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TECHNISCHER
BEREICH
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Die
vorliegende Erfindung schafft ein Substrat und ein Verfahren zur
Ermittlung und/oder Überwachung
von elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen in Strukturen,
die Ionenkanäle
enthalten, typischerweise in Lipid-Membranen enthaltenden Strukturen
wie z.B. Zellen, durch die Ausbildung einer elektrophysiologischen
Messkonfiguration, bei der eine Zellmembran eine Dichtung mit hohem
elektrischen Widerstand um eine Messelektrode herum ausbildet, wodurch
es möglich
wird, einen elektrischen Stromfluss durch die Zellmembran hindurch
zu ermitteln und zu überwachen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Substrat und ein Verfahren zum
Analysieren der elektrophysiologischen Eigenschaften einer Zellmembran,
die eine Glycocalyx aufweist. Das Substrat ist typischerweise Teil
einer Vorrichtung zum Untersuchen von elektrischen Ereignissen in
Zellmembranen, wie z.B. einer Vorrichtung zum Durchführen von
Patch-Clamp-Verfahren, die verwendet werden, um Ionen-Transferkanäle in biologischen
Membranen zu untersuchen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Einführung
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Die
allgemeine Idee einen Patch (Flecken) einer Membran elektrisch zu
isolieren und die Ionenkanäle
in diesem Patch unter Spannungs-Clamp-Bedingungen zu untersuchen,
wurde von Neher, Sakmann und Steinback in dem Artikel „The Extracellular Patch
Clamp, A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels
In Biological Membranes",
Pflüger
Arch. 375; 219-278, (1978) umrissen. Sie fanden, dass sie dadurch,
dass sie eine Pipette, die Acetylcholin (ACh) enthielt, gegen die
Oberfläche einer
Muskelzellen-Membran pressten, diskrete Sprünge im elektrischen Strom feststellen
konnten, die dem Öffnen
und Schließen
von durch ACh aktivierten Ionenkanälen zugeordnet werden konnten. Sie
waren bei ihrer Arbeit jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass
der Widerstand der Dichtung zwischen dem Glas der Pipette und der
Membran (10 MΩ bis
50 MΩ)
sehr klein im Vergleich zum Widerstand des Kanals (10 GΩ) war. Das
elektrische Rauschen, das sich aus einer solchen Dichtung ergibt,
ist umgekehrt proportional zum Widerstand und war somit ausreichend
groß,
um die Ströme
zu verdecken, die durch Ionenkanäle
fließen,
deren Leitfähigkeit kleiner
ist als die des ACh-Kanals. Es verhinderte auch aufgrund der sich
ergebenden großen
Ströme durch
die Dichtung, das Clampen der Spannung in der Pipette auf Werte,
die von dem des Bades unterschiedlich waren.
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Es
wurde dann erkannt, dass durch Feuerpolieren von Glaspipetten und
durch Anlegen einer Saugwirkung an das Innere der Pipette eine Dichtung mit
sehr hohem Widerstand (1 GΩ bis
100 GΩ)
mit der Oberfläche
der Zelle erzielt werden konnte, die das Rauschen um eine Größenordnung
auf Pegel verminderte, bei denen die meisten Kanäle von biologischem Interesse
untersucht werden können,
und die den Spannungsbereich in starkem Maße erweiterte, über den
hinweg diese Untersuchungen durchgeführt werden konnten. Diese verbesserte
Dichtung wird als „Giga-Dichtung" bezeichnet, und
die Pipette wird als „Patchpipette" bezeichnet. Eine
detailliertere Beschreibung der Giga-Dichtung findet sich im Artikel
von O.P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann & F.J. Sigworth (1981) mit dem Titel „Improved patch-clamp
techniques for high resolution current recordings from cells and
cell-free membrane patches",
Pflügers
Arch. 391, 85-100, (1981). Für
ihre Arbeit bei der Entwicklung des Patch-Clamp-Verfahrens erhielten
Neher und Sakmann 1991 den Nobelpreis für Physiologie und Medizin.
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Ionenkanäle sind
transmembrane Proteine, die den Transport von anorganischen Ionen über die Zellmembranen
hinweg katalysieren. Die Ionenkanäle nehmen an den verschiedensten
Vorgängen
teil, wie z.B. der Erzeugung und zeitlichen Steuerung von Aktionspotentialen,
der synaptischen Übertragung, der
Sekretion von Hormonen, der Kontraktion von Muskeln usw. Viele Medikamente üben ihre
speziellen Wirkungen durch die Modulation von Ionenkanälen aus.
Beispiele sind antiepileptische Verbindungen, wie z.B. Phenytoin
und Lamotrigin, welche spannungsabhängige Na+-Kanäle im Gehirn
blockieren, Medikamente gegen Bluthochdruck, wie Nifedipin und Diltiazem,
welche spannungsabhängige Ca2+-Kanäle
in glatten Muskelzellen blockieren, und Stimulatoren für die Freisetzung
von Insulin, wie z.B. Glibenclamid und Tolbutamid, die einen ATP-gesteuerten
K+-Kanal
in der Bauchspeicheldrüse
blockieren. Zusätzlich
zur chemisch induzierten Modulation der Ionenkanal-Aktivität hat das
Patch-Clamp-Verfahren Wissenschaftler in die Lage versetzt, Manipulationen
mit spannungsabhängigen
Kanälen
durchzuführen.
Diese Verfahren umfassen das Einstellen der Polarität der Elektrode
in der Patchpipette und die Änderung
der Salzlösungs-Zusammensetzung,
um die freien Ionenpegel in der Badlösung zu moderieren.
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Das Patch-Clamp-Verfahren
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Das
Patch-Clamp-Verfahren stellt eine wesentliche Entwicklung in der
Biologie und Medizin dar, da es die Messung des Ionenstroms durch
einzelne Ionenkanal-Proteine und auch die Untersuchung der Aktivität eines
einzelnen Ionenkanals in Reaktion auf eine Medikamentenexposition
ermöglicht.
Kurz gesagt, wird bei einem standardmäßigen Patch-Clamp-Verfahren
eine dünne
Glaspipette (mit einem Durchmesser von ungefähr 0,5 μm bis 2 μm) verwendet. Die Spitze dieser
Patchpipette wird gegen die Oberfläche der Zellmembran gedrückt. Die Pipettenspitze
dichtet eng an der Zelle ab und isoliert einige kleine Gruppe von
Ionenkanal-Proteinen in dem winzigen Fleck der Membran, der durch
die Pipettenöffnung
begrenzt wird. Die Aktivität
dieser Kanäle
kann individuell gemessen werden (Einzelkanal-Aufzeichnung); alternativ
kann der Fleck (patch) aufgerissen werden, wodurch Messungen der
Kanalaktivität
der gesamten Zellmembran ermöglicht
werden (Gesamtzellen-Konfiguration). Es kann ein Zugang mit hoher
Leitfähigkeit
zum Inneren der Zelle zur Durchführung
von Gesamtzellen-Messungen beispielsweise dadurch erzielt werden,
dass die Membran dadurch zerrissen wird, dass in der Pipette ein negativer
(unter dem Atmosphärendruck
liegender) Druck angelegt wird
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Die Giga-Dichtung
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Wie
oben erläutert,
ist ein wesentliches Erfordernis für die Patch-Clamp-Messungen
von Einzelkanal-Strömen
die Ausbildung einer Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand
zwischen der Zellmembran und der Glas-Mikropipetten-Spitze, um Ionen
daran zu hindern, sich in dem Raum zwischen den beiden Oberflächen zu
bewegen. Typischerweise sind Widerstandswerte von mehr als 1 GΩ erforderlich,
daher wird die physikalische Berührungszone
auch als „Giga-Dichtung" bezeichnet.
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Die
Ausbildung einer Giga-Dichtung erfordert, dass die Zellmembran und
das Pipettenglas in enge Berührung
miteinander gebracht werden. Während
der Abstand zwischen benachbarten Zellen in Geweben oder zwischen
Zellen in einer Zellkultur und ihren Substraten im allgemeinen in
der Größenordnung
von 20 nm bis 40 nm liegt (Neher 2001) wird vorhergesagt, das der
Abstand zwischen der Zellmembran und dem Pipettenglas in der Giga-Dichtung im
Angström-Bereich
(d.h. 10–10m)
liegt. Die physikalisch-chemische Beschaffenheit der Giga-Dichtung ist
nicht bekannt. Es können
jedoch Giga-Dichtungen zwischen Zellmembranen und einer Vielzahl
von Glaspipetten hergestellt werden, zu denen Pipetten aus Quarz,
Aluminiumsilikat und Borsilikat gehören (Rae & Levis, 1992), was anzeigt, dass
die spezielle chemische Zusammensetzung des Glases nicht entscheidend
ist.
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Zellmembran-Struktur
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Zellmembranen
bestehen aus einer Phospholipid-Doppelschicht mit eingefügten Glycoproteinen,
wobei letztere für
eine Vielzahl von Funktionen dienen, einschließlich der Wirkung als Rezeptoren für verschiedene
Wirkstoffe. Diese Membran überspannenden
Glycoproteine umfassen typischerweise Peptid- und Glyco-Bestandteile,
die sich von der Membran nach außen in den extrazellulären Raum erstrecken
und eine so genannte „Glycocalyx-Schicht" um die Phospholipid-Doppelschicht
herum bilden, die eine Höhe
von 20 nm bis 50 nm erreicht und in der Nachbarschaft der Phospholipid-Doppelschicht
ein mit Elektrolyt gefülltes
Kompartment erzeugt (siehe 1). Somit
bildet die Glycocalyx einen hydrophilen und negativ geladenen Bereich,
der einen Zwischenraum zwischen der Zelle und ihrer wässrigen
Umgebung bildet.
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Cytoskelett
und Glycocalyx
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Unmittelbar
unterhalb der Zellmembrane befinden sich das Cytoskelett, ein Netz
von Actin-Filamenten, Spectrin, Anchyrin und eine Vielzahl von anderen
Molekülen
mit großer
Struktur. Eine wichtige Rolle des Cytoskeletts ist es, gewisse integrale
Membranproteine und Glycoproteine an festen Positionen in der Membran
zu verankern. Es wird jedoch angenommen, dass die eingefügten Membran-Glycoproteine
innerhalb gewisser Grenzen (Lipid-Mikrodomänen oder „rafts"; für
eine Übersicht
siehe Simons and Toomer, 2000) frei sind, sich in der Phospholipid-Doppelschicht
seitlich zu bewegen. Tatsächlich wurde
eine solche Anordnung als „wie
Protein-Eisberge in einem Meer von Lipiden" beschrieben.
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Einfluss der
Glycocalyx auf die Ausbildung der Gigdichtung
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Bei
herkömmlichen
Patch-Clamp-Verfahren umfasst der anfängliche Berührungspunkt zwischen der Glaspipetten-Spitze
(die eine Wanddicke von ungefähr
100 nm besitzt) und der Zelle die Glycocalyx. Eine Abschätzung des
elektrischen Widerstandes, der von dem 150 mM Elektrolyten gebildet
wird, der in dem Zwischenraum enthalten ist, der zwischen der Glasoberfläche und
der Lipid-Membran durch die Höhe
der Glycocalyx (beispielsweise 20 nm bis 40 nm) definiert wird,
führt zu
ungefähr
20 MΩ bis
60 MΩ.
Diese Abschätzung
ist in Übereinstimmung
mit experimentellen Beobachtungen an Chips mit einer glatten, mit
Quarz beschichteten Oberfläche
des TEOS-Typs (Triethyloxysilan), die typischerweise Widerstandswerte
in der Größenordnung
von 40 MΩ (oder
nur 4 % eines GΩ liefern).
Bei dieser Abschätzung
wird angenommen, dass der Elektrolyt zwischen der Lipid-Membran
und einer Glasoberfläche mit
ungefähr
zylindrischer Form und einem Durchmesser von 1 μm und einer Länge von
ungefähr
3 μm bis
10 μm vorhanden
ist. Ein nachfolgend an die Pipette angelegter, sanfter Unterdruck
(< 20 hPa) erhöht den Widerstand
weiter und führt
im Idealfall zu einer Giga-Dichtung. Die Ausbildung der Giga-Dichtung kann schnell
in einem Zeitraum von 0,1 bis 10 Sekunden erfolgen, oder sie kann
ein sich hinziehender Vorgang sein, der erst nach mehreren, aufeinander
folgenden Schritten mit zunehmendem Ansaug-Unterdruck abgeschlossen
ist. Der zeitliche Verlauf der Ausbildung der Giga-Dichtung spiegelt den
Ausschluss von Glycoproteinen aus dem Bereich des physikalischen
Membran/Pipetten-Kontakts durch eine seitliche Verschiebung in der „Flüssigkristall"–Phospholipid-Doppelschicht
wieder. Mit anderen Worten, die Elemente der Glycocalyx, d.h. die
Glycoproteine werden aufgrund des negativen hydrostatischen Drucks,
der an die Pipette angelegt wird, und die Phospholipid-Doppelschicht
(die hydrophilen polaren Köpfe
der Phospholipide) gegen die Glasoberfläche drückt (hydrophile Silanol-Gruppen) aus
dem Kontaktbereich heraus gedrückt.
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Manchmal
schreitet der Vorgang des Anwachsens des Widerstandes nur bis zur
Ausbildung einer Quasi-Giga-Dichtung (0,5 GΩ bis 1 GΩ) fort. Empirisch kann das
Anlegen eines großen
(50 mV bis 70 mV; Penner, 1995) negativen elektrischen Potentials
an die Pipette zu diesem Zeitpunkt zu einem endgültigen Widerstands-Anwachsen
führen,
das mit der Ausbildung einer Giga-Dichtung endet. Unter dem Gesichtspunkt
der Glycocalyx kann diese Beobachtung dadurch erklärt werden,
dass negativ geladene Bereiche von Glycoproteinen angetrieben durch
das angelegte negative Pipettenpotential seitlich verschoben werden.
Die Stärke
des elektrischen Feldes (I), das auf die Glycoproteine einwirkt,
d.h. des elektrischen Feldes vom Lumen der Pipette zum umgebenden
Bad ist beträchtlich:
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Unter
der Annahme, dass die Pipettenspitze eine Wanddicke (x von 100 nm)
besitzt und ein Pipetten potential (V von –70 mV) angelegt wurde.
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Herkömmliche
Pipetten im Vergleich mit ebenen Substraten
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In
jüngster
Zeit erfolgten Entwicklungen des Patch-Clamp-Verfahrens umfassten
die Einführungen
von ebenen Substraten (d.h. eines Silikon-Chips anstelle der herkömmlichen
Glas-Mikropipetten) (siehe beispielsweise WO 01/25769 und Mayer,
2000).
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WO-00/71742
beschreibt ein System, das analysiert, wie das Aktionspotential
einer elektrisch aktiven Zelle durch Arzneimittel oder Gifte unterbrochen
wird. Es werden Algorithmen verwendet, um die Unterschiede in den
Aktionspotential-Scheitelformen zu analysieren, um den oder die
Pfade anzuzeigen, welche durch die Anwesenheit eines neuen Arzneimittels
oder einer neuen Verbindung beeinflusst werden; hiervon werden die
Gesichtspunkte ihrer Funktion in dieser Zelle abgeleitet. Das System
bildet eine Dichtung mit hoher Impedanz zwischen der Zelle und einer
Metall-Mikroelektrode, um die Zwischenfläche auszubilden, welche eine
funktionale Patch-Clamp-Elektrophysiolgie mit Glas-Mikropipetten
ermöglicht
und eine extrazelluläre
Elektrophysiologie an einer Mikroelektroden-Anordnung.
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WO-01/25769
beschreibt ein Substrat und ein Verfahren zur Erzielung einer elektrophysiologischen
Mess-Konfiguration, bei der eine Zelle eine Dichtung mit hohem elektrischen
Widerstand (Giga-Dichtung) um eine Messelektrode herum bildet, die
sie geeignet macht, einen Stromfluss durch die Zellmembran zu messen
und zu überwachen.
Das Substrat ist typischerweise Teil einer Vorrichtung zur Untersuchung
von elektrischen Ereignissen in Zellmembranen, wie z.B. einer Vorrichtung
zur Durchführung
von Patch-Clamp-Verfahren, die verwendet werden, um Ionen-Transferkanäle in biologischen Membranen
zu untersuchen. Das Substrat hat eine Vielzahl oder eine Anordnung
von Messplätzen
mit integrierten Mess- und Referenzelektroden, die durch ein Wafer-Bearbeitungsverfahren
ausgebildet worden sind. Die Elektroden sind geeignet, Strom zwischen
ihnen durch die Abgabe von Ionen durch eine Elektrode und die Aufnahme
von Ionen durch die andere Elektrode zu leiten, und es handelt sich dabei
typischerweise um Silber/Silberhalid-Elektroden. Dies ermöglicht eine
effiziente und schnelle Messung von Zellen in Konfigurationen, bei
denen eine direkte elektrische Verbindung zwischen der Messelektrode
und dem Inneren der Zelle besteht, d.h. eine Gesamtzellen-Mess-Konfiguration.
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Versuche
zur Ausbildung von Giga-Dichtungen zwischen ebenen auf Silizium
basierenden Chips und lebenden Zellen haben zu Problemen geführt (beispielsweise
siehe Mayer, 2000). Es wurden jedoch Erfolge dahingehend erzielt,
dass Giga-Dichtungen zwischen künstlichen
Phospholipid-Bläschen erhalten
wurden, die keine äußere Glycocalyx
aufweisen. Dieser Befund zeigt an, dass die Glycocalyx bei dem Vorgang
der Ausbildung einer Giga-Dichtung eine entscheidende Rolle spielt.
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Somit
besteht ein Bedarf für
verbesserte ebene Substrate, die für eine Verwendung bei Patch-Clamp-Untersuchungen
der Elektrophysiologie von Zellmembranen geeignet sind und welche
die Ausbildung einer Giga-Dichtung mit Zellmembranen ermöglichen,
die eine Glycocalyx aufweisen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung schafft ein Substrat und ein Verfahren die
für die
Messung und/oder Überwachung
von Stromflüssen
durch eine Ionenkanäle
enthaltende Struktur, insbesondere eine Zellmembran mit einer Glycocalyx
unter Bedingungen optimiert sind, die bezüglich der Einflüsse realistisch sind,
denen die Zellen oder Zellmembranen unterworfen sind. Somit kann
man Daten, die unter Verwendung des Substrats und des Verfahrens
gemäß der Erfindung
erhalten wurden, wie z.B. Veränderungen
in der Ionenkanal-Aktivität
als Ergebnis der Beeinflussung der Zellmembran beispielsweise mit
verschiedenen Testverbindungen, als echte Manifestationen des jeweiligen
Einflusses und nicht als Artefakte betrachten, die durch das Messsystem
verursacht werden, und man kann diese Daten als zuverlässige Basis
für die
Untersuchung von elektrophysiologischen Phänomenen verwenden, die in Verbindung mit
der Leitfähigkeit
oder Kapazität
von Zellmembranen unter gegebenen Bedingungen stehen.
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Es
sei darauf hingewiesen, dass dann, wenn in der vorliegenden Beschreibung
der Ausdruck „Zelle" oder „Zellmembran" verwendet wird,
es üblicherweise
in Abhängigkeit
von Zusammenhang möglich ist,
irgendeine andere Ionenkanäle
enthaltende Struktur, wie z.B. eine andere Ionenkanäle enthaltende
Lipid-Membran oder eine Ionenkanäle
aufweisende künstliche
Membran zu verwenden.
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Wie
oben erläutert,
ist ein wesentliches Erfordernis für Patch-Clamp-Messungen von
Einzelkanal-Strömen
die Ausbildung einer Giga-Dichtung mit hohem Widerstand zwischen
der Zellmembran und dem Substrat. Ein Schlüsselfaktor bei der Ausbildung einer
Giga-Dichtung ist
die Nähe
der Zellmembran zum Substrat, die ihrerseits von der Größe der Kontaktfläche zwischen
der Zellmembran und dem Substrat abhängt.
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Der
physikalische Kontaktbereich zwischen der Zellmembran und einem
ebenen Silizium-Chip (ungefähr 1 μm Breite
des Kontaktrandes; siehe 2, rechtes Diagramm) mit einer
glatten, gerundeten, trichterartigen Mündung ist wesentlich größer als der,
der zwischen einer Zellmembran und einer aus Glas bestehenden Mikropipette
ausgebildet wird (ungefähr
100 nm Weite, 2, linkes Diagramm). Dies hat
zur Folge, dass die Kraft pro Flächeneinheit
beim Chip im Vergleich zur Pipettenkonfiguration beträchtlich
vermindert wird und dass die Anzahl von zwischengefügten Glycoproteinen
im Kontaktbereich wesentlich größer ist,
wodurch in wirksamer Weise der erforderliche Angström-Abstand
zwischen der Phospholipid-Doppelschicht und der Substratoberfläche verhindert
wird, der für
die Ausbildung einer Giga-Dichtung unabdingbar ist.
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Die
vorliegende Erfindung versucht, dieses Problem dadurch zu lösen, dass
ein planares Substrat (beispielsweise ein auf Silizium basierender
Chip) vorgesehen wird, das für
Patch-Clamp-Untersuchungen von elektrophysiologischen Eigenschaften
von Zellmembranen geeignet und so aufgebaut ist, dass es eine verminderte
Kontaktfläche
mit der Zellmembran schafft, wodurch die Ausbildung einer Giga-Dichtung
gefördert
wird.
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Somit
schafft die Erfindung ein ebenes Substrat für die Verwendung bei der Patch-Clamp-Analyse der
elektrophysiologischen Eigenschaften einer Zellmembran, die eine
Glycocalyx besitzt, wobei das Substrat eine Öffnung aufweist, die einen
die Öffnung begrenzenden
Rand besitzt, wobei der Rand geeignet ist, bei Berührung mit
der Zellmembran eine Giga-Dichtung zu bilden, und ist dadurch gekennzeichnet,
dass der Rand aus dem gleichen Material gebildet ist, wie das Substrat
und in Längsrichtung
von der Ebene des Substrats über
wenigstens 20 nm vorsteht und eine Weite bzw. Breite im Bereich
von 10 nm bis 200 nm besitzt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Substrat ein auf Silizium basierender Chip.
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Im
vorliegenden Zusammenhang wird mit dem Ausdruck Giga-Dichtung normalerweise
eine Dichtung mit einem elektrischen Widerstand von wenigstens 1
GΩ bezeichnet
und dies ist die Größe einer
Dichtung, die normalerweise als Minimum angezielt wird, doch können bei
gewissen Arten von Messungen, bei denen die Ströme größer sind, kleinere Werte als
Schwellenwerte ausreichend sein.
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Unter „Glycocalyx" wird die Schicht
verstanden, die von den Peptid- und Glyco-Bestandteilen erzeugt
wird, die sich von den Glycoproteinen in der Lipid-Doppelschicht
der Zellmembran in den extrazellulären Raum hinein erstrecken.
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Vorzugsweise
erstreckt sich der Rand wenigstens 30 nm, wenigstens 40 nm, wenigstens
50 nm, wenigstens 60 nm, wenigstens 70 nm, wenigstens 80 nm, wenigstens
90 nm oder wenigstens 100 nm Ober die Ebene des Substrates hinaus.
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Vorteilhafterweise
ist der Rand so geformt, dass der Bereich des physikalischen Kontaktes
zwischen dem Substrat und der Zellmembran minimiert wird, wodurch
die Durchdringung der Glycocalyx und die Ausbildung einer Giga-Dichtung
begünstigt
werden.
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Der
Fachmann sieht, dass der Rand irgendein geeignetes Querschnittsprofil
besitzen kann. Beispielsweise können
die Wände
des Randes abgeschrägt
oder im Wesentlichen parallel sein. In entsprechender Weise kann
die oberste Spitze des Randes verschiedene Formen annehmen, beispielsweise
kann sie kuppelförmig,
flach oder spitz sein. Weiterhin kann der vorstehende Rand im Wesentlichen senkrecht,
schräg
oder parallel zur Ebene des Substrates verlaufen. Ein parallel vorstehender
Rand kann an oder in der Nähe
der Mündung
der Öffnung
angeordnet oder alternativ tiefer in der Öffnung positioniert sein.
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Weiterhin
sieht der Fachmann, dass die Öffnung
Abmessungen haben sollte, die es einer intakten Zelle nicht ermöglichen,
durch das ebene Substrat hindurch zu treten.
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Vorzugsweise
ist die Länge
(d.h. die Tiefe) der Öffnung
zwischen 20 μm
und 30 μm,
beispielsweise zwischen 2 μm
und 20 μm,
2 μm und
10 μm oder
5 μm und
10 μm. Der
optimale Durchmesser für die Öffnung für eine optimale
Ausbildung einer Giga-Dichtung
und eine Ganzzellen-Anordnung hängt von
der speziellen Zellart ab, die ver wendet wird. Vorteilhafterweise
liegt der Durchmesser der Öffnung
im Bereich von 0,5 μm
bis 2 μm.
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Das
Substrat der Erfindung ist typischerweise eine Komponente, die in
einer Vorrichtung zur Durchführung
von Messungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionen-Transferkanälen in Lipid-Membranen
wie z.B. Zellen verwendet wird.
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Die
Vorrichtung kann so konstruiert sein, dass sie Mittel zur Durchführung einer
großen
Anzahl von einzelnen Experimenten in einem kurzen Zeitraum umfasst.
Dies wird dadurch erreicht, dass ein Mikrosystem vorgesehen wird,
das eine Vielzahl von Testbereichen (d.h. mit einem Rand versehene Öffnungen
für ein
in Kontakt Treten mit Zellen) besitzt, von denen jeder Stellen besitzt,
die integrierte Messelektroden umfassen, und dass für eine geeignete Testproben-Zufuhr
gesorgt wird. Jeder Testbereich kann Einrichtungen zum Positionieren
von Zellen, für eine
Ausbildung einer Giga-Dichtung, zur Auswahl von Stellen, an denen
eine Giga-Dichtung ausgebildet worden ist, Messelektroden und eine
oder mehrere Referenzelektroden umfassen. Dadurch ist es möglich, in
jedem Testbereich unabhängige
Experimente durchzuführen,
und die Vorbereitung und die Messungen aller Experimente von einer
zentralen Steuereinheit aus zu überwachen,
beispielsweise durch einen Computer. Aufgrund der kleinen Größe der Testbereiche
ermöglicht
die Erfindung die Durchführung
von Messungen unter Verwendung von nur sehr kleinen Mengen von Trägerflüssigkeit
und Testprobe.
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Das
Substrat der Erfindung kann aus irgendeinem für eine Wafer-Herstellungstechnologie geeignetem
Material, wie z.B. Silizium, Kunststoff, reinem Siliziumdioxid und
anderen Gläsern,
wie z.B. Quarz und PyrexTM oder Silizium
bestehen, das mit einem oder mehreren Dotierstoffen dotiert ist,
die aus der Gruppe Be, Mg, Ca, B, Al, Ga, Ge, M, P, As ausgewählt sind.
Silizium ist das bevorzugte Substratmaterial.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des ersten Gesichtspunktes der Erfindung sind die Oberfläche des
Substrates und/oder die Wände
der Öffnung
mit einem Material beschichtet, das gut geeignet ist, eine Dichtung
mit der Zellmembran zu erzeugen. Zu diesen Materialen gehören Silizium,
Kunststoff, reines Silizium und andere Gläser, wie z.B. Quarz und PyrexTM oder Silizium, das mit einem oder mehreren
Dotiermitteln dotiert ist, die aus der Gruppe Be, Mg, Ca, B, Al,
Ga, Ge, M, P, As und Oxiden dieser Elemente ausgewählt sind.
Vorzugsweise ist das Substrat zumindest teilweise mit Siliziumoxid
beschichtet.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des ersten Gesichtspunktes der Erfindung hat das ebene Substrat
einen ersten Oberflächenteil und
einen gegenüberliegenden
zweiten Oberflächenteil,
wobei der erste Oberflächenteil
wenigstens einen Bereich aufweist, der geeignet ist, eine Ionenkanäle enthaltende
Struktur zu halten, wobei jeder Bereich eine Öffnung mit einem Rand umfasst
und zugeordnete Elektroden aufweist, wobei das Substrat eine oder
mehrere Referenzelektroden trägt
und wobei die Messelektroden und die Referenzelektroden in Kompartments
angeordnet sind, die auf jeder Seite der Öffnung mit Elektrolyten gefüllt sind,
wobei die Messelektroden und die entsprechende(n) Referenzelektrode(n)
Elektroden sind, die in der Lage sind, dann, wenn sie miteinander
in elektrolytischem Kontakt stehen und wenn zwischen ihnen eine
Potentialdifferenz angelegt wird, zwischen sich dadurch einen Strom
zu erzeugen, dass von einer Elektrode Ionen abgegeben und von der
anderen Elektrode Ionen aufgenommen werden, wobei jeder der Bereiche
geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand zwischen
einer Ionenkanäle
enthaltenden Struktur, die in dem Bereich festgehalten wird, und
einem Oberflächenteil
des Bereiches zu erzeugen, wobei die Dichtung dann, wenn sie erzeugt
ist, eine Domäne,
die auf einer Seite der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur definiert ist und in elektrolytischen Kontakt
mit der Messelektrode steht, von einer Domäne zu trennen, die auf der
anderen Seite der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur definiert ist und im elektrolytischen Kontakt
mit der entsprechenden Referenzelektrode steht, so dass ein Strom,
der durch die Ionenkanäle
der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur zwischen den Elektroden fließt, gemessen
und/oder überwacht
werden kann, wobei die Elektroden auf beiden Seiten des Substrates
angeordnet sind.
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Beispiele
für den
allgemeinen Aufbau der bevorzugten Ausführungsform des ersten Gesichtspunktes
der Erfindung, bei dem das Substrat integrale Elektroden umfasst
(jedoch ohne das Merkmal der mit einem Rand versehenen Öffnung der
vorliegenden Erfindung) sind in WO-01/25769 beschrieben.
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Weiterhin
schafft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen
ebenen Substrates zur Verwendung bei der Patch-Clamp-Analyse der
elektrophysiologischen Eigenschaften einer Zellmembran, die eine
Glycocalyx besitzt, wobei das Substrat eine Öffnung umfasst, welche einen
Rand besitzt, der geeignet ist, bei Berührung mit der Zellmembran eine
Giga-Dichtung zu bilden, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
- i) Bereitstellen einer Substratrohlings,
- ii) Ausbilden einer Öffnung
in dem Rohling,
dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren
weiterhin die folgenden Schritte umfasst:
- iii) Ausbilden eines Randes, der von dem Substrat für wenigstens
20 nm vorsteht und eine Breite im Bereich von 10 nm bis 200 nm besitzt,
aus dem gleichen Material wie das Substrat, in welchem die Öffnung ausgebildet
ist.
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Vorzugsweise
wird das Substrat unter Verwendung des Silizium-Mikro-Herstellungsverfahrens „MADOU,
M. 2001" hergestellt.
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Der
Fachmann sieht, dass die Schritte ii) und iii) nacheinander, d.h.
in zeitlich getrennten Schritten oder gleichzeitig durchgeführt werden
können.
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Vorteilhafterweise
umfasst der Schritt ii) die Ausbildung einer Öffnung unter Verwendung eines induktiv
gekoppelten, reaktiven Plasma-Ionen-Tiefätz-Verfahrens (inductively
coupled plasma [ICP] deep reactive ion etch process) „Laermer
F. u. Schlip A., DE-4 241 045.
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Wenn
es erforderlich ist, einen im Wesentlichen vertikalen Vorsprung
bezüglich
der Ebene des Substrates zu schaffen, umfasst das Verfahren einen Zwischenschritt
eines gerichteten selektiven Ätzens der
Vorderseite des Substrats, der ein Entfernen einer Maskierungsschicht
an der Vorderseite des Substrates bewirkt und weiterhin ein Fortschreitendes Ätzen über die
vorgeschriebene Vorsprungsweite in das darunter liegende Substrat
hinein.
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Infolge
einer größeren Ätzrate des
Siliziums im Vergleich zu der des maskierenden Materials bleibt
das maskierende Material innerhalb der Öffnung zurück und steht von der Oberfläche ab.
Danach kann eine Gesamtoberflächenbeschichtung aufgebracht
werden.
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Wenn
es erforderlich ist, einen Vorsprung auszubilden, der im wesentlichen
in der Ebene des Substrates liegt, umfasst das Verfahren einen Zwischenschritt
der Verwendung der induktiv gekoppelten Plasma-Atzung (ICP) oder
der fortgeschrittenen Silizium-Atzung (Advanced Silicon Etch) (ASE)
für die
Ausbildung der Pore, wobei das wiederholte Abwechseln zwischen Ätz- und
Passivierungs-Schritten, die diese Verfahren charakterisiert, zu
einem gewissen Ausbogen zur Mündung
der Öffnung
hin führt. Durch
geeignete Einstellung der Verfahrensparameter kann das Ausbogen
zu einer in der Ebene liegenden nach innen gerichteten Vorsprung
des Randes führen.
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Auch
hier kann wieder eine Gesamtoberflächenbeschichtung nachfolgend
angewandt werden.
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Günstigerweise
umfasst das Verfahren weiterhin eine Beschichtung der Oberfläche des
Substrates (beispielsweise mit Siliziumoxid) entweder vor oder nach
der Ausbildung der Öffnung
und/oder des Randes. Alternativ wird der Schritt (iii) gleichzeitig
wie das Beschichten des Substrates durchgeführt.
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Solche
Beschichtungen können
durch die Verwendung von plasmaverstärkter chemischer Dampfabscheidung
(PECVD) und/oder durch die Verwendung chemischer Niederdruck-Dampf-Abscheidung
(LPCVD) aufgebracht werden.
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Die
bevorzugte Ausführungsform
des ersten Gesichtspunktes der Erfindung, bei welcher das Substrat
integrale Elektroden umfasst, kann in der Weise hergestellt werden,
wie dies in WO-01/25769 beschrieben ist.
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Weiterhin
schafft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse der elektrophysiologischen
Eigenschaften einer Zellmembran, die eine Glycocalyx umfasst, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- i)
Herstellen eines im Wesentlichen ebenen Substrates zur Verwendung
bei der Patch-Clamp-Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften
einer Zellmembran, die eine Glycocalyx aufweist, wobei das Substrat
eine Öffnung umfasst,
die einen Rand besitzt und dieser Rand geeignet ist, bei Berührung mit
der Zellmembran eine Giga-Dichtung auszubilden, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- ii) Bereitstellen eines Substratrohlings,
- iii) Ausbilden einer Öffnung
in dem Rohling, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin
folgende Schritte umfasst:
- iv) Ausbilden eines Randes, der in Längsrichtung von dem Substrat über wenigstens
20 nm absteht und eine Breite im Bereich von 10 nm bis 200 nm besitzt,
aus dem gleichen Material wie das Substrat, in welchem die Öffnung ausgebildet
ist,
- v) In Berührung
Bringen der Zellmembran mit dem Rand der Öffnung derart, dass zwischen
der Zellmembran und dem Substrat eine Giga-Dichtung ausgebildet
wird, und
- vi) Messen der elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellmembran.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Ausbildung einer Gesamtzellen-Messkonfiguration
zur Ermittlung und/oder Überwachung
einer elektrophysiologischen Eigenschaft eines oder mehrerer Ionenkanäle von einer
einen oder mehreren Ionenkanäle
enthaltenden Strukturen geschaffen, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte
umfasst:
- i) Bereitstellen eines Substrats wie
oben definiert,
- ii) Zuführen
einer Trägerflüssigkeit
zu einer oder mehreren Öffnungen,
wobei die Trägerflüssigkeit eine
oder mehrere Ionenkanäle
enthaltende Strukturen enthält,
- iii) Positionieren wenigstens einer der Ionenkanäle aufweisenden
Strukturen an einer entsprechenden Anzahl von Öffnungen,
- iv) Überprüfen der
Existenz einer Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand zwischen
einer Ionenkanäle
enthaltenden Struktur, die an einer Stelle (d.h. an einer Öffnung)
festgehalten wird und dem Oberflächenteil
der Stelle (d.h. des Randes) mit dem die Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand
geschaffen werden soll, durch nacheinander erfolgendes Anlegen einer
ersten elektrischen Potentialdifferenz zwischen der Messelektrode,
die der Stelle zugeordnet ist, und einer Referenzelektrode, Überwachen
eines ersten Stroms, der zwischen der Messelektrode und der Referenzelektrode
fließt,
und Vergleichen dieses ersten Stroms mit einem vorbestimmten Schwellenstrom
und, wenn der erste Strom im Wesentlichen gleich dem vorbestimmten
Schwellenstrom ist, bestätigen,
dass die Stelle eine annehmbare Dichtung zwischen der Ionenkanäle enthaltenden Struktur
und dem Oberflächenteil
des Platzes aufweist, und
- v) Ausbilden einer Gesamtzellen-Konfiguration an bestätigten Stellen,
- vi) wodurch ein dritter Strom, der durch die Ionenkanäle der Ionenkanäle aufweisenden
Struktur zwischen der Messelektrode und den Referenzelektroden fließt, gemessen
und/oder überwacht werden
kann
-
Eine
Ionenkanäle
enthaltende Struktur (beispielsweise eine Zelle) in einer Lösung kann
zu einer Stelle auf einem Substrat entweder durch aktive oder durch
passive Mittel geführt
werden. Wenn die Ionenkanäle
enthaltende Struktur mit dem Rand der Öffnung in Berührung tritt,
bilden die Berührungsoberflächen eine
Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand (Giga-Dichtung) an der
Stelle, so dass eine elektrophysiologische Eigenschaft der Ionenkanäle unter
Verwendung von Elektroden gemessen werden kann. Eine solche elektrophysiologische
Eigenschaft kann der Strom sein, der durch den Teil der Membran der
Ionenkanäle
enthaltenden Struktur geleitet wird, der von der Giga-Dichtung umschlossen
ist.
-
Eine
Gesamtzellen-Konfiguration kann dadurch erhalten werden, dass man
zwischen der Messelektrode, die jeder bestätigten Stelle zugeordnet ist,
und einer Referenzelektrode, eine Reihe von zweiten elektrischen
Potentialdifferenz-Impulsen anlegt, einen zweiten Strom, der zwischen
der Messelektrode und der Referenzelektrode fließt, überwacht und die Reihe von
zweiten elektrischen Potentialdifferenz-Impulsen immer dann unterbricht,
wenn der zweite Strom einen vorgegebenen Schwellenwert übersteigt,
wodurch der Teil der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur aufgerissen wird, der sich am nächsten bei
der Messelektrode befindet.
-
Alternativ
kann die Gesamtzellen-Konfiguration dadurch erhalten werden, dass
man den Teil der Ionenkanäle
aufweisenden Struktur, der sich am nächsten bei der Messelektrode
befindet, einer Wechselwirkung mit einer eine Öffnung bildenden Substanz aussetzt.
-
Es
sei darauf hingewiesen, dass im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „Gesamtzellen-Konfiguration" nicht nur Konfigurationen
bezeichnet, bei denen eine ganze Zelle mit dem Substrat an einer
Messstelle in Berührung
gebracht worden ist und für
einen elektrischen Kontakt mit dem Inneren der Zelle durchlöchert oder
mit Hilfe einer eine Öffnung
bildenden Substanz geöffnet
worden ist, sondern auch Konfigurationen, bei denen ein herausgeschnittener
Zellmembran-Fleck so angeordnet worden ist, dass die äußere Fläche der
Membran nach „oben" zu einer aufzubringenden
Testprobe hinweist.
-
Da
die Messelektrode, die einer Stelle zugeordnet ist, eine aus einer
Vielzahl von Elektroden auf dem Substrat sein kann, und da die Ionenkanäle aufweisende
Struktur eine von vielen in einer Lösung sein kann, ist es möglich, viele
solche vorbereitete Messanordnungen auf einem Substrat zu erzielen. Eine
typische Messung umfasst die Zugabe einer speziellen Testprobe zur
Anordnung, und deshalb ist jede Messanordnung von den anderen Messanordnungen
getrennt, um eine Vermischung der Testproben und eine elektrische
Leitung zwischen den Messanordnungen zu vermeiden.
-
Im
Betrieb wird die Zugabe der die Zellen tragenden Flüssigkeit
und der Zellen zum Substrat in einer der der folgenden Weisen durchgeführt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Testkompartments von oben her zugänglich und Tröpfchen von Trägerflüssigkeit
und Zellen können
jedem Testkompartment mit Hilfe eines Abgabe- oder Pipettier-Systems
zugeführt
werden. Systeme wie z.B. ein Tintenstrahl-Druckerkopf oder ein Bläschenstrahl-Druckkopf
können
verwendet werden. Eine andere Möglichkeit
ist ein nQUAD-Ansaug-Dispenser oder irgendeine andere Dispenser/Pipettier-Vorrichtung, die
geeignet ist, kleine Flüssigkeitsmengen
zu dosieren. Alternativ werden die Trägerflüssigkeit und die Zellen dem
Substrat als Ganzem zugeführt
(beispielsweise dadurch, dass Trägerflüssigkeit,
welche Zellen enthält, über das
Substrat gegossen oder das Substrat in eine solche Flüssigkeit
eingetaucht wird), wodurch jedem der Testkompartments Trägerflüssigkeit
und Zellen zugeführt
werden. Da die Volumina der Trägerflüssigkeit
und später
der Testproben im Nanoliter liegen, könnte die Verdampfung von Wasser
ein Problem darstellen. Daher sollte in Abhängigkeit von den spezifischen
Volumina die Handhabung der Flüssigkeiten
auf dem Substrat vorzugsweise in Atmosphären mit hoher Feuchtigkeit
durchgeführt werden.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
werden die Zellen direkt auf dem Substrat kultiviert, während dieses
in ein Meermedium eingetaucht ist. Im optimalen Fall bilden die
Zellen eine homogene Monoschicht (in Abhängigkeit vom Zelltyp, den man
wachsen lassen will) auf der gesamten Oberfläche mit Ausnahme von Bereichen,
in denen die Oberfläche absichtlich
für ein
Zellwachstum ungeeignet gemacht worden ist. Der Erfolg der Kultivierung
von Zellen auf dem Substrat hängt
in starkem Maße
von dem Substratmaterial ab.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
kann eine künstliche
Membran mit eingeschlossenen Ionenkanälen an der Stelle von Zellen
verwendet werden. Solche künstlichen
Membranen können
aus einer gesättigten
Lösung
von Lipiden dadurch hergestellt werden, dass eine kleine Menge des
Lipids über einer Öffnung positioniert
wird. Dieses Verfahren wird genau von Christopher Miller (1986)
Ion Channel Reconstitution, Plenum 1986, Seite 577 beschrieben. Wenn
die Öffnungsgröße geeignet
ist und eine polare Flüssigkeit,
wie z.B. Wasser, auf beiden Seiten der Öffnung vorhanden ist, kann
sich eine Lipid-Doppelschicht über
der Öffnung
ausbilden. Der nächste Schritt
besteht darin, einen Protein-Ionenkanal in die Doppelschicht einzubringen.
Dies kann dadurch erreicht werden, dass Lipid-Bläschen mit darin vorhandenen
Ionenkanälen
auf einer Seite der Doppelschicht zugeführt werden. Die Vesikel können beispielsweise
durch osmotische Gradienten dazu gebracht werden, mit der Doppelschicht
zu fusionieren, wodurch die Ionenkanäle in die Doppelschicht aufgenommen
werden.
-
Das
Erzielen eines guten Kontaktes zwischen der Zelle und einer Glaspipette
und der damit verbundenen Erzeugung einer Giga-Dichtung zwischen
der Zelle und der Spitze der Pipette sind im Stand der Technik gut
beschrieben. Um die Zelle zur Spitze der Pipette zu ziehen und auch
um den erforderlichen Kontakt für
die Erzielung der Giga-Dichtung auszubilden, ist es üblich, an
die Pipette einen Unterdruck bzw. eine Saugwirkung anzulegen. Bei
den ebenen Substraten der vorliegenden Erfindung kann jedoch der
bloße
Kontakt zwischen der Zellmembran und dem Substrat, typischerweise
ultrareinem Siliziumoxid ausreichend sein, dass sich die Zellen
in einer gewissen Weise an die Oberfläche binden und eine Giga-Dichtung
erzeugen.
-
Die
Positionierung einer Zelle über
einer Öffnung
im Substrat kann durch Elektrophorese durchgeführt werden, bei der ein elektrisches
Feld von einer Elektrode die geladene Zelle zu dieser Elektrode hin
zieht. Negativ geladene Zellen werden zu positiven Elektroden gezogen
und umgekehrt. Der elektrostatische Zug kann auch als Führungsmittel
für eine Gruppe
von Elektroden dienen. Alternativ kann innerhalb eines Testkompartments
ein hydrophobes Material die Oberfläche des Substrates mit Ausnahme
von Flächenbereichen
unmittelbar um die Elektroden herum bedecken. Dadurch können sich
die Zellen nur an die Elektrodenbereiche binden. Es ist möglich, diese
beiden Verfahren gleichzeitig oder optional in Kombination mit einer
geeigneten geometrischen Form der Substratoberfläche um die Elektroden herum
zu verwenden, um die absinkenden Zellen zur Elektrode hin zu führen.
-
Alternativ
kann die Positionierung einer Zelle über einer Öffnung im Substrat durch Elektroosmose durchgeführt werden.
-
Wenn
eine Saugwirkung angelegt wird, so zieht sie die Zelle zur Öffnung hin
und bildet eine Verbindung zwischen der Zelle und der Öffnung aus,
wodurch eine Giga-Dichtung erzeugt wird, welche die im Inneren liegende Öffnung und
die Lösung
voneinander trennt. Die Giga-Dichtung kann irgendeine Form, beispielsweise
kreisförmig,
oval oder rechtwinkelig annehmen. Wenn das Substrat integrale Elektroden umfasst,
kann die Trägerflüssigkeit
einen elektrischen Kontakt zwischen der Zellmembran und einer Referenzelektrode
herstellen. Die Zelle kann durch die Saugwirkung deformiert werden
und ein Fall, bei dem sich die Zelle in die Öffnung hinein erstreckt (ohne
sich jedoch durch sie hindurch zu bewegen) kann in gesteuerter Weise
wünschenswert
sein.
-
Unter
Verwendung der Substrate und Verfahren gemäß der Erfindung kann die Aktivität der Ionenkanäle in der
Zellmembran elektrisch gemessen werden (Einzelkanal-Aufzeichnung)
oder alternativ kann der Fleck aufgerissen werden, wodurch Messungen
der Kanalaktivität
der gesamten Zellenmembran (Gesamtzellen-Aufzeichnung) ermöglicht werden.
Ein Zugang mit hoher Leitfähigkeit
zum Inneren der Zelle zur Durchführung
von Gesamtzellen-Messungen kann auf wenigstens drei verschiedene
Weisen erreicht werden (alle Verfahren sind durchführbar, doch
können
verschiedene Zellen mit unterschiedlichen Methoden besser arbeiten):
- a) Die Membran kann durch Ansaugung von der Öffnungsseite
her aufgerissen werden. Unter dem Atmosphärendruck liegende Drücke werden
entweder als kurze Impulse mit zunehmender Stärke oder als Rampensignale
oder in Stufen mit zunehmender Größe angelegt. Das Reißen der
Membran wird durch stark erhöhte
kapazitive Stromspitzen (welche die Gesamtzellen-Membran-Kapazität darstellen)
in Antwort auf einen gegebenen Spannungstestimpuls erkannt.
- b) Aufreißen
der Membran durch angelegte Spannungsimpulse. Spannungsimpulse werden
entweder als kurze Impulse mit zunehmender Größe (mV bis V) und zeitlicher
Dauer (μs-ms)
oder als Rampensignale oder in Form von Stufen mit zunehmender Höhe zwischen
den Elektroden angelegt. Die Lipide, welche die Membran einer typischen
Zelle bilden, werden durch die große elektrische Feldstärke der
Spannungsimpulse beeinflusst, wodurch die Membran in der Nachbarschaft
der Elektrode disintegriert. Das Zerreißen der Membran wird durch
stark erhöhte
kapazitive Stromspitzen in der Reaktion auf einen gegebenen Spannungs-Testimpuls
erkannt.
- c) Durchlässigmachen
der Membran. Das Aufbringen von Substanzen, welche eine Öffnung formen
(beispielsweise von Antibiotika wie z.B. Nystatin oder Amphotericin
B), beispielsweise durch deren vorherige Abscheidung an dieser Stelle. Statt
eines Zerreißens
der Membran wird der Widerstand der Membran selektiv durch die Aufnahme
von permeabilisierenden Molekülen
abgesenkt, was zu einer wirksamen Zellspannungs-Steuerung über das
Elektrodenpaar führt. Auf
die Aufnahme folgen ein schrittweise abnehmender Gesamtwiderstand
und eine sich erhöhende
Kapazität.
-
Wenn
das Substrat eine Vielzahl von Testkompartments umfasst, von denen
jedes eine Öffnung
aufweist, können
die Testproben jeden Testkompartment einzeln zugegeben werden, wobei
für jedes
Testkompartment eine andere Probe zugegeben werden kann. Dies kann
unter Verwendung von Verfahren zum Aufbringen von Trägerflüssigkeit
mit Ausnahme der Verfahren durchgeführt werden, bei denen die Trägerflüssigkeit
dem Substrat als Ganzem zugeführt
wird.
-
Nach
dem Positionieren der Zelle in einer Messkonfiguration können mehrere
elektrophysiologische Eigenschaften gemessen werden, wie z.B. der
Strom durch die Ionenkanäle
(Spannungsklemm-Anordnung) oder die Kapazität von Ionenkanäle enthaltenden
Membranen. In jedem Fall sollte eine geeignete elektronische Messschaltung
vorgesehen werden. Der Fachmann ist in der Lage, solche geeigneten
Messschaltungen auszuwählen.
-
Die
Erfindung schafft auch einen Teilesatz zur Durchführung eines
Verfahrens zum Analysieren der elektrophysiologischen Eigenschaften
einer Zellmembran, die eine Glycocalyx besitzt, wobei der Teilesatz
ein ebenes Substrat zur Verwendung bei der Patch-Clamp-Analyse der elektrophysiologischen
Eigenschaften einer Zellmembran mit einer Glycocalyx umfasst, wobei
das Substrat eine Öffnung
besitzt, die einen Rand aufweist, der so ausgebildet ist, dass er bei
einer Berührung
mit der Zellmembran eine Giga-Dichtung ausbildet, dadurch gekennzeichnet, dass
der Rand aus dem gleichen Material wie das Substrat hergestellt
ist und in Längsrichtung
von dem Substrat über
wenigstens 20 nm vorsteht und eine Breite im Bereich von 10 nm bis
200 nm aufweist, sowie ein oder mehrere Medien oder Reagenzien zur Durchführung von
Patch-Clamp-Untersuchungen.
-
Vorzugsweise
umfasst der Teilesatz eine Vielzahl von Substraten.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die nachfolgenden,
nicht einschränkend
zu verstehenden Beispiele und Figuren erläutert; in der Zeichnung zeigen:
-
1 eine
Zelle mit einer mit ihr in Verbindung stehenden Patchpipette. In
dem Giga-Dichtungs-Bereich (der durch einen schraffierten Bereich am
Berührungspunkt
zwischen der Pipettenspitze und der Zellmembran gekennzeichnet ist)
wurden die Glycoproteine der Glycocalyx seitlich verschoben, um
eine direkte Berührung
zwischen der Phospholipid-Doppelschicht der Membran und der Pipette
zu ermöglichen,
-
2a und 2b zwei
Zellen, von denen die eine (2a) mit
einer Pipettenspitze und die andere (2b)
mit einem ebenen Substrat in Verbindung steht. Der Berührungsbereich
zwischen der Zellmembran und der Substratoberfläche ist bei der Substrat-Konfiguration
(2b) beträchtlich größer als bei der Pipetten-Konfiguration
(2a).
-
3 die
Veränderung
des tatsächlichen
Pipettenwiderstandes für
jeden beabsichtigten Widerstandssatz,
-
4 die
Giga-Dichtungs-Erfolgsrate aufgetragen gegen den Pipetten-Widerstand,
-
5 die
Erfolgsrate einer Gesamtzellen-Ausbildung (von erfolgreichen Giga-Dichtungen) in
Abhängigkeit
vom Pipetten-Widerstand,
-
6 die
Zeitabhängigkeit
der Ausbildung einer Giga-Dichtung mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen, wobei
die Fehlerbalken die Standardabweichung vom Mittelwert wiedergeben,
-
7 ein
Beispiel einer Zelle, die an einem ebenen Substrat mit einem vorstehenden
Rand anhaftet, der die Öffnung
umgibt, wobei die Giga-Dichtungs-Ausbildungszone
sehr begrenzt ist,
-
8a, 8b, 8c und 8d vier
unterschiedliche Öffnungsformen,
die einen vorstehenden Rand umfassen: einen vertikalen Rand (8a); einen schrägen Rand (8b);
einen horizontalen Rand (8c) und eingesenkten
Rand (8d).
-
9 eine
Konstruktion ohne vorstehenden Bereich aber mit einem Rand, der
ausreichend scharf ist (r=25 nm bis 100 nm) um die Berührungszone
zwischen Membran und Substrat auf 50 nm bis 200 nm zu verringern.
Der Öffnungswinkel
(ϴ) ist 45° bis
90°,
-
10a und 10b Rasterelektronen-Mikroskopaufnahmen
eines Substrats mit langen Poren mit einem vorstehenden Rand in
der Ebene der Oberfläche
unter Verwendung von ECP und LPCVD für die Oberflächen-Modifikation,
und
-
11 eine
Rasterelektroden-Mikroskopaufnahme eines Substrats mit langen Poren
mit einem aus der Ebene der Oberfläche heraus vorstehenden Rand
unter Verwendung von ICP und LPCVD zur Oberflächen-Modifikation.
-
BEISPIELE
-
Die
vorliegende Erfindung identifiziert drei Faktoren, die für die Ausbildung
einer Giga-Dichtung und
eine Gesamtzellen-Anordnung bei Patch-Clamp-Messungen wichtig sind,
welche an lebenden Zellen durchgeführt werden, die in der Zellmembran
eine Glycocalyx aufweisen:
- 1. Die Länge der Öffnung sollte
ausreichend groß sein,
um die relativ elastischen Zellen daran zu hindern, beim Anlegen
einer Saugwirkung durch die Öffnung
hindurch bewegt zu werden.
- 2. Es scheint auch eine optimale Öffnungsgröße für die Ausbildung einer Giga-Dichtung
und die Herstellung einer Gesamtzellen-Anordnung zu geben, welche
mit den elastischen Eigenschaften der Zellmembran und des Zelltyps
in Verbindung steht, der untersucht werden soll.
- 3. Die Öffnung
des ebenen Substrats sollte von einem Rand begrenzt sein, der in
der Lage ist, die Glycocalyx zu verschieben, wenn eine Annäherung zur
Zelloberfläche
stattfindet.
-
Jeder
dieser Faktoren wird im Folgenden erläutert:
-
Länge der Öffnung
-
Die
Länge (d.h.
die Tiefe) der Öffnung,
die von der Membrandicke des Chips definiert wird, ist ebenfalls
wichtig. Konstruktionen mit kleinem Seitenverhältnis (kurze Öffnungen)
leiden unter dem Nachteil, dass Zellen, nach ihrer Positionierung
und dem nachfolgenden Anlegen eines Unterdrucks eine Tendenz haben,
sich aufgrund der ihnen innewohnenden Elastizität durch das Loch hindurch zu
bewegen. Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses Problem in wirksamer
Weise durch die Verwendung längerer Öffnungen
vermieden werden kann, die typischerweise länger als 2 μm sind (Daten nicht dargestellt).
-
Ermittlung
der optimalen Öffnungsgröße
-
Um
die optimale Öffnungsgröße zu ermitteln, um
eine Giga-Dichtung und Gesamtzellen-Konfigurationen zu erzielen, wurden
die Erfolgsraten für
die Erreichung einer Giga-Dichtung bzw. einer Gesamtzellen-Konfiguration
in einer Standard-Patch-Clamp-Anordnung unter Verwendung von Patch-Clamp-Pipetten
unterschiedlicher Größe verglichen.
Die Experimente wurden an HIK239-Zellen durchgeführt, die an Coverslips anhafteten,
welche in Natrium-Ringer-Lösung
eingetaucht wurden. Borsilikat-Kapillaren (Hilgenberg, Katalog-Nr.
1403573, L=75 mm, Od=1,5 mm, ID=0,87 mm, 0,2 mm Filament) wurden
zur Herstellung von Pipetten verwendet. Der Pipetten-Widerstand
wurde als Indikator für
die relative Öffnungsgröße verwendet;
Pipetten mit beabsichtigten Widerstandswerten von 0,5, 1, 2, 5,
10 und 15 MΩ wurden hergestellt.
Zur Zeit der Messung wurde der tatsächliche Pipetten-Widerstand
notiert und der mittlere tatsächliche
Pipetten-Widerstand für
jeden Satz zusammen mit der Standardabweichung vom Mittelwert ist in 3 dargestellt.
-
4 zeigt
die Abhängigkeit
der Giga-Dichtungs- und der Gesamtzellen-Erfolgsraten vom Pipetten-Öffnungswiderstand
(Öffnungsgröße). Die Anzahl
von Experimenten, die für
jeden Datensatz durchgeführt
wurden, ist oberhalb der Datenpunkte angegeben. Die Ergebnisse zeigen,
dass Pipetten mit einem Widerstandswert von 5 MΩ sowohl für die Ausbildung von Giga-Dichtungen
als auch für
Gesamtzellen-Anordnungen optimal waren, während Widerstandswerte oberhalb
5 MΩ bis
zu 15 MΩ zu
einem ungefähr
20%-igen Abfall der Erfolgsrate führten. Eine Verminderung des
Pipetten-Widerstandes unter 5 MΩ war
schädlicher;
ein Widerstand von 2 MΩ gab
eine Erfolgsrate von 50%, die um 37% niedriger liegt als die für 5 MΩ, während Widerstandswerte
von 1 MΩ oder
kleiner praktisch zu keiner Ausbildung einer Giga-Dichtung führten.
-
5 zeigt
den Prozentsatz der Gesamtzellen-Anordnungen, die aus Experimenten
erzielt wurden, bei denen die Giga-Dichtungen in erfolgreicher Weise
ausgebildet worden waren (d.h. unter Weglassung derer, die keine
Giga-Dichtung erreichten). Die Daten zeigen, dass obwohl 5 MΩ-Pipetten
die höchste
Gesamtzellen-Erfolgsrate besaßen,
die anderen Öffnungsgrößen nur
geringfügig
weniger erfolgreich waren.
-
Der
Einfluss des Pipetten-Widerstandswertes auf die Zeit, die benötigt wird,
um einen GΩ-Widerstandswert
zu erreichen, wurde jedenfalls untersucht (siehe 6).
Die Ergebnisse zeigen, dass die 2 MΩ-Pipetten wesentlich mehr Zeit
benötigten,
um eine Giga-Dichtung zu erreichen, als Pipetten mit Widerstandswerten
von 5, 10 oder 15 MΩ.
Die Ähnlichkeit
der Ergebnisse für
die Pipetten mit 5, 10 und 15 MΩ zeigt,
dass eine Vergrößerung der Öffnungsgröße in diesem
Bereich die Zeit nicht beeinflusst, die erforderlich ist, um eine
Giga-Dichtung zu erreichen.
-
Die
Ergebnisse zeigen deutlich, dass der Erfolg der Ausbildung einer
Giga-Dichtung von der Größe der Pipettenöffnung abhängt. Die
5 MΩ-Pipetten hatten
die optimale Öffnungsgröße und größere Größen als diese (d.h. mit kleineren Widerstandswerten) führten zu
einer deutlichen Verminderung bei einer erfolgreichen Ausbildung
einer Giga-Dichtung.
-
Obwohl
die obigen Experimente unter Verwendung herkömmlicher Glas-Mikropipetten
durchgeführt
wurden, können
die Ergebnisse auf ebene Substrate zur Verwendung in Patch-Clamp-Experimenten
extra poliert werden. Somit zeigen die Ergebnisse, dass Öffnungen
im Chip-System im Allgemeinen nicht größer sein sollten, als die Öffnungen
der 5 MΩ-Pipetten.
Pipetten, die kleiner waren als die 5 MΩ-Pipetten zeigten ein halbwegs
akzeptables Verhalten, doch waren sie beträchtlich schlechter. Daher ist
es weniger schädlich,
die Chipöffnung
geringfügig kleiner
zu machen als die der 5 MΩ-Pipetten, doch deutlich
schlechter, wenn man sie größer macht.
-
Eine
Veränderung
der Pipetten-Öffnungsgröße schien
weniger Einfluss auf die Gesamtzellen-Ausbildung zu haben. Obwohl
der Erfolg der Gesamtzellen-Ausbildung bei 5 MΩ-Pipetten am höchsten war,
gab es bei Pipetten von 2 MΩ bis
15 MΩ nur eine
geringe Verminderung der Erfolgsrate.
-
Es
wurde auch beobachtet, dass die Pipetten-Öffnungsgröße einen Einfluss auf die Zeit
hatte, die benötigt
wurde, um einen GΩ-Widerstandswert zu
erreichen. Pipetten mit 5 MΩ und
15 MΩ benötigten ähnliche
Zeiten um die Giga-Dichtung zu erreichen, doch benötigten Pipetten
mit 2 MΩ eine
2,5- bis 3-mal längere
Zeit.
-
Eine
mikroskopische Untersuchung der Glaspipetten, die bei den Experimenten
verwendet wurden, zeigte, dass Pipetten, die einen 5 MΩ Widerstandswert
zeigten, eine Öffnungsgröße im Bereich von
0,5 μm bis
1 μm besaßen. Es
ist jedoch zu erwarten, dass die optimale Öffnungsgröße vom Zelltyp und der Zellengröße abhängt.
-
Die
Erfolgsrate für
die Erzielung von Giga-Dichtungen bei herkömmlichen Patch-Clamp-Experimenten ist
typischerweise hoch, häufig
um die 90%, wenn eine Patch-Clamp-Verbindung zu in der Kultur gezogenen
Zellen wie HIK oder CHO hergestellt wird. Basierend auf den obigen Überlegungen ist
zu erwarten, dass vergleichbare Erfolgsraten an ebenen Chips unter
Verwendung einer Öffnungsgeometrie
erreicht werden können,
welche die einer herkömmlichen
Pipettenspitzen-Öffnung
nachahmt. Eine solche Geometrie umfasst einen vorstehenden Rand,
der ein Öffnungsloch
mit 0,5 μm
bis 1 μm
flankiert. Darüber
hinaus sollte die Länge
(d.h. die Tiefe) der Öffnung
vorzugsweise mehr als 2 μm
betragen.
-
Herstellung
von ebenen Patch-Clamp-Substraten
-
Ein
bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der ebenen Patch-Clamp-Substrate
gemäß der Erfindung
erfolgt unter Verwendung von Silizium-, Wafer-Mikroherstellungs-
und – Verarbeitungsverfahren, die
es ermöglichen
Siliziumoberflächen
mit Siliziumoxid zu beschichten und dadurch in wirksamer Weise eine
Glasoberfläche
hoher Qualität
zu erzeugen. Vorzugsweise können
lange Poren und die Oberflächen-Modifikationen
unter Verwendung von ICP (Inductively Coupled Plasma) und LPCVD
(Low Pressure Chemical Vapor Deposition) erzeugt werden. Lange Öffnungen
mit einem vorstehenden Rand können unter
Verwendung von ICP hergestellt werden, um die Poren zu erzeugen
und unter Verwendung von RIE (Reactive Ion Etch) um den vorstehenden
Rand herzustellen, in Kombination mit LPCVD, um die Oberflächenmodifikation
zu erzielen.
- a) Beispiele für Verfahrens-Rezepte für lange Öffnungen
mit einem vorstehenden Rand in der Ebene der Oberfläche unter
Verwendung von ICP und LPCVD für
die Oberflächenmodifikation
(10a und 10b).
- 1) Ausgangssubstrat: Einkristall–Silizium-Wafer, Kristallorientierungs- <100>.
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (Deep Reactive Ion Etch
[DRIE]) oder Advanced Silicone Etch (ASE) unter Verwendung eines
induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was zu tiefen vertikalen
Poren mit einer Tiefe von 1 μm
bis 50 μm
führt.
- 4) Die Siliziumoberfläche
wird mit einer Ätzmaske beschichtet,
die einer KOH- oder TMAH-Losung widersteht. Beispielsweise könnte dies
Siliziumoxid oder Siliziumnitrid sein.
- 5) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet,
und ein Muster, das die Membran definierenden Öffnungen im Siliziumnitrid
enthält,
wird auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 6) Der Wafer wird an der Unterseite des Wafers in den Bereichen
abgeätzt,
die durch die Öffnungen im
Fotolack definiert sind, wobei ein geeignetes Musterübertragungs-Verfahren
verwendet wird. Beispielsweise könnte
es sich hierbei um reaktive Ionenätzung (Reactive Ion Etch [RIE9)
handeln.
- 7) Der Wafer wird anisotrop in einer KOH- oder TMAH-Lösung geätzt, was
zu einer pyramidenförmigen Öffnung auf
der Unterseite des Wafers führt.
Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges definiert
die Dicke der verbleibenden Membran aus Silizium an der Oberseite
des Wafers. Alternativ kann eine Dotierung mit Bor verwendet werden,
um einen Ätz-Stopp
zu definieren, was zu einer besseren Steuerung der Dicke führt.
- 8) Die Ätzmaske
wird selektiv vom Siliziumsubstrat entfernt.
- 9) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampf-Abscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Einkristall-Silizium-Wafer
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etch (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren mit einer Tiefe von 1 μm bis 50 μm führt.
- 4) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet,
und ein Muster, das die Membrandefinitionen enthält, wird auf den Fotolack durch
UV-Licht-Exposition übertragen.
- 5) Der Wafer wird unter Verwendung von reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE)
oder Advanced Silicon Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten
Plasmas (ICP) anisotrop geätzt,
was zu einer zylindrischen Öffnung
auf der Unterseite des Wafers führt.
Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges
definiert die Dicke der verbleibenden Membran aus Silizium an der
Oberseite des Wafers.
- 6) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampf-Abscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Silizium auf einem Isolator (SOI)
mit einer vergrabenen Oxidschicht (buried Oxide layer), die 1 μm bis 50 μm unter der
oberen Oberfläche
liegt, Trägerkristall-Orientierung <100>.
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicon
Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas
(ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht
führt.
- 4) Die Siliziumoberfläche
wird mit einer Ätzmaske beschichtet,
die einer KOH- oder TMAH-Lösung widersteht.
Beispielsweise könnte
dies Siliziumoxid oder Siliziumnitrid sein.
- 5) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet,
und ein Muster, das die Membran definierenden Öffnungen im Siliziumnitrid
enthält,
wird auf dem Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 6) Der Wafer wird an der Unterseite des Wafers in den Bereichen
abgeätzt,
die durch die Öffnungen im
Fotolack definiert sind, wobei ein geeignetes Musterübertragungs-Verfahren
verwendet wird. Beispielsweise könnte
es sich hierbei um reaktive Ionenätzung (RIE) handeln.
- 7) Der Wafer wird anisotrop in einer KOH- oder TMAH-Losung geätzt, was
zu einer pyramidenförmigen Öffnung in
der Unterseite des Wafers führt. Die
vergrabene Oxidschicht wirkt als Ätz-Stopp für das Verfahren, und somit
definiert die Dicke der Siliziumschicht auf der Oberseite die Dicke der
zurückbleibenden
Membran.
- 8) Die freigelegten Bereiche der vergrabenen Oxidschicht werden
durch RIE, nasse Flusssäure (HF-Ätzung) oder
HF-Dampfätzung
entfernt. Dies stellt eine Berührung
zwischen den oberen und unteren Öffnungen
im Wafer sicher.
- 9) Die Ätzmaske
wird selektiv vom Siliziumsubstrat entfernt.
- 10) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampf-Abscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt
werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Silizium auf einem
Isolator (SOI) mit einer vergrabenen Oxidschicht (buried Oxide layer),
die 1 μm
bis 50 μm
unter der oberen Oberfläche
liegt.
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekop gelten Plasmas
(ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht
führt.
- 4) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet
und ein Muster, das die Membran-Definitionen enthält, wird
durch UV-Licht-Exposition
auf den Fotolack übertragen.
- 5) Der Wafer wird unter Verwendung von reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE)
oder Advanced Silicon Etching (ASE) Unter Verwendung eines induktiv gekoppelten
Plasmas (ICP) anisotrop geätzt,
was auf der Unterseite des Wafers zu vertikalen Aushöhlungen
führt.
Die vergrabene Oxidschicht wirkt für den Vorgang als Ätzstopp
so dass die Dicke der Siliziumschicht der Oberseite die Dicke der verbleibenden
Membran festlegt.
- 6) Die freigelegten Bereiche der vergrabenen Oxidschicht werden
durch RIE, nasse Flusssäure (HF-Ätzung) oder
HF-Dampfätzung
entfernt. Dies stellt eine Berührung
zwischen den oberen und unteren Öffnungen
im Wafer sicher.
- 7) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampf-Abscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt
werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Glas- oder Pyrex-Wafer
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf den Wafer mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etch (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren mit einer Tiefe von 1 μm bis 50 μm führt.
- 4) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet
und ein Muster, das die Membran-Definitionen enthält, wird
durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
- 5) Der Wafer wird unter Verwendung von reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE)
oder Advanced Oxide Etching (AOE) Unter Verwendung eines induktiv gekoppelten
Plasmas (ICP) anisotrop geätzt,
was auf der Unterseite des Wafers zu vertikalen Aushöhlungen
führt.
Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges
definiert die Dicke der verbleibenden Membran aus Glas oder Pyrex
an der Oberseite des Wafers.
- 6) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampf-Abscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Wir
haben das Verfahren mit Glas nicht durchgeführt.
- b)
Beispiele für
Verfahrens-Rezepte für
lange Poren mit einem aus der Ebene der Oberfläche vorstehenden Rand unter
Verwendung von ICP und LPCVD für
die Oberflächenmodifikation
(11).
- 1) Ausgangssubstrat: Einkristall–Silizium-Wafer, Kristallorientierungs- <100>.
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etch (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren mit einer Tiefe von 1 μm bis 50 μm führt.
- 4) Die Siliziumoberfläche
wird unter Verwendung von chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (Low Pressure Chemical
Vapour Deposition [LPCVD]) oder plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung
(Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition [PECVD]) mit Siliziumnitrid
beschichtet.
- 5) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet
und ein Muster, das die die Membranen definierenden Öffnungen
im Siliziumnitrid enthält,
wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
- 6) Das Siliziumnitrid wird auf der Unterseite des Wafers unter
Verwendung der reaktiven Ionenätzung
(RIE) in den Bereichen weggeätzt,
die durch die Öffnungen
im Fotolack definiert sind.
- 7) Der Wafer wird anisotrop in einer KOH- oder TMAH-Losung geätzt, was
zu einer pyramidenförmigen Öffnung auf
der Unterseite des Wafers führt.
Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges definiert
die Dicke der verbleibenden Membran aus Silizium an der Oberseite
des Wafers. Alternativ kann eine Dotierung mit Bor verwendet werden,
um einen Atz-Stopp zu definieren, was zu einer besseren Steuerung
der Dicke führt.
- 8) RIE auf der Rückseite,
Entfernen des Siliziumnitrids auf der Rückseite des Wafers und Öffnen des
hinteren Endes der Öffnung.
- 9) RIE auf der Vorderseite, Entfernen der Siliziumnitrid-Maske
auf der Vorderseite, wodurch ein vorstehender Siliziumnitrid-Rand
an der Öffnung
zurückbleibt.
- 10) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt
werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Einkristall-Silizium-Wafer
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etch (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren mit einer Tiefe von 1 μm bis 50 μm führt..
- 4) Die Siliziumoberfläche
wird unter Verwendung von chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (LPCVD) oder plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung
(PECVD) mit Siliziumnitrid beschichtet.
- 5) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet
und ein Muster, das die die Membranen definierenden Öffnungen
im Siliziumnitrid enthält,
wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
- 6) Das Siliziumnitrid wird auf der Unterseite des Wafers unter
Verwendung der reaktiven Ionenätzung
(RIE) in den Bereichen weggeätzt,
die durch die Öffnungen
im Fotolack definiert sind.
- 7) Der Wafer wird unter Verwendung von reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE)
oder Advanced Silicon Etching (ASE) Unter Verwendung eines induktiv gekoppelten
Plasmas (ICP) anisotrop geätzt,
was zu einer zylindrischen Öffnung
auf der Unterseite des Wafers führt.
Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges
definiert die Dicke der verbleibenden Membran aus Silizium an der
Oberseite des Wafers.
- 8) RIE auf der Rückseite,
Entfernen der Siliziumnitrid-Maske auf der Rückseite des Wafers und Öffnen des
hinteren Endes der Öffnung.
- 9) RIE auf der Vorderseite, Entfernen des Siliziumnitrids auf
der Vorderseite, wodurch ein vorstehender Siliziumnitrid-Rand an
der Öffnung
zurückbleibt.
- 10) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt
werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Silizium auf einem
Isolator (SOI) mit einer vergrabenen Oxidschicht (buried Oxide layer),
die 1 μm
bis 50 μm
unter der oberen Oberfläche
liegt; Träger-Kristallorientierung <100>.
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas
(ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht
führt.
- 4) Die Siliziumoberfläche
wird unter Verwendung von chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (LPCVD) oder plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung
(PECVD) mit Siliziumnitrid beschichtet.
- 5) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet
und ein Muster, das die die Membranen definierenden Öffnungen
im Siliziumnitrid enthält,
wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
- 6) Das Siliziumnitrid wird auf der Unterseite des Wafers unter
Verwendung der reaktiven Ionenätzung
(RIE) in den Bereichen weggeätzt,
die durch die Öffnungen
im Fotolack definiert sind.
- 7) Der Wafer wird anisotrop in einer KOH- oder TMAH-Lösung geätzt, was
zu einer pyramidenförmigen Öffnung auf
der Unterseite des Wafers führt.
Die vergrabene Oxidschicht wirkt für den Vorgang als Ätzstopp
so dass die Dicke der Siliziumschicht der Oberseite die Dicke der
verbleibenden Membran festlegt.
- 8) Die freigelegten Bereiche der vergrabenen Oxidschicht werden
durch RIE, nasse Flusssäure (HF-Ätzung) oder
HF-Dampfätzung
entfernt. Dies stellt eine Berührung
zwischen den oberen und unteren Öffnungen
im Wafer sicher.
- 9) RIE auf der Rückseite,
Entfernen der Siliziumnitrid-Maske auf der Rückseite des Wafers und Öffnen des
hinteren Endes der Öffnung.
- 10) RIE auf der Vorderseite, Entfernen des Siliziumnitrids auf
der Vorderseite, wodurch ein vorstehender Siliziumnitrid-Rand an
der Öffnung
zurückbleibt.
- 11) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Alternativ
kann das Substrat mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt
werden:
- 1) Ausgangssubstrat: Silizium auf einem
Isolator (SOI) mit einer vergrabenen Oxidschicht (buried Oxide layer),
die 1 μm
bis 50 μm
unter der oberen Oberfläche
liegt.
- 2) Eine Oberfläche
des Siliziums wird mit einem Fotolack beschichtet und das Muster,
das die Stellen und die Durchmesser der Öffnungen enthält, wird
auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
- 3) Das Öffnungsmuster
wird auf das Silizium mit reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE) oder Advanced Silicone
Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas
(ICP) übertragen, was
zu tiefen vertikalen Poren bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht
führt.
- 4) Die Siliziumoberfläche
wird unter Verwendung von chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (LPCVD) oder plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung
(PECVD) mit Siliziumnitrid beschichtet.
- 5) Die gegenüberliegende
Seite des Wafers (die Unterseite) wird mit Fotolack beschichtet
und ein Muster, das die die Membranen definierenden Öffnungen
im Siliziumnitrid enthält,
wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
- 6) Das Siliziumnitrid wird auf der Unterseite des Wafers unter
Verwendung der reaktiven Ionenätzung
(RIE) in den Bereichen weggeätzt,
die durch die Öffnungen
im Fotolack definiert sind.
- 7) Der Wafer wird unter Verwendung von reaktiver Ionen-Tiefätzung (DRIE)
oder Advanced Silicon Etching (ASE) Unter Verwendung eines induktiv gekoppelten
Plasmas (ICP) anisotrop geätzt,
was auf der Unterseite des Wafers zu vertikalen Aushöhlungen
führt.
Die vergrabene Oxidschicht wirkt für den Vorgang als Ätzstopp
so dass die Dicke der Siliziumschicht der Oberseite die Dicke der verbleibenden
Membran festlegt.
- 8) Die freigelegten Bereiche der vergrabenen Oxidschicht werden
durch RIE, nasse Flusssäure (HF-Ätzung) oder
HF-Dampfätzung
entfernt. Dies stellt eine Berührung
zwischen den oberen und unteren Öffnungen
im Wafer sicher.
- 9) RIE auf der Rückseite,
Entfernen der Siliziumnitrid-Maske auf der Rückseite des Wafers und Öffnen des
hinteren Endes der Öffnung.
- 10) RIE auf der Vorderseite, Entfernen des Siliziumnitrids auf
der Vorderseite, wodurch ein vorstehender Siliziumnitrid-Rand an
der Öffnung
zurückbleibt.
- 11) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische
Oxidation, oder durch plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD)
oder durch LPCVD beschichtet.
-
Literaturangaben
-
- Mayer, M (2000). Screening for bioactive compounds:
Chip-based functional analysis of single ion channels & capillary electrochromatography
for immunoaffinity selection. Ph.D thesis, Lausanne.
- Neher, E (2001). Molecular biology meets microelectronics. Nature
Biotechnology 19:114.
- Penner, R (1995). A practical guide to patch clamping. In: Single-Channel
Recording. (Ed. E Neher) Plenum Press, New York, London.
- Rae, JL and Levis, RA (1992). Glass technology for patch clamp
electrodes. Methods Enzymol. 207:66-92.
- Simons, K and Toomre, D (2000). Lipid rafts and signal transduction.
Nature Reviews 1:31-41.
- Madou, M., "Fundamentals
of Microfabrication",
2nd Ed (December 2001) CRC Press; ISBN: 0849308267.
- Laermer F.; Schilp, A., "Method
of anisotropically etching silicon", Patent DE4241045 (also US5501893 , WO94/14187)
