CN100506969C - 测量细胞膜的电生理性质的基片和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及膜片钳中使用的基本上平面的基片，用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括有定义小孔的边缘的小孔，该边缘在与细胞膜接触时，适合形成吉欧姆隔离层。本发明还提供一种制造该基片的方法，和用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质的方法。

Description

测量细胞膜的电生理性质的基片和方法
技术领域
本发明通过建立一种电生理测量配置，其中的细胞膜形成包围测量电极的高电阻隔离层，使它能确定并监测流过细胞膜的电流，从而提供一种确定和/或监测含有离子通道结构的离子通道电生理性质的基片和方法，该离子通道结构通常含有如细胞的脂质膜结构。更具体说，本发明涉及一种基片和一种方法，用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜性质。该基片通常是用于研究细胞膜中电过程的设备的一部分，诸如用于研究生物膜中离子通道的膜片钳技术设备。
背景技术
引言
使膜片电绝缘并在电压箝位条件下研究该膜片中的离子通道的一般概念，见Neher、Sakmann、和Steinback(1978)的文章“TheExtracellular Patch Clamp，A Method For Resolving CurrentsThrough Individual Open Channels In Biological Membranes”，Pflueger Arch.375；219-278。已经发现，对着肌肉细胞膜挤压含有乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)的玻璃移液管，可以看到电流不连续的跳动，这些跳动可归因于Ach激活的离子通道的开关。但是，这些研究人员在他们的工作中，受如下事实的限制：玻璃移液管与膜之间隔离层的电阻(10-50MΩ)，比通道的电阻(10GΩ)小得多。从该隔离层产生的电噪声，与电阻成反比，因此电噪声大得足以遮蔽流过离子通道的电流，离子通道的导电率比Ach通道小得多。由于产生大的流过隔离层的电流，还阻止移液管中的电压箝位在与该液体不同的值上。
之后发现，通过用火对玻璃移液管抛光并对移液管内部吸气，可以在细胞表面获得非常高电阻(1到100GΩ)的隔离层，从而把噪声降低一个数量级，以致达到大多数要研究的生物通道都可以研究的程度，同时极大地扩展了这些研究能够进行的电压范围。这种改进的隔离层已经被称为“吉欧姆隔离层(“gigaseal”)”，而该种移液管被称为“膜片移液管(“patch pipette”)”。更详细的“吉欧姆隔离层”的说明，可见O.P.Hamill，A.Marty，E.Neher，B.Sakmann，和F.J.Sigworth(1981)的文章：“Improved patch-clamp techniques for highresolution current recordings from cells and cell-free membranepatches”，Pflueger Arch.391；85-100。由于他们发展膜片钳技术的工作，Neher和Sakmann获得1991年生物医学的Nobel奖。
离子通道是贯穿细胞膜的蛋白质，它促使无机离子跨越细胞膜的输运。离子通道参与种种过程，如产生并定时作用的电势、突触的传输、激素的分泌、肌肉的收缩等等。许多药剂通过离子通道的调节，产生它们特定的作用。例子包括：抗癫痫复合物，如苯妥英(phenytoin)和lamotrigine，这些药剂阻断与电压有关的脑组织中Na+通道；抗高血压药物，如心痛定(nifedipine)和硫氮卓酮(diltiazem)，这些药物阻断与电压有关的平滑肌细胞中Ca2+通道；和胰岛素释放刺激剂，如glibenclamide和甲磺丁脉(tolbutamide)，这些刺激剂阻断调整ATP的胰腺中的K+通道。除了化学上导致离子通道活动的调节外，膜片钳技术已经能使科学家操纵与电压有关的通道。这些技术包括调整膜片移液管中电极的极性和改变盐水的组分，节制液体溶液中自由离子的水平。
膜片钳技术
膜片钳技术代表生物和医学的主要发展，因为它能测量流过单个离子通道蛋白质的离子，还能研究单个离子通道响应药物剂量的活动。简单地说，在标准的膜片钳操作中，使用细的玻璃移液管(约0.5～2μm直径)。该膜片移液管的尖对着细胞膜表面挤压。移液管尖紧紧地封闭细胞膜，并隔离出受移液管管口限制的少量离子通道蛋白质种群。这些通道的活动能够被个别测量(“单通道记录”)，或者，可以使膜片破裂，能测量整个细胞膜的通道活动(“全细胞配置”)。通过在移液管中施加负压，使细胞膜破裂，能够为施行全细胞测量获得进入细胞内部的高导电性。
吉欧姆隔离层
如上所述，对单通道电流的膜片钳测量，一个重要的要求，是在细胞膜与玻璃微移液管尖之间建立高电阻的隔离层，以便限制离子在两个表面间的空间中移动。通常，要求超过1GΩ的电阻，因此，该物理接触区称为“吉欧姆隔离层”。
吉欧姆隔离层的形成，要求细胞膜与移液管玻璃彼此紧密靠近。因此，当组织中相邻细胞的距离，或培养的细胞与它们的基片的距离，一般在20-40nm的量级时(Neher，2001)，可以预测细胞膜与移液管玻璃之间的距离，应在
Figure C03808556D0008102831QIETU
(即10-10m)的范围。仍不清楚吉欧姆隔离层的物理化学性质。但，吉欧姆隔离层可以在细胞膜与各种玻璃之间形成，包括石英、硅化铝、和硅化硼(Rae与Levis，1992)，表明玻璃的特定化学组分不是关键。
细胞膜结构
细胞膜由磷脂双分子层构成，中间夹着糖蛋白，糖蛋白具有多种功能，包括作为各种试剂的受体。这些膜间糖蛋白通常包括肽和糖各占一半，从膜中伸出，进入细胞外的空间，形成包围磷脂双分子层的所谓“多糖-蛋白质复合物”层，多糖-蛋白质复合物层的高度为20到50nm，并建立与磷脂双分子层邻接的充满电解质的分隔室(见图1)。因此，多糖-蛋白质复合物形成亲水的并带负电荷的区域，构成细胞与它的水性环境之间的间隙。
细胞支架和多糖-蛋白质复合物
紧靠细胞膜下面是细胞支架、肌纤蛋白丝网、血影蛋白、联接蛋白、和多种其他大结构的分子。细胞支架的一种重要作用，是使某些整体膜蛋白与糖蛋白锚固在膜内固定位置上。但是，相信夹在膜间的糖蛋白在某些限度(在脂质微区或“筏”；评论见Simons和Toomre，2000)内，可以自由地在磷脂双分子层内作侧向移动。的确，这种排列已经被描述为“像蛋白质冰山在脂质海洋中”。
多糖-蛋白质复合物对吉欧姆隔离层形成的作用
在常规的膜片钳方法中，玻璃移液管尖(它的壁厚约100nm)与细胞的初始接触点，涉及多糖-蛋白质复合物。电阻的估计，由玻璃表面与脂质膜之间规定的间隙中包含的150mM电解质表示，由多糖-蛋白质复合物的高度(如20到40nm)，得到20-60MΩ。这一估计与在涂敷TEOS(Triethyloxysilane，三乙基氧化硅烷)型芯片的光滑表面石英的实验观察一致，该种TEOS型芯片照例产生的电阻在40MΩ量级(或仅及GΩ的4％)。在这种估计中，假定在脂质膜与近似柱形玻璃表面之间存在电解质，该柱形玻璃表面直径约1μm，长度约3-10μm。随后轻轻抽吸移液管(<20hPa)，进一步增加电阻，理想的情况下得到吉欧姆隔离层。吉欧姆隔离层的形成，可以在时间尺度0.1到10s上迅速发生，也可能是一拖长的过程，仅在若干次相继增加抽吸压力后完成。吉欧姆隔离层形成的时间过程，反映了糖蛋白通过在“液晶”磷脂双分子层中的侧向移动，从物理接触区(膜/移液管)被排除。换句话说，由于施加于移液管的负流体静压，对着玻璃表面(亲水的硅醇族)挤压磷脂双分子层(磷脂的亲水极头)，多糖-蛋白质复合物，即糖蛋白单元被挤出接触区。
但是，有时该电阻增加过程只前进至形成准吉欧姆隔离层(0.5到1GΩ)。按经验，此时向移液管施加大的(50-70mV；Penner，1995)负电势，可使最后的电阻增加，终止在吉欧姆隔离层上。就多糖-蛋白质复合物而言，后一种观察结果可以解释为，糖蛋白负的带电区被施加的负移液管电势沿侧向驱动而移动。作用在糖蛋白上的电场(E)强度，即从移液管腔lumen到包围液体的电场，可以考虑成：
E = x V = 70 mV 100 nm = 700.000 V / m
假定移液管尖的壁厚(x)100nm和施加于移液管的电势(V)是-70mV。
常规的移液管与平面基片的对比
近来在膜片钳方法中的发展，已经引进平面基片(如硅芯片)，取代常规的玻璃微移液管(如见WO 01/25769和Mayer，2000)。在平面硅基芯片与活细胞之间形成吉欧姆隔离层的尝试，被证明是有问题的(例如见Mayer，2000)。但是，在人造的不包含外部多糖-蛋白质复合物的磷脂小泡之间获得吉欧姆隔离层，已经取得成功。这一发现表明，在吉欧姆隔离层的形成过程中，多糖-蛋白质复合物起关键的重要作用。
因此，存在改进平面基片，使之适合用于细胞膜电生理的膜片钳研究的需求，该平面基片允许以含有多糖-蛋白质复合物的细胞膜形成吉欧姆隔离层。
发明内容
本发明提供一种优化的基片和方法，在细胞和细胞膜遭受影响的真实条件下，用于确定和/或监测流过含有结构，特别是含有多糖-蛋白质复合物的细胞膜结构的离子通道的电流。因此，使用本发明的基片和方法获得的数据，诸如，作为各种测试复合物对细胞膜的影响结果，使离子通道活动发生的变化，能够作为固有的而非人为地由测量系统引入的影响而值得信赖，并且能用作研究有关给定条件下，细胞膜的导电性或电容性的电生理现象的有效基础。
应当指出，当本说明书使用“细胞”或“细胞膜”的术语时，它通常依赖于前后文，可能使用任何另一个含有结构的离子通道，诸如另一个含脂质膜的离子通道，或含人造膜的离子通道。
如上所述，对单通道电流的膜片钳测量，一个重要的要求是在细胞膜与基片之间建立高电阻的吉欧姆隔离层。形成吉欧姆隔离层的关键因素，是细胞膜到基片的接近度，它又依赖于细胞膜与基片之间接触区的大小。
细胞膜与具有光滑圆形漏斗状小孔的平面硅芯片之间的物理接触区域(约1μm宽的接触缘；见图2右手侧的图)，比细胞膜与玻璃微移液管之间形成的(约100nm宽；见图2左手侧的图)大得多。该结果导致芯片中每单位面积的力比移液管配置显著降低，而在接触面积上夹在中间的糖蛋白数量变得更多，有效地预防磷脂双分子层与形成吉欧姆隔离层必不可少的基片表面之间要求的
Figure C03808556D0008102831QIETU
(埃)距离。
本发明通过提供一种平面基片(如硅基的芯片)，适合供细胞膜电生理性质的膜片钳研究，找到解决该问题的途径，该平面基片专用于提供缩减与细胞膜的接触面积，从而改进了吉欧姆隔离层的形成。
因此，本发明的第一方面，是提供一种基本上平的基片，用于包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质膜片钳分析，其中的基片包括小孔，该小孔有适合与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该边缘从基片凸出，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度，并用与基片相同的材料形成。
在一个优选实施例中，该基片是硅基的芯片。
现在的上下文中，术语吉欧姆隔离层，通常是指至少1G欧姆的隔离层，且该大小一般是隔离层的最低目标，但对某些种类型的大电流测量，用较低的值作为阈值已经足够。
“多糖-蛋白质复合物”，我们是指由肽和糖各占一半建立的层，从细胞膜的磷脂双分子层中的糖蛋白伸出，进入细胞外的空间。
最好是，该边缘从基片伸出至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、或至少100nm。
有利的做法是，该边缘的形状能使基片与细胞膜间的物理接触面积成为最小，从而有助于多糖-蛋白质复合物的穿透并形成吉欧姆隔离层。
本领域熟练人员显然清楚，该边缘可以是任何合适的横截面形状。例如，边缘的壁可以逐渐变细或基本上平行的。同样，边缘的最上端可以取若干种形状，例如，它可以是圆拱形的、平坦的、或尖的。此外，边缘的凸出部可以基本上垂直于、倾斜于、或平行于基片的平面。平行伸出的边缘可以位于或靠近小孔的口，或者更深入地位于小孔内。一般说，边缘的宽度在10到200nm之间。
本领域熟练人员显然还清楚，该小孔的尺寸应当不允许完整的细胞通过该平面基片。
小孔的长度(即深度)，最好在2到30μm之间，例如在2到20μm、2到10μm、或5到10μm之间。
对最佳吉欧姆隔离层形成及全细胞建立的最佳小孔直径，与使用的特定细胞类型有关。小孔直径在0.5到2μm的范围较为有利。
本发明的基片通常是设备中使用的一个部件，以便实现脂质膜如细胞膜中离子传递特定电生理性质的测量。
该设备的设计，目的是提供在短时间内完成大量个别实验的装置。这是通过提供一种微系统实现的，该微系统有多个测试分隔室(即用于接触细胞的有边缘的小孔)，各有包含集成的测量电极的部位，还提供合适的测试样品源。每一测试分隔室可以包括：使细胞定位、建立吉欧姆隔离层、选择已经建立吉欧姆隔离层的部位的装置；测量的电极；和一个或多个参考电极。因而能够在各测试分隔室中施行独立的实验，和从中央控制单元例如计算机，控制所有实验的准备和测量。由于测试分隔室的小的尺寸，本发明能用仅仅很少量的载体液体和测试样品，即可完成测量。
本发明的基片能用任何适合晶片处理技术的材料制成，例如硅、塑料、纯石英、和其他的玻璃，如石英和PyrexTM，或掺杂了一种或多种选自如下掺杂物的石英：Be、Mg、Ca、B、Al、Ga、Ge、N、P、As。硅是优选的基片材料。
在本发明第一方面的一个优选实施例中，基片表面和/或小孔的壁，涂敷了十分适合用细胞膜建立隔离层的材料。这些材料包括：硅、塑料、纯石英、和其他的玻璃，如石英和PyrexTM，或掺杂了一种或多种选自如下掺杂物的石英：Be、Mg、Ca、B、Al、Ga、Ge、N、P、As及这些材料的氧化物。基片最好至少部分涂敷氧化硅。
在本发明第一方面的再一个优选实施例中，该平面基片有第一表面部分和反方向的第二表面部分，该第一表面部分至少有一部位适合夹持含有结构的离子通道，每一部位包括有边缘的小孔和有与之相关的测量电极，该基片载有一个或多个参考电极，测量电极与参考电极位于小孔每一部位上充满电解质的分隔室中，这些测量电极和相应的参考电极或参考电极，当在电解质中彼此接触并当它们之间被加上电势差时，这些电极能通过一个电极送出离子而另一个电极接收离子，在它们之间产生电流，每一部位适合在该部位夹持的含有结构的离子通道与该部位的表面部分之间，提供高电阻的隔离层，该已提供的隔离层，把含有结构的离子通道一侧上定义并在电解质中与测量电极接触的区域，与含有结构的离子通道另一侧上定义并在电解质中与相应的参考电极接触的区域分离，于是，流过位于基片每一侧的各电极间含有结构的离子通道的离子通道电流，能够被确定和/或被监测。
本发明第一方面优选实施例一般设计的例子，其中的基片包括整个电极(但不包括本发明有边缘的小孔的特征)，已在WO 01/25769中说明。
本发明的第二方面，是提供一种制造膜片钳中使用的基本上平面基片的方法，该基片用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有适合与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该方法包括如下步骤：
(i)提供基片模板；
(ii)在模板中形成小孔；和
(iii)形成围绕小孔的边缘，使该边缘从基片凸出，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度。
该基片最好用硅微制作技术“Madou，M.，2001”制造。
本领域熟练人员应当清楚，步骤(ii)和(iii)可以按顺序施行(即在时间上分离的步骤)，也可以同时施行。
有利的做法是，步骤(ii)包括使用感应耦合等离子(ICP)深离子蚀刻处理过程(Laermer F.And Schilp，A.，DE 4241045)来形成小孔。
当需要形成基本上垂直于基片平面的凸出部时，本方法包括一个中间步骤，该步骤有方向地和有选择地蚀刻基片前面的一侧，使基片前面一侧上的掩模层被除去，并进一步把前述凸出部的距离继续进入下面的基片。
由于硅比掩模材料有更快的蚀刻速率，结果是，掩模材料将留在小孔内侧，并从基片凸出。随后可以涂敷整个表面的涂层。
当需要形成基本上在基片平面内的凸出部时，本方法包括一个中间步骤，该步骤使用形成微孔的Inductive Coupled Plasma(ICP)蚀刻，或Advanced Silicon Etch(ASE)，这些方法的特征在于重复交替的蚀刻和钝化步骤，将能产生一些指向小孔口的凹坑。通过适当调整处理过程参数，能够在边缘凸出部平面中得到向里的凹坑。
还是一样，随后可以采用整个表面的涂层。
通常，在小孔和/或边缘形成之前或之后，本方法还包括涂敷基片表面(例如用氧化硅)。另外，步骤(iii)在基片涂敷的同时施行。
这样的涂敷可以用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)和/或用低压化学汽相淀积(LPCVD)。
本发明第一方面优选实施例，其中的基片包括集成电极，可按WO 01/25769中的说明制造)。
本发明的第三方面，是提供一种方法，用于分析含有多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，本方法包括如下步骤：
(i)制造膜片钳中使用的基本上平面的基片，用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有适合与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该方法包括如下步骤
(ii)提供基片模板；
(iii)在模板中形成小孔；和
(iv)形成从基片凸出的边缘，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度，并用与其中形成小孔的基片相同的材料形成。
(v)使细胞膜与基片小孔边缘接触，以便在细胞膜与基片间形成吉欧姆隔离层；和
(vi)测量细胞膜的电生理性质。
在本发明第三方面的一个优选实施例中，是提供一种建立全细胞测量配置的方法，用于确定和/或监测含有结构的一种或多种离子通道的一个或多个离子通道的电生理性质，所述方法包括如下步骤：
(i)提供按上述定义的基片；
(ii)在一个或多个小孔上提供载体液体，所述载体液体包含一种或多种含有结构的离子通道；
(iii)把至少一个含有结构的离子通道定位在对应数量的小孔上；
(iv)通过在与某一部位(即小孔)相关的测量电极及参考电极之间，持续施加定第一电势差，来检查该部位夹持的含有结构的离子通道与提供了高电阻隔离层的该部位表面部分(即边缘)之间的高电阻隔离层；监测流过所述测量电极与所述参考电极之间的第一电流；和把所述第一电流与预定的阈值电流比较，并且，如果该第一电流至多不过是预定的阈值电流，那么可以认可，在含有结构的离子通道与该部位表面部分之间，该部位具有可接受的隔离层；和
(v)在认可的部位建立全细胞配置。
由此，流过测量电极与参考电极之间含有结构的离子通道的离子通道第三电流，可以确定和/或监测。
通过或主动的或被动的装置，可以把溶液中含有结构(如细胞)的离子通道，引向某一部位。当该含有结构的离子通道与小孔边缘接触时，在该部位的接触表面形成高电阻隔离层(吉欧姆隔离层)，于是能够用电极测量离子通道的电生理性质。这种电生理性质可以是通过被吉欧姆隔离层包围的、含有结构的离子通道的膜部分的电流。
全细胞配置的获得，可以在与每一认可部位相关的测量电极及参考电极之间，施加一系列第二电势差脉冲；监测流过测量电极与参考电极之间的第二电流；和当所述第二电流超过预定阈值时，中断该第二电势差脉冲列，从而使最接近测量电极的含有结构的离子通道部分破裂。
另外，全细胞配置的获得，可以通过使最接近测量电极的部分含有结构的离子通道，与形成基片的小孔相互作用。
应当指出，在本发明的行文中，“全细胞配置”一词不仅指如下的配置，在该配置中，在测量部位，整个细胞与基片接触，并已经被刺破，或借助形成基片的小孔，已经能与细胞内部进行电接触，而且还指如下的配置，在该配置中，切去细胞膜的片段已经排列，使膜的外表面“面朝上”，向着将要施加的测试样品。
因为与某一部位相关的测量电极，可以是基片上多个电极之一，且含有结构的离子通道可以是溶液中许多通道之一，因此在基片上能够获得许多如此制备的测量构造。一种典型的的测量，包括向该构造添加专门的测试样品，为此，每一测量构造与其他的测量构造分离，避免测试样品的混合及各构造之间的电导。
使用中，向基片添加的细胞载体液体及细胞，可以按如下方式之一施行。在一个优选实施例中，测试分隔室可从上面进入，且能够借助调剂或移液系统，在每一测试分隔室上供应载体液体及细胞。诸如喷墨打印机头或气泡喷射打印机头等系统都可以使用。另一种可能，是nQUAD吸气调剂器或任何其他适合投配小剂量液体的调剂/移液装置。另外，载体液体及细胞，是作为一个整体施加在基片上的(例如，通过把含有细胞的载体液体倒在基片上，或把基片浸入该含有细胞的载体液体中)，据此向每一测试分隔室提供载体液体及细胞。因为载体液体及其后的测试样品体积小得仅及纳升，水的蒸发可能成为问题。因此，与特定的体积有关，基片上液体的处理，最好在高高湿度的气氛中进行。
在另一个实施例中，细胞直接在基片上培养，同时浸没在生长培养基中。在该最佳的情形中，细胞将在整个表面形成均匀的单层(与要生长的细胞类型有关)，但故意造成不宜细胞生长的区域除外。基片上细胞培养的成功，强烈依赖于基片材料。
在又一个实施例中，代替细胞的是使用一种具有合并离子通道的人造膜。这种人造膜可通过使脂质小块在小孔上定位，从脂质饱和溶液制作。该技术由Christopher Miller(1986)Ion ChannelReconstitution，Plenum 1986，p.577充分地说明。如果小孔尺寸合适，且在小孔两侧都有极性液体如水，能够在小孔上形成脂质双分子层。下一步是把蛋白质离子通道合并进该双分子层。这是通过在双分子层的一侧，输送具有合并离子通道的磷脂小泡达到的。通过例如渗透梯度，能够驱使这些小泡与双分子层融合，据此把离子通道合并进双分子层。
要获得细胞与玻璃移液管之间良好的接触，并从而建立细胞与移液管尖之间的吉欧姆隔离层，在现有技术中有充分说明。为了把细胞拖到移液管的尖部，以及为获得该吉欧姆隔离层而产生必需的接触，通常是抽吸移液管。但是，对本发明的平面基片，仅仅细胞膜与典型的超纯石英基片的接触，对细胞与表面的键合和建立吉欧姆隔离层已经足够。
细胞在基片中的小孔上的定位，可以通过电泳实现，电泳是电极的电场把带电细胞拉向电极。带负电的细胞将被拉向正电极，反之亦真。静电拉力也可用作一组电极的引导手段。另外，在测试分隔室内，亲水性材料覆盖除紧包围电极区域外的基片表面。因此，细胞只把它们自己键合在电极部位。可以同时运用这些方法的两种方法，或任选地与围绕电极的基片表面适当的几何形状结合，把下沉的细胞引向电极。
另外，细胞在基片中的小孔上的定位，能够通过电渗透实现。
如果运用抽吸，它把细胞拉向小孔，并建立细胞与小孔间的连接，产生把小孔内侧与溶液分离的吉欧姆隔离层。该吉欧姆隔离层可取任何形式，如圆形、椭圆形、或矩形。其中，基片包括总的电极，载体液体可使细胞膜与参考电极实现电接触。细胞可因抽吸而变形，而如果受控制，细胞延伸进入小孔的情形(但不通过小孔)，可能是需要的。
使用本发明的基片和方法，能够用电的方法测量离子通道在细胞膜中的活动(单通道记录)，另外，能使膜片破裂，实现整个细胞膜通道活动的测量(全细胞记录)。至少在三种方式(所有三种方式都是可行的，但不同的细胞可能与不同的途径工作得更好)中，能够获得高电导进入细胞内部，以进行全细胞测量。
(a)细胞膜能够通过抽吸从小孔一侧破裂。或者作为增强强度的短脉冲，或者作为增强强度的逐渐上升或步骤，施加低于大气压的压力。膜的破裂，由对给定电压测试脉冲的响应，出现强烈增加的容性电流尖峰检测(反映总的细胞膜电容)；
(b)通过施加电压脉冲，使膜破裂。或者作为增加强度(mV到V)和持续时间(μs到ms)的短脉冲，或者作为增强强度的逐渐上升或步骤，在电极间施加电压脉冲。形成通常细胞的膜的脂质，受电压脉冲的大电场强度的影响，据此使膜在电极的邻域分裂。膜的破裂，由对给定电压测试脉冲的响应，出现强烈增加的容性电流尖峰检测。
(c)膜的渗透化。应用形成小孔的物质(例如抗菌素，如制霉菌素或两性霉素B)，例如通过事先把这些物质淀积在部位上。与通过使膜破裂不同，由于渗透化分子的结合，膜电阻有选择地降低，得到经过电极对的对细胞电压有效的控制。跟随该结合的是逐渐下降的总电阻和逐渐增加的电容。
这里的基片包括多个各包含小孔的测试分隔室，可以个别地向每一测试分隔室添加测试样品，每一测试分隔室可以有不同的测试样品。这些方法可以用于添加载体液体，不用这些方法，载体液体是整体地加在基片上的。
在把细胞定位在测量配置中之后，能够测量若干种电生理性质，如流过离子通道的电流(电压钳)，或含有膜的离子通道的电容。在任一种情形下，应当提供适当的电子测量电路。本领域熟练人员应当能选择这种适当的测量电路。
本发明的第四方面，是提供实施按照权利要求24的方法的一套工具，该套工具包括膜片钳中使用的基本上平面的基片，和一种或多种培养基或反应物，该平面的基片用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有适合与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该边缘从基片凸出，凸出的高度超过多糖-蛋白质复合物的厚度，并用与基片相同的材料形成，该一种或多种培养基或反应物则用于进行膜片钳研究。
该套工具最好包括多种基片。
附图说明
本发明现在将参照叙述非限制的例子和图加以说明：
图1画出附着在膜片移液管上的细胞。在吉欧姆隔离层区，(以移液管尖与细胞膜之间接触点的阴影区域表示)多糖-蛋白质复合物的糖蛋白已经侧向移动，能使膜磷脂双分子层与移液管之间直接接触。
图2a和2b画出附着在移液管尖(图2a)和附着在基片(图2b)的细胞。可以认为，细胞膜与基片表面间的接触区，基片配置(图2b)大于移液管配置(图2a)。
图3对各预期的电阻组画出实际移液管电阻的变化；
图4画出Gigaseal(吉欧姆隔离层)成功率对移液管电阻；
图5画出全细胞建立(从成功的吉欧姆隔离层)的成功率对移液管电阻；
图6画出以不同小孔大小的吉欧姆隔离层形成的时间相关性，误差条表示与平均的标准偏差；
图7画出在小孔侧面有凸出边缘的平面基片上附着的细胞例子。吉欧姆隔离层的形成区受许多限制；
图8a、8b、8c、和8d画出四种包括凸出边缘的不同的小孔设计(模具处理)：垂直边缘(8a)；倾斜边缘(8b)；水平边缘(8c)；和嵌入边缘(8d)。
图9画出没有凸出边缘但有足够尖锐边缘(r＝25-100nm)的设计，以便把膜/基片接触区降低到50-200nm。小孔角(θ)是45到90度；
图10a和图10b是基片的扫描电子显微镜图，该基片用ICP和LPCVD作表面修改，在表面平面中有带凸出边缘的长孔；和
图11是基片的扫描电子显微镜图，该基片用ICP和LPCVD作表面修改，有从表面平面伸出的凸出边缘的长孔。
具体实施方式
举例
本发明在细胞膜中含有多糖-蛋白质复合物的活细胞膜片钳测量中，对吉欧姆隔离层的形成和全细胞的建立，识别了三种重要因素：
1.小孔的长度应足够长，以便阻止较有弹性的细胞在抽吸时穿过孔口移动。
2.对吉欧姆隔离层的形成和全细胞的建立，还存在最佳的小孔尺寸，该尺寸与细胞膜的弹性和要研究的细胞类型有关。
3.平面基片的小孔，当接近细胞表面时，应由能移动多糖-蛋白质复合物的边缘定义。
对各因素的讨论如下：
小孔的长度
由芯片的膜厚定义的小孔的长度(即深度)，也十分重要。低长宽比的设计(短的小孔)的缺点，是由于细胞固有的弹性，在使细胞定位及随后的抽吸时，细胞有穿过孔的趋势。研究表明，该问题可以通过用较长的小孔，通常超过2μm，有效地缓解(数据没有出示)。
最佳小孔尺寸的确定
为确定最佳的小孔尺寸，以便获得吉欧姆隔离层和全细胞配置，我们使用各种尺寸的膜片移液管，比较了标准膜片钳构造中获得它们的成功率。实验在附着并浸没于钠Ringer溶液中的盖玻片HEK293细胞上进行。用硅化硼毛细管(Hilgenberg，Cat No.1403573，L＝75mm，OD＝1.5mm，ID＝0.87mm，0.2mm的丝)制成的移液管。移液管电阻用作相对小孔尺寸的指示器；制造有预期电阻0.5、1、2、5、10和15MΩ的移液管。测量时，记下实际的移液管电阻，并对每一组求实际移液管电阻的平均，以及偏离平均的标准偏差，这些数据示于图3。
图4画出吉欧姆隔离层和全细胞的成功率，对移液管小孔电阻小孔尺寸的依赖关系。对每一组数据进行的实验数，画在数据点之上。结果表明，电阻5MΩ的移液管，对吉欧姆隔离层的形成和全细胞的建立，成功率最佳，而电阻在5直至15MΩ，成功率下降了约20％。移液管电阻降到5MΩ以下更加有害；电阻2MΩ的成功率比5MΩ低或50％，37％，而电阻1MΩ或以下将导致基本上没有吉欧姆隔离层的形成。
图5画出实验给出的形成全细胞的百分比，这些实验都成功地形成了吉欧姆隔离层(即不计入没有达到吉欧姆隔离层)。数据表明，虽然5MΩ移液管有最高的全细胞成功率，但其他的小孔尺寸只有略低的成功率。
移液管电阻对为达到GΩ所用时间的作用，也在考察之列(见图6)。结果表明，2MΩ的移液管，达到吉欧姆隔离层明显比5、10和15MΩ的长。5、10和15MΩ移液管相似的结果表明，在该范围内增加小孔尺寸，不影响达到吉欧姆隔离层所用时间。
这些结果清楚表明，吉欧姆隔离层形成的成功与移液管小孔的尺寸有关。5MΩ移液管有最佳的小孔尺寸，比它大的尺寸(即有较低电阻)，导致成功的吉欧姆隔离层形成显著下降。
虽然上面的实验是用常规的玻璃微移液管进行的，但结果可外推到膜片钳实验使用的基片。因此，这些结果表明，芯片系统中的小孔，一般说来，不能测量大于5MΩ移液管的小孔。但是，小于5MΩ的各种移液管，仍能很好地进行，不过它们明显坏些。因此，使芯片小孔略小于5MΩ移液管，将比把它加大害处更小。
改变移液管小孔尺寸，似乎对全细胞的形成没有太大影响。虽然全细胞的形成在5MΩ移液管中最高，但对2MΩ到15MΩ的移液管，成功率只有稍稍降低。
还观察到，移液管小孔大小对达到GΩ所用的时间有影响。5MΩ和15MΩ的移液管，用相同时间达到吉欧姆隔离层，但那些2MΩ的移液管，要用长2.5到3倍的时间。
用于实验的玻璃移液管的显微镜观察揭示，呈现5MΩ电阻的移液管的小孔尺寸，是0.5-1μm的量级。但是，预料最佳的小孔尺寸与细胞类型和细胞大小有关。
在常规的膜片钳实验中，当使用如HEK或CHO膜片培养细胞时，获得吉欧姆隔离层的成功率通常是高的，常常在90％附近。按照上面的考虑，使用模仿常规移液管尖小口的小孔几何形状，有望在平面芯片上达到相当的成功率。该几何形状包括侧面凸出0.5到1μm边缘的小孔。此外，小孔的长度(即深度)最好超过2μm。
平面膜片钳基片的制造
本发明制造平面膜片钳基片的优选方法，是通过用硅(Si)晶片微制作及处理方法，它能使Si表面涂敷上氧化硅，有效地形成高质量的玻璃表面。最好是，用ICP(Inductive Coupled Plasma，感应耦合等离子)和LPCVD(Low Pressure Chemical Vapour Deposition，低压化学汽相淀积)制成长孔和表面修改。具有凸出边缘的长的小孔，可以用IPC制作小孔，和用RIE(Reaction Ion Etch，反应离子蚀刻)形成凸出边缘，结合LPCVD进行表面修改。
(a)例，在用ICP和LPCVD作表面修改的平面表面中，制作有凸出边缘的长小孔的方法(图10a和图10b)。
1.开始的基片：单晶硅晶片，结晶方向<100>。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的有深度1-50μm的垂直孔。
4.在硅表面涂敷蚀刻掩模，该掩模应能耐受KOH或TMAH溶液。举例说，它可以是氧化硅或氮化硅。
5.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有定义氮化硅中开孔的膜片的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
6.在晶片的下侧，用适当的图形转印工艺，按光致抗蚀剂中开孔定义的区域把晶片蚀刻掉。该适当的图形转印工艺，举例说，可以是Reaction Ion Etch(RIE，反应离子蚀刻)。
7.在KOH或TMAH溶液中，晶片的蚀刻是各向异性的，在晶片下侧产生金字塔形开孔。蚀刻的时间定义晶片上侧剩余硅膜片的厚度。另外，可以用硼掺杂定义蚀刻的终止，可以给出较好的厚度控制。
8.有选择地除去硅基片上的蚀刻掩模。
9.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：单晶硅晶片。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的有深度1-50μm的垂直孔。
4.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有膜片定义的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
5.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，对基片进行各向异性蚀刻，在晶片下侧得到柱状开孔。蚀刻时间定义了晶片上侧剩余硅膜片的厚度。
6.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：有埋设氧化层的隔离物上的硅，氧化层在上表面以下1-50μm处，载体晶体取向<100>。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的垂直孔，深度直至埋设的氧化层。
4.在硅表面涂敷蚀刻掩模，该掩模应能耐受KOH或TMAH溶液。举例说，它可以是氧化硅或氮化硅。
5.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有定义氮化硅中开孔的膜片的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
6.在晶片的下侧，用适当的图形转印工艺，按光致抗蚀剂中开孔定义的区域把晶片蚀刻掉。该适当的图形转印工艺，举例说，可以是Reaction Ion Etch(RIE，反应离子蚀刻)。
7.在KOH或TMAH溶液中，晶片的蚀刻是各向异性的，在晶片下侧产生金字塔形开孔。埋设的氧化层将用作该过程蚀刻的终止，因此，硅层上侧的厚度，定义了剩余膜片的厚度。
8.通过RIE、湿性氟化氢酸(HF)蚀刻、或HF蒸气蚀刻，除去埋设的氧化层的暴露区域。这样能保证晶片中上部与下部开孔之间的接触。
9.有选择地除去硅基片上的蚀刻掩模。
10.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：有埋设氧化层的隔离物上的硅，氧化层在上表面以下1-50μm处。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的垂直孔，深度直至埋设的氧化层。
4.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有膜片定义的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
5.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，对晶片进行各向异性蚀刻，在晶片下侧得到垂直空腔。埋设的氧化层将用作该过程蚀刻的终止，因此，硅层上侧的厚度，定义了剩余膜片的厚度。
6.通过RIE、湿性氟化氢酸(HF)蚀刻、或HF蒸气蚀刻，除去埋设的氧化层的暴露区域。这样能保证晶片中上部与下部开孔之间的接触。
7.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：玻璃或Pyrex晶片。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Oxide Etch(AOE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的有深度1-50μm的垂直孔。
4.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有膜片定义的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
5.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Oxide Etch(AOE，先进硅蚀刻)，对晶片进行各向异性蚀刻，在晶片下侧得到垂直空腔。蚀刻的时间定义晶片上部的玻璃或Pyrex剩余膜片的厚度。
6.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
我们不举出用玻璃晶片的制作工艺。
(b)例，在用ICP和LPCVD作表面修改的平面表面上，制作有伸出凸出边缘的长小孔的方法(图11)
1.开始的基片：单晶硅晶片，结晶方向<100>。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的有深度1-50μm的垂直孔。
4.用Low Pressure Chemical Vapour Deposition(LPCVD，低压化学汽相淀积)或Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition(PECVD，等离子增强化学汽相淀积)，在硅表面涂敷氮化硅。
5.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有定义氮化硅中开孔的膜片的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
6.在晶片的下侧，用Reaction Ion Etch(RIE，反应离子蚀刻)，按光致抗蚀剂中开孔定义的区域，把氮化硅蚀刻掉。
7.在KOH或TMAH溶液中，晶片的蚀刻是各向异性的，在晶片下侧产生金字塔形开孔。蚀刻的时间定义晶片上侧剩余硅膜片的厚度。另外，可以用硼掺杂定义蚀刻的终止，可以给出较好的厚度控制。
8.在后侧用RIE，除去基片后侧上的氮化硅掩模，并打开小孔的后端。
9.在前侧用RIE，除去基片前侧上的氮化硅，在开口上留下凸出的氮化硅边缘。
10.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：单晶硅晶片。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的有深度1-50μm的垂直孔。
4.用Low Pressure Chemical Vapour Deposition(LPCVD，低压化学汽相淀积)或Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition(PECVD，等离子增强化学汽相淀积)，在硅表面涂敷氮化硅。
5.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有定义氮化硅中开孔的膜片的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
6.在晶片的下侧，用Reaction Ion Etch(RIE，反应离子蚀刻)，按光致抗蚀剂中开孔定义的区域，把氮化硅蚀刻掉。
7.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，对晶片进行各向异性蚀刻，在晶片下侧产生柱形开孔。蚀刻的时间定义晶片上侧剩余硅膜片的厚度。
8.在后侧用RIE，除去基片后侧上的氮化硅掩模，并打开小孔的后端。
9.在前侧用RIE，除去基片前侧上的氮化硅，在开口上留下凸出的氮化硅边缘。
10.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：有埋设氧化层的隔离物上的硅(SOI)，氧化层在上表面以下1-50μm处，载体晶体取向<100>。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的垂直孔，深度直至埋设的氧化层。
4.用Low Pressure Chemical Vapour Deposition(LPCVD，低压化学汽相淀积)或Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition(PECVD，等离子增强化学汽相淀积)，在硅表面涂敷氮化硅。
5.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有定义氮化硅中开孔的膜片的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
6.在晶片的下侧，用Reaction Ion Etch(RIE，反应离子蚀刻)，按光致抗蚀剂中开孔定义的区域，把氮化硅蚀刻掉。
7.在KOH或TMAH溶液中，晶片的蚀刻是各向异性的，在晶片下侧产生金字塔形开孔。埋设的氧化层将用作该过程蚀刻的终止，因此，硅层上侧的厚度，定义了剩余膜片的厚度。
8.通过RIE、湿性氟化氢酸(HF)蚀刻、或HF蒸气蚀刻，除去埋设的氧化层的暴露区域。这样能保证晶片中上部与下部开孔之间的接触。
9.在后侧用RIE，除去基片后侧上的氮化硅掩模，并打开小孔的后端。
10.在前侧用RIE，除去基片前侧上的氮化硅，在开口上留下凸出的氮化硅边缘。
11.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
另外，基片可以通过如下工艺制作：
1.开始的基片：有埋设氧化层的隔离物上的硅(SOI)，氧化层在上表面以下1-50μm处。
2.硅的一个表面涂敷光致抗蚀剂，并把含有小孔位置及直径的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
3.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，把小孔图形转印到硅上，得到深的垂直孔，深度直至埋设的氧化层。
4.用Low Pressure Chemical Vapour Deposition(LPCVD，低压化学汽相淀积)或Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition(PECVD，等离子增强化学汽相淀积)，在硅表面涂敷氮化硅。
5.晶片相反一侧(下侧)涂敷光致抗蚀剂，并把含有定义氮化硅中开孔的膜片的图形，通过UV光曝光，转印到光致抗蚀剂上。
6.在晶片的下侧，用Reaction Ion Etch(RIE，反应离子蚀刻)，按光致抗蚀剂中开孔定义的区域，把氮化硅蚀刻掉。
7.用Deep Reactive Ion Etch(DRIE，深度反应离子蚀刻)或使用Inductive Coupled Plasma(ICP)的Advanced Silicon Etch(ASE，先进硅蚀刻)，对晶片进行各向异性蚀刻，在晶片下侧产生垂直空腔。埋设的氧化层将用作该过程蚀刻的终止，因此，硅层上侧的厚度，定义了剩余膜片的厚度。
8.通过RIE、湿性氟化氢酸(HF)蚀刻、或HF蒸气蚀刻，除去埋设的氧化层的暴露区域。这样能保证晶片中上部与下部开孔之间的接触。
9.在后侧用RIE，除去基片后侧上的氮化硅掩模，并打开小孔的后端。
10.在前侧用RIE，除去基片前侧上的氮化硅，在开口上留下凸出的氮化硅边缘。
11.或者用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)的热氧化，或者用LPVCD，在硅上涂敷氧化硅。
参考文献
Mayer，M.(2000).Screening for bioactive compounds：Chip-based functional analysis of single ion channel & capillaryelectrochromatography for immunoaffinity selection.Ph.Dthesis，Lausanne.
Neher，E.(2001).Molecular biology meets microelectronics.Nature Biotechnology 19：114
Penner，R.(1995).A practical guide to patch clamping.In：Single-Channel Recording.(Ed.E.Neher)Plenum Press，New Pork，London.
Rae，JL and Levis，RA(1992).Glass technology for patch clampelectrodes.Methods Enzymol.207：66-92.
Simons，K and Toomre，D(2000).Lipid rafts and signaltransduction.Nature Reviews 1：31-41.
Madou，M.，“Fundamentals of Microfabrication”，2nd Ed(December 2001)CRC Press；ISBN：0849308267
LaermerF.，Schilp，A.，“Method of anisotropically etchingsilicon”，Patent DE 4241045(also US 5501893，WO 94/14187)

Claims (36)

1.一种膜片钳中使用的平面基片，用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有形成在基片中并适合在与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该边缘从基片凸出，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度。
2.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出，凸出的长度离平面基片表面至少20nm。
3.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少30nm。
4.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少40nm。
5.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少50nm。
6.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少60nm。
7.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少70nm。
8.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少80nm。
9.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少90nm。
10.按照权利要求1的平面基片，其中的边缘从基片凸出的长度，离平面基片表面至少100nm。
11.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中边缘的宽度，在10到200nm的范围。
12.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中小孔的长度，即深度，在2和30μm之间。
13.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中小孔的长度，即深度，在2和20μm之间。
14.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中小孔的长度，即深度，在2和10μm之间。
15.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中小孔的长度，即深度，在5和10μm之间。
16.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中小孔的直径，在0.5到2μm的范围。
17.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中的边缘垂直于基片平面伸出。
18.按照前面权利要求1到16任一项的基片，其中的边缘与基片平面成斜角。
19.按照前面权利要求1到16任一项的基片，其中的边缘平行于基片平面。
20.按照权利要求1的基片，其中的边缘由小孔的口定义，该口有5和100nm之间的曲率半径，具有45到90度的角度。
21.按照前面权利要求任一项的平面基片，其中的基片由硅、塑料、纯石英、或其他的玻璃，或掺杂了一种或多种选自如下掺杂物的石英：Be、Mg、Ca、B、Al、Ga、Ge、N、P、As制成。
22.按照权利要求21的平面基片，其中的基片由硅制成。
23.按照前面权利要求任一项的基片，其中的基片表面和/或小孔的壁，涂敷了第二种涂敷材料。
24.按照权利要求23的基片，其中的涂敷材料是硅、塑料、纯石英、其他的玻璃，掺杂了一种或多种选自如下掺杂物的石英：Be、Mg、Ca、B、Al、Ga、Ge、N、P、As，或它们的氧化物。
25.按照权利要求21的基片，其中的涂敷材料是氧化硅。
26.一种制造膜片钳中使用的平面基片的方法，该基片用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有适合在与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该方法包括如下步骤：
(i)提供基片模板；
(ii)在模板中形成小孔；和
(iii)形成在基片中的边缘，该边缘从基片凸出，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度。
27.按照权利要求26的方法，其中的基片是用硅微制作技术制造的。
28.按照权利要求26或27的方法，其中的步骤(ii)包括用感应耦合等离子(ICP)深反应离子蚀刻过程来形成小孔。
29.按照权利要求26的方法，还包括涂敷基片表面的步骤。
30.按照权利要求29的方法，其中的步骤(iii)是在涂敷基片的同时进行的。
31.按照权利要求29的方法，其中的步骤(iii)包括有方向地和有选择地蚀刻基片前侧的中间步骤，以除去基片前侧的掩模层，并进一步把已说明的凸出部的距离继续进入下面的基片。
32.按照权利要求29、30、或31的方法，其中的涂敷是用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)和/或用低压化学汽相淀积(LPCVD)淀积的。
33.按照权利要求32的方法，其中的涂层是用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)淀积的。
34.按照权利要求28的方法，其中的步骤(iii)包括用等离子增强化学汽相淀积(PECVD)，从淀积表面的涂层形成一边缘。
35.一种用于分析包含多糖-蛋白质复合物细胞膜的电生理性质的方法，该方法包括如下的步骤：
(i)制造膜片钳中使用的平面基片，用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有适合在与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的在基片中的边缘，该方法包括如下步骤：
(ii)提供基片模板；
(iii)在模板中形成小孔；和
(iv)形成边缘，该边缘从基片凸出，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度。
(v)使细胞膜与基片小孔边缘接触，以便在细胞膜与基片间形成吉欧姆隔离层；和
(vi)测量细胞膜的电生理性质。
36.一套用于施行权利要求35所述方法的工具，该套工具包括膜片钳中使用的平面基片，和一种或多种培养基或反应物，该平面基片用于分析包含多糖-蛋白质复合物的细胞膜的电生理性质，其中，该基片包括小孔，该小孔有形成在基片中并适合在与细胞膜接触时形成吉欧姆隔离层的边缘，该边缘从基片凸出，凸出的长度超过多糖-蛋白质复合物的厚度，而该一种或多种培养基或反应物则用于进行膜片钳研究。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2398635A (en) 2003-02-21 2004-08-25 Sophion Bioscience As A substrate providing a cell gigaseal for a patch clamp
WO2007138902A1 (ja) * 2006-05-25 2007-12-06 Panasonic Corporation 細胞電気生理センサ用チップとこれを用いた細胞電気生理センサおよび細胞電気生理センサ用チップの製造方法
EP1801586B1 (en) * 2002-08-21 2010-10-13 Cellectricon Ab System for obtaining and maintaining high-resistance seals in patch clamp recordings
DE60334580D1 (de) 2002-08-21 2010-11-25 Cellectricon Ab System zur Gewinnung und Erhaltung hochresistenter Verschlüsse bei Patch-Clamp-Aufzeichnungen
WO2007108773A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Agengy For Science, Technology And Research Device for analyzing the status of a particle
CN1987459B (zh) * 2006-12-14 2012-07-18 上海交通大学 生物传感器的制作方法
WO2010016193A1 (ja) * 2008-08-04 2010-02-11 パナソニック株式会社 細胞電気生理センサ用チップとこれを用いた細胞電気生理センサ、および細胞電気生理センサ用チップの製造方法
EP2422198B1 (en) * 2009-04-20 2013-09-25 Oxford Nanopore Technologies Limited Lipid bilayer sensor array
KR101119381B1 (ko) * 2009-06-18 2012-03-07 한국과학기술원 세포 특성 측정 장치 및 시스템과 이를 이용한 세포 특성 측정 방법
JP5159808B2 (ja) * 2010-02-09 2013-03-13 日本電信電話株式会社 脂質二分子膜基板
US20130136673A1 (en) 2010-07-09 2013-05-30 Sophion Bioscience A/S Chip assembly for use in a microfluidic analysis sytem
EP2681550B1 (en) 2011-03-01 2016-07-06 Sophion Bioscience A/S Handheld device for electrophysiological analysis
JP6037717B2 (ja) * 2011-12-20 2016-12-07 国立研究開発法人科学技術振興機構 プレーナーパッチクランプ装置、該装置用電極部及び細胞イオンチャンネル電流計測方法
DE102013007295B4 (de) * 2013-04-26 2015-06-25 Universität Rostock Elektrophysiologische Messanordnung und elektrophysiologisches Messverfahren
DE102014203280B4 (de) * 2014-02-24 2015-12-17 Cytocentrics Bioscience Gmbh Vorrichtung zur Bestimmung von Messgrößen an Membranen
JP7436991B2 (ja) 2021-02-24 2024-02-22 日本電信電話株式会社 脂質相分離ドメイン形成基板及びその製造方法、並びに、脂質相分離ドメイン形成用の基板

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1377464A (zh) * 1999-10-01 2002-10-30 索菲昂生物科学有限公司 用于测定和/或监视离子通道电生理学性质的基底及方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE29721359U1 (de) * 1997-12-03 1998-02-12 Itt Ind Gmbh Deutsche Vorrichtung zum Messen physiologischer Parameter
DE59801410D1 (de) * 1997-12-17 2001-10-11 Ecole Polytech Positionierung und elektrophysiologische charakterisierung einzelner zellen und rekonstituierter membransysteme auf mikrostrukturierten trägern
WO2000071742A2 (en) * 1999-05-21 2000-11-30 Hickman James J An apparatus for the analysis of the electrophysiology of neuronal cells and its use in high-throughput functional genomics
GB9930718D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Central Research Lab Ltd Apparatus for and method of making electrical measurements on objects

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1377464A (zh) * 1999-10-01 2002-10-30 索菲昂生物科学有限公司 用于测定和/或监视离子通道电生理学性质的基底及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
膜片钳技术及其应用. 杜育哲等.天津农学院学报，第8卷第2期. 2001
膜片钳技术及其应用. 杜育哲等.天津农学院学报，第8卷第2期. 2001 *

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