DE10125713A1 - Immobilisierte asymmetrische Lipiddoppelschichten - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren bereitgestellt, welches zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten mit jeweils einer inneren und einer äußeren Lipidschicht geeignet ist. Diese Lipiddoppelschichten weisen bezüglich der inneren und der äußeren Lipidschicht eine definierte Orientierung auf der Oberfläche eines Festkörpers auf und sind auf der Oberfläche des Festkörpers im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert. Zur Durchführung des Verfahrens wird zunächst eine Oberfläche eines Festkörpers derart modifiziert, daß eine Fläche ausgebildet wird, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt. In einem zweiten Schritt wird auf dieser modifizierten Oberfläche eine Lipiddoppelschicht deponiert. Bevorzugterweise werden in die Lipiddoppelschicht weitere Komponenten, insbesondere Proteine, eingefügt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orien­ tierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche eines Festkörpers aufweisen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von modifizierten Festkörperoberflächen zur Herstellung derartiger Lipiddoppelschichten sowie einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten.

Natürliche Membranen, die sogenannten Biomembranen, sind als wichtiger Bestandteil aller Organismen schon lange Gegenstand intensiver Forschung. Membranen sind im Prinzip aus zwei Schichten von Lipidmolekülen aufgebaut, die eine Lipiddoppelschicht bilden. Diese Lipiddoppelschicht ist im Inneren hydrophob und zu beiden Außenseiten hin hydrophil. Entscheidend für die verschiedenen Funktionen einer Membran ist die strukturelle und funktionelle Asymmetrie dieser Lipiddoppelschicht. Diese besteht zum einen in einer unterschiedlichen Verteilung verschiedener Lipidmoleküle in den beiden Lipidschichten ("inner leaflet" und "outer leaflet"), welche die Lipiddoppelschicht bilden. Weitere Komponenten sind verschiedene Membranproteine, die sich in der Biomembran befinden. Hierbei kann es sich um transmembrane Membranproteine handeln, die die gesamte Lipiddoppelschicht durchspannen. Andere Membranproteine sind in nur einem Teil der Lipiddoppelschicht eingebettet, beispielsweise in der äußeren Lipidschicht. Weiterhin können Membranproteine auch auf einer oder beiden Seiten der Membran angelagert sein.

Prinzipiell können sich Membranproteine lateral in der Lipidmatrix bewegen. Allerdings können die Proteine auch durch spezifische Wechselwirkungen mehr oder weniger an einer bestimmten Stelle fixiert sein. Im allgemeinen ist es jedoch nicht möglich, daß Membranproteine von einer Lipidschicht zur anderen wandern, so daß es sich bei der durch die verschiedenen Lipide und Membrankomponenten der Membran gebildeten Asymmetrie um eine langfristige strukturelle und damit natürlich auch funktionelle Eigenschaft der Membran handelt.

Ein Beispiel für die Asymmetrie von Biomembranen ist die sogenannte Glykokalix auf der äußeren Seite von Membranen. Diese Glykokalix, die bestimmte Erkennungs- und Identifizierungsfunktionen ausübt, wird durch Glykoproteine auf der äußeren Seite der Lipiddoppelschicht und Glykolipide in der äußeren Lipiddoppelschicht gebildet.

Für die innere Lipidschicht einer tierischen Zelle sind beispielsweise Phosphat­ idylserinlipide typisch. Während des programmierten Zelltodes (Apoptose) werden diese bestimmten Lipide auch in die äußere Lipidschicht eingebaut und dienen dort als Erkennungsmuster für weitere Prozesse.

Ein weiteres sehr wichtiges Beispiel für die Asymmetrie von Membranen sind die Transportproteine, die einen gerichteten Transport von außen nach innen oder von innen nach außen ermöglichen. Zusammengefaßt stellt die Asymmetrie einer Biomembran die entscheidende Voraussetzung dafür dar, daß eine Membran ihre komplexen Aufgaben erfüllen kann.

Die Eigenschaften von Biomembranen sind beispielsweise im Bereich des Pharmascreenings und der Biosensorik von sehr großem Interesse. Beispielsweise werden schon lange Versuche unternommen, um die sehr komplexen Transportvorgänge an Membranen zu verstehen. Weiterhin sind natürlich auch die in der Membran befindlichen Rezeptoren von großer Bedeutung. Von daher besteht ein Interesse an geeigneten Modellsystemen für Biomembranen.

Problematisch hierbei war jedoch bisher, daß in der Regel bei der Herstellung von entsprechenden Systemen die für viele Anwendungen entscheidende Asymmetrie der Membran bzw. der Lipiddoppelschicht verloren geht. So werden bei der Isolierung von natürlichen Membranen aus Organismen oft Ultraschallgeräte oder Polytrone eingesetzt. Bei derartigen Aufarbeitungen entstehen vesikuläre Strukturen mit einer im allgemeinen zufälligen Orientierung der Lipiddoppelschicht. So kann hierbei die im natürlichen System nach außen gerichtete Lipidschicht auch bei den Vesikeln nach außen zeigen. In diesem Fall spricht man von sogenannten "right-side-out" (RSO)-Vesikeln. Andererseits kann auch die innere Seite der ursprünglichen Membran bei den entstehenden Vesikeln nach außen gerichtet sein, wobei man dann von "in-side-out" (ISO)-Vesikeln spricht. In der Regel handelt es sich bei den durch derartige Aufarbeitungen entstehenden Vesikeln um ein Gemisch von RSO- und ISO-Vesikeln. Diese Präparationen sind nicht geeignet, um damit zuverlässige Studien über Membraneigenschaften zu betreiben, da es sich hierbei nicht um definierte Vesikel handelt.

Für die Analyse der bei Membranen vorliegenden Asymmetrie bzw. der Orientierung der beiden Lipidschichten sind verschiedene Verfahren bekannt. Beispielsweise kann die Aktivität asymmetrisch angeordneter Enzyme (Ellman, G. L.; Courtney, A.; Valentino, Jr.; Featherstone, R.M.: Biochem. Pharmacol. 1961 (7), 88) oder die Freisetzung von in bestimmter Weise orientierten Membranbestandteilen mittels Enzymen (Warren, L.J. Biol. Chem. 1959 (234), 1971) analysiert werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Markierung der Glykokalix mit spezifisch markierten Lektinen oder die Markierung von Membranproteinen von außen- oder innenliegenden Proteindomänen mit spezifischen Antikörpern.

Es wurden sehr aufwendige Methoden entwickelt, um Vesikel einer bestimmten Orientierung herzustellen (z. B. Steck, T.L.; Kant, J.A. Methods in Enzymology 1974 (31), 172-180; DePierre, J.W.; Karnovsky, M.L. Journal of Cell Biology 1973 (56), 275-303). Damit konnten vesikuläre Strukturen erzielt werden, in denen die Asymmetrie der natürlichen Membran erhalten ist. Allerdings sind solche Vesikel für Untersuchungen der Membraneigenschaften bzw. der Membranproteineigenschaften nur sehr bedingt geeignet, da die Größe der Vesikel und Morphologie kaum zu kontrollieren ist und das System somit keine definierten und reproduzierbaren Eigenschaften aufweist. Weiterhin sind solche vesikulären Strukturen wegen ihrer geringen Stabilität und schlechten Handhabbarkeit einer Automatisierung nicht zugänglich. Ein hochdurchsatzfähiges Screening, wie es im Bereich funktioneller Tests und beim Pharmascreening notwendig ist, ist daher mit Vesikeln nicht möglich.

Um dem Problem der geringen Stabilität von vesikulären Strukturen und der schlechten Handhabbarkeit insbesondere in automatisierten Prozessen Rechnung zu tragen, wurden festkörperunterstützte Membransysteme entwickelt. Eine Möglichkeit ist hierbei die Immobilisierung von einfachen Lipidschichten, sogenannten Monolayern, auf einer Festkörperoberfläche. Hierfür kann die Oberfläche zunächst beispielsweise mit Alkylsilanen oder Mercaptanen hydrophobisiert werden. Eine hierauf aufgebrachte Lipidschicht orientiert sich mit ihrem hydrophoben Teil zum Träger hin, und die hydrophile Seite weist nach außen. Dieses System ist jedoch nicht geeignet, die natürlichen Eigenschaften einer Membran zu simulieren, da weder die Dynamik noch die molekulare Ordnung einer natürlichen Membran widergespiegelt wird. Darüber hinaus ist der Einbau von transmembranen Proteinen in einer solchen Lipidmonoschicht erschwert oder oft überhaupt nicht möglich.

Einen besseren Ansatz bietet daher die Immobilisierung von Lipiddoppelschichten auf Festkörperoberflächen. Für die Präparation solcher festkörperunterstützten Lipiddoppelschichten werden Lipidvesikel auf einer Festkörperoberfläche fusioniert, wobei hierbei spontan eine Lipiddoppelschicht auf der Oberfläche ausgebildet wird (Tamm, L.K.; McConnell, H.M. Biophysical Journal 47, 105-113 (1985); Salafsky, J.; Groves, J.T.; Boxer, S. Biochemistry 35, 14773-14781 (1996)).

Der Prozeß der Vesikelfusion und die Ausbildung der Lipiddoppelschicht ist in seinen Details bisher nicht vollständig verstanden. So werden immer noch zwei mögliche Mechanismen in der Literatur diskutiert (Salafsky, J.; Groves, J.T.; Boxer, S. Biochemistry 1996 (35), 14773-14781 und Puu, G.; Gustafson, I. Biochim. Biophys. Acta-Biomembranes 1997 (1327), 149-161). Hierbei geht es vor allem um die Frage, ob das Vesikel bei der Fusion mit einer Oberfläche seine Orientierung invertiert oder beibehält. Es deutet jedoch alles darauf hin, daß die Orientierung der Vesikel bei der Fusion zufällig erfolgt. Die erste Zufälligkeit bei der Orientierung liegt also im Schritt der Präparation der Membranvesikel, und die zweite Zufälligkeit liegt bei der Fusion mit der Festkörperoberfläche. Somit läßt sich die Orientierung der immobilisierten Lipiddoppelschichten bisher nicht steuern.

Allerdings gibt es verschiedene Hinweise, daß Vesikel/Zellen orientiert auf Festkörperoberflächen angeheftet werden (Jacobson, Branton Science 1977 (195, 4275), 302-304; Wasserman, B.P.; Hultin, H.O.; Jacobson, B.S. Biotechnol. Bioeng. 1980 (22) 271-287. Durch eine hier gezielt herbeigeführte elektrostatische Interaktion von Festkörperoberfläche mit transmembranen Proteinen konnte eine Orientierung der Lipiddoppelschicht erreicht werden, bei der die ursprünglich innere Seite der Lipiddoppelschicht in der immobilisierten Form nach außen weist (Kalish, D.L; Cohen, C.M.; Jacobson, B.S.; Branton, D. Biochim. Biophys. Acta 1978 (506), 97-110). Hier konnte also zwar die Asymmetrie der Membran erhalten bleiben, es war jedoch nur möglich, die innere Membranseite nach außen zu orientieren. Eine Orientierung der Membran mit der ursprünglich äußeren Seite nach außen war nicht möglich. Darüber hinaus verringerten sich die enzymatischen Aktivitäten infolge der elektrostatischen Wechselwirkungen der Membran mit der Festkörperoberfläche, so daß dieses System für funktionelle Untersuchungen der Membran nicht geeignet ist.

Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Lipiddoppelschichtsystem bereitzustellen, welches eine definierte Orientierung der Lipidschichten auf einer Oberfläche eines Festkörpers gewährleistet. Dieses System soll festkörperunter­ stützt sein, so daß es stabil und leicht handhabbar ist und auch für eine Auto­ matisierung geeignet ist. Die Orientierung, also die Asymmetrie der Lipid­ doppelschicht, soll frei wählbar sein, so daß entweder die ursprünglich äußere Seite der Lipiddoppelschicht bzw. der Membran nach außen zeigt oder daß diese Seite der Festkörperoberfläche zugewandt ist. Die funktionellen und strukturellen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht sollen auch in der immobilisierten Form erhalten bleiben, um die natürlichen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bzw. der darin enthaltenen Proteine oder ähnlichem in vitro untersuchen zu können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine immobilisierte Lipiddoppelschicht, die durch ein Verfahren herstellbar ist, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 8 ausgeführt. Die Ansprüche 9 bis 13 betreffen die Verwendung einer modifizierten Festkörperoberfläche zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht. Die Ansprüche 14 bis 20 beziehen sich auf eine immobilisierte Lipiddoppelschicht bzw. immobilisierte Proteine sowie auf einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten bzw. immobilisierten Proteinen. Die Ansprüche 21 und 22 betreffen schließlich ein Verfahren zur Untersuchung von Proteinen. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Herstellung einer Lipiddoppelschicht, die auf einem Festkörper immobilisiert ist. Die Lipiddoppelschicht bedeckt nach Abschluß des Verfahrens den Festkörper als im wesentlichen kontinuierlicher Membranfilm. Die Lipiddoppelschicht besteht aus einer inneren und äußeren Lipidschicht ("inner leaflet" bzw. "outer leaflet"), wobei diese beiden Lipid­ schichten in bestimmter Weise orientiert sind, so daß die immobilisierte Lipid­ doppelschicht eine definierte Orientierung bzw. Asymmetrie hinsichtlich der Festkörperoberfläche aufweist. Auf der Oberfläche des Festkörpers ist die Lipiddoppelschicht im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert, so daß die strukturellen und funktionellen Eigenschaften einer natürlichen Lipiddoppelschicht, insbesondere einer Membran, widergespiegelt werden. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Oberfläche des Festkörpers zunächst in der Weise modifiziert, daß eine Fläche ausgebildet wird, die vorzugsweise mit einer der beiden Lipidschichten, also mit der inneren oder der äußeren Lipid­ schicht, wechselwirken kann. In einem weiteren Verfahrensschritt wird auf dieser modifizierten Festkörperoberfläche die Lipiddoppelschicht deponiert. Durch die erfindungsgemäße Modifizierung der Festkörperoberfläche wird hierbei ermöglicht, daß sich die Lipiddoppelschicht derart auf der Festkörperoberfläche ausrichtet, daß eine bestimmte Orientierung der Lipiddoppelschicht erreicht wird. Erfindungsgemäß verantwortlich sind hierfür im wesentlichen elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der modifizierten Festkörperoberfläche und den beiden Schichten der Lipiddoppelschicht, wobei die Wechselwirkungen sowohl attraktiver wie auch repulsiver Natur sein können. Die elektrostatischen Wechselwirkungen führen insbesondere in Kombination mit der weiter unten näher ausgeführten "ultraweichen" Oberfläche zu der gewünschten Orientierung der Lipiddoppelschicht auf dem Festkörper. Nähere Details hierzu ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und insbesondere aus den Beispielen.

Die Asymmetrie der Lipiddoppelschicht kann zum einen durch unterschiedliche Lipide oder lipidanaloge Moleküle in den beiden Lipidschichten der Lipiddoppel­ schicht verursacht sein. Weiterhin kann die Asymmetrie auch durch weitere Komponenten in den Lipidschichten begründet sein, die in den beiden Lipidschichten unterschiedlich verteilt sind. Vorteilhafterweise sind diese weiteren Komponenten Proteine, insbesondere Membranproteine. Es kann sich hierbei um sogenannte transmembrane Membranproteine handeln, die die gesamte Lipiddoppelschicht in einer bestimmten Orientierung durchspannen. Beispiele hierfür sind verschiedene Transportproteine, die einen gerichteten Transport durch eine Membran bzw. eine Lipiddoppelschicht hindurch ermöglichen. Ein Beispiel für solche transmembranen Proteine sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die sehr interessante Angriffsstellen für potentielle Medikamente darstellen. Die Bindungsstellen dieser Rezeptoren befinden sich an der Außenseite von Membranen. Zur Untersuchung der Wechselwirkung dieser Rezeptoren mit potentiellen Wirkstoffen ist das erfindungsgemäße Verfahren also besonders geeignet, da hier die Orientierung der solche Rezeptoren enthaltenen Lipiddoppelschichten so gesteuert werden kann, daß diese Bindungsstellen im immobilisierten Membransystem von außen zugänglich sind.

Da mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens eine festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht hergestellt werden kann, die eine bestimmte Orientierung aufweist, kann hierdurch natürlich auch die Orientierung der in der Lipiddoppelschicht integrierten Bestandteile, also beispielsweise der Transportproteine, kontrolliert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also ein Membranmodellsystem bereitgestellt, welches in hervorragender Weise für die Untersuchung und Charakterisierung der Membraneigenschaften und/oder der Eigenschaften von einzelnen Membrankomponenten geeignet ist.

Neben den transmembranen Membranproteinen, die die Doppelschicht in einer Vorzugsrichtung ganz oder teilweise durchspannen, kann die Lipiddoppelschicht auch sogenannte periphere Komponenten, insbesondere Proteine, aufweisen, die sich nur in einer der beiden Lipidschichten bzw. auf einer der beiden Oberflächen der Lipiddoppelschicht befinden. Ein Beispiel für solche peripheren Proteine sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPR), die ebenfalls sehr interessante Angriffsstellen für potentielle Medikamente darstellen. Sie befinden sich auf der Innenseite der Zellmembran und sind somit erst nach Inversion der ursprünglichen Orientierung zugänglich.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine Vielzahl unter­ schiedlicher Lipidstrukturen immobilisiert werden. Gemäß dem Verfahren werden die zu immobilisierenden Lipidstrukturen hierbei zunächst in die Form von Vesikeln überführt, welche durch Fusion mit der modifizierten Festkörper­ oberfläche die erfindungsgemäße festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht bilden. Für die Fusion der Vesikel mit der modifizierten Oberfläche werden die Vesikel vorteilhafterweise in wässriger Dispersion bereitgestellt.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Vesikeln aus natürlichem Material, so daß die erfindungsgemäß immobilisierte Lipiddoppelschicht ein Modell der natürlichen Membran darstellt, bei welchem entweder die ursprünglich innere oder die ursprünglich äußere Membranoberfläche letztendlich nach außen zeigt.

Besonders geeignet hierfür sind beispielsweise Membranvesikel, die aus Erythrozyten oder kultivierbaren Zellen, beispielsweise CACO-2-Zellen, gewonnen werden. Weiterhin kann die Lipiddoppelschicht zumindest teilweise aus Membranfragmenten von natürlichen Zellen aufgebaut sein. Die Präparation der Vesikel erfolgt nach herkömmlichen Methoden. Erfindungsgemäß werden die Vesikel mit der modifizierten Festkörperoberfläche in Kontakt gebracht, wodurch die Vesikel spontan miteinander verschmelzen und die Lipiddoppelschicht bzw. die Membranschicht ausbilden. Durch die Wahl einer entsprechend modifizierten Oberfläche kann die Endorientierung der Lipiddoppel- bzw. Membranschicht im voraus bestimmt werden.

Als natürliche Membranen kommen neben der Plasmamembran von Zellen selbstverständlich auch intrazelluläre Membranen in Frage, die beispielsweise von Leber- oder Nierenzellen stammen können. Für die Präparation von intrazellulären Membranen können beispielsweise Zellorganellen eingesetzt werden. Diese intrazellulären Membranen sind für verschiedene Wirkstoffscreening- und/oder Testanwendungen sehr interessant. Gerade in den intrazellulären Membranen sind im wesentlichen alle Enzyme lokalisiert, die beim Metabolismus von Pharmaka eine entscheidende Rolle spielen.

Neben natürlichen Membranen sind auch künstliche Lipidschichten bzw. Membranen für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Solche künstlichen Strukturen können in vitro aus verschiedenen Komponenten zusammengefügt (rekonstituiert) werden, so daß hierdurch ein entsprechendes Membranvesikel zur Verfügung gestellt wird, welches im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht genutzt werden kann. Künstliche Lipidschichten sowie auch natürliche Lipidschichten können aus verschiedenen Lipiden, Lipidderivaten, lipidähnlichen und/oder lipidanalogen Substanzen zusammengesetzt sein. Weiterhin können die Lipidschichten Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, ionische oder nichtionische Tenside und/oder Polymere aufweisen. Bei diesen zusätzlichen Komponenten der Lipidschichten kann es sich vorteilhafterweise um Enzyme, Rezeptoren und/oder Liganden handeln, die die Lipidschicht oder die Lipiddoppelschicht mehr oder weniger durchspannen, darin eingebettet sind und/oder oberflächlich auf der Lipiddoppelschicht angelagert sind.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Festkörperoberfläche zunächst so modifiziert, daß hierdurch die anschließende Ausbildung einer Lipiddoppelschicht infolge der Fusion von Vesikeln von ihrer Orientierung her gesteuert wird. Weiterhin bietet die erfindungsgemäße Modifizierung der Festkörperoberfläche optimale Bedingungen für die schonende Immobilisierung einer Lipiddoppel­ schicht bzw. einer Membran. Diese optimalen Bedingungen beziehen sich auf eine Kombination verschiedener intermolekularer Wechselwirkungen, aus deren Überlagerung eine anziehende Kraft zwischen der aufzubringenden Lipiddoppelschicht und dem Festkörper resultiert. Hierdurch wird gleichzeitig ein direkter Kontakt der Lipiddoppelschicht mit dem Festkörper verhindert. Auf diese Weise werden die charakteristischen dynamischen Bewegungseigenschaften der Lipiddoppelschicht, insbesondere die laterale Diffusion der verschiedenen Lipidkomponenten, weitgehend unverändert gelassen.

Durch die Modifizierung wird im molekularen Sinne eine "ultraweiche" Oberfläche gebildet, die zum einen die darauf immobilisierte Lipiddoppelschicht weitgehend unbeeinflußt läßt und zum anderen einen ausreichenden Abstand zwischen Festkörperoberfläche und Lipiddoppelschicht gewährleistet. Hierdurch werden denaturiende Effekte der Festkörperoberfläche auf die Lipiddoppelschicht mit den darin enthaltenen Komponenten vermieden. Weiterhin hat die erfindungsgemäße Modifizierung der Festkörperoberfläche den Vorteil, daß Wechselwirkungen von Komponenten der Lipiddoppelschicht, insbesondere von Proteinen, mit der Festkörperoberfläche weitgehend minimiert bzw. eliminiert werden, so dass die Membranproteine beispielsweise ihre Aktivität, beispielsweise ihre Enzymaktivität, auch in der neuen Umgebung beibehalten. Durch die erfindungsgemäße Immobilisierung werden auch die Lipideigenschaften der Lipiddoppelschicht erhalten, wodurch die natürlichen Eigenschaften einer Membran perfekt imitiert werden. Insgesamt bewirkt die Oberflächenmodi­ fizierung u. a. also eine Entkopplung der Lipiddoppelschicht von der Festkörper­ oberfläche. Dies ist beispielsweise für eine Anwendung im Bereich der Biosensorik ein ganz entscheidender Vorteil, da hier immobilisierte Lipiddoppelschichten, insbesondere Membranen, die ihre nativen Eigenschaften, also beispielsweise enzymatische Aktivitäten und/oder Kanalaktivitäten, beibehalten, benötigt werden. Dieser Vorteil der Erfindung kann beispielsweise in einer Anwendung mit Biochips besonders vorteilhaft ausgenutzt werden.

Erfindungsgemäß wird durch die Wahl einer bestimmten Modifizierung der Festkörperoberfläche die letztendliche Orientierung der darauf immobilisierten Lipidschichten bestimmt. Für das Deponieren der Lipiddoppelschicht auf der modifizierten Oberfläche können vorteilhafterweise Membranvesikel zufälliger Orientierung, also sogenannte ISO- und RSO-Vesikel, hergestellt werden und mit dem modifizierten Festkörper in Kontakt gebracht werden. Aufgrund der Oberflächeneigenschaften des modifizierten Festkörpers findet im wesentlichen nur die Fusion der Vesikel einer bestimmten Orientierung statt. Hierdurch wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht erhalten, die eine definierte Orientierung aufweist.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens wird dem modifizierten Festkörper eine Vesikelpräparation mit nur einer Orientierung angeboten. Hierdurch können ggf. größere Ausbeuten an immobilisierter Lipiddoppelschicht bestimmter Orientierung erhalten werden.

Um die letztendliche Orientierung der durch das erfindungsgemäße Verfahren immobilisierten Lipidschichten zu überprüfen, können verschiedene her­ kömmliche Methoden eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Funktionalität und/oder Aktivität immobilisierter Membranproteine analysiert werden, von denen bekannt ist, daß sie sich auf der ursprünglich inneren, also insbesondere der zytoplasmatischen Seite, oder der äußeren Seite der Membran bzw. der Lipiddoppelschicht befinden. Weiterhin kann die durch Neuramidase freigesetzte N-Acetylsialinsäure untersucht werden. Auch die auf der Außenseite der ursprünglichen Membranschicht sich befindliche Glykokalix kann mittels fluoreszenzmarkierter Lektine markiert werden. Einzelheiten zu diesen Analyse­ methoden lassen sich den Beispielen entnehmen.

Vorteilhafterweise wird bei der erfindungsgemäßen Modifizierung der Festkörperoberfläche eine im wesentlichen hydrophile Fläche erreicht. Hierfür wird zunächst die Oberfläche funktionalisiert. Beispielsweise können hierbei Aminofunktionen, Epoxyfunktionen, Halogenalkylfunktionen und/oder Thiofunk­ tionen auf die Oberfläche aufgebracht werden. Für die Funktionalisierung können vorteilhafterweise Silane eingesetzt werden. Weiterhin sind auch Mercaptane und/oder Disulfide, insbesondere Alkyldisulfide, bevorzugt. Für die Funktio­ nalisierung ganz besonders bevorzugt sind N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyl­ trimethoxysilan (EDA), Polyethylenimin (PEI) und/oder Cysteamin, insbesondere Cysteaminhydrochlorid.

In einem weiteren Schritt werden mit diesen Funktionen wechselwirkende Moleküle adsorbiert und/oder chemisorbiert. Eine vorherige Funktionalisierung der Oberfläche kann auch entfallen, wenn aufgrund der Materialeigenschaften des Festkörpers eine Wechselwirkung von weiteren Molekülen ohne weiteres möglich ist. Als wechselwirkende Moleküle können verschiedene Polymere, insbesondere Polyelektrolyte, vorzugsweise anionische Polyelektrolyte, eingesetzt werden. Auch Polyampholyte, vorzugsweise Proteine, und/oder Polyzwitterionen sind erfindungsgemäß geeignet. Besonders bevorzugt sind Polystyrolsulfonat (PSS), insbesondere Na-Polystyrolsulfonat, und/oder Poly(styrol-co-Maleinsäure­ anhydrid) (PSPMA). Eine besonders bevorzugte Substanz, die chemisorbiert wird, ist Polyoxyethylen bis(glycidylether).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden weitere wechselwirkende Moleküle zur Modifizierung der Oberfläche eingesetzt, die mit den zunächst aufgebrachten wechselwirkenden Molekülen interagieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als wechselwirkende Moleküle funktionelle Substanzen eingesetzt, die für eine Analyse der Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bzw. der in der Lipiddoppelschicht enthaltenen Komponenten genutzt werden können. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, und/oder um enzymatisch, chemisch und/oder photochemisch reaktive Moleküle.

Erfindungsgemäß wird die Modifizierung der Oberfläche so gewählt, daß die modifizierte Oberfläche im wesentlichen nur mit einer der beiden Lipidschichten der Lipiddoppelschicht wechselwirkt, wobei die Wechselwirkung im wesentlichen elektrostatischer Natur ist, die sowohl repulsiv als auch attraktiv sein kann. Hierdurch wird gewährleistet, daß sich die Lipiddoppelschicht bei der Fusion der Vesikel im Zuge des Deponierens der Lipiddoppelschicht auf dem Festkörper in einer bestimmten Orientierung ausrichtet. In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wechselwirkt die modifizierte Oberfläche vorzugsweise mit der ursprünglich inneren Lipidschicht (inner leaflet) der Lipiddoppelschicht. Bevorzugterweise weist die modifizierte Oberfläche hierbei eine negative Nettoladung auf. Hierfür wird vorteilhafterweise die Modifizierung der Festkörperoberfläche durch die Herstellung "ultraweicher" Polymeroberflächen mit negativer Nettoladung vorgenommen. Für das Deponieren der Lipid­ doppelschicht auf dieser modifizierten Festkörperoberfläche werden beispiels­ weise orientierte Vesikelsysteme eingesetzt, die eine negative Nettoladung an der Außenseite tragen. Durch die Modifizierung wird eine im wesentlichen hydrophile Oberfläche bereitgestellt, die derart repulsiv mit der äußeren Lipidschicht reagiert, daß sich die Lipiddoppelschicht bei einer Fusion einer Vesikelpräparation im wesentlichen so ausrichtet, daß die ursprünglich äußere Seite der Lipid­ doppelschicht nach außen zeigt, also vom Festkörper abgewandt ist, und so für verschiedene Untersuchungen zugänglich ist.

In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Festkörperoberfläche so modifiziert, daß sie vorzugsweise mit der ursprünglich äußeren Lipidschicht der zu immobilisierenden Lipiddoppelschicht wechselwirkt. Bevorzugterweise weist die modifizierte Oberfläche hierbei eine positive Nettoladung auf. Hierfür wird die Modifizierung der Oberfläche vorzugsweise durch Herstellung weicher Polymeroberflächen mit positiver Nettoladung vorgenommen. Für das Deponieren der Lipiddoppelschichten auf dieser modifizierten Festkörperoberfläche werden vorteilhafterweise orientierte Vesikelsysteme eingesetzt, die eine negative Nettoladung an der Außenseite tragen. Bei der Fusion richten sich die Vesikel dann so aus, daß die ursprünglich äußere Lipidschicht dem Festkörper zugewandt ist. Hierdurch werden die Komponenten, die sich ursprünglich in oder an der inneren Seite der Lipiddoppelschicht, also beispielsweise an der cytoplasmatischen Seite befanden, einer Untersuchung zugänglich. Durch diese Beispiele wird deutlich, daß in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu immobilisierenden Lipiddoppelschicht durch die Wahl einer entsprechend geeigneten Oberfläche die Orientierung der immobilisierten Lipiddoppelschicht auf dem Festkörper gesteuert werden kann.

Die derart modifizierten Festkörperoberflächen werden bevorzugterweise mit den vesikulären Strukturen der zu immobilisierenden Lipiddoppelschicht innerhalb eines Mediums, vorzugsweise eines wässrigen Mediums, in Kontakt gebracht, wodurch die Vesikel spontan miteinander und mit der modifizierten Oberfläche fusionieren und so infolge der Eigenschaften der modifizierten Oberfläche eine immobilisierte Lipiddoppelschicht ausbilden, die eine definierte Asymmetrie aufweist. Es handelt sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein ausgesprochen leicht zu handhabendes System, welches lediglich geringen präparativen Aufwand erfordert.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können verschiedene herkömmliche Trägermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein im wesentlichen planarer Träger als Festkörper verwendet. Dieser kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Vorteilhafterweise kann auch die Oberfläche aus einem anderen Material als der restliche Träger hergestellt sein. Die Festkörperoberfläche besteht vorzugsweise aus Silikat, einem Halbleiter, insbesondere Silizium, einem Edelmetall, beispielsweise Gold, und/oder einem Polymer, beispielsweise Polystyrol. Andere Oberfläche sind selbstverständlich auch möglich.

Darüber hinaus können als Oberflächenmaterialien Filme aus pulverförmigen Metallen, Halbleitern, Edelmetallen und/oder Polymeren eingesetzt werden, die auf weitgehend planaren Trägermaterialien aufgebracht sind oder auf diesen aufgebracht werden können. Bei diesen Trägermaterialien kann es sich beispielsweise um Unterlagen aus Papier, Glas, Kunststoff o. dgl. handeln, mit denen die Festkörper in geeigneter Weise verbunden werden, insbesondere durch Verkleben oder Verschmelzen.

Besonders bevorzugt ist der Einsatz von dispergierbaren Festkörpern, die vorteilhafterweise aus Partikeln von beispielsweise mikroskopischen Dimensionen bestehen. Bevorzugte Materialien für solche Festkörper sind Aluminate, Borate und/oder Zeolithe. Weiterhin sind kolloidale Lösungen von Edelmetallen, Metallen usw. geeignet. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Silikatpartikeln. Diese Partikel können beispielsweise herkömmliche Silikatkugeln sein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden poröse Partikel eingesetzt, wodurch die für die Immobilisierung zur Verfügung stehende Oberfläche vergrößert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den verwendeten Partikeln um magnetische Partikel, wodurch die Handhabbarkeit in verschiedenen Anwendungen wesentlich erleichtert werden kann. Dies spielt insbesondere bei dem Einsatz der erfindungsgemäß immobilisierten Lipiddoppelschichten in Automatisierungsprozessen eine Rolle. Weiterhin ist die Verwendung von Kernschalenpolymerpartikeln bevorzugt.

Bevorzugterweise werden die verwendeten Festkörper in Form einer Dispersion eingesetzt. Diese Dispersion wird vorteilhafterweise in wäßrigen Lösungen hergestellt.

Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung einer modifizierten Oberfläche eines Festkörpers zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht mit einer definierten Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche des Festkörpers. Die modifizierte Oberfläche ist dafür geeignet, die Lipiddoppel­ schicht im wesentlichen stabil und dynamisch zu immobilisieren. Bezüglich der weiteren Eigenschaften der Verwendung der modifizierten Oberfläche wird auf die obige Beschreibung verwiesen.

Ferner umfaßt die Erfindung eine immobilisierte Lipiddoppelschicht, die durch ein Verfahren herstellbar ist, wie es oben beschrieben ist. Diese immobilisierte Lipiddoppelschicht weist eine definierte Orientierung auf und ist auf einem Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert.

Weiterhin umfaßt die Erfindung immobilisierte Proteine, die durch ein oben be­ schriebenes Verfahren herstellbar sind. Hierbei handelt es sich um Proteine, die mit einer Lipiddoppelschicht assoziiert sind, welche ihrerseits auf einem Fest­ körper immobilisiert ist. Die Proteine sind insbesondere Membranproteine, die die Lipiddoppelschicht ganz oder teilweise durchspannen, die nur eine der die Lipid­ doppelschicht bildenden Lipidschichten durchspannen oder hier eingebettet sind, oder die auf einer oder beiden Seiten der Lipiddoppelschicht eingebettet oder angelagert sind.

Außerdem umfaßt die Erfindung einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten. Dieser Kit ist dafür vorgesehen, Lipiddoppelschichten zu immobilisieren, so daß diese Lipiddoppelschichten mit ihrer inneren und äußeren Lipidschicht eine definierte Orientierung auf der Oberfläche eines Festkörpers aufweisen. Die Orientierung ist im vorhinein bestimmbar. Die derart immobilisierten Lipiddoppelschichten sind im wesentlichen stabil und dynamisch auf dem Festkörper fixiert, so daß sie für funktionelle und strukturelle Untersuchungen der Lipiddoppelschicht, beispielsweise einer Membran, in besonderer Weise geeignet sind. Dieser Kit umfaßt mindestens einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche, der für die Immobilisierung der Lipiddoppelschicht im erfindungsgemäßen Sinne geeignet ist. Bezüglich der Eigenschaften dieser modifizierten Festkörperoberfläche wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Weiterhin kann es bevorzugt sein, daß der Kit nicht die fertig modifizierte Oberfläche enthält, sondern vielmehr die verschiedenen Komponenten, die zur Herstellung einer solchen modifizierten Oberfläche notwendig sind. Dies kann beispielsweise aus Lagerungs- und/oder Stabilitätsgründen vorteilhaft sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits sind in diesem Kit weiterhin Lipidvesikel vorhanden, wobei die Lipidvesikel vorzugsweise zusätzliche Komponenten, insbesondere Proteine, aufweisen. Diese Lipidvesikel sind für eine Fusion auf der modifizierten Festkörperoberfläche vorgesehen und bilden somit das Material für die immobilisierte Lipiddoppelschicht. Hierbei kann es bevorzugt sein, daß weitere Komponenten für die Lipiddoppelschicht vom Anwender selbst bereitgestellt und in die Lipidvesikel eingebracht werden. Die Lipidvesikel liegen vorteilhafterweise in Form einer Dispersion vor. Dies kann beispielsweise eine wäßrige Dispersion sein, die unter Umständen entsprechende Zusätze enthält, die die Stabilität und Haltbarkeit der Lipidvesikel verbessern. Selbstverständlich können die Lipide auch in anderer Form als in Vesikeln, beispielsweise in trockener Form, bereitgestellt werden.

Weiterhin umfaßt die Erfindung einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Proteinen, die sich in oder an ihrerseits immobilisierten Lipiddoppelschichten mit definierter Orientierung befinden. Dieser Kit umfaßt mindestens einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche sowie vorzugsweise Lipide, insbesondere in Form von Vesikeln, die die zu immobilisierenden Proteine aufweisen. Bevorzugterweise handelt es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine, die durch die Immobilisierung in Lipiddoppelschichten ihre natürliche Umgebung vorfinden und so unter nahezu nativen Bedingungen analysiert werden können. Bezüglich der verschiedenen Einzelheiten im Hinblick auf die immobilisierten Proteine wird auf die obige Beschreibung verwiesen.

Schließlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung von Proteinen, insbesondere von Membranproteinen, wobei diese Proteine als immobilisierte Proteine in ihrerseits immobilisierten Lipiddoppelschichten eingesetzt werden. Hinsichtlich der eingesetzten immobilisierten Proteine in Lipiddoppelschichten wird ebenfalls auf die obige Beschreibung Bezug genommen. Die weitere Durchführung des Verfahrens wird nach üblichen Methoden vorgenommen, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.

Die beschriebenen Merkmale sowie weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Figuren und der folgenden Beschreibung von Beispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Figuren ist gezeigt:

Fig. 1 Vergleich erfindungsgemäß immobilisierter Erythrozytenmembranen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand der Aktivität der Acetylcholinesterase,

Fig. 2 Vergleich von erfindungsgemäß immobilisierten CACO-2 Plasmamembranen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand der Hydrolyseaktivität des P- Glykoproteins in Gegenwart eines Modulators (Verapamil),

Fig. 3 Vergleich erfindungsgemäß immobilisierter Plasmamembranen auf HEK293-Zellen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand durch Neuromidase freigesetzter N- Acetylsialinsäure und

Fig. 4 Vergleich erfindungsgemäß immobilisierter Erythrozytenmembranen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand der Bindung von Peanuts Lektin-FITC an die Glykokalix nach Neuramidasebehandlung.

Beispiele 1. MODIFIZIERUNG DER FESTKÖRPEROBERFLÄCHE 1.1. Funktionalisierung der Festkörperoberfläche 1.1.1 Aminofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatober­ flächen mit N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan (EDA)

Eine Silanlösung, bestehend aus 9,2 mL N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyl­ trimethoxysilan (EDA) und 243 µL konzentrierter Essigsäure in 450 mL entionisiertem Wasser, wurde frisch hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 2 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 50-10 von Macherey-Nagel, Düren) zu der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt. Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach wird das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wird mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert. In ähnlicher Weise wurden weitere Trägermaterialien mit Porengrößen zwischen 5 und 400 nm funktionalisiert.

1.1.2. Aminofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatoberflächen mit Polyethylenimin (PEI)

Zu einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg PEI (50%-Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 ml entionisiertem Wasser wurden 5 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 4000-10) von Macherey-Nagel, Düren) gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Umsetzung wurde mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert. In ähnlicher Weise wurden weitere Trägermaterialien mit Porengrößen zwischen 5 und 400 nm funktionalisiert.

1.2. Einstellung besonders bevorzugter Eigenschaften 1.2.1. Chemisorption von Polyoxyethylen bis(glycidylether (PEG-DiGly) auf EDA-funktionalisierten Silikatoberflächen

Zu 10 mL einer 5%igen Lösung aus Polyoxyethylen bis(glycidylether PEG- DiGly) (Mw~3350 SIGMA) in Phosphatpuffer (pH 7,4) wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. aminofunktionalisierten Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Chemisorption wurde mittels DRIFT dokumentiert.

1.2.2. Adsorption von Na-Polystyrolsulfonat (PSS) auf Polyethylenimin­ funktionalisierten Silikatoberflächen

Zu einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung, bestehend aus 25 mg PSS (Mw~70.000, Aldrich, Steinheim) in 50 mL einer 3molaren NaCl-Lösung wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.2. aminofunktionalisierten Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels DRIFT und der Abnahme der PSS-Konzentration in der Lösung dokumentiert.

2. DEPOSITION VON LIPIDSCHICHTEN AUF DEN MODIFIZIERTEN OBERFLÄCHEN 2.1. Immobilisierung von nativen Erythrozyten-Membranen auf unbehandelten Silikatoberflächen und Messung der Acetylcholin­ esterase-Funktion

Orientierte RSO- und ISO-Plasmamembranvesikel wurden nach einem Verfahren von Steck und Kant (Methods in Enzym. 1974, 31, 172-180) hergestellt. Diese Dispersion wurde anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu jeweils 900 µL dieser Lösungen (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg eines porösen Silikatträgers (Mache­ rey-Nagel, Düren) zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCl (Inkubations­ puffer) verwendet wurde. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkubationspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Aktivität der in der Außenschicht vorkommenden Acetylcholinesterase wurde nach einer Methode von Ellman et. al. (Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88) auf dem Trägermaterial nach der Waschung im Inkubationspuffer bestimmt. Dabei ist es wichtig, in einer Kontrolle mittels Detergenz Löcher in der Lipiddoppelschicht herzustellen und so eventuell von der Oberfläche abgewandte Enzymmoleküle zu messen (Fig. 1). Diese Funktionstests belegten eine Invertierung bei der Fusion mit der angebotenen Festkörperoberfläche, sowie die Einheitlichkeit (<90%) der erhaltenen Oberfläche.

2.2. Immobilisierung von nativen CACO-2-Membranen auf unterschied­ lichen Silikatoberflächen und Messung der ATPase-Funktion des P-Glykoproteins

ISO-orientierte Plasmamembranvesikel aus CACO-2 Zellen wurden nach einem Verfahren von Schlemmer und Sirotnak (Anal. Biochem. 1995, 228, 226-231) hergestellt. Diese Dispersion wurde anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 µL dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden jeweils 50 mg eines ent­ sprechend Beispiel 1.2.1. bzw. Beispiel 1.2.2. modifizierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurden die Trägermaterialien sedimentiert und dreimal mit Inkubations­ puffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Bestimmung der Aktivität des P- Glykoproteins auf den Trägermaterialien erfolgte nach der Waschung im Inkubationspuffer durch Bestimmung der ATP-Hydrolyse-Aktivität in Abhängigkeit eines bekannten Modulators (Verapamil). Im Falle des nach Beispiel 1.2.2. modifizierten Träger wird nach der Immobilisierung eine RSO-orientierte Oberfläche erhalten, die jedoch aufgrund der falschen Orientierung des zu untersuchenden Proteins keine nennenswerte Enzymaktivität besitzt. Anders die mit Hilfe des Trägers aus Beispiel 1.2.1. hergestellten ISO-Oberfläche. Sie besitzt eine zu den isolierten Vesikeln vergleichbare Hydrolyseaktivität (Fig. 2) auf dem Trägermaterial.

2.3. Immobilisierung von nativen HEK293-Membranen auf unterschied­ lichen Silikatoberflächen und Messung der mittels Neuramidase freigesetzten N-Acetylsialinsäure

RSO-orientierte Plasmamembranvesikel aus HEK293-Zellen wurden nach einem Verfahren von DePierre und Karnovsky (Journal of Cell Biology 1973, 56, 275-303) hergestellt. Diese Dispersion wurde anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 µL dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden jeweils 50 mg eines ent­ sprechend Beispiel 1.2.1. bzw. Beispiel 1.2.2. modifizierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurden die Trägermaterialien sedimentiert und dreimal mit Inkubations­ puffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Freisetzung von N-Acetylsialinsäure durch Neuramidase auf den Trägermaterialien erfolgte nach der Waschung im Inkubationspuffer durch einen Kit der Firma CalBiochem (Bad Soden) entsprechend des beigefügten Protokolls. Im Falle des nach Beispiel 1.2.1. modifizierten Trägers wird nach der Immobilisierung eine ISO-orientierte Oberfläche erhalten, die jedoch aufgrund der falschen Orientierung der zu untersuchenden Glykokalix keine nennenswerte Freisetzung an N- Acetylsiliansäure durch Neuramidase besitzt. Erst durch Zugabe von Detergenz kann eine vergleichbare Freisetzung erzielt werden. Anders die mit Hilfe des Trägers aus Beispiel 1.2.2. hergestellte RSO-Oberfläche. Sie besitzt eine zu den isolierten Vesikeln vergleichbare Freisetzung (Fig. 3) auf dem Trägermaterial.

2.4. Immobilisierung von nativen Erythrozyten-Membranen auf PEI/PSS- modifizierten Silikatoberflächen und Markierung der Glykokalix mit FITC-Lektinen

Orientierte RSO- und ISO-Plasmamembranvesikel wurden nach einem Verfahren von Steck und Kant (Methods in Enzym. 1974, 31, 172-180) hergestellt. Diese Dispersionen wurden anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 µL einer 1 : 1 (v/v) Mischung dieser Lösungen (insgesamt etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg eines entsprechend Beispiel 1.2.2. modifizierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Trie­ thanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkubationspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Markierung der Glykokalix (Außenseite der RSO- Vesikel) wurde mit Hilfe der Bindung von Peanut Lektin (FITC-gekoppelt, Sigma- Aldrich GmbH, München) auf dem Trägermaterial nach der Waschung im Inkubationspuffer vorgenommen und im Fluoreszenzmikroskop dokumentiert.

Diese Markierung belegt, daß nur eine RSO-Oberfläche mit einer Einheitlichkeit von mind. 90% hergestellt wurde (Fig. 4).

3. EIGENSCHAFTEN DER MEMBRANEN AUF OPTIMIERTEM TRÄGERMATERIAL 3.1. Stabilität im fließenden wäßrigen Medium

Die in Beispielen 2.1. bis 2.4. beschriebenen Systeme wurden für die Dauer von 24 Stunden einem strömenden Medium (Inkubationspuffer des jeweiligen Beispiels) in einem Testbad ausgesetzt. In Abständen von 2 Stunden wurden jeweils gleiche Mengen Trägermaterial aus dem Testbad entnommen, getrocknet und anschließend mittels DRIFT auf ihre Beschichtung hin untersucht. Es wurde keine meßbare Abnahme der Membranbeschichtung mit der Zeit beobachtet.

3.2. Stabilität nach Einfrieren

Die in den Beispielen 2.1. bis 2.4. beschriebenen Systeme wurden bei -80°C im dispergierten Zustand eingefroren und anschließend auf Raumtemperatur gebracht und getrocknet. Vergleichende DRIFT-Messungen vor und nach dem Einfrieren ergaben unveränderte Lipid- und Proteinmengen auf dem Trägermaterial. Die beschriebenen Systeme wurden zusätzlich nach der Präparation über die Dauer von 3 Monaten bei -80°C aufbewahrt. Im Abstand von 1 Monat wurden Proben entnommen und entsprechend in den Beispielen beschriebenen Meßgrößen untersucht. Nach 2 Monaten waren die Enzymaktivitäten auf ca. 70% des ursprünglichen Wertes (unmittelbar nach der Präparation und Waschung des Trägermaterials gemessen) abgesunken, während die Markierung der Glykokalix mit FITC-Lektin unveränderte Ergebnisse brachten. In den jeweiligen Überständen der gelagerten Proben konnte kein Protein nachgewiesen werden.

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht mit einer inneren und einer äußeren Lipidschicht, wobei die Lipiddoppel­ schicht eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf einer Oberfläche eines Festkörpers aufweist und auf der Oberfläche des Festkörpers im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert ist, umfassend die folgende Verfahrensschritte:

• a) Modifizieren der Oberfläche des Festkörpers zur Ausbildung einer Fläche, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt und
• b) Deponieren der Lipiddoppelschicht auf der modifizierten Oberfläche.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in die Lipid­ doppelschicht weitere Komponenten, insbesondere Proteine, eingefügt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Deponieren der Lipiddoppelschicht durch Fusion von Lipid­ vesikeln vorgenommen wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Oberfläche des Festkörpers folgende Teilschritte umfaßt:

• a) Funktionalisieren der Oberfläche und/oder
• b) Adsorbieren und/oder Chemisorbieren von wechselwirkenden Mole­ külen.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Verfahrensschritt a) modifizierte Oberfläche mit der inneren Lipidschicht wechselwirkt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Oberfläche durch Aufbringen von Polymer­ filmen mit negativer Nettoladung vorgenommen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Verfahrensschritt a) modifizierte Oberfläche mit der äußeren Lipidschicht wechselwirkt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Oberfläche durch Aufbringen von Polymerfilmen mit positiver Nettoladung vorgenommen wird.

9. Verwendung einer modifizierten Oberfläche eines Festkörpers zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht mit einer inneren und einer äußeren Lipidschicht, wobei die Lipiddoppelschicht eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf einer Ober­ fläche eines Festkörpers aufweist und auf der Oberfläche des Fest­ körpers im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert ist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Festkörpers zur Wechselwirkung mit der inneren Lipidschicht vorgesehen ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche eine negative Nettoladung, insbesondere einen Polymerfilm mit negativer Nettoladung, aufweist.

12. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Festkörpers zur Wechselwirkung mit der äußeren Lipidschicht vorgesehen ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche eine positive Nettoladung, insbesondere einen Polymerflim mit positiver Nettoladung, aufweist.

14. Immobilisierte Lipiddoppelschicht, herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

15. Immobilisierte Proteine, insbesondere Membranproteine, herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8.

16. Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten mit inneren und äußeren Lipidschichten, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche von Festkörpern aufweisen und auf der Oberfläche der Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert sind, mindestens umfassend einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt.

17. Kit nach Anspruch 16, weiterhin umfassend Lipidvesikel, die vorzugs­ weise weitere Komponenten, insbesondere Proteine, aufweisen.

18. Kit zur Herstellung von immobilisierten Proteinen in immobilisierten Lipiddoppelschichten mit inneren und äußeren Lipidschichten, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche von Festkörpern aufweisen und auf der Oberfläche der Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch stabilisiert sind, mindestens umfassend einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt, sowie vorzugsweise Lipidvesikel, die Proteine aufweisen.

19. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 6 herstellbar ist.

20. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche nach einem Verfahren gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8 herstellbar ist.

21. Verfahren zur Untersuchung von Proteinen, insbesondere von Membranproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Proteine als immobilisierte Proteine in immobilisierten Lipiddoppelschichten mit inneren und äußeren Lipidschichten eingesetzt werden, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche von Festkörpern aufweisen und auf der Oberfläche der Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert sind.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die immo­ bilisierten Lipiddoppelschichten nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 herstellbar sind.