.1.1 1 g of one according to Example 1.1.1.
  • Functionalized EDA carrier material was placed in a solution consisting of 220 mg bovine serum albumin (BSA, from Sigma-Aldrich, Steinheim) in 50 ml of a 25 mM HEPES buffer pH 7.1 (buffer A) and rotated for three hours. The carrier material was then sedimented, washed three times with buffer A and then dried. The success of the coating was documented by DRIFT and measurement of the decrease in the BSA concentration in the solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 1.1.4 For the preparation of an anionic surface, 1 g of one according to Example 1.1.4. prepared material rotated for 16 h in a 0.1 molar sodium thiosulfate solution. The material was then sedimented, washed three times with deionized water and at 80 ° C dried. The success of the coating was documented using DRIFT.
  • PEI polyethyleneimine
  • Example 1 To produce a modified surface in a multi-stage process, 1 g of a mixture corresponding to Example 1.2.1 was added to a polyallylamine hydrochloride (PAH) solution consisting of 12.5 mg of PAH (Aldrich, Steinheim) in 25 ml of deionized water. PSS-functionalized silicate material was given and shaken for three hours. The silicate material was then sedimented and washed three times with deionized water. The success of the adsorption was documented using DRIFT. 0.5 g of the PAH-functionalized silicate material obtained was placed in a solution consisting of 10 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 10 ml deionized water and shaken for three hours.
  • PAH polyallylamine hydrochloride
  • PSS Na polystyrene sulfonate
  • EDA carrier material was placed in a solution consisting of 0.2 g of 3,3 ', 4,4'-benzophenonetetracarboxylic acid dianhydride (BPA) in 25 ml of acetone and rotated overnight. After that, the backing material sedimented, washed three times with acetone and dried. The success of the treatment was documented using DRIFT.
  • BPA 4,4'-benzophenonetetracarboxylic acid dianhydride
  • Example 1.2.1 1 g of one according to Example 1.2.1. EDA / PSS material prepared was rotated for 16 hours in a solution of 50 mg of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) in chloroform. The material was then sedimented and washed three times with chloroform. The success of the coating was documented using DRIFT.
  • DODAB dioctadecyldimethylammonium bromide
  • DEPC dielaidoylphosphatidylcholine
  • Example 2.1 To 16 ml of a vesicle dispersion prepared in accordance with Example 2.1 was added 1 g of one in accordance with Example 1.2.1. optimized porous silicate carrier added and slowly rotated for 30 minutes. The carrier material was then sedimented and three times with coating buffer washed. The success of the coating was documented by means of DSC on the material dispersed in coating buffer (as described by C. Naumann, T. Brumm, TM Bayerl, Biophys. J., 1992, 63, 1314) and DRIFT (after drying of the material).
  • Example 2.1 1.3 ml of a vesicle dispersion prepared according to Example 2.1 were added to 4 ml of a vesicle dispersion prepared according to Example 2.1. modified polymer carrier added and slowly rotated for 30 minutes. The carrier material was then sedimented and washed three times with coating buffer. The success of the coating was documented by means of DSC on the material dispersed in the coating buffer.
  • Example 2.1 To 16 ml of a vesicle dispersion prepared in accordance with Example 2.1 was added 1 g of one in accordance with Example 1.3.4. optimized porous silicate carrier and slowly rotated for 30 minutes. The carrier material was then sedimented and washed three times with coating buffer. The success of the coating was documented by means of DSC on the material dispersed in the coating buffer and DRIFT (after the material had dried).
  • Example 2.1 To 16 ml of a vesicle dispersion prepared in accordance with Example 2.1 was added 1 g of one in accordance with Example 1.4.1. optimized porous silicate carrier and slowly rotated for 30 minutes. After that was the carrier material sedimented and washed three times with coating buffer. The success of the coating was documented by means of DSC on the material dispersed in the coating buffer and DRIFT (after the material had dried).
  • Membrane vesicles of the sarcoplasmic reticulum were produced from the muscle tissue of a rabbit using a method by W. Hasselbach and M. Makinose (Biochem Z. 1961, 333, 518-528). This dispersion was then transferred into small, single-shell vesicles with a diameter of 20-90 nm by ultrasound treatment. To 900 ⁇ l of this solution (about 0.5 mg of total protein) was 50 mg of one according to Example 1.2.1. Optimized porous silicate carrier added and incubated for 18 hours at 4 ° C, using 100 mM triethanolamine (pH 7.4) and 100 mM NaCl (incubation buffer) as the buffer solution.
  • the carrier material was then sedimented and washed three times with incubation buffer. The success of the coating was documented using DRIFT on the dried material.
  • the Ca 2+ -ATPase activity on the support material after washing in the incubation buffer was carried out by determining the ATP hydrolysis activity as a function of the calcium ion concentration and its inhibition by the specific inhibitor "Cyclopiazonic Acid". This functional test demonstrated a Ca 2+ ATPase activity on the carrier material that was comparable to that of the SR vesicle.
  • SR native sarcoplasmic reticulum
  • Membrane vesicles of the sarcoplasmic reticulum were produced from the muscle tissue of a rabbit using a method by W. Hasselbach and M. Makinose (Biochem Z. 1961, 333, 518-528). This dispersion was then transferred into small, single-shell vesicles with a diameter of 20-90 nm by ultrasound treatment. To 900 ⁇ l of this solution (about 0.5 mg of total protein), 50 mg of one according to Example 1.2.8. Optimized porous silicate carrier added and incubated for 18 hours at 4 ° C, using 100 mM triethanolamine (pH 7.4) and 100 mM NaCl (incubation buffer) as the buffer solution.
  • the carrier material was then sedimented and washed three times with incubation buffer. The success of the coating was documented using DRIFT on the dried material.
  • the Ca 2+ -ATPase activity on the support material after washing in the incubation buffer was carried out by determining the ATP hydrolysis activity as a function of the calcium ion concentration and its inhibition by the specific inhibitor "Cyclopiazonic Acid". This functional test demonstrated a Ca 2+ -ATPase activity on the carrier material that was comparable to that of the SR vesicle.
  • Test bath exposed At intervals of 2 hours, the same became Quantities of carrier material removed from the test bath, dried and then examined for their coating by means of DRIFT.
  • the systems described in Examples 2.2 to 2.5 were also examined by means of DSC. A measurable decrease in the membrane coating over time was not observed with either DRIFT or DSC.
  • Example 2.2 to 2.5 The systems described in Examples 2.2 to 2.5 were dried and the amount of lipid on them was documented using DRIFT. The samples were then resuspended in the coating buffer and washed three times. After this treatment, the sample was dried again and measured using DRIFT. In all cases, no change in the amount of lipid present on the carrier material was detectable.
  • Example 2.6 The system described in Example 2.6 was kept at -80 ° C. for 3 months after the preparation. At a distance of 1
  • FIG. 2 shows comparative differential calorimetric (DSC) measurements of the phase transition of solid-supported bilayers, consisting of the synthetic lipid Dielaidoyl-sn-3-glycero-3-phosphocholine (hereinafter called DEPC) on a non-optimized
  • Solid surface production according to the state of the art, e.g. C.
  • FIG. 4 shows DSC measurements of DEPC lipid membranes on various complex surfaces. All of the examples shown show almost no shift in the phase transition temperature and only an insignificant broadening of the phase transition itself. 3.6. Comparative deuterium ( 2 H) NMR measurements
  • FIG. 3 shows deuterium ( 2 H) NMR measurements of chain-interpreted dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) -d8 (7.7 ', 8.8') coated non-porous silicate particles with and without an optimized surface in comparison with natural DPPC-d8 (7.7 ⁇ 8.8 ') - vesicles.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • the quadrupole splitting of the signal originating from the selectively deuterated lipid chains is a measure of the molecular order in the bilayer (Seelig, J. Quarterly Reviews of Biophysics 1977, 10, 353-418).

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Immobilisieren von Lipidschichten auf Festkörperoberflächen bereitgestellt, bei welchem die Festkörperoberflächen derart modifiziert werden, dass die darauf deponierten Lipidschichten in ihren Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf Diffusivität, denen nicht-immobilisierter Lipidschichten weitgehend entsprechen. Hierbei wird die Festkörperoberfläche zunächst mit Molekülen so modifiziert, dass eine im wesentlichen hydrophile Fläche ausgebildet wird. In einem zweiten Verfahrensschritt werden auf dieser modifizierten Oberfläche Lipidschichten, insbesondere Lipiddoppelschichten, deponiert.

Description

Verfahren zur Immobilisierung von Lipidschichten
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von auf Oberflächen pulverförmiger Festkörper immobilisierten Lipidschichten sowie modifizierte Festkorperoberflachen, immobilisierte Lipidschichten und einen Kit, der zu deren Herstellung geeignet ist.
Festkörperunterstützte Lipiddoppelschichten (im folgenden Bilayer genannt) und festkörperunterstützte funktioneile Biomembranen mit darin immobilisierten Membranproteinen haben in den letzten Jahren im Bereich des Pharmascreenings, der Chromatographie, der Biosensorik, und für Lipidbindungsstudien an Bedeutung gewonnen. Die ersten in der Literatur beschriebenen festkörperunterstützten Bilayer waren nur durch einen 1 bis 2 nm dicken Wasserfilm von der Festkörperoberfläche entfernt (Tamm, L. K.; McConnell, H. M. Biophysical Journal 1985, 47, 105-113; Johnson, S. J.; Bayerl, T. M.; McDermott, D. C; Adam, G. W.; Rennie, A. R.; Thomas, R. K.; Sackmann, E. Biophysical Journal 1991 , 59, 289-294; Bayerl, T. M.; Bloom, M. Biophysical Journal 1990, 58, 357-362), wodurch wesentliche Bewegungseigenschaften des Bilayers (z.B. Diffusion der Lipide in der Bilayerebene ( . Hetzer, S. Heinz, S. Grage, T. M. Bayerl, Langmuir, 1998, 14, 982-984)) vom Festkörper dominiert wurden. Mit dieser Technik wurden auch in Liposomen rekonstituierte Proteine mittels Fusion auf unbehandelten, planaren Oberflächen immobilisiert (J. Salaf- sky, J. T. Groves, S. G. Boxer, Biochemistry, 1996, 35, 14773 - 14781). Die daraus resultierenden Unterschiede zu natürlichen Zellmembranen sowie der geringe Abstand zwischen Bilayer und Festkörper erschwerten insbesondere die funktioneile Immobilisierung von integralen Membranproteinen. So beschäftigen sich neuere Forschungsarbeiten insbesondere mit einer Erhöhung des Abstandes zwischen Bilayer und Festkörper, um eine dynamische Entkopplung des Bilayers zu erreichen und integralen Membranproteinen im Bilayer einen ausreichend großen Abstand zur häufig denaturierend wirkenden Festkörperoberfläche zu ermöglichen. Dies ist beispielsweise eine Voraussetzung für die Verwendung von lonenkanälen im Bilayer als Biosensor.
Aktuelle Strategien zur Erreichung dieses Ziels bestehen insbesondere darin, Lipidmoleküle über hydrophile Spacer ("Abstandshalter") auf der Festkörperoberfläche chemisch oder physikalisch anzubinden (B. A. Cornell, V. L. Braach-Maksvytis, L. G. King, P. D. Osman, B. Raguse, L. Wieczorek, R. J. Pace, Nature, 1997, 387, 580; S. Lingler, I. Rubinstein, W. Knoll, A. Offenhäuser, Langmuir, 1997, 13, 7085; H. J.Galla, C. Steinern, K. Rheis, Patent DE 19607279), wobei der hydrophile Spacer zur Entkopplung des aus weiteren Lipidmolekülen gebildeten Bilayers vom Substrat dient, indem die gebundenen Lipide als "Anker" wirken und damit die maximale Entfernung zwischen Bilayer und Oberfläche durch die Länge des hydrophilen Spacers vorgeben. Dabei können die Lipidmoleküle entweder an polymere, oligomere oder niedermolekulare Spacer gebunden sein. Nachteilig ist der hohe präparative Aufwand bei diesen Strategien und die Abhängigkeit der Eigenschaften des Bilayers von der lateralen Dichte der Ankermoleküle, von der Hydratisierbarkeit des hydrophilen Spacermaterials sowie von den dynamischen Eigenschaften des Spacers selbst.
Einen weiteren Schritt zu einem weitgehend von der Festkörperoberfläche entkoppelten Bilayer stellt deshalb die Verwendung von Festkorperoberflachen dar, die durch ein hydrophiles Polymer (z.B. Dextran) modifiziert und anschließend mit einem Bilayer beschichtet wurden (M. Kuhner, E. Sackmann, Langmuir, 1996 12 (20), 4866; G. Elender, M. Kuhner, E. Sackmann, Biosens. Bioelectron., 1996, 11 , 565; E. Sackmann, Science, 1996, 271 , 43; E. Györvary, B. Wetzer, U.B. Sieytr, A. Sinner, A. Offenhäusser, W. Knoll, Langmuir 1999, 15, 1337). In diesem Zusammenhang sind auch die im folgenden beschriebenen Arbeiten zu sehen, die als hydrophile Polymere Polyelektrolytmono- oder -multilagen verwenden, um den Bilayer von einer planaren Festkörperoberfläche zu entkoppeln. In (J. Majewski, J.Y. Wong, C.K. Park, M. Seitz, J.N. Israelachvili, G.S. Smith, Biophysical Journal 1998, 75, 2363) ist die Möglichkeit beschrieben, eine bereits bestehende festkörperunterstützte Lipidmembran auf einem planaren Quarzsubstrat durch Behandlung mit einem verzweigten kationischen Polyelektrolyten nachträglich von der Festkörperoberfläche zu entkoppeln, wobei allerdings ein schrittweiser Aufbau bzw. eine direkte Fusion der Vesikel auf der Polykation-Lage nicht zu einem definierten Bilayer führte. In (J.Y. Wong, J. Majewski, M. Seitz, C.K. Park, J.N. Israelachvili, G.S. Smith, Biophysical Journal 1999, 77, 1445) wird gezeigt, daß eine definierte Lipidmembran nur auf einer vorher getrockneten PEI-(Polyethylenimin) Lage erhalten werden kann. Dagegen gelang (U. Sohling, A.J. Schouten, Langmuir 1996, 12, 3912) der Aufbau einer festkörperunterstützten Lipidmembran auf PEI-modifizierten Oberflächen im Falle von negativ geladenen Lipiden. In (B. Lindholm-Sethson, Langmuir 1996, 12, 3305) ist beschrieben, daß definierte Bilayer aus partiell negativ geladenen Lipiden ebenfalls auf anionischen PSS (Na-Polystyrolsulfonat) Oberflächen durch Verwendung von Ca2+-Brücken erhalten werden. In (B. Lindholm- Sethson, J.C. Gonzales, G. Puu, Langmuir 1998, 14, 6705) wird schließlich gezeigt, daß Cytochrom C-Oxidase enthaltende Proteoliposomen auf Polyelektrolytmultilagen funktionell immobilisiert werden können.
Alle diese Arbeiten wurden jedoch auf planaren Substraten vorgenommen, wodurch nur eine geringe Gesamtoberfläche zur Verfügung steht, was beispielsweise chromatographische Anwendungen unmöglich macht, und andere Anwendungen erschwert. Weitere Ansätze zur Herstellung polymerunterstützter Lipidmembranen nutzen sogenannte Filmwaagentechniken wie Langmuir-Blodgett und Langmuir-Schäfer, und sind daher im wesentlichen beschränkt auf planare Oberflächen, und ebenfalls nicht geeignet für bestimmte Anwendungen. Ein Beispiel hierfür ist beschrieben in (H. Hillebrandt, G. Wiegand, M. Tanaka, E. Sackmann, Langmuir 1999, 15, 8451).
Der Verzicht auf Spacerelemente ermöglicht dem Bilayer bei dieser Strategie eine höchstmögliche Entkopplung von der Festkörperoberfläche und gleichzeitig können auf diese Weise integrale Proteine in die Membran eingebettet werden ohne direkt in Kontakt mit dem Festkörper zu gelangen. Das entscheidende Problem dieser Methode ist die Stabilität des Bilayers auf der Polymeroberfläche, die ein wichtiges Kriterium für Anwendungen in der Bioanalytik und Biosensorik ist. Externe Kräfte (z.B. Flußkräfte eines vorbeiströmenden Mediums) führen bei dieser Strategie daher leicht zur Ablösung von Teilen des Bilayers.
Weitere Strategien beruhen auf der Ausbildung von Lipidmonolagen (im folgenden als Monolayer bezeichnet) auf Festkorperoberflachen, die zuvor mittels Alkylsilan- oder Mercaptanmonolagen hydrophobisiert wurden. Der Nachteil ist hier offensichtlich: ein reales Entkoppeln von der Substratoberfläche findet nicht statt, was die Dynamik und molekulare Ordnung der Monolayer signifikant gegenüber denen eines Bilayers verändert (Linseisen, F. M.; Hetzer, M.; Brumm, T.; Bayerl, T. M. Biophysical Journal 1997, 72, 1659-1667) und den Einbau von transmembranen Proteinen erschwert oder gar verhindert. So zeigten C. Steinern et al. (Steinern, C; Janshoff, A.; Galla, H .; Sieber, M., Bioelectrochem. Bioenerg. 1997, 42 (2), 213-220), daß eine Fusion der Proteoliposomen zum Lipidbilayer wahrscheinlich nicht stattfindet, sondern nur eine Anlagerung bzw. Teilfusion, so daß letztlich immobilisierte Vesikel auf der Oberfläche vorliegen. Ältere Arbeiten zu diesem Thema untersuchten diese Möglichkeit nicht bzw. ihre gezeigten funktionellen Daten lassen ebenso die Interpretation zu, daß kein direkter Proteineinbau in einem Lipidbilayer stattfindet und die Enzymaktivität aus den vesikulären Strukturen resultiert.
Die Erfindung stellt sich nun die Aufgabe, ein weitgehend universell anwendbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die beschriebenen Mängel der herkömmlichen Strategien zur Immobilisierung von Lipidschichten vermeidet und auf eine präparativ einfache Art die Entkopplung der Lipidschichten, insbesondere der Lipiddoppelschichten, von der Membran erlaubt. Bei dem neuen Verfahren soll die Festkörperoberfläche derart optimiert werden, daß die Eigenschaften der festkörperunterstützten Lipidschichten bei hoher Stabilität gegen äußere Kräfte möglichst nahe den Eigenschaften natürlicher Membransysteme sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Ansprüche 2 bis 24 dargestellt. Die Ansprüche 25 bis 27 betreffen eine entsprechend modifizierte Festkörperoberfläche, eine immobilisierte Lipidschicht bzw. einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipidschichten. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Festkorperoberflachen zunächst derart modifiziert, daß diese optimale Bedingungen für die schonende Immobilisierung einer über der modifizierten Oberfläche aufgebrachten Lipidschicht, insbesondere Lipiddoppelschicht bzw. Lipidmembran bieten. In einem zweiten Schritt des Verfahrens werden sodann Lipidschichten, beispielsweise Membranen aus nativen Zellen, so auf der modifizierten Oberfläche immobilisiert, daß die Eigenschaften der immobilisierten Lipidschichten im wesentlichen denen nicht- immobilisierter Lipidschichten entsprechen. Bevorzugt erfolgt dabei die Immobilisierung der Lipidschichten mittels Fusion von Vesikeln aus Pufferlösungen.
Bei den genannten Eigenschaften der Lipidschichten handelt es sich zunächst um die Diffusivität der Lipidschicht. Eine nicht-immobilisierte Lipidschicht, insbesondere eine Lipiddoppelschicht, zeichnet sich dadurch aus, daß die einzelnen Lipide und andere Komponenten, beispielsweise Proteine, innerhalb der Schicht und bei einer Doppelschicht auch zwischen den beiden Schichten relativ frei beweglich sind. Bei herkömmlichen Immobilisierungsmethoden wird diese Diffusivität der Lipidschichten extrem herabgesetzt. Bei einer Doppelschicht wird vor allem in der Lipidlage, die der Oberfläche des Substrates zugeordnet ist, die Bewegungsmöglichkeit der Lipide deutlich abgebremst. Dies führt zu einer drastischen Veränderung der Eigenschaften der herkömmlich immobilisierten Membran. Bei der erfindungsgemäßen Immobilisierungsmethode wird die Bewegungsmöglichkeit innerhalb der Lipidschicht nicht eingeschränkt, so daß diese charakteristische Eigenschaft bei den erfindungsgemäß immobilisierten Lipidschichten erhalten bleibt.
Weiterhin wird durch die erfindungsgemäße Immobilisierungsmethode durch die Modifizierung der Festkörperoberfläche eine "weiche" Oberfläche erzielt, die zum einen die darauf immobilisierte Lipidschicht weitgehend unbeeinflußt läßt und zum anderen auch einen ausreichenden Abstand zwischen Festkörperoberfläche und Lipidschicht gewährleistet, so daß keine denaturierenden Effekte der Festkörperoberfläche auf die evtl. in der Lipidschicht enthaltenden Proteine, insbesondere Enzyme, auftreten. Hierdurch wird erreicht, daß Aktivitäten von in der Lipidschicht eingelagerten Proteinen erhalten bleiben. Dieses Merkmal der Erfindung ist ausgesprochen wichtig für die verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung. Vor allem in der Biosensorik sind immobilisierte Membranen, die ihre nativen Eigenschaften, also beispielsweise enzymatische Aktivitäten oder auch Kanalaktivitäten, beibehalten, ausgesprochen wichtig. Mit herkömmlichen Methoden war eine derartige Immobilisierung von Membranen bei Erhalt der nativen Eigenschaften nicht möglich. Durch die Erfindung erschließen sich daher ganz neue Möglichkeiten in der Biosensorik und natürlich auch in ganz verschiedenen anderen Bereichen, wie beispielsweise in der Diagnostik oder in der Forschung allgemein.
Nach dem bisherigen Wissenstand war es nicht vorstellbar, daß solche "dynamisch" immobilisierten Membranen eine ausreichende Stabilität auf dem jeweiligen Träger aufweisen würden. Vielmehr war der Fachmann davon ausgegangen, daß für eine Immobilisierung eine konkrete Fixierung der Membran, insbesondere durch die bereits oben erwähnten Linker, notwendig sei, damit die Membran sich nicht sofort vom Träger wieder ablöst. Die andere bekannte Möglichkeit für eine ausreichend stabil immobilisierte Lipidschicht war ein relativ geringer Abstand der Lipidschicht zum Träger, wie er durch eine oben erwähnte Immobilisierung mit Hilfe von Dextran oder Polyelektrolyten erreicht wird. Der Fachmann war folglich davon ausgegangen, daß eine immobilisierte Membran entweder kovalent fixiert sein muß - mit dem Nachteil der fehlenden Diffusivität innerhalb der Membran - oder daß die Membran sehr nah an den Träger gebracht werden muß, wobei allerdings der Träger denaturierende Effekte auf die Lipidschicht bzw. auf die darin enthaltenen Proteine ausübt.
Die von den Erfindern erzielten Resultate mit erfindungsgemäß modifizierten Membranen stellen daher sehr überraschende Ergebnisse dar, da es sich zeigte, daß die "dynamisch" immobilisierten Lipidschichten derart stabil auf ihren Trägern immobilisiert sind, daß sie für alle denkbaren Anwendungen geeignet ist. Die erfindungsgemäß immobilisierten Lipidschichten weisen einen ausreichenden Abstand von dem Träger auf, so daß keine denaturierenden Effekte des Trägers auftreten. Darüberhinaus werden Linker vermieden, welche die Membran an distinkten Stellen fixieren würden. Hierdurch wird gewährleistet, daß eine erfindungsgemäß immobilisierte Lipidschicht ihre dynamischen Eigenschaften, insbesondere die Diffusivität der verschiedenen Lipidschichtkomponenten und Aktivitäten von möglichen weiteren Schichtkomponenten, beibehält.
In der nachfolgenden Beschreibung werden einige Fachbegriffe aus der Biophysik und der Oberflächen- und Polymerchemie verwendet, die hier kurz erläutert werden. Für eine ausführliche Erläuterung sei auf die Fachliteratur verwiesen (A. Ulman "An Introduction to Ultrathin Organic Films", Academic Press, Inc., 1991 ; Albert L. Lehninger "Prinzipien der Biochemie" Walter de Gruyter 1987; R. W. Armstrong, U. P. Strauss "Polyelectrolytes" in "Enzyclopedia of Polymer Science and Technology", Eds. A. Klingsber, R. M. Piccinne, A. Salvatore, John Wiley and Sons, 1969, Volume 10, 781 ; M. Mandel "Polyelectrolytes" in "Enzyclopedia of Polymer Science and Technology", Eds. N. M. Bikales, J. Conrad, A. Ruks, John Wiley and Sons, 1988, Volume 11 , 739; H. G. M. van de Steg, M. A. Cohen Stuart, A. de Keizer, B. H. Bijsterbosch, Langmuir, 1992, 8, 2538).
Die im nachfolgenden Text beschriebenen "Polyionen" beschreiben allgemein Polymere, die ionische und/oder ionisierbare Funktionalitäten entweder in den Seitenketten und/oder entlang der Hauptkette tragen. Unter Polyionen sollen nachfolgend die Molekülklassen "Polyelektrolyte", "Polyampholyte" und "Polyzwitterionen" verstanden werden.
"Polyelektrolyte" sind Polymere, die ionische oder ionisierbare Gruppen in der Haupt- oder Seitenkette eingebaut haben. "Polyelektrolyte" im nachfolgend verwendeten Sinn können auch Copolymere aus ionischen/ionisierbaren und nichtionischen Monomereinheiten sein. Polyelektrolyte können sowohl in anionischer wie auch in kationischer Form vorliegen. Beispiele für anionische Polyelektrolyte sind Poly(styrolsulfonsäure), Polyvinyl(sulfonat), Poly(acrylsäure),
Dextransulfat, PAMAM-Dendrimere (Poly(amidoamine),
Carboxylterminierte, halbzahlige Generation) und Carboxycellulose. Komplexere Formen anionischen Polyelektrolyten sind beispielsweise Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA). Beispiele für kationische Polyelektrolyte sind Poly(allylaminhydrochlorid), Poly(vinyl- amin), Poly(ethylenimin), Poly(diallylammoniumchlorid), PAMAM- Dendrimere (Aminoterminierte, ganzzahlige Generation) und Poly(2-vinylpyridin). Beispiele für ionische Copolymere sind Poly(acrylsäure-co-acrylamid) und Poly(diallylammonium- chlorid-co-acrylamid). Aus dieser kurzen Auflistung ist ersichtlich, daß typische funktionelle Gruppen anionischer Polyelektrolyte Carboxyl-, Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat- und Phosphonatgruppen sind. Typische kationische Funktionalitäten sind primäre, sekundäre, tertiäre und quaternäre Amin-, sowie auch R3S(+)-Gruppen. '
Der Gruppe der Polyelektrolyte verwandte Polymere sind Polyampholyte, die in der Haupt- oder Seitenkette ionisierbare funktioneile Gruppen tragen, und deren Netto-Ladungszustand von dem pH- Wert der Lösung abhängt. Unter Polyampholyten im allgemeinen Sinn sollen auch Proteine und Enzyme verstanden werden.
Eine weitere Gruppe ionischer Polymere sind Polyzwitterionen, die in der Haupt- oder Seitenkette permanente anionische und kationische Ladungen tragen.
Die im nachfolgenden Text verwendeten Begriffe "Bilayer", "Lipidmembran" und "Lipidbilayer" sind synonym und beziehen sich auf eine Lipiddoppelschicht, die aus einem hydrophoben inneren Bereich und einem hydrophilen äußeren Bereich besteht, und die beispielsweise bei der Selbstorganisation von natürlichen und synthetischen Lipiden oder lipid-ähnlichen Substanzen in einer wäßrigen Phase spontan entstehen, oder durch Übertragungstechniken (Langmuir-Blodgett-Technik) erzeugt werden können.
Der Begriff "Vesikel" bezieht sich auf uni- und multilamellare Aggregatformen, die Lipide und lipidähnliche Substanzen bei Quellung in wäßriger Phase spontan, oder unter äußerem Einfluß, wie beispielsweise durch Behandlung mit Ultraschall oder durch Hochdruckfiltration (Extrusion), ausbilden.
Der im folgenden Text verwendete Begriff "Substrate" bezieht sich auf in wäßriger Lösung unlösliche Festkörper aus organischem oder anorganischem Material, die als ausreichend feste Oberflächen (Festkorperoberflachen) nach der Optimierung zur Unterstützung der Lipidschichten dienen.
Die Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur Optimierung der Oberflächeneigenschaften von pulver- oder partikelförmigen Substraten beliebiger Geometrie mit dem Ziel, die Eigenschaften der hierauf zu deponierenden Lipidschichten möglichst weit an jene einer natürlichen Membran anzunähern und gleichzeitig die Immobilisierung integraler Membranproteine ohne signifikanten Verlust ihrer Aktivität zu ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich in zwei Verfahrensschritte unterteilen. Dies ist zum einen (a) die Modifizierung der Festkörperoberfläche (Substratoberfläche) mit Molekülen zur Ausbildung einer im wesentlichen hydrophilen Fläche und (b) das Deponieren der Lipidschichten auf der modifizierten Festkörperoberfläche. Diese Verfahrensschritte sind schematisch der Figur 1 zu entnehmen, wobei der pulverförmige Charakter des Festkörpers nicht dargestellt ist. Durch den ersten Verfahrensschritt wird eine geeignete Modifizierung der Substratoberfläche erreicht, die eine weitgehende Entkopplung der im zweiten Verfahrensschritt zu deponierenden Lipidschicht vom Substrat bei gleichzeitiger hoher morphologischer Integrität und Stabilität gewährleistet. Hierbei wird die Verwendung von kovalent an das Substrat gebundenen Spacerelementen vermieden. Die immobilisierte Lipidschicht ist also frei, d.h. ohne punktuelle Verbindung an das Substrat, auf der modifizierten Oberfläche immobilisiert.
Durch die Modifizierung der Oberfläche gemäß Verfahrensschritt (a) kann insbesondere die Ausbildung einer hydrophilen Oberfläche erreicht werden, die ionische Gruppen trägt, d.h. vorzugsweise funktionelle Gruppen, die in wässriger Umgebung dissoziieren.
Darüberhinaus ist die entstehende festkörperunterstützte Lipidschicht den Eigenschaften ihres natürlichen (festkörperunabhängigen) Analogons (z.B. dem Lipidvesikel im Fall von reinen Lipiden oder der Biomembran im Fall von natürlichen Lipidmischungen mit Proteinen, insbesondere Transmembranproteinen) sehr ähnlich.
Für die Modifizierung der Festkörperoberfläche (Verfahrensschritt (a)) sind im wesentlichen zwei Schritte notwendig. Zunächst (aa) wird die Festkörperoberfläche funktionalisiert, d.h. es werden funktionelle Gruppen, insbesondere chemisch funktionelle Gruppen, auf der Oberfläche fixiert. In einem weiteren Schritt (ab) werden auf der funktionalisierten Oberfläche wechselwirkende Moleküle adsorbiert/chemisorbiert. Weiterhin können in einem dritten Schritt (ac) weitere Moleküle adsorbiert oder chemisorbiert werden. Diese Moleküle können identisch mit den in Schritt (ab) eingesetzten Molekülen sein, oder es kann eine andere Molekülspezies für diesen weiteren Schritt verwendet werden. Darüberhinaus kann die Modifizierung auch noch weitere entsprechende Teilschritte umfassen. Dies kann dann von Nutzen sein, wenn der Abstand der Lipidschicht zur Festkörperoberfläche besonders groß ausgebildet sein soll. Eine Modifizierung in wenigen Schritten ist jedoch oft auch im Hinblick auf den präparativen Aufwand besonders vorteilhaft und bevorzugt.
Das Aufbringen der entsprechenden Moleküle kann beispielsweise durch Deposition aus einer Lösung oder aus der Gasphase vorgenommen werden.
Die Modifizierung der Oberfläche kann auch in einem Schritt durchgeführt werden, insbesondere wenn ein geeignetes oberflächenmodifizierendes Material kommerziell erhältlich ist.
Durch eine entsprechende Modifizierung der Festkörperoberfläche (Verfahrensschritt (a)) wird die Ausbildung einer hydrophilen Oberfläche auf dem Substrat erreicht. Hierdurch wird eine spontane Bildung einer Lipidschicht, insbesondere eines Bilayers, auf der modifizierten Oberfläche (Verfahrensschritt (b)) ermöglicht. Dies kann bevorzugt durch eine herkömmliche Vesikelfusion auf der Oberfläche erzielt werden.
Nach beiden Verfahrensschritten (a) und (b) - Modifizierung der Oberfläche und Deponierung bzw. Immobilisierung der Lipidschicht - ist das Ergebnis eine stabile festkörperunterstützte Lipidschicht, vorzugsweise ein Bilayer oder eine festkörperunterstützte Biomembran mit enzymatischer Aktivität der in ihr immobilisierten Proteine. Die Topologie der Lipidschicht bzw. Bilayer- oder Membranoberfläche ist hierbei weitgehend durch die des Substrates, also der Festkörperoberfläche, vorgegeben. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich vorzugsweise also dadurch aus, daß anorganische und/oder organische Festkorperoberflachen chemisch und/oder physikalisch derart modifiziert werden, daß a) die Oberflächeneigenschaften des Trägermaterials (Substrats) in gezielter Weise beeinflußbar und einstellbar sind; b) das Aufbringen einer Lipidschicht auf die modifizierte Festkörperoberfläche ermöglicht wird; c) die Lipidschicht durch physikalische und/oder chemische Kräfte so an die modifizierte Festkörperoberfläche gebunden wird, daß sie diese vollständig umschließt, ohne daß jedoch die Diffusion der Lipidschichtbestandteile innerhalb der Schicht wesentlich beeinträchtigt ist; d) die Eigenschaften der immobilisierten Lipidschicht, insbesondere einer Lipidmembran, möglichst nahe den Eigenschaften der nicht- immobilisierten Lipidschicht bzw. der natürlichen Lipidmembran sind.
Kriterien für den Vergleich der Eigenschaften der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen immobilisierten Lipidschicht mit denen ihrer festkörperfreien Analoga sind beispielsweise Messungen der Phasenübergangstemperatur mittels Differential-Mikrokalorimetrie (DSC), Messung der Fluidität und Mobilität mittels Festkörper-Kernresonanz (NMR) oder Bestimmung der Funktionalität bzw. Aktivität immobilisierter Membranproteine.
Bei dem bevorzugten ersten Teilschritt der Modifizierung der Festkörperoberfläche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren (Teilschritt (aa)) werden funktionelle Gruppen auf der Festkörperoberfläche eingeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform geschieht dies durch eine Aminofunktionalisierung, Epoxyfunktionalisierung, Halogenalkylfunktionalisierung und/oder Thiofunktionalisierung. Dies erfolgt dadurch, daß die Festkörperoberfläche mit entsprechend funktioneilen Molekülen behandelt wird. Vorzugsweise werden hierfür die Moleküle, die die funktionellen Gruppen enthalten, in einer Lösung, beispielsweise in einer wässrigen Lösung, gelöst und das Oberflächenmaterial in diese Lösung gegeben bzw. die Lösung auf das Oberflächenmaterial aufgebracht. Die Inkubation kann beispielsweise bei Raumtemperatur über einige Stunden erfolgen. Je nach gewähltem Material können natürlich auch andere Reaktionsbedingungen gewählt werden. Weiterhin stellen die aufgezählten Funktionalitäten lediglich Beispiele dar, die von einem Fachmann um zusätzliche geeignete Möglichkeiten erweitert werden können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für die Funktionalisierung Silane eingesetzt, die eine entsprechende Funktionalität tragen. Besonders geeignet sind hierfür mono-, di- oder trifunktionelle Silane. Es kann sich hierbei also folglich um aminofunktionelle, epoxyfunktionelle, halogenalkylfunktionelle und/oder thiofunktionelle Silane handeln.
Ein Beispiel für ein besonders geeignetes aminofunktionelles Silan ist N- (2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan (EDA). Geeignete epoxy- funktionelle, halogenalkylfunktionelle bzw. thiofunktionelle Silane sind [3- (2,3-Epoxypropoxy)-propyl]trimethoxysilan (EPOXY), [3- lodopropyljtrimethoxysilan bzw. [3-Thiopropyl]trimethoxysilan.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden für die Funktionalisierung Mercaptane und/oder Disulfide eingesetzt. Die Funktionalisierung mit Mercaptanen ist vor allem für metallische Festkorperoberflachen zu bevorzugen. Als Disulfide sind besonders Alkyldisulfide geeignet. Vorteilhafterweise tragen die Mercaptane und Disulfide funktionelle Gruppen.
Entsprechend wie bei den oben erwähnten Silanen können Mercaptane unterschiedlicher Funktionalität verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als aminofunktionelles Mercaptan Cysteaminhydrochlorid und/oder Cysteamin eingesetzt. Selbstverständlich können auch andere Mercaptane, beispielsweise auch epoxyfunktionelle oder halogenalkylfunktionelle Mercaptane mit Erfolg eingesetzt werden.
Weiterhin können auch andere funktionelle Moleküle für eine Funktionalisierung der Festkörperoberfläche verwendet werden. Ein besonders geeignetes Beispiel hierfür ist Polyethylenimin (PEI), welches Aminofunktionen auf die Oberfläche bringt.
Als zweiter bevorzugter Teilschritt der Modifizierung der Festkörperoberfläche (Teilschritt (ab)) werden wechselwirkende Moleküle auf der funktionalisierten Oberfläche absorbiert. Diese Absorption an die funktionalisierte Oberfläche erfolgt insbesondere durch Wechselwirkung mit den funktioneilen Gruppen, die in dem ersten Teilschritt auf die Oberfläche aufgebracht wurden. Es kann sich hierbei auch um eine sogenannte Chemisorption handeln, bei welcher kovalente Bindungen zwischen den wechselwirkenden Molekülen und den auf der Oberfläche angebrachten funktioneilen Gruppen ausgebildet werden. Es kann sich jedoch auch um andere Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden Molekülen und der funktionalisierten Oberfläche handeln, hierfür kommen beispielsweise elektrostatische Wechselwirkungen und auch van der Waalsche Kräfte in Frage.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als wechselwirkende Moleküle Polymere eingesetzt. Dies können auch Biopolymere sein. Selbstverständlich können auch Monomere verwendet werden. Als Polymere sind besonders Polyelektrolyte, Polyampholyte und/oder Polyzwitterionen geeignet. Als Polyelektrolyte kommen vorzugsweise anionische Polyelektrolyte zum Einsatz. Zu den Polyampholyten zählen bekanntermaßen auch Proteine, die für diesen Teilschritt der Modifizierung der Festkörperoberfläche sehr geeignet sein können.
Einige Beispiele für Polyanionen bzw. anionische Polyelektrolyte, die besonders geeignet sind, sind Polysulfate, Polysulfonate, Polycarboxylate, Polyphosphate und deren freie Säuren, Polystyrolsulfonsäure, Polystyrolsulfonat (PSS), PAMAM-Dendrimere (Carboxylterminierte, halbzahlige Generation), Polyacrylsäure, Polyacrylat, Polymethacrylsäure, Polymethacrylat, Dextransulfat, Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure. Beispiele für geeignete Polykationen sind Polyamine und deren Salze, Polyethylenimin, Polyallylamin, PAMAM-Dendrimere (Aminoterminierte, ganzzahlige Generation), Polyvinylamin, Polylysin, Poly(vinylpyridin) und deren Salze sowie Poly(diallyldimethylammoniumchlorid).
Ein Beispiel für ein geeignetes Protein, welches als wechselwirkendes Molekül erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist Rinderserumalbumin (BSA). Es sind natürlich auch eine Vielzahl von weiteren Proteinen geeignet, insbesondere auch Enzyme.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als wechselwirkende (reaktive) Moleküle Substanzen eingesetzt, die mit der funktionalisierten Oberfläche kovalente Wechselwirkungen eingehen, wobei also eine sogenannte Chemisorption stattfindet. Besonders bevorzugt sind hierbei aminoreaktive Moleküle, die als wechselwirkende Moleküle für eine aminofunktionalisierte Oberfläche eingesetzt werden.
Besonders geeignete Beispiele hierfür sind die Polymere Poly(styrol-co- Maleinsäureanhydrid) (PSPMA) und Poly(ethylen-co-
Maleinsäureanhydrid) (PEPMA). Weitere geeignete aminoreaktive Substanzen sind S.S'^^'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid und S.S'^^'-Biphenyltetracarbonsäuredianhydrid.
Neben diesen aminoreaktiven Substanzen bzw. Polymeren werden weitere wechselwirkende bzw. reaktive Moleküle von der Erfindung mitumfasst, die sich einem Fachmann aus dem bisher Gesagten ohne weiteres erschließen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Oberfläche im ersten Teilschritt der Modifizierung mit epoxyfunktionellen Gruppen versehen, und in dem zweiten Teilschritt der
Modifizierung mit entsprechend geeigneten epoxyreaktiven Molekülen behandelt. Beispiele für epoxyreaktive Polymere sind Polyethylenimin,
Polyallylamin, Polyallylaminhydrochlorid, Polyvinylamin, Poly(ethylengly- kol), Polyvinylalkohol und Dextran. Wie ersichtlich können Polyamine sowohl in einem einstufigen Prozess als Funktionalisierungsschicht, als auch in zweistufigen Prozessen als wechselwirkende Schicht aufgebracht werden. Dies ist immer dann von Vorteil, wenn in dem ersten Schritt die ursprünglichen Eigenschaften des Festkörpers durch eine kovalente Umsetzung der Oberflächenfunktionalitäten verändert werden sollen.
Auch für eine epoxyfunktionalisierte Oberfläche ist der Einsatz von Proteinen, insbesondere von Enzymen, als wechselwirkende Moleküle geeignet. Als weitere epoxyreaktive Substanzen kommen Natriumthiosulfat, Ethylendiaminhydrochlorid oder Taurin in Frage.
Durch den Einsatz von geladenen Molekülen, insbesondere Polymeren, bei der Modifizierung der Oberfläche können die Oberflächeneigenschaften dahingehend optimiert werden, daß die dem Oberflächenmaterial eigenen unerwünschten Ladungseffekte minimiert werden. Eine entsprechende Auswahl der hierfür geeigneten Reagenzien ist je nach dem gewünschten Versuchsziel zu treffen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zwischen der Festkörperoberfläche und der aufzubringenden Lipidschicht weitere Moleküle, die insbesondere eine weitere Funktionalität der Oberfläche bewirken, eingefügt. So ist es beispielsweise möglich, Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, Nanopartikel oder Biomoleküle, wie beispielsweise Proteine, insbesondere Enzyme, in die modifizierte Oberflächenschicht zu integrieren. Dies ermöglicht den Einbau von Sondenmolekülen in das System festkörperunterstützter Lipidschichten bzw. Lipidmembranen. Weiterhin ist es so möglich, chemisch oder photochemisch reaktive Funktionalitäten in die modifizierte Oberfläche einzubauen, was beispielsweise zur kovalenten Immobilisierung von transmembranen Proteinen in einer ansonsten fluiden, d.h. im wesentlichen flüssigen, Lipidmembran genutzt werden kann. Diese zusätzlich einzubringenden Funktionalitäten können beispielsweise kovalent oder auch über andere Wechselwirkungen mit der Festkörperoberfläche verbunden sein.
Als Festkorperoberflachen, also als Träger für die zu immobilisierende Lipidschicht oder Membran, kommen im Prinzip alle im Stand der Technik bekannten pulverförmigen Trägermaterialien in Frage. Vorteilhafterweise können diese Trägermaterialien auch porös sein, um eine noch größere Oberfläche zur Verfügung zu stellen.
Als Festkorperoberflachen sind insbesondere Silikatoberflächen bzw. Silikatpartikel geeignet. Weiterhin können poröse oder nicht-poröse Aluminate, Borate oder Zeolithe mit Erfolg eingesetzt werden. Außerdem geeignet sind kolloidale Lösungen von Edelmetallen, Metallen usw.. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden als Festkorperoberflachen pulverförmige und vorzugsweise poröse Polymeroberflächen eingesetzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Festkorperoberflachen magnetische Träger eingesetzt, beispielsweise Polymerkügelchen mit einem Magnetkern. Weiterhin können mit Vorteil Kern-Schalen-Polymerpartikel als Trägermaterial verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden solche Materialien als Festkörperoberflächenmaterial eingesetzt, die in chromatographischen Säulen als Packungsmaterial üblicherweise verwendet werden.
Darüberhinaus können als Oberflächenmaterialien Filme aus pulverförmigen Metallen, Halbleitern, Edelmetallen und/oder Polymeren eingesetzt werden, die auf insbesonders weitgehend planaren Trägermaterialien aufgebracht sind oder auf diesen aufgebracht werden können. Bei diesen Trägermaterialien kann es sich beispielsweise um Unterlagen aus Papier, Glass, Kunststoff oder dergleichen handeln, mit denen die Festkörper in geeigneter Weise verbunden werden, insbesondere durch verkleben oder verschmelzen.
Die Modifizierung der Festkörperoberfläche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren macht die Oberfläche für die Immobilisierung von ganz unterschiedlichen Lipidschichten geeignet. Ganz besonders ist diese modifizierte Festkörperoberfläche für eine Immobilisierung von Lipiddoppelschichten, und insbesondere für eine Immobilisierung von Lipidmembranen geeignet. Lipiddoppelschichten bzw. Lipidmembranen sind auch von besonderem Interesse für die verschiedenartigen Anwendungen der Erfindung in der Forschung, Diagnostik und vor allem in der Biosensorik, wobei die nativen Eigenschaften solcher Schichten als Modelle für natürliche Systeme genutzt werden können.
Erfindungsgemäß setzen sich die Lipidschichten aus Substanzen aus den Stoffklassen der Lipide, Lipidderivate, lipidähnlichen und/oder lipidanalogen Stoffe zusammen. Weiterhin können die Lipidschichten auch Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, ionische oder nichtionische Tenside und/oder Polymere aufweisen. Durch diese weiteren Komponenten in den immobilisierten Lipidschichten können natürliche Systeme abgebildet werden, indem in den Lipidschichten beispielsweise Kanalproteine oder Enzyme enthalten sind. Diese zusätzlichen Komponenten können sich auf der Oberfläche der Lipidschicht oder eingebettet in der Lipidschicht, also integral, befinden. Weiterhin können sich die zusätzlichen Komponenten durch die ganze Schicht bzw. Membran hindurch, also transmembran (schichtdurchspannend), erstrecken. Bei diesen Proteinen kann es sich um Enzyme, Rezeptoren und/oder Liganden handeln, wobei sich die Rezeptoren und/oder Liganden vorzugsweise auf der dem Träger abgewandten Oberfläche der Lipidschicht zumindest teilweise orientieren. Weiterhin kann die Lipidmembran aus Proteoliposomen aufgebaut sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei den zu immobilisierenden Lipidschichten zumindest teilweise um Membranfragmente aus natürlichen Zellen. Selbstverständlich können auch entsprechende künstliche Lipidschichten bzw. Membranen in vitro aus verschiedenen Komponenten zusammengefügt werden, so daß hierdurch ein entsprechendes Membranmodell zur Verfügung gestellt wird. In besonders bevorzugter Weise werden jedoch Membranen von natürlichen Zellen isoliert und auf den erfindungsgemäß modifizierten Oberflächen deponiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die immobilisierte Lipidschicht, insbesondere die Lipidmembran, Proteine auf, die vorzugsweise transmembran und/oder integral angeordnet sind, wobei diese Proteine wasserlösliche Proteine peripher binden können bzw. gebunden haben. Das Deponieren der Lipidschichten auf der modifizierten Festkörperoberfläche geschieht vorzugsweise durch herkömmliche Fusion von Lipidvesikeln. Bei diesen Vesikeln kann es sich um Vesikel definierter Zusammensetzung aus beispielsweise Phospholipiden handeln. Andererseits ist es natürlich auch möglich, Membranvesikel aus natürlichem Material zu isolieren und im Sinne der erfindungsgemäßen Erfindung zu verwenden. Besonders geeignet hierfür sind beispielsweise Membranvesikel, die aus dem sarkoplasmatischen Retikulum gewonnen werden. Die Bereitstellung der Vesikel erfolgt nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind. Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß derartige Vesikel lediglich mit der erfindungsgemäß modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden müssen, wodurch die Vesikel spontan miteinander verschmelzen und eine Lipidschicht ausbilden. Von daher handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein ausgesprochen leicht zu handhabendes System, welches lediglich geringen präparativen Aufwand erfordert.
Die Erfindung umfasst ferner eine modifizierte Festkörperoberfläche, wie sie gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar ist. Weiterhin umfasst sie eine entsprechend immobilisierte Lipidschicht auf einer modifizierten Festkörperoberfläche. Bezüglich der Merkmale der modifizierten Festkörperoberfläche bzw. der immobilisierten Lipidschicht wird auf die obige Beschreibung Bezug genommen.
Schließlich umfasst die Erfindung einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipidschichten auf Festkorperoberflachen. Ein solcher Kit umfasst mindestens eine modifizierte Festkörperoberfläche gemäß der obigen Beschreibung. In einer anderen Variante umfasst der Kit Reagenzien zur Herstellung einer entsprechend modifizierten Festkörperoberfläche. Weiterhin kann es vorgesehen sein, daß der Kit zusätzlich Reagenzien zur Deponierung von Lipidschichten auf einer modifizierten Festkörperoberfläche aufweist. Es kann jedoch auch bevorzugt sein, daß diese Reagenzien von dem jeweiligen Anwender selbst bereitgestellt werden. Dies gilt vor allem dann, wenn es darum geht, Membranen aus natürlichen Systemen zu isolieren und diese erfindungsgemäß zu immobilisieren.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung Beispielen in Verbindung mit den Figuren und den Unteransprüchen. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren ist das folgende dargestellt:
Figur 1 zeigt schematisch die Vorgehensweise beim erfindungsgemäßen Verfahren.
Figur 2 zeigt DSC-Meßkurven von mit Dielaidoylphosphatidylcholin (DEPC) beschichteten, porösen Silikatpartikeln mit und ohne optimierter Oberfläche im Vergleich mit natürlichen DEPC-Vesikeln ohne Trägermaterial.
Figur 3 zeigt Deuterium (2H)-NMR-Spektren von mit selektiv kettendeuteriertem Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC)-dδ (7,7, I8,8'-D2) beschichteten, nichtporösen Silikatpartikeln mit und ohne optimierter Oberfläche im Vergleich mit natürlichen DPPC-d8 (7,7', 8,8')- Vesikeln ohne Trägermaterial.
Figur 4 zeigt DSC-Messungen von DEPC-beschichteten, porösen
Silikatpartikeln auf komplexen, optimierten Oberflächen. Beispiele
1. MODIFIZIERUNG DER FESTKÖRPEROBERFLÄCHE 1.1. FUNKTIONALISIERUNG DER FESTKÖRPEROBERFLÄCHE 1.1.1 Amϊnofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatoberflächen mit N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan (EDA)
Eine Silanlösung, bestehend aus 1 ,05 ml N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopro- pyltrimethoxysilan (EDA) und 27 μl konzentrierter Essigsäure in 100 ml entionisiertem Wasser, wurde frisch hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 5 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 4000-30 von Macherey-Nagel, Düren) zu der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt. Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach wird das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wird mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert.
1.1.2. Aminofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatoberflächen mit Polyethylenimin (PEI)
Zu einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg PEI (50% Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 ml entionisiertem Wasser wurden 5 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 4000-10 von Macherey-Nagel, Düren) gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wurde mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert. 1.1.3. Thiofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatoberflächen
Eine Silanlösung, bestehend aus 1 ml Mercaptopropyl-trimethoxysilan (THIO) in 50 ml 2-Propanol, wurde frisch hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 5 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 4000-30 von Macherey-Nagel, Düren) zu der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt. Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und der Überstand entfernt. Das Material wurde zunächst bei 80°C getrocknet und eine Stunde bei 100°C getempert. Danach wurde dreimal mit 2-Propanol gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1.1.4. Epoxyfunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatoberflächen
Eine Silanlösung, bestehend aus 2 ml [3-(2,3-Epoxypropoxy)- propyljtrimethoxysilan (GPS) in 100 ml 2-Propanol wurde frisch hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 10 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 4000-30 von Macherey-Nagel, Düren) zu der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt. Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und der Überstand entfernt. Das Material wurde zunächst bei 80°C getrocknet und eine Stunde bei 100°C getempert. Danach wurde dreimal mit 2-Propanol gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wird mittels DRIFT dokumentiert. 1.1.5. Aminofunktionalisierung von magnetischen Partikeln mit Polyethylenimin (PEI)
2 ml einer Suspension von magnetischen Polystyrolpartikeln (DynabeadsR M-280, Tosylactivated, der Firma Dynal, Oslo, Norwegen) werden mit 0,1 M NaCl in Wasser gewaschen. Zu der entstehenden Suspension werden 5 ml einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg PEI (50% Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 ml 0,1 M NaCl in entionisiertem Wasser gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach werden die Partikel mit Hilfe eines Magneten abgetrennt und dreimal mit 0,1 M NaCl in Wasser gewaschen. Der Erfolg der Umsetzung wird mittels Titration bestimmt.
1.2. ADSORPTION/CHEMISORPTION VON WECHSELWIRKENDEN MOLEKÜLEN 1.2.1. Adsorption von Na-Polystyrolsulfonat (PSS) auf
EDA-funktionalisierten Silikatoberflächen
Zu einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung bestehend aus 12,5 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml entionisiertem Wasser wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. aminofunktionalisiertem Silikatmaterial gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels DRIFT und der Abnahme der PSS-Konzentration in der Lösung dokumentiert.
1.2.2. Adsorption von Na-Polystyrolsulfonat (PSS) auf
PEI-funktionalisierten Silikatoberflächen Zu einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung, bestehend aus 25 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml entionisiertem Wasser, wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.2. aminofunktionalisiertem Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels DRIFT und der Abnahme der PSS-Konzentration in der Lösung dokumentiert.
1.2.3. Adsorption von Na-Polystyrolsulfonat (PSS) auf aminofunktionalisierten pulverförmigen Polymeroberflächen
Zu einer Lösung bestehend aus 3 ml 0,1 molarer Na-Polystyrolsulfonat (Aldrich, Steinheim)-Lösung sowie 5 ml einer 4,8 molaren NaCI-Lösung wurden 4 ml einer Latexdispersion, bestehend aus aminofunktionalisiertem Polystyrol-Iatices (K2-080, Prolabo, France), gegeben und über Nacht geschüttelt. Danach wurde das modifizierte Polymermaterial durch Zentrifugation abgetrennt. Zum Waschen wurde das abgesetzte Polymermaterial in 10 ml entionisiertem Wasser resuspendiert, geschüttelt und im Anschluß wieder zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde insgesamt viermal wiederholt und das Polymermaterial abschließend in 4 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Der Erfolg der Adsorption wurde durch Titration der Oberflächenladungen dokumentiert.
1.2.4. Chemisorption von Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid)
(PSPMA) auf EDA-funktionalisierten Silikatoberflächen
Zu einer Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid) (PSPMA)-Lösung, bestehend aus 250 mg PSPMA (Aldrich, Steinheim) in 200 ml Aceton wurden 5 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. aminofunktionalisiertem
Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit Aceton gewaschen. Der Erfolg der Chemisorption wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1.2.5. Chemisorption von Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid) (PSPMA) auf PEI-funktionalisierten Silikatoberflächen
Zu einer Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid) (PSPMA)-Lösung, bestehend aus 250 mg PSPMA (Aldrich, Steinheim) in 200 ml Aceton wurden 5 g eines entsprechend Beispiel 1.1.2. aminofunktionalisiertem Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit Aceton gewaschen. Der Erfolg der Chemisorption wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1.2.6. Adsorption von Rinderserumalbumin (BSA) auf EDA- funktionalisierten Silikatoberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. funktionalisierten EDA-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 220 mg Rinderserumalbumin (BSA, von Sigma-Aldrich, Steinheim) in 50 ml eines 25 mM HEPES-Puffer pH 7,1 (Puffer A), gegeben und drei Stunden rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Puffer A gewaschen und anschließend getrocknet. Der Erfolg der Beschichtung wurde durch DRIFT und Messung der Abnahme der BSA-Konzentration in der Lösung dokumentiert.
1.2.7. Adsorption von Natriumthiosulfat auf epoxyfunktionalisierten Silikatoberflächen
Zur Herstellung einer anionischen Oberfläche wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.4. hergestellten Materials für 16 h in einer 0,1 molaren Natriumthiosulfatlösung rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert, dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und bei 80°C getrocknet. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1.2.8. Chemisorption von Poylethylenimin auf epoxyfunktio nalisierte Silikatoberflächen
Zu einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg PEI (50% Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 mL entionisiertem Wasser wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.4. hergestellten Materials gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wird mittels DRIFT dokumentiert.
1.2.9. Adsorption von Polyallylaminhydrochlorid (PAH) auf PSS- funktionalisierten Silikatoberflächen und weitere Adsorption von
PSS
Zur Herstellung einer modifizierten Oberfläche in einem mehrstufigen Verfahren wurden zu einer Polyallylaminhydrochlorid (PAH)-Lösung, bestehend aus 12,5 mg PAH (Aldrich, Steinheim) in 25 ml entionisiertem Wasser, 1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. PSS-funktionalisiertem Silikatmaterial gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels DRIFT dokumentiert. 0,5 g des erhaltenen PAH-funktionalisierten Silikatmaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 10 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 10 ml entionisiertem Wasser gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels DRIFT dokumentiert. 1.2.10. Adsorption von Na-Polystyrolsulfonat (PSS) auf PEI- funktionalisierte magnetische Partikeln
Zu der entsprechend Beispiel 1.1.5. hergestellten Suspension werden 5 ml einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung bestehend aus 12,5 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml 0,1 M NaCl in entionisiertem Wasser gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach werden die Partikel abgetrennt und dreimal mit 0,1 M NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wird mittels Titration und der Abnahme der PSS-Konzentration dokumentiert.
1.3. EINFÜGUNG WEITERER FUNKTIONELLER MOLEKÜLE IN DIE MODIFIZIERTE OBERFLÄCHE 1.3.1. Herstellung photoreaktiver Oberflächen auf PSS/EDA- funktionalisierten Silikatoberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. funktionalisierten EDA/PSS-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 0,2 g S.S'^^'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid (BPA) in 25 ml Aceton, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Aceton gewaschen und getrocknet. Der Erfolg der Behandlung wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1.3.2. Herstellung photoreaktiver Oberflächen auf EDA- funktionalisierten Silikatoberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1 funktionalisierten
EDA-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 0,2 g 3,3',4,4'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid (BPA) in 25 ml Aceton, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Aceton gewaschen und getrocknet. Der Erfolg der Behandlung wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1.3.3. Herstellung von Anhydridoberflächen auf PSS/EDA- funktionalisierten Silikatoberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. funktionalisierten EDA/PSS-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 0,1 g S^'^^'-Biphenyltetracarbonsäuredianhydrid in 25 ml Aceton, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Aceton gewaschen und getrocknet.
1.3.4. Herstellung von Farbstoffoberflächen auf PSS/EDA- funktionalisierten Silikatoberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. funktionalisierten EDA/PSS- Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 2 mg Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in 10 ml Ethanol, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Ethanol gewaschen und getrocknet.
1.4. LIPIDANKER
1.4.1. Herstellung von Lipidankern aus chemisch reaktiven Oberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.4. hergestellten EDA/PSPMA-Ma- terials wurde für 16 Stunden in einer Lösung von 50 mg Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in Triethylamin/Chloroform rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert und dreimal mit Chloroform gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT dokumentiert. 1.4.2. Herstellung von Lipidankern aus ionischen Oberflächen
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. hergestellten EDA/PSS-Materials wurde für 16 Stunden in einer Lösung von 50 mg Dioctadecyldimethylammoniumbromid (DODAB) in Chloroform rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert und dreimal mit Chloroform gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT dokumentiert.
2. DEPOSITION VON LIPIDSCHICHTEN AUF DEN
MODIFIZIERTEN OBERFLÄCHEN 2.1. Herstellung von Lipidvesikel zur Immobilisierung auf pulverförmigen Oberflächen
80 mg Dielaidoylphosphatidylcholin (DEPC) wurden in 16 ml Beschichtungspuffer, bestehend aus 20 mM HEPES-Puffer pH 7,1 mit 30 mM NaCl, eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gequollen und anschließend 30 Minuten mit einem Stabbeschaller (Branson Sonorex) ultrabeschallt. Das Ergebnis war eine klare Vesikeldispersion mit Vesikeldurchmessern im Bereich 20-80 nm. Die Bestimmung erfolgte mittels herkömmlicher dynamischer Laserlichtstreuung ("Particle-Sizing").
2.2. Immobilisierung von Lipidmembranen auf optimierten pulverförmigen Silikatoberflächen
Zu 16 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten Vesikeldispersion wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. optimierten porösen Silikatträgers zugegeben und 30 Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in Beschichtungspuffer dispergiertem Material (wie beschrieben bei C. Naumann, T. Brumm, T. M. Bayerl, Biophys. J., 1992, 63, 1314) und DRIFT (nach Trocknung des Materials) dokumentiert.
2.3. Immobilisierung von Lipidmembranen auf optimierten pulverförmigen Polymeroberflächen
Zu 4 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten Vesikeldispersion wurden 1 ,3 ml eines entsprechend Beispiel 1.2.3. modifizierten Polymerträgers zugegeben und 30 Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in Beschichtungspuffer dispergierten Material dokumentiert.
2.4. Immobilisierung von Lipidmembranen auf optimierten pulverförmigen Oberflächen mit gemischter Funktionalität
Zu 16 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten Vesikeldispersion wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.3.4. optimierten porösen Silikatträgers gegeben und 30 Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in Beschichtungspuffer dispergiertem Material und DRIFT (nach Trocknung des Materials) dokumentiert.
2.5. Immobilisierung von Lipidmembranen auf optimierten pulverförmigen Oberflächen mit Lipidanker
Zu 16 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten Vesikeldispersion wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.4.1. optimierten porösen Silikatträgers gegeben und 30 Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in Beschichtungspuffer dispergiertem Material und DRIFT (nach Trocknung des Materials) dokumentiert.
2.6. Immobilisierung von nativen Sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membranen auf EDA/PSS modifizierten Silikatoberflächen und Messung der Ca2+-ATPaseFunktion
Aus dem Muskelgewebe eines Kaninchens wurden nach einem Verfahren von W. Hasselbach und M. Makinose (Biochem Z. 1961 , 333, 518-528) Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retikulums hergestellt (SR-Vesikel). Diese Dispersion wurde anschließend durch Ultraschallbehandlung in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 μl dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg eines entsprechend Beispiel 1.2.1. optimierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkubationsspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem Trägermaterial nach der Waschung im Inkubationspuffer erfolgte durch Bestimmung der ATP-Hydrolyse-Aktivität in Abhängigkeit der Calciumionenkonzentration und deren Hemmung durch den spezifischen Inhibitor "Cyclopiazonic Acid". Dieser Funktionstest belegte eine zum SR- Vesikel vergleichbare Ca2+- ATPase-Aktivität auf dem Trägermaterial. 2.7. Immobilisierung von nativen Sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membranen auf GPS/PEI modifizierten Silikatoberflächen und Messung der Ca2+-ATPaseFunktion
Aus dem Muskelgewebe eines Kaninchens wurden nach einem Verfahren von W. Hasselbach und M. Makinose (Biochem Z. 1961 , 333, 518-528) Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retikulums hergestellt (SR-Vesikel). Diese Dispersion wurde anschließend durch Ultraschallbehandlung in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 μl dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg eines entsprechend Beispiel 1.2.8. optimierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkubationsspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem Trägermaterial nach der Waschung im Inkubationspuffer erfolgte durch Bestimmung der ATP-Hydrolyse-Aktivität in Abhängigkeit der Calciumionenkonzentration und deren Hemmung durch den spezifischen Inhibitor "Cyclopiazonic Acid". Dieser Funktionstest belegte eine zum SR- Vesikel vergleichbare Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem Trägermaterial.
3. EIGENSCHAFTEN DER MEMBRANEN AUF OPTIMIERTEM TRÄGERMATERIAL 3.1. Stabilität im fließenden wäßrigen Medium
Die in Beispielen 2.2. bis 2.6 beschriebenen Systeme wurden für die Dauer von 24 Stunden einem strömenden Medium (Beschichtungspuffer nach Beispiel 2.1 bzw. Inkubationspuffer nach Beispiel 2.6) in einem
Testbad ausgesetzt. In Abständen von 2 Stunden wurden jeweils gleiche Mengen Trägermaterial aus dem Testbad entnommen, getrocknet und anschließend mittels DRIFT auf ihre Beschichtung untersucht. Die in den Beispielen 2.2 bis 2.5 beschriebenen Systeme wurden zusätzlich mittels DSC untersucht. Weder mit DRIFT noch mit DSC wurde eine meßbare Abnahme der Membran beschichtung mit der Zeit beobachtet.
3.2. Stabilität nach Trocknung und erneuter Dispersion
Die in den Beispielen 2.2 bis 2.5 beschriebenen Systeme wurden getrocknet und die auf ihnen befindlichen Lipidmenge mittels DRIFT dokumentiert. Anschließend wurden die Proben im Beschichtungspuffer resuspendiert und dreimal gewaschen. Nach dieser Behandlung wurde die Probe erneut getrocknet und mittels DRIFT vermessen. In allen Fällen war keine Veränderung der auf dem Trägermaterial befindlichen Lipidmenge nachweisbar.
3.3. Stabilität nach Einfrieren
Die in den Beispielen 2.2 bis 2.5 beschriebenen Systeme wurden bei -80°C im dispergierten Zustand eingefroren und anschließend wieder auf Raumtemperatur gebracht und getrocknet. Vergleichende DRIFT- Messungen vor und nach dem Einfrieren ergaben unveränderte Lipidmengen auf dem Trägermaterial.
3.4. Stabilität der enzymatischen Aktivität von SR-beschichteten Trägermaterial
Das in Beispiel 2.6 beschriebene System wurde nach der Präparation über die Dauer von 3 Monaten bei -80°C aufbewahrt. Im Abstand von 1
Monat wurden Proben entnommen und auf ihre Ca2+-ATPase-Aktivität mittels des in 2.6 beschriebenen Verfahrens untersucht. Nach 2 Monaten war die Aktivität auf ca. 70% des ursprünglichen Wertes (unmittelbar nach der Präparation und Waschung des Trägermaterials gemessen) abgesunken. Im Überstand der gelagerten Proben konnte keine Ca2+- ATPase-Aktivität gemessen werden.
3.5. Vergleich der Phasenübergangstemperaturen
Figur 2 zeigt vergleichende differentialkalorimetrische (DSC)-Messungen des Phasenübergangs festkörperunterstützter Bilayer, bestehend aus dem synthetischen Lipid Dielaidoyl-sn-3-glycerö-3-phosphocholin (im folgenden DEPC genannt) auf einer nichtoptimierten
Festkörperoberfläche (Herstellung nach Stand der Technik, z.B. C.
Naumann, T. Brumm, T. M. Bayerl, Biophys. J., 1992, 63, 1314), auf einer durch den obigen Schritt optimierten Oberfläche (wie im Beispiel beschrieben) im Vergleich zum natürlichen Analogon, den
DEPC-Vesikeln ohne Festkörperunterstützung (Herstellung nach Stand der Technik durch Quellen des Lipids und anschließende Extrusion gemäß M. J. Hope, M. B. Bally, G. Web, P.R. Cullis, Biochim. Biophys. Acta 1985, 812, 55).
Diese Ergebnisse zeigen eine deutliche Verschiebung und Verbreiterung des Phasenübergangs bei der nichtoptimierten Oberfläche im Vergleich zu den (festkörperfreien) DEPC-Vesikeln. Die Phasenübergangstemperatur auf der optimierten Oberfläche wird nicht beeinflußt. Der Phasenübergang selbst ist im Vergleich zum natürlichen Analogon nur unwesentlich verbreitert.
Figur 4 zeigt DSC-Messungen von DEPC-Lipidmembranen auf verschiedenen komplexen Oberflächen. Dabei zeigen alle dargestellten Beispiele nahezu keine Verschiebung der Phasenübergangstemperatur und nur eine unwesentliche Verbreiterung des Phasenüberganges selbst. 3.6. Vergleichende Deuterium (2H)-NMR-Messungen
Figur 3 zeigt Deuterium (2H)-NMR-Messungen von kettendeuteriertem Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC)-d8 (7,7', 8,8') beschichteten nichtporösen Silikatpartikeln mit und ohne optimierter Oberfläche im Vergleich mit natürlichen DPPC-d8 (7,7\8,8')-Vesikeln. Die Quadrupolaufspaltung des von den selektiv deuterierten Lipidketten herrührenden Signals ist ein Maß für die molekulare Ordnung im Bilayer (Seelig, J. Quarterly Reviews of Biophysics 1977, 10, 353-418). Für den Fall der nichtmodifizierten Oberfläche resultieren zwei Aufspaltungen, die bereits früher mit der durch die unmittelbare Nähe der Festkörperoberfläche verursachten Asymmetrie der molekularen Ordnung in der inneren und äußeren Monolage des Bilayers erklärt wurde (M. Hetzer, S. Heinz, S. Grage, T. M. Bayerl, Langmuir, 1998, 14, 982-984). Die zweifache Aufspaltung findet sich weder bei dem optimierten System noch bei dem natürlichen Analogon (Vesikel) und ist deshalb als Beweis einer Äquivalenz der molekularen Ordnung in beiden Monolagen des Bilayers anzusehen.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Immobilisieren von Lipidschichten, insbesondere Lipiddoppelschichten, auf Oberflächen pulverförmiger Festkörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Festkorperoberflachen derart modifiziert werden, daß die darauf deponierten Lipidschichten in ihren Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf Diffusivität, denen nicht-immobilisierter Lipidschichten weitgehend entsprechen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , umfassend die folgenden Verfahren ssch ritte: a) Modifizieren der Festkörperoberfläche mit Molekülen zur Ausbildung einer im wesentlichen hydrophilen Fläche und b) Deponieren der Lipidschichten auf der modifizierten Festkörperoberfläche.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Festkörperoberfläche die folgenden Teilschritte umfaßt: aa) Funktionalisieren der Festkörperoberfläche und/oder ab) Adsorption oder Chemisorption von wechselwirkenden Molekülen.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Festkörperoberfläche die folgenden Teilschritte umfaßt: aa) Funktionalisieren der Festkörperoberfläche und/oder ab) Adsorption oder Chemisorption von wechselwirkenden Molekülen und ac) Adsorption oder Chemisorption weiterer wechselwirkender Moleküle.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Funktionalisieren der Festkörperoberfläche durch Aufbringen von Aminofunktionen, Epoxyfunktionen, Halogenalkyl- funktionen und/oder Thiofunktionen vorgenommen wird, wobei insbesondere die Festkörperoberfläche mit aminofunktionellen, epoxy- funktionellen, halogenalkylfunktionellen und/oder thiofunktionellen Molekülen behandelt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Funktionalisierung Silane eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß für die Funktionalisierung Mercaptane und/oder Disulfide, insbesondere Alkyldisulfide, eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß für die Funktionalisierung N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopro- pyltrimethoxysilan (EDA), Polyethylenimin (PEI) und/oder Cysteamin, insbesondere Cysteaminhydrochlorid eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als wechselwirkende Moleküle Polymere, insbesondere Polyelektrolyte, vorzugsweise anionische Polyelektrolyte, Polyampholyte, vorzugsweise Proteine, und/oder Polyzwitterionen eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als wechselwirkende Moleküle Polystyrolsulfonat (PSS), insbeson- dere Na-Polystyrolsulfonat, und/oder Poly(styrol-co-Maleinsäureanhydrid) (PSPMA) eingesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Modifizieren der Festkörperoberfläche weitere Moleküle, insbesondere funktionelle Moleküle, in die Oberfläche eingefügt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den funktioneilen Molekülen um Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, und/oder um enzymatisch, chemisch und/oder photochemisch reaktive Moleküle handelt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Festkörpern um im wesentlichen poröse pulverförmigen Festkörper handelt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Festkörpern um pulverförmige Silikate und/oder pulverförmige Polymere handelt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Festkörpern um pulverförmige magnetische Partikel und/oder Kern-Schalen-Polymerpartikel handelt.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Festkörper auf einem im wesentlichen planaren Träger aufgebracht sind oder auf diesen aufgebracht werden.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Festkörper, insbesondere bei der Modifikation ihrer Oberfläche, in Form einer Dispersion, vorzugsweise in Form einer Dispersion in Wasser und/oder Alkohol, eingesetzt werden.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Festkörperoberfläche um eine Silikatoberfläche, Halbleiteroberfläche, insbesondere Siliziumoberfläche, Edelmetalloberfläche, insbesondere Goldoberfläche, und/oder Polymeroberfläche, insbesondere Polystyrol-Oberfläche handelt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten Lipiddoppelschichten, insbesondere Lipidmembranen sind.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten aus Lipiden, Lipidderivaten, lipidähnlichen und/oder lipidanalogen Substanzen aufgebaut sind.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten weiterhin Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, ionische oder nichtionische Tenside und/oder Polymere aufweisen.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten oberflächlich, schichtdurchspannend und/oder darin eingebettet Proteine, insbesondere Enzyme, Rezeptoren und/oder Liganden aufweisen.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten zumindest teilweise aus Membranfragmenten von natürlichen Zellen aufgebaut sind.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Deponieren der Lipidschichten auf der modifizierten Festkörperoberfläche durch Fusion von Lipidvesikeln vorgenommen wird.
25. Modifizierte Festkörperoberfläche herstellbar durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18.
26. Immobilisierte Lipidschicht auf einer modifizierten Festkörperoberfläche herstellbar durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 24.
27. Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipidschichten auf Festkorperoberflachen, mindestens umfassend eine modifizierte Festkörperoberfläche gemäß Anspruch 25 und/oder Reagenzien zur Herstellung mindestens einer modifizierten Festkörperoberfläche gemäß Anspruch 25 sowie vorzugsweise Reagenzien zur Deponierung von Lipidschichten auf der modifizierten Festkörperoberfläche gemäß mindestens einem der Ansprüche 19 bis 24.
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