-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Gebiet der Erfindung
-
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Bilden von Lipiddoppelschichtmembranen und insbesondere auf das Bilden planarer Lipiddoppelschichten über kleinen Öffnungen zur Verwendung in Ionenkanalmesssystemen.
-
Derartige Verfahren sind beispielsweise aus folgenden Veröffentlichungen bekannt: WHITE, R.J. [et al.]: Single Ion-Channel Recordings Using Glass Nanopore Membranes. In: J. Am. Chem. Soc., Vol. 129, No. 38, 2008, S. 11766-11775, WANUNU, M. [et. al.]: Chemically Modified Solid-State Nanopores. In: Nano Letter, Vol. 7, No. 6, 2007, S. 1580-1585 und SUZUKI, H. [et al.]: Planar lipid bilayer reconstitution with a micro-fluidic system. In: Lab Chip, Vol. 4, 2004, S. 502-505.
-
Diskussion des Stands der Technik
-
Eine planare Lipiddoppelschicht (Planar Lipid Bilayer; PLB), auch als schwarze Lipidmembran (Black Lipid Membrane; BLM) bezeichnet, ist eine aus Lipiden zusammengesetzte Membran, die eine Öffnung in einer synthetischen Stützstruktur überspannen. PLBs werden ausgiebig als gesteuerte Umgebungen für die Untersuchung von Ionenkanalfunktionen verwendet. Ist eine PLB gebildet, können Ionenkanäle in die PLB entweder durch spontanes Einsetzen von wasserlöslichen Ionenkanälen aus einer vorgehaltenen Lösung oder durch das Einfügen von Ionenkanälen durch Fusion von Ionenkanälen enthaltenden Liposomen eingesetzt werden. Ionenkanäle sind Membranproteine, die eine kritische Rolle bei einer großen Anzahl von physiologischen Prozessen spielen, einschließlich neuronaler Signalübertragung, Muskelerregung, Hormonsekretion, Blutdruckregulierung, Elektrolytgleichgewicht und Zelltod. Aufgrund ihrer Bedeutung in solch einem großen Bereich von physiologischen Funktionen sind die detaillierte Funktion von Ionenkanälen wie auch deren Interaktion mit Medikamenten und anderen Chemikalien ein Gebiet intensiver wissenschaftlicher Forschung. Ionenkanäle werden oft in ihrer natürlichen zellulären Umgebung untersucht, aber die PLB bietet ein weit mehr kontrolliertes und zugängliches Mittel zum Studium des Verhaltens eines weiten Bereichs von Ionenkanälen dar.
-
In Lipiddoppelschichten vorhandene Ionenkanäle sind auch als Komponenten von Biosensoren nützlich. Die Anwesenheit spezifischer Chemikalien und Änderungen in Umgebungsbedingungen, wie etwa pH, Elektrolytkonzentration und Temperatur, beeinflussen die Funktion des Ionenkanals. Durch Beobachten der Leitfähigkeit eines Ionenkanals ist es möglich, die Anwesenheit einer großen Auswahl von chemischen Agentien zu detektieren.
-
Öffnungen im Nanometer- und Mikrometermaßstab, die als „Nanoporen“ bezeichnet werden, bieten eine robuste Plattform für die Bildung von Lipiddoppelschichten und die Messung von Ionenkanalströmen. Die auf den Nanoporen gebildete kleine Fläche der Doppelschichten führt zu langen Doppelschichtlebensdauern, einer Unempfindlichkeit gegenüber Vibrationen und einer sehr geringen Kapazität über die Doppelschicht. Die Erschütterungsunempfindlichkeit reduziert den Rauschpegel der Ionenkanalmessung durch Eliminieren kohärenter Geräuschquellen aus der die Vorrichtung umgebenden Umgebung. Die kleine Fläche der Doppelschicht minimiert das Stromrauschen aufgrund der Leitung von zeitvariierenden Strömen über die Doppelschicht selbst. In Glas und Quarzsubstraten hergestellte Nanoporen haben den weiteren Vorteil, dass der hohe Widerstand und geringe Leitfähigkeit des Materials weiter das Stromrauschen der Ionenkanalmessung reduzieren.
-
Die Lipide in einer PLB sind typischerweise Phospholipide, aber Doppelschichten können ebenso aus einer großen Vielzahl von Lipiden gebildet sein, einschließlich Glycerolipiden, Glycerophospholipiden, Sphingolipiden, Saccharolipiden, Prenollipiden, Fetten, Fettacylen, Sterolen und Polyketiden. Üblicherweise sind PLBs über eine einzige Öffnung (z. B., 10 - 200 µm im Durchmesser) in einem hydrophoben Film (z. B., Delrin™, Polysterol, Polysulfon, Polymethylmethacrylat) gebildet oder eine Glaspatchpipette (z. B. 100 nm bis 5) gezogen. Eine PLB kann auch über eine Glasnanoporenmembran (GNM) gebildet sein, die aus einer einzelnen konisch geformten Pore (10 nm bis 2 µm Öffnungsradius) eingebettet in einer dünnen Glasmembran (~50 µm) und dem Ende einer cyano-silanbeschichteten Glaskapillare besteht. PLB sind auch über Öffnungen in Silikon, Silikonnitrit und Silikonoxid, das auf einer Halbleiteroberfläche abgelegt wurde, gebildet worden. Die Oberflächeneigenschaft der verwendeten Substrate haben einen dramatischen Einfluss auf die Struktur der Doppelschicht.
-
Derzeit gibt es eine Anzahl von Methoden zur PLB Bildung, die dem Fachmann bekannt sind. Diese beinhalten: Apposition, Lackieren, Spitzentauchen und Mikrofluidik, die im Folgenden näher erläutert werden. Bei der Appositionsmethode wird ein hydrophober Film, der eine einzige Öffnung enthält, zwischen zwei Kompartimenten einer Zelle befestigt. Die zwei Kompartimente werden dann mit einer Elektrolytlösung befüllt, so dass die Höhe der Lösungen unterhalb der Öffnung ist. Als nächstes wird der hydrophobe Film durch Platzieren eines Tropfens Hexadekan auf der Oberfläche des Films in der Umgebung der Öffnung vorbehandelt. Eine Mixtur von Lipid/Pentan wird tropfenweise auf die Oberfläche beider Elektrolytlösungen platziert und dem Pentan Zeit gegeben zu verdunsten, worauf Lipid Monolayer auf der Oberfläche der Elektrolytlösungen verbleiben. Eine Elektrolytlösung wird dann über die Öffnung angehoben, wodurch ein Lipid Monolayer auf der Oberfläche des hydrophoben Films und ein Blatt des Bilayers abgelegt wird, das die Öffnung überspannt. Die andere Elektrolytlösung wird dann über die Öffnung angehoben, wodurch ein Lipid Monolayer auf der gegenüberliegenden Seite des hydrophoben Films und das zweite Blatt der Doppelschicht abgelegt wird, die die Öffnung überspannt. Diese Technik ist gut bekannt, um lösungsfreie Doppelschichten herzustellen, d. h., die PLB enthält keine signifikanten Mengen eines organischen Lösungsmittels. Jedoch kann die Apposition nicht in Systemen verwendet werden, bei denen nur eine Seite eine Öffnung zugänglich ist, z. B., eine Glasnanoporenmembran oder eine Anordnung von Nanoporen mit individuellen Ablesungen.
-
Die Spitzentauchmethode wird üblicherweise verwendet, um planare Lipid-Doppelschichten über eine Patchpipette abzulegen und beinhaltet zunächst das Anordnen einer Patchpipettenspitze in einer Zelle, die eine Elektrolytlösung enthält. Eine Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur wird dann tropfenweise auf der Oberseite der Elektrolytlösung angeordnet und dieser ermöglicht sich auszubreiten, wodurch ein Lipid Monolayer über der Oberfläche gebildet wird. Als nächstes wird die Patchpipettenspitze aus der Elektrolytlösung herausgezogen, wodurch ein Lipid Monolayer auf der Oberfläche der Pipettenspitze, mit den hydrophilen Kopfgruppen in Richtung der Wasserschicht auf der Glasoberfläche orientiert abgelegt wird. Die Pipettenspitze wird dann durch die Lipid Monolayer an der Luft/Wasserschnittstelle zurückgedrückt, um die zweiten Lipid Monolayer auf der bereits existierenden Monolayer abzulegen und eine Lipiddoppelschicht zu bilden. Von diesen Lipid-Doppelschichten ist bekannt, dass diese einen kleinen Anteil eines organischen Lösungsmittels enthalten. Da die Oberfläche der Patchpipette hydrophil ist, erstreckt sich die PLB über die Öffnung und um die Seite der Patchpipette. Diese ausgedehnte Doppelschicht ermöglicht den Ionenkanälen die gestützte Doppelschicht am Glas in einer Region einzunehmen, die nicht über der Öffnung selbst ist. Ionenkanäle in dieser Region neigen dazu, anomal kleine Leitfähigkeit aufgrund des hohen Widerstands der Wasserschicht zwischen der gestützten Lipiddoppelschicht und dem Glas auszubilden.
-
Das Lackierverfahren beinhaltet das Ausbreiten eines Lipids/organischen Lösungsmittels über der Oberfläche eines hydrophoben Films, unter Verwendung einer Pipettenspitze, um eine Lipiddoppelschicht über einer Öffnung in diesem Film anzulegen. Beim Lackierverfahren wird die Oberfläche des Films zunächst mit Lipid/organischen Lösungsmitteln„angesogen". Üblicherweise stellt das Ansaugen das Verwenden einer Pipettenspitze zum Ablegen des Lipids/organischen Lösungsmittels auf dem hydrophoben Film dar. Dieses Lipid/Lösungsmittel ist dann leicht über der Oberfläche des Films um die Öffnung ausgebreitet und zum Trocknen belassen. Nach dem Trocknen wird der Film in einer Zwei-Kompartimentenzelle, die durch eine einzige Öffnung getrennt sind, eingesetzt. Beide Seiten der Zelle werden dann mit einer Elektrolytlösung befüllt, so dass die Höhe jeder Lösung oberhalb der Öffnung liegt. Der Film wird dann ein zweites Mal in der Lösung angesogen. Eine saubere Pipettenspitze wird dann verwendet, um das Lipid/Lösungsmittel auf der Oberfläche des Films über der Öffnung zu ziehen, wodurch spontan eine Lipid-Doppelschicht gebildet wird. Das Lackierverfahren ist ein manueller Vorgang, der zum Ausführen beträchtliches Geschick erfordert und nicht automatisiert werden kann. Zusätzlich enthält die PLB, die durch Lackieren gebildet ist, eine große Menge Lösungsmittel auf Grund der Natur des Vorgangs. Von einem hohen Lösungsmittelgehalt in der PLB ist bekannt, dass er die Funktion der eingebetteten Ionenkanäle beeinflusst.
-
PLBs wurden auch in Mikrofluidvorrichtungen gebildet. Bei diesem Verfahren wird beispielsweise eine Öffnung mit einem Durchmesser von 100 µm zwischen einer oberen Kammer und einem 0,5 mm hohen und 2 mm weiten Kanal gebildet. Ein wässriger Elektrolyt wird zur oberen Kammer hinzugegeben und eine Lipid/Lösungsmittelösung wird durch den Kanal und durch die Öffnung eingeströmt. Luft wird durch den Kanal geführt, um die Lipid/Lösungsmittellösung zu entfernen, und ein wässriger Elektrolyt wird in den Kanal eingeführt. Die äußere Kammer wird versiegelt, ein Druck wird angelegt und die PLB bildet sich spontan über der Öffnung. Das Mikrofluid PLB Bildungsverfahren erfordert eine große Anzahl von Schritten und es konnte nicht gezeigt werden, dass es bei Öffnungen unterhalb 100 µm Durchmesser funktioniert.
-
Die vorstehend erläuterten Doppelschichtbildungsverfahren erfordern entweder deutliche Übung (z. B. das Lackieren und das Eintauchen der Spitzen), große Porengrößen, viele Schritte oder erfordern freien Zugang zu beiden Seiten der Öffnung, über der die Doppelschicht gebildet wird. Derzeit gibt es kein verfügbares Verfahren zum zuverlässigen und automatischen Bilden von Lipid-Doppelschichten über einer Öffnung, wenn nur eine Seite der Öffnung zugänglich ist. Entsprechend besteht die Notwendigkeit im Stand der Technik für ein Verfahren und ein System, in dem Lipid-Doppelschichten einfach und reproduzierbar direkt angelegt werden können, auch wenn der Zugang nur auf eine Seite der Öffnung beschränkt ist.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur einseitigen planaren Lipid-Doppelschicht; PLB (Planar Lipid Bilayer) Bildung über Nanoporen. Die Membran bildende Vorrichtung der vorliegende Erfindung weist eine erste Fluidkammer und eine zweite Fluidkammer auf, die sich durch die Seitenwandung der ersten Fluidkammer erstreckt und von dieser durch eine Trennwand separiert ist, die eine darin gebildete Nanopore aufweist. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die zweite Fluidkammer eine Glaskapillare, die eine Glasnanoporenmembran (GNM) definiert. Optional kann die Vorrichtung einen Deckel zum selektiven Abdichten der ersten Fluidkammer und einen automatischen Fluid Pegelregulator zum selektiven Ändern der Fluidpegel innerhalb der ersten Fluidkammer aufweisen.
-
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um entweder Lösungsmittel enthaltende PLBs oder lösungsfreie PLBs zu enthalten. Bei Verwendung wird eine Elektrolytlösung in die erste und die zweite Fluidkammer eingefüllt. Eine Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur wird dann tropfenweise auf der Oberseite der Elektrolytlösung in der ersten Fluidkammer abgesetzt und dieser ermöglicht, sich über die Oberfläche der Elektrolytlösung auszubreiten, um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht zu bilden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird eine Lösungsmittel enthaltende PLB unter Verwendung einer Lipid-/organischen Lösungsmittel-Mixtur erzeugt, die aus 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) in einem gering flüchtigen organischen Lösungsmittel, wie etwa Dekan, Hexadekan, Squalen oder anderen Alkanen besteht. Der Pegel der Elektrolytlösung in der ersten Fluidkammer wird dann im Hinblick auf die Trennwand derart eingestellt, dass die Elektrolytlösung und die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht über die Trennwand hinaus getragen wird, wodurch eine Lösungsmittel enthaltende PLB über der Nanopore auf der Oberfläche der Trennwand gebildet wird. Wird eine lösungsmittelfreie PLB gewünscht, besteht die Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur aus einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel mit hohem Dampfdruck, wie etwa Pentan. Dem organischen Lösungsmittel mit hohem Dampfdruck wird ermöglicht sich zu verflüchtigen, um eine Lipid Monoschicht auf der Oberfläche der Elektrolytlösung vor dem Anpassen des Pegels des Elektrolyts in der ersten Fluidkammer zu bilden. Der Pegel der Elektrolytlösung wird dann derart eingestellt, dass die Elektrolytlösung und die Lipid Monoschicht nach oben über die Trennwand getragen werden, wodurch über die Nanopore auf der Oberfläche der Trennwand eine lösungsmittelfreie PLB gebildet wird.
-
Eine hydrophobe Beschichtung kann vor der PLB Bildung auf der Oberfläche der Trennwand hinzugefügt werden, um eine zusätzliche Stütze für die PLB bereitzustellen.
-
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um entweder lösungsmittelenthaltende PLB oder lösungsmittelfreie PLB unter Verwendung von Lipidvesikeln zu erzeugen. Bei Verwendung wird eine Elektrolytlösung in die erste und in die zweite Fluidkammer gegeben. Lipidvesikel können entweder bereits in der Elektrolytlösung zur ersten Kammer hinzugefügt sein oder Lipidvesikel können zu der Elektrolytlösung hinzugegeben werden, nachdem die Elektrolytlösung zur ersten Kammer hinzugefügt worden ist. Die Lipidvesikel werden dann spontan auf der Oberfläche des Elektrolyts eine Lipid Monoschicht bilden. Ein Lösungsmittel mit einem geringen oder einem kombinierten hohen und geringen Dampfdruck wird dann auf der Oberfläche der Elektrolytlösung hinzugegeben, um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht auf der Oberfläche des Elektrolyts zu bilden. Der Pegel der Elektrolytlösung in der ersten Fluidkammer wird dann im Hinblick auf die Trennwand derart eingestellt, dass die Elektrolytlösung und die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht vorbei an der Trennwand nach oben getragen werden, wodurch eine Lösungsmittel enthaltende PLB über der Nanopore in der Oberfläche der Trennwand gebildet wird. Wird eine lösungsmittelfreie PLB gewünscht, die durch Verwenden durch Lipidvesikeln gebildet ist, können Lipidvesikel entweder bereits in der zu der ersten Kammer hinzugegebenen Elektrolytlösung sein oder Lipidvesikel können zu der Elektrolytlösung hinzugegeben werden, nachdem die Lösung zur ersten Kammer hinzugegeben worden ist. Die Lipidvesikel werden dann spontan eine Lipid Monoschicht auf der Oberfläche des Elektrolyts bilden vor dem Anpassen des Pegels des Elektrolyts in der ersten Fluidkammer. Ein Lösungsmittel mit geringem Dampfdruck kann auf die Oberfläche der Trennwand vor dem Anpassen des Pegels der Elektrolytlösung gebracht werden. Der Pegel der Elektrolytlösung wird dann derart eingestellt, dass die Elektrolytlösung und die Lipid Monoschicht an der Trennwand vorbei nach oben getragen werden, wodurch eine lösungsfreie PLB über der Nanopore in der Oberfläche der Trennwand gebildet wird.
-
Elektrolytpegel können manuell oder unter Verwendung des automatischen Fluidpegelregulators eingestellt werden. Der automatische Fluidpegelregulator kann in Form einer Pumpe oder einer Steuerung sein, die den Pegel der Elektrolytlösung in der ersten Fluidkammer selektiv variiert, um das Ablegen einer PLB über der Nanopore zu beeinflussen oder kann in der Form einer Kippeinrichtung sein, die die erste Fluidkammer kippt, um das Ablegen einer PLB über der Nanopore zu beeinflussen.
-
Die membranbildende Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist insbesondere an die Verwendung in einem Ionenkanalmesssystem angepasst. Speziell können Ionenkanäle oder Proteinporen in PLBs eingesetzt werden und das System kann verwendet werden, um die Ionenkanalsensitivität zu analysieren. Bei Verwendung legt eine Steuerung eine Vorspannung über die ersten und die zweiten Elektroden an, die jeweils in der ersten und der zweiten Fluidkammer angeordnet sind und der Strom zwischen den Elektroden wird gemessen. Optional kann die membranbildende Vorrichtung verwendet werden, um mehrere PLBs über einer Anordnung von Nanoporen zu bilden. In dieser Ausstattung ist das Messsystem eingerichtet zum separaten Aufzeichnen der Leitfähigkeit von Ionenkanälen, die in mehrere PLBs eingesetzt sind.
-
Vorteilhafterweise vermeiden die vorliegende Vorrichtung und das Verfahren die signifikante Lernkurve, die mit dem Anwenden von Spitzentauchen und Membranlackierverfahren verbunden sind und bietet ein zuverlässiges Mittel zum Bilden von Lipid-Doppelschichten über eine Öffnung, wenn nur eine Seite der Öffnung zugänglich ist.
-
Figurenliste
-
- 1A-1C stellen verschiedene Stadien der Membranbildung in einer membranbildenden Vorrichtung der vorliegenden Erfindung dar;
- 2A-2B stellen verschiedene Fluidpegelstände in der membranbildenden Vorrichtung der 1A-1C unter Verwendung eines Kippverfahrens einer Fluidpegelsteuerung dar;
- 3A-3C zeigen eine teilweise geschnittene Ansicht einer Glasnanoporenmembran während unterschiedlicher Stadien der Bildung einer lösungsmittelenthaltenden planaren Lipid-Doppelschicht der vorliegenden Erfindung;
- 4A-4D stellen eine teilweise geschnittene Ansicht einer Glasnanoporenmembran während verschiedener Stadien der Bildung einer lösungsmittelfreien planaren Lipid-Doppelschicht nach der vorliegenden Erfindung dar;
- 5 ist eine schematische Abbildung eines ionenleitenden Messsystems der vorliegenden Erfindung, die die membranbildende Vorrichtung aus den 1A-1C beinhaltet;
- 6 ist ein Graph, der die Erfassung eines organischen Moleküls in einer Lösung darstellt, unter Verwenden eines rekombinanten alpha-Haemolysin-Ionenkanals, der in eine PLB eingesetzt ist, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung gebildet ist;
- 7 stellt ein Ionenleitmesssystem der vorliegenden Erfindung einschließlich einer Anordnung von vier Glasnanoporenmembranen dar; und
- 8 stellt elektrische Ablesungsergebnisse des Ionenleitfähigkeitsmesssystems aus 7 dar.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN
-
Allgemein betrifft die vorliegende Erfindung ein System und ein Verfahren zum Bilden von planaren Lipid-Doppelschichten; PLBs (Planar Lipid Bilayers) über Öffnungen in Nanometer- und Mikrometermaßstab, d. h. Nanoporen. Anfänglich mit Bezug auf die 1A-1C wird eine membranbildende Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Bildung von einseitigen Doppelschichten allgemein mit 20 bezeichnet. Die membranbildende Vorrichtung 20 weist eine erste Fluidzelle oder Kammer 24 auf, die eingerichtet ist um Fluid zurückzuhalten und eine zweite Fluidkammer 28, die eingerichtet ist um Fluid zurückzuhalten. Die erste Fluidkammer 24 weist eine Bodenwandung 30 und wenigstens eine Seitenwandung 32 auf, die wenigstens eine Öffnung 34 darin beinhaltet, durch die die zweite Fluidkammer 28 verbunden ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Fluidkammer eine 1,25 cm × 3 cm × 2 cm Teflon® Zelle mit einer Gesamtkapazität von ungefähr 7,5 cm3. Die zweite Fluidkammer 28 weist auch wenigstens eine Seitenwand 40 und eine Trennwand 42 zum Trennen der ersten Fluidkammer 24 von der zweiten Fluidkammer 28 auf. In dem gezeigten bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die zweite Fluidkammer 28 aus einer 1,6 mm O.D. Natronkalkglaskapillare gebildet mit einem inneren Durchmesser von 0,75 mm, die an einem Polykarbonatpipettenhalter 44, der von der DAGAN Corp. hergestellt ist, befestigt. Die Trennwand 42 ist mit einer Nanopore 46 ausgestattet, wie in den 3 und 4 gezeigt. Bevorzugt ist die Nanopore 46 zu ungefähr 0,5 cm von der Bodenwandung 30 der ersten Fluidkammer 24 angeordnet. Optional kann die Vorrichtung auch einen automatischen Fluidpegelregulator, bezeichnet mit 50, zum selektiven Ändern des Fluidpegels innerhalb der ersten Fluidkammer 24 aufweisen. Wenn, wie gezeigt, eine Glaskapillare verwendet wird, definieren die Trennwand 42 und die Nanopore 46 eine Glasnanoporenmembran (GNM). Es sollte beachtet werden, dass, wenn ein GNM System verwendet wird, der Zugriff auf nur eine Seite der Nanopore 46 beschränkt ist. Mit „beschränkt“ ist gemeint, dass der Zugriff auf eine Seite der Nanopore 46 durch die zweite Fluidkammer 28 im Wesentlichen zu Zwecken der Membranbildung über der Pore 46 unzugänglich ist.
-
Bei Verwendung wird eine erste Elektrolytlösung 54 in die erste Fluidkammer 24 bis auf einen ersten Fluidpegel, der bei 58 gezeigt ist, gegeben und die zweite Fluidkammer 28 wird mit einer zweiten Elektrolytlösung 55 gefüllt. Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht die Elektrolytlösung 54 und die Elektrolytlösung 55 aus einer Lösung von 1M KCl in Wasser, gepuffert mit 10mM Trispuffer und Salzsäure (HCL), um die Lösung auf einen pH von 7,4 zu bringen. Eine Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur wird dann tropfenweise auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 platziert und diese ermöglicht, sich über die Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubreiten, um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60, wie in 1B gezeigt, zu bilden. Der Pegel der Elektrolytlösung 54 in der ersten Fluidkammer 24 wird dann im Hinblick auf die Trennwand 42 eingestellt. In dem in den 1A-1C gezeigten Beispiel wird zusätzlich Elektrolytlösung 54 zur ersten Fluidkammer 24 gegeben, um den Fluidpegel der Elektrolytlösung 54 und die Lipid/Lösungsmittelschicht 60 vom ersten Fluidpegel 58 auf einen zweiten Fluidpegel 64, wie in 1C dargestellt, zu heben. Das Hinzufügen von Elektrolytlösung 54 in die erste Fluidkammer 24 kann manuell ausgeführt werden, etwa mit einer Spritze, oder mechanisch unter Verwendung des Fluidpegelregulators 50. Nach einem Ausführungsbeispiel weist der Fluidpegelregulator 50 eine Leitung in fluidischer Kommunikation mit der ersten Fluidkammer 24 auf und ist an eine Fluidquelle über eine Pumpe und eine Steuerung zum automatischen Hinzufügen und/oder Entfernen einer gewünschten Menge von Elektrolytlösung 54 zu/aus dem System angeschlossen. Die Steuerung kann programmiert sein, um ein oder zwei Flüssigkeitspegel innerhalb der ersten Fluidkammer 24 zu halten, wobei ein Pegel oberhalb der Nanopore 46 und ein Pegel unterhalb der Nanopore 46 ist.
-
In einem in den 2A und 2B dargestellten Ausführungsbeispiel weist ein Fluidpegelregulator 50' bevorzugt eine mechanische Vorrichtung zum Kippen der Fluidkammer 24 auf. In dieser Ausgestaltung wird der Pegel der Elektrolytlösung 54 relativ zur Trennwand 42 und Nanopore 46 durch Kippen der ersten Fluidkammer 24 in einem Winkel relativ zur Vertikalen vor dem Hinzufügen der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 geändert, die erste Fluidkammer 24 dann in eine horizontale Position gekippt, so dass der Pegel der Elektrolytlösung 24 und die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 von einem ersten Fluidpegel 58' unterhalb der Trennwand 42 auf einen zweiten Fluidpegel 64' oberhalb der Trennwand 42 gehoben wird, wenn die erste Fluidkammer 24 repositioniert wird. Optional kann die Vorrichtung 20 einen Deckel 66 zum selektiven Versiegeln der ersten Fluidkammer 24 und zum Verhindern von Spritzern aufweisen.
-
Mit dieser Anordnung werden PLBs über der Trennwand 42 durch Ändern des Pegels der Elektrolytlösung 54 und der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 gebildet, wie im Folgenden näher erläutert wird. Obwohl das Membranbildungsverfahren der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf ein GNM System erläutert wird, versteht es sich, dass die Vorrichtung 20 mit jeder Öffnung im Nano- oder Mikrometermaßstab in einem hydrophoben film oder einer synthetischen Stützstruktur (z. B., Trennwand 42) verwendet werden kann, die eine geeignete Hydrophobie oder Hydrophilie zum Aufrechterhalten einer Lipid-Monoschicht oder Doppelschicht besitzt, wie etwa Silizium, Glas, Quarz, Siliziumnitrid und Öffnungen im hydrophoben Kunststoff (z. B., Teflon®, Polyethylen, Delrin™, Styropor, Polysulfon, usw.). Ohne Rücksicht auf das Substrat wird jede Nanopore 46, die in der Trennwand 42 gebildet ist, einen Durchmesser zwischen 10 nm und 500 µm und besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 2 µm haben. Das vorliegende Verfahren stellt bereit entweder: 1) die Bildung gestützter PLBs, in denen Monolayer von Lipiden auf einer hydrophoben Stützoberfläche abgelegt sind, die zusammenschwirren, um eine Doppelschicht zu bilden, die nur die Öffnung überspannt; oder 2) gestützte PLBs, in denen eine Doppelschicht auf der Oberseite einer hydrophoben Stützstruktur und der Öffnung liegt. Die Bildung beider Doppelschichtstrukturen hängt allein von den Oberflächeneigenschaften der Stützstruktur ab und ist nicht durch das Doppelschichtbildungsverfahren der vorliegenden Erfindung eingeschränkt.
-
Die Bildung einer lösungsmittelenthaltenden planaren Lipid-Doppelschicht 76 wird nun mit Bezug auf die 3A-3C erläutert. Wiederum wird Elektrolytlösung 54 in die erste Fluidkammer 24 zum Etablieren eines ersten Fluidpegels 58, wie in 3A abgebildet, eingeführt. Eine Lipid-/organische Lösungsmittellösung, z. B., ungefähr 0,1 bis 1 µL wird dann auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 eingeführt und dieser ermöglicht, sich über die Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubreiten, um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 zu bilden. Bevorzugt besteht die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 aus 2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Lipid in einem Lösungsmittel mit geringer Flüchtigkeit, wie etwa Dekan, Hexan, Hexadekan, Squalen, andere Alkane und Mixturen davon. Besonders bevorzugt besteht die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 aus DPhPC Lipid in 100% Dekan oder DPhPC Lipid in einer Mischung aus 99 % Dekan und 1 % Hexadekan. Zusätzliche Elektrolytlösung wird dann zur ersten Fluidkammer 24 hinzugefügt, um den Pegel der Elektrolytlösung 54 und die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb der Nanopore 46 auf den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der Nanopore 46 zu heben. Während die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 sich entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt eine kleine Menge des Lipids (durch 70 angezeigt) die Nanopore 46 in der Trennwand 42 und zusätzliche Lipide versammeln sich spontan in einer Monolayer 72 auf einer äußeren Oberfläche 74 der Trennwand 42 und hinterlassen eine kleine Menge des Lösungsmittels 75 zwischen den Lipidschichten 75 und 72, um eine organische Lösungsmittel enthaltende PLB 76 zu bilden, die über der Nanopore 46 hängt. Bevorzugt erstreckt sich die äußere Oberfläche 76 in einer Ebene, die von ungefähr vertikal bis 60° von vertikal reicht. Nach einem alternativen Verfahren wird das Elektrolyt 54 über die Trennwand 42 gehoben vor dem Bilden der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60, die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 wird bis unterhalb der Trennwand 42 abgesenkt und der Elektrolytpegel wird wieder angehoben, um die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 über die Trennwand 42 zum spontanen Bilden von PLB 76 getragen. Die Vorrichtung 20 ermöglicht, dass eine oder mehrere PLBs 76 einheitlich reproduziert werden durch einfaches Absenken der Elektrolytlösung 54 unterhalb der äußeren Oberfläche 74 der Trennwand 42 und dann Anheben der Elektrolytlösung 54 über die äußere Oberfläche 74 der Trennwand 42.
-
Wie oben erläutert, kann die PLB Bildung auch durch Kippen der ersten Fluidkammer 24 erreicht werden, so dass die Elektrolytlösung 54 und die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 von einem ersten Fluidpegel 58' unterhalb der Nanopore 46 auf einen zweiten Fluidpegel 64' oberhalb der Nanopore 46 bewegt werden. Die PLB 76 kann wiederholt gebrochen und wiedergebildet werden durch Kippen der ersten Fluidkammer 24, um den Pegel der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 unterhalb der Ebene der Trennwand 42 zu bringen und Zurückkippen der ersten Fluidkammer 24 in eine Position, in der der Pegel der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 oberhalb der Trennwand 42 ist. Unabhängig des zur Fluidpegelanpassung verwendeten Verfahrens kann die Trennwand 42 mit einer Beschichtung 78 vor der Fluidpegelanpassung ausgestattet sein, wie in den 4A-4C dargestellt, um die Membranbildung und Retention zu unterstützen. Die Beschichtung 78 kann in der Form einer hydrophoben Beschichtung und/oder eines Lösungsmittels mit geringem Dampfdruck wie etwa Squalen oder Hexadekan, sein.
-
An diesem Punkt sollte erwähnt sein, dass die Bildung von lösungsmittelenthaltenden Lipid-Doppelschichten 76 auch durch Verwenden von Lipidvesikeln erreicht werden kann. Bei dieser Anordnung wird wiederum Elektrolytlösung 54 in die erste Fluidkammer 24 eingefüllt, um einen ersten Fluidpegel 58 auszubilden. Lipidvesikel (nicht gezeigt) werden dann zur Elektrolytlösung 54 hinzugegeben und diesen ermöglicht, spontan ein Lipid Monolayer auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubilden. Alternativ können die Lipidvesikel bereits in der Elektrolytlösung 54 enthalten sein, bevor die Lösung zur ersten Fluidkammer 24 gegeben wird. Bevorzugt bestehen die Lipidvesikeln aus 2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Lipidvesikeln. Ein Lösungsmittel mit geringer Flüchtigkeit wird dann auf die Oberfläche der Elektrolytlösung gegeben, um eine Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht entsprechend der Schicht 60 zu bilden. Besonders bevorzugt werden dann ein geringflüchtiges Lösungsmittel und ein hochflüchtiges Lösungsmittel zur Oberfläche der Elektrolytlösung hinzugegeben, um die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht zu bilden. Zusätzliche Elektrolytlösung wird dann zuerst in Fluidkammer hinzugegeben, um den Pegel der Elektrolytlösung 54 und die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb der Nanopore 46 auf den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der Nanopore 46 zu heben. Während die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht sich entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt ein kleiner Anteil des Lipids, wie etwa bei 70 angezeigt, die Nanopore 46 in der Trennwand 46 und weitere Lipide sammeln sich spontan zu einer Monolayer 72 an einer äußeren Oberfläche der Trennwand 42 und hinterlassen eine kleine Menge des Lösungsmittels 75 zwischen den Lipidschichten 70 und 72, um eine organische lösungsmittelenthaltende PLB 76 zu bilden, die über der Nanopore 46 hängt. Bevorzugt erstreckt sich die äußere Oberfläche 74 in einer Ebene, die von ungefähr vertikal bis 60° von vertikal reicht. Nach einem alternativen Verfahren wird das Elektrolyt 54 auf oberhalb der Trennwand 42 vor dem Bilden der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht gehoben, die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht wird unterhalb der Trennwand 42 abgesenkt und der Elektrolytpegel wird wieder angehoben, um die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht über die Trennwand 42 zum spontanen Bilden von PLB 76 zu tragen. Die Vorrichtung 20 erlaubt, das ein oder mehrere PLBs 76 einheitlich durch einfaches Absenken der Elektrolytlösung 54 unterhalb der äußeren Oberfläche 74 der Trennwand 42 und dann Anheben der Elektrolytlösung 54 auf oberhalb der äußeren Oberfläche 74 der Trennwand 42 reproduziert werden.
-
Die Bildung einer lösungsmittelfreien PLB 76' wird nun mit Bezug auf die 4A-4D erläutert. Zunächst wird die Elektrolytlösung 54 in die erste Fluidkammer 24 eingeführt, um einen ersten Fluidpegel 58 auszubilden. Eine Lösung eines Lipids in einem organischen Lösungsmittel mit einem hohen Dampfdruck wird dann auf die Oberfläche der Elektrolytlösung 54 gegeben und diesem ermöglicht, sich über die Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubreiten, um eine Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60', wie in 4B dargestellt, zu bilden. Bevorzugt besteht die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60' aus Lipid in Pentan. Das Lipid bildet eine Monoschicht an der Schnittstelle zwischen dem organischen Lösungsmittel und dem Elektrolyt 54. Der Lösungsmittelschicht 60' wird es dann ermöglicht, sich für eine Zeitspanne, die ausreicht, um das Verdunsten des organischen Lösungsmittels mit hohem Dampfdruck (z. B. Pentan) zu ermöglichen, abzusetzen, wodurch eine Lipid-Monoschicht 80, wie in 4C dargestellt, verbleibt. Die Elektrolytlösung 54 wird dann zur ersten Fluidkammer 24 gegeben, um den Pegel der Elektrolytlösung 54 und der Lipid Monoschicht 58 vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb der Nanopore 46 auf den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der Nanopore 46 anzuheben. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist eine Beschichtung 78 auf die Trennwand 42 vor dem Ändern des Fluidpegels innerhalb der ersten Fluidkammer 24 aufgebracht. Während die Lipid-Monolayer 80 sich entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt eine kleine Menge Lipid, die mit 70' bezeichnet ist, die Nanopore 46 in der Trennwand 42 und zusätzliche Lipide sammeln sich spontan in einer Monoschicht 72' auf der Beschichtung 78 der Trennwand 42, um eine lösungsmittelfreie PLB 76' zu bilden, die über der Nanopore 46 hängt. Alternativ kann der PLB Bildungsvorgang durch Verwenden der Kippmethode der oben erläuterten Fluidpegelsteuerung abgeschlossen werden.
-
In ähnlicher Weise zu der oben beschriebenen im Hinblick auf das Potential zum Bilden einer planaren Lipidschicht 70 unter Verwendung von Lipidvesikeln, kann die lösungsmittelfreie PLB ebenso unter Verwenden von Lipidvesikeln gebildet werden. In dieser Situation würde die Elektrolytlösung 54 zunächst in die erste Fluidkammer 24 zum Ausbilden eines ersten Fluidpegels 58 eingebracht werden. Lipidvesikel (nicht gezeigt) werden dann zur Elektrolytlösung 54 gegeben und diesen ermöglicht, spontan eine Lipid-Monolayer auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubilden. Alternativ können die Lipidvesikel bereits in der Elektrolytlösung 54 enthalten sein, bevor die Lösung zur ersten Fluidkammer 24 gegeben wird. Bevorzugt bestehen die Lipidvesikel aus 2-Diphytanoyl-sn-Gycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Lipidvesikeln. Die Elektrolytlösung 54 wird dann zur ersten Fluidkammer 24 gegeben, um den Pegel der Elektrolytlösung 54 und den Lipid Monolayer vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb der Nanopore 46 auf den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der Nanopore 46 zu heben. Wie zuvor ist eine Beschichtung 78 an der Trennwand 42 vor dem Ändern des Fluidpegels innerhalb der Fluidkammer 24 aufgebracht. Während sich die Lipid Monoschicht entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt eine kleine Menge des Lipids, wie bei 70' angezeigt, durch die Nanopore 46 in der Trennwand 42 und zusätzliche Lipide sammeln sich spontan in einem Monolayer 72' auf der Beschichtung 78 der Trennwand 42 zum Bilden einer lösungsfreien PLB 76', die über die Nanopore 46 hängt. Alternativ kann der PLB Bildungsvorgang auch durch Verwenden der Kippmethode der oben erläuterten Fluidpegelsteuerung abgeschlossen werden.
-
Durch einseitige Doppelschichtbildung hergestellte PLBs sind zur Ionenkanal/ Proteinporenrekonstitution und/oder Liposomenfusion geeignet. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung 20 in einem Ionenkanalmesssystem, das mit 100 in 5 bezeichnet ist, verwendet. Insbesondere können, wenn die PLB 76, 76' erst einmal an Ort und Stelle sind, Ionenkanäle oder Proteinproben (nicht gezeigt) in die PLB 76, 76' in einer im Stand der Technik bekannten Weise eingesetzt werden und das System 100 kann zum Analysieren der Ionenkanalsensitivität verwendet werden. Typischerweise wird ein positiver Druck von 20 bis 300 mm Hg an den zweiten Fluidkanal 28 mittels einer Drucksteuerung 102, die mit einem Halter 44 nach PLB Bildung verbunden ist, angelegt, um Insertionen von Ionenkanälen in die über der Nanopore 46 abgehängten PLB zu induzieren, während bevorzugt ein negativer oder positiver Gegendruck angelegt wird, um die Ionenkanalaktivität zu stoppen. Eine erste Elektrode 104 wird in die zweite Fluidkammer 28 derart eingesetzt, dass diese in die Elektrolytlösung 55 getaucht ist und eine zweite Elektrode 105 wird in die Elektrolytlösung 54 der ersten Fluidkammer 24 eingetaucht. Die erste und die zweite Elektrode 104 und 105 sind mittels elektrischer Leitungen 106 und 107 jeweils mit einer Steuerung 110 verbunden, die eingerichtet ist, um eine konstante oder eine sich über die Zeit verändernde Vorspannung über die erste und die zweite Elektrode 104 und 105 anzulegen und den elektrischen Strom zwischen der ersten und der zweiten Elektrode 104 und 105 zu messen. Die erste und die zweite Elektrode 104 und 105 sind bevorzugt Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl) Elektroden, die durch Freilegen von Silberdrähten zu einer Bleichlösung erzeugt sind, obwohl auch andere Arten von Elektroden verwendet werden können einschließlich derjenigen, die aus Silber, Silberchlorid, Platin, Kohlenstoff, Gold oder jeder anderen Verbindung, die im Stand der Technik bekannt ist, zusammengesetzt sein kann.
-
Bei einer alternativen Ausgestaltung kann der Fluidpegelregulator 52 mit der Steuerung 110 mittels einer Rückkopplungssteuerung, wie durch die gepunktete Linie, die den Fluidpegelregulator 52 mit der Steuereinheit 10 verbindet, verbunden sein. Dieses ermöglicht der Lösungshöhe innerhalb der Zelle 24 automatisch eingestellt zu werden basierend auf der zwischen den Elektroden 104 und 105 über die Nanopore 46 in der Trennwand 42 gemessenen Leitfähigkeit.
-
In einer Rückkopplungsausgestaltung liegt die Höhe 55 der Lösung anfänglich unterhalb der Trennwand 42 und der Nanopore 46. Lipid/organisches Lösungsmittel 60 wird geeignet abgelegt. Die Leitfähigkeit zwischen den beiden Elektroden ist unmessbar gering, weil keine elektrische Verbindung zwischen den beiden Elektroden 104 und 105 besteht (offener Schaltkreis). In diesem Fall wird der Fluidpegelregulator 52 beginnen, die Lösungshöhe der Elektrolytlösung automatisch anzuheben. Während die Lösungshöhe die Trennwand 42 überstreicht, über die Nanopore 46, eine PLB ablegend, wird die Leitfähigkeit zwischen den zwei Elektroden 104 und 105 messbar werden, zwischen 1,1 pS und 2 fS, dieser Wert ist abhängig von der Stärke der Elektrolytlösung, der Größe der Nanopore, des verwendeten Lipids und des verwendeten organischen Lösungsmittels. Wird eine messbare Leitfähigkeit gemessen, wird die Steuerung fortfahren, die Elektrolytlösungshöhe für eine vorbestimmte Volumenmenge anzuheben, so dass die Elektrolytoberfläche oberhalb der Trennwand und der Nanopore liegt.
-
In einer zweiten Rückkopplungsausgestaltung liegt die Lösungshöhe 55 oberhalb der Trennwand 42 und der Nanopore 46. Lipid/organisches Lösungsmittel wird geeignet abgelegt 60. Die Leitfähigkeit zwischen den zwei Elektroden 104 und 105 ist messbar zwischen 20 pS und 0,1 mS, abhängig von der Stärke der Elektrolytlösung und der Größe der Nanopore. Basierend auf den gemessenen Leitfähigkeitswert, wird der Fluidpegelregulator 52 mittels des Feedbacks, beginnen, die Höhe der Elektrolytlösungshöhe zu verringern. Ist die Elektrolytlösung unterhalb der Trennwand und der Nanopore gefallen, wie durch einen Abfall in der Leitfähigkeit (< 2 fS) zwischen den zwei Elektroden gemessen, wird die Lösung wieder an der Trennwand vorbei angehoben, die PLB über der Nanopore abgelegt, wie durch ein Leitfähigkeitswert zwischen 0,1 pS und 2 fS gemessen. Die beiden Ausgestaltungen der Rückkopplung, die vorstehend beschrieben worden sind, können also wiederholt zusammen verwendet werden, um automatisch über der Nanopore Doppelschichten neu zu bilden, sollten diese brechen.
-
6 stellt die Veränderung im gemessenen Strom aufgrund des Einsetzens eines rekombinanten αHL Ionenkanals in eine PLB dar, die durch einseitige Doppelschichtbildung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gebildet worden ist. Der rekombinante αHL Kanal unterscheidet sich vom Wildtyp αHL (WT-aHL) Kanal dadurch, dass der Methioninrest an Position 113 jedes Monomers durch Lysin ersetzt ist. Nach der spontanen Insertion des rekombinanten Ionenkanals, behält der Ionenkanal seine ihm innewohnende Aktivität, wie durch die Detektion des organischen Moleküls Diethylen-triamin-penta(Methylenphosphorsäure)-heptanatriumsalz (DTPMPA) dargestellt.
-
Die PLB Bildungseinrichtung 20 kann auch verwendet werden, um mehrere PLB über eine Anordnung von Nanoporen zu bilden. Beispielsweise wird, wie in 7 abgebildet, eine membranbildende Vorrichtung 20' zum Bilden einer Anordnung von Membranen in einem Ionenkanalmesssystem 100' verwendet. Die Vorrichtung 20' ist gezeigt mit vier GNMs 120-123, die durch eine Seitenwandung 32' in eine ersten Fluidkammer 24' eingesetzt sind. Jede GNM 120-123 ist innerhalb eines separaten Halters 44' eingesetzt, der das Anlegen eines Gegendrucks an das Innere jeder GNM 120-123 ermöglicht. Jede GNM 120-123 wird mit einer Elektrolytlösung gefüllt und separate Elektroden (nicht gezeigt) werden in jede GNM 120-123 derart eingesetzt, dass jede Elektrode in die Elektrolytlösung innerhalb der jeweiligen GNM 120-123 eingetaucht ist. Elektrolytlösung 54 wird zur ersten Fluidkammer 24' bis zu einem ersten Fluidpegel unterhalb aller GNMs, wie bei 125 angezeigt, hinzugefügt. Eine einzelne Elektrode (nicht gezeigt) wird dann in die Elektrolytlösung 54 der ersten Fluidkammer 24' eingesetzt. Die Elektroden innerhalb der GNMs 120-123 und die Referenzelektrode in der ersten Fluidkammer 24' sind an eine Steuerung angeschlossen, wie der in 5 dargestellten Steuerung 110, die zum Anlegen einer separaten und eindeutigen Vorspannung zwischen jeder der Elektroden innerhalb der GNM 120-123 und der Referenzelektrode in der ersten Fluidkammer 24' eingerichtet ist. Die Steuerung ist ebenso zum Messen des Stroms zwischen jeder der Elektroden innerhalb der GNM 120-123 und der Referenzelektrode der ersten Fluidkammer 24' fähig. PLBs werden dann über die Oberfläche der GNM 120-123 unter Verwendung des Membranbildungsverfahrens, das oben beschrieben ist, gebildet. Insbesondere wird eine Lipid-/organischen Lösungsmittelmixtur auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 abgelegt und der Pegel der Elektrolytlösung wird entlang der Anordnung von GNMs 120-123 gehoben, wodurch sich spontan PBL über jeder einzelnen GNM 120-123 ausbilden. Ionenkanäle werden dann in die die Nanopore 46 jeder GNM überspannende Doppelschicht eingesetzt mittels Vesikelfusion oder spontane Insertionauslösung in einer aus dem Stand der Technik bekannten Weise. Mit dieser Einrichtung ist das Messsystem 100' fähig, die Leitfähigkeit von in die PLB mehrerer GNMs eingesetzter Ionenkanäle separat aufzuzeichnen.
-
Ein Beispiel von Ionenkanalaufzeichnungen unter Verwendung des Messsystems 100' der vorliegenden Erfindung sind in 8 abgebildet. In diesem Beispiel wurde die erste Fluidkammer 24 aus Teflon hergestellt und hat Reservoirabmessungen von 35 mm Tiefe, 35 mm Breite und 25 mm Länge. GNMs 120-123 wurden an einer breiten Fläche 32' der ersten Fluidkammer 24' angeordnet, wie in 7 angezeigt. Mit der Elektrolytlösung 54 unterhalb des Pegels der GNMs 102-123 wurde eine kleine Menge (0,5 bis 1 µl) von 5 mg/ml DPhPC Lipid in Dekan auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54, die ein M KCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer (PPB) (pH 7,2) aufweist, abgegeben. Die Elektrolytlösungsoberfläche wurde dann vorbei an jeder GNM 120-123 angehoben, wodurch simultan unterstützte Lipid-Doppelschichten auf jeder GNM 120-123 abgelegt wurden. Enthielten alle vier GNM 120-123 Doppelschichten, wurde WT- αHL Monomer zur Testzelle auf eine Endkonzentration von etwa 400 nM hinzugegeben. Dem Hinzugeben von WT- αHL folgend, wurde der Gegendruck jeder GNM 120-123 nahe des jeweiligen Brechdrucks (vor dem Hinzufügen von WT- αHL bestimmt) erhöht. War WT- αHL in die PLB 76 über der Nanopore 46 einer bestimmten GNM 120-123 insertiert, wurde der Gegendruck dieser GNM 120-123 auf nahe dem Auszugsdruck verringert. Kam WT- αHL aus der Doppelschicht heraus, wurde der Druck wieder nahe des jeweiligen Brechdrucks erhöht. Dieser Vorgang wurde fortgesetzt, bis alle vier Doppelschichten, die die Nanoporen in den GNM 120-123 überspannten, einen bis einige wenige αHL Kanäle enthielten. Jede GNM 120-123 wurde mit der Elektrolytlösung (1 M KCl, 10 mM PPB, pH 7,2) oder der Elektrolytlösung und einer oder mehrerer zusätzlicher Untersuchungssubstanzen befüllt. Insbesondere enthielt GNM 120-123 50 µM Beta-Cyclodextrin, sulfatiertes Natriumsalz (s7γCD) (CAS#3791-69-8); GNM 121 enthielt 50 µM Gamma-Cyclodextrin (γCD) (CAS#17465-86-0); GNM 122 enthielt 50 µM s7γCD und 50 µM γCD; und GNM 123 enthielt nur die Elektrolytlösung. Eine Vorspannung von 40 mV wurde zwischen den internen Elektroden jedes GNM 120-1123 und der Referenzelektrode in der ersten Fluidkammer 23' angelegt. Die separaten Aufzeichnungen der elektrischen Ströme durch die Ionenkanäle, in denen PLBs jeder der vier GNMs 1120-123 sind diejenigen, die in 8 gezeigt sind.
-
Es versteht sich, dass die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung zuverlässige Mittel zum Bilden von Lipid-Doppelschichten über einer Öffnung bereitstellt, wenn nur eine Seite der Öffnung zugänglich ist. Vorteilhaft vermeiden die vorliegende Vorrichtung und das Verfahren die signifikante Lernkurve, die mit dem Verwenden von Spitzentauchen und Membranlackierungstechniken assoziiert sind. Obwohl mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben, versteht es sich selbstverständlich, dass verschiedene Änderungen und/oder Modifikationen an der Erfindung vorgenommen werden können, ohne sich von deren Wesen zu lösen. Als besondere Anmerkung sollte es verständlich sein, dass die offenbarten Beschichtungen, die zum Bilden der verschiedenen Schichten benutzt sind, zur Doppelschichtbildung mit einem Lösungsmittel wie auch lösungsmittelfrei verwendet werden können. Beispielsweise kann die Beschichtung bereits auf dem Nanoporenmembran bestehen und darauf ein Lösungsmittel geringer Flüchtigkeit, wie etwa Hexadekan hinzugefügt werden. Daher muss es erkannt werden, dass die offenbarte Beschichtung tatsächlich wenigstens eine Beschichtung umfasst, die selbst aus mehreren Ebenen oder Unterschichten gebildet sein kann. Allgemein ist beabsichtigt, dass die Erfindung ausschließlich durch den Umfang der folgenden Ansprüche beschränkt ist.
