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QUERVERWEIS ZU ZUSAMMENHÄNGENDEN
ANMELDUNGEN
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Die
vorliegende Erfindung beansprucht den Zeitrang der US Provisional
Patentanmeldung Nr. 60/991 542 mit der Bezeichnung „Single
Side Automated Bilayer Formation”, die am 30. November 2007
angemeldet worden ist.
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ERKLÄRUNG ZU ÖFFENTLICH GEFÖRDERTER FORSCHUNG
ODER ENTWICKLUNG
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Die
US Regierung hat eine vollständig
bezahlte Lizenz an dieser Erfindung und das Recht, unter besonderen
Umständen
vom Patentinhaber zu verlangen, die Erfindung an andere unter angemessenen
Bedingungen, wie sie durch die Bedingungen des Vertrags FA9550-06-C-006,
der durch das US Air Force Office of Scientific Research gewährt worden ist,
zu lizenzieren.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Bilden von Lipiddoppelschichtmembranen
und insbesondere auf das Bilden planarer Lipiddoppelschichten über kleinen Öffnungen
zur Verwendung in Ionenkanalmesssystemen.
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2. Diskussion des Stands der
Technik
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Eine
planare Lipiddoppelschicht (Planar Lipid Bilayer; PLB), auch als
schwarze Lipidmembran (Black Lipid Membrane; BLM) bezeichnet, ist
eine aus Lipiden zusammengesetzte Membran, die eine Öffnung in
einer synthetischen Stützstruktur überspannen.
PLBs werden ausgiebig als gesteuerte Umgebungen für die Untersuchung
von Ionenkanalfunktionen verwendet. Ist eine PLB gebildet, können Ionenkanäle in die
PLB entweder durch spontanes Einsetzen von wasserlöslichen
Ionenkanälen
aus einer vorgehaltenen Lösung
oder durch das Einfügen
von Ionenkanälen
durch Fusion von Ionenkanälen
enthaltenden Liposomen eingesetzt werden. Ionenkanäle sind
Membranproteine, die eine kritische Rolle bei einer großen Anzahl
von physiologischen Prozessen spielen, einschließlich neuronaler Signalübertragung,
Muskelerregung, Hormonsekretion, Blutdruckregulierung, Elektrolytgleichgewicht
und Zelltod. Aufgrund ihrer Bedeutung in solch einem großen Bereich von
physiologischen Funktionen sind die detaillierte Funktion von Ionenkanälen wie
auch deren Interaktion mit Medikamenten und anderen Chemikalien
ein Gebiet intensiver wissenschaftlicher Forschung. Ionenkanäle werden
oft in ihrer natürlichen
zellulären Umgebung
untersucht, aber die PLB bietet ein weit mehr kontrolliertes und
zugängliches
Mittel zum Studium des Verhaltens eines weiten Bereichs von Ionenkanälen dar.
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In
Lipiddoppelschichten vorhandene Ionenkanäle sind auch als Komponenten
von Biosensoren nützlich.
Die Anwesenheit spezifischer Chemikalien und Änderungen in Umgebungsbedingungen,
wie etwa pH, Elektrolytkonzentration und Temperatur, beeinflussen
die Funktion des Ionenkanals. Durch Beobachten der Leitfähigkeit
eines Ionenkanals ist es möglich,
die Anwesenheit einer großen
Auswahl von chemischen Agentien zu detektieren.
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Öffnungen
im Nanometer- und Mikrometermaßstab,
die als „Nanoporen” bezeichnet
werden, bieten eine robuste Plattform für die Bildung von Lipiddoppelschichten
und die Messung von Ionenkanalströmen. Die auf den Nanoporen
gebildete kleine Fläche
der Doppelschichten führt
zu langen Doppelschichtlebensdauern, einer Unempfindlichkeit gegenüber Vibrationen
und einer sehr geringen Kapazität über die
Doppelschicht. Die Erschütterungsunempfindlichkeit
reduziert den Rauschpegel der Ionenkanalmessung durch Eliminieren
kohärenter
Geräuschquellen
aus der die Vorrichtung umgebenden Umgebung. Die kleine Fläche der
Doppelschicht minimiert das Stromrauschen aufgrund der Leitung von zeitvariierenden
Strömen über die
Doppelschicht selbst. In Glas und Quarzsubstraten hergestellte Nanoporen
haben den weiteren Vorteil, dass der hohe Widerstand und geringe
Leitfähigkeit
des Materials weiter das Stromrauschen der Ionenkanalmessung reduzieren.
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Die
Lipide in einer PLB sind typischerweise Phospholipide, aber Doppelschichten
können
ebenso aus einer großen
Vielzahl von Lipiden gebildet sein, einschließlich Glycerolipiden, Glycerophospholipiden,
Sphingolipiden, Saccharolipiden, Prenollipiden, Fetten, Fettacylen, Sterolen
und Polyketiden. Üblicherweise
sind PLBs über
eine einzige Öffnung (z.
B., 10–200 μm im Durchmesser)
in einem hydrophoben Film (z. B., DelrinTM,
Polysterol, Polysulfon, Polymethylmethacrylat) gebildet oder eine
Glaspatchpipette (z. B. 100 nm bis 5) gezogen. Eine PLB kann auch über eine
Glasnanoporenmembran (GNM) gebildet sein, die aus einer einzelnen
konisch geformten Pore (10 nm bis 2 μm Öffnungsradius) eingebettet
in einer dünnen
Glasmembran (~50 μm)
und dem Ende einer cyano-silanbeschichteten Glaskapillare besteht.
PLB sind auch über Öffnungen
in Silikon, Silikonnitrit und Silikonoxid, das auf einer Halbleiteroberfläche abgelegt
wurde, gebildet worden. Die Oberflächeneigenschaft der verwendeten
Substrate haben einen dramatischen Einfluss auf die Struktur der
Doppelschicht.
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Derzeit
gibt es eine Anzahl von Methoden zur PLB Bildung, die dem Fachmann
bekannt sind. Diese beinhalten: Apposition, Lackieren, Spitzentauchen
und Mikrofluidik, die im Folgenden näher erläutert werden. Bei der Appositionsmethode
wird ein hydrophober Film, der eine einzige Öffnung enthält, zwischen zwei Kompartimenten
einer Zelle befestigt. Die zwei Kompartimente werden dann mit einer
Elektrolytlösung
befüllt,
so dass die Höhe
der Lösungen unterhalb
der Öffnung
ist. Als nächstes
wird der hydrophobe Film durch Platzieren eines Tropfens Hexadekan
auf der Oberfläche
des Films in der Umgebung der Öffnung
vorbehandelt. Eine Mixtur von Lipid/Pentan wird tropfenweise auf
die Oberfläche
beider Elektrolytlösungen
platziert und dem Pentan Zeit gegeben zu verdunsten, worauf Lipid
Monolayer auf der Oberfläche
der Elektrolytlösungen
verbleiben. Eine Elektrolytlösung
wird dann über
die Öffnung
angehoben, wodurch ein Lipid Monolayer auf der Oberfläche des
hydrophoben Films und ein Blatt des Bilayers abgelegt wird, das
die Öffnung überspannt. Die
andere Elektrolytlösung
wird dann über
die Öffnung
angehoben, wodurch ein Lipid Monolayer auf der gegenüberliegenden
Seite des hydrophoben Films und das zweite Blatt der Doppelschicht
abgelegt wird, die die Öffnung überspannt.
Diese Technik ist gut bekannt, um lösungsfreie Doppelschichten herzustellen,
d. h., die PLB enthält
keine signifikanten Mengen eines organischen Lösungsmittels. Jedoch kann die
Apposition nicht in Systemen verwendet werden, bei denen nur eine
Seite eine Öffnung
zugänglich
ist, z. B., eine Glasnanoporenmembran oder eine Anordnung von Nanoporen
mit individuellen Ablesungen.
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Die
Spitzentauchmethode wird üblicherweise
verwendet, um planare Lipid-Doppelschichten über eine Patchpipette abzulegen
und beinhaltet zunächst
das Anordnen einer Patchpipettenspitze in einer Zelle, die eine
Elektrolytlösung
enthält.
Eine Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur
wird dann tropfenweise auf der Oberseite der Elektrolytlösung angeordnet
und dieser ermöglicht
sich auszubreiten, wodurch ein Lipid Monolayer über der Oberfläche gebildet
wird. Als nächstes
wird die Patchpipettenspitze aus der Elektrolytlösung herausgezogen, wodurch ein
Lipid Monolayer auf der Oberfläche
der Pipettenspitze, mit den hydrophilen Kopfgruppen in Richtung der
Wasserschicht auf der Glasoberfläche
orientiert abgelegt wird. Die Pipettenspitze wird dann durch die Lipid
Monolayer an der Luft/Wasserschnittstelle zurückgedrückt, um die zweiten Lipid Monolayer
auf der bereits existierenden Monolayer abzulegen und eine Lipiddoppelschicht
zu bilden. Von diesen Lipid-Doppelschichten
ist bekannt, dass diese einen kleinen Anteil eines organischen Lösungsmittels
enthalten. Da die Oberfläche
der Patchpipette hydrophil ist, erstreckt sich die PLB über die Öffnung und
um die Seite der Patchpipette. Diese ausgedehnte Doppelschicht ermöglicht den
Ionenkanälen
die gestützte Doppelschicht
am Glas in einer Region einzunehmen, die nicht über der Öffnung selbst ist. Ionenkanäle in dieser
Region neigen dazu, anomal kleine Leitfähigkeit aufgrund des hohen
Widerstands der Wasserschicht zwischen der gestützten Lipiddoppelschicht und
dem Glas auszubilden.
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Das
Lackierverfahren beinhaltet das Ausbreiten eines Lipids/organischen
Lösungsmittels über der
Oberfläche
eines hydrophoben Films, unter Verwendung einer Pipettenspitze,
um eine Lipiddoppelschicht über
einer Öffnung
in diesem Film anzulegen. Beim Lackierverfahren wird die Oberfläche des Films
zunächst
mit Lipid/organischen Lösungsmitteln „angesogen”. Üblicherweise
stellt das Ansaugen das Verwenden einer Pipettenspitze zum Ablegen
des Lipids/organischen Lösungsmittels
auf dem hydrophoben Film dar. Dieses Lipid/Lösungsmittel ist dann leicht über der
Oberfläche
des Films um die Öffnung ausgebreitet
und zum Trocknen belassen. Nach dem Trocknen wird der Film in einer
Zwei-Kompartimentenzelle,
die durch eine einzige Öffnung
getrennt sind, eingesetzt. Beide Seiten der Zelle werden dann mit
einer Elektrolytlösung
befüllt,
so dass die Höhe
jeder Lösung
oberhalb der Öffnung
liegt. Der Film wird dann ein zweites Mal in der Lösung angesogen.
Eine saubere Pipettenspitze wird dann verwendet, um das Lipid/Lösungsmittel
auf der Oberfläche
des Films über
der Öffnung
zu ziehen, wodurch spontan eine Lipid-Doppelschicht gebildet wird.
Das Lackierverfahren ist ein manueller Vorgang, der zum Ausführen beträchtliches
Geschick erfordert und nicht automatisiert werden kann. Zusätzlich enthält die PLB,
die durch Lackieren gebildet ist, eine große Menge Lösungsmittel auf Grund der Natur des
Vorgangs. Von einem hohen Lösungsmittelgehalt
in der PLB ist bekannt, dass er die Funktion der eingebetteten Ionenkanäle beeinflusst.
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PLBs
wurden auch in Mikrofluidvorrichtungen gebildet. Bei diesem Verfahren
wird beispielsweise eine Öffnung
mit einem Durchmesser von 100 μm
zwischen einer oberen Kammer und einem 0,5 mm hohen und 2 mm weiten
Kanal gebildet. Ein wässriger
Elektrolyt wird zur oberen Kammer hinzugegeben und eine Lipid/Lösungsmittelösung wird durch
den Kanal und durch die Öffnung
eingeströmt. Luft
wird durch den Kanal geführt,
um die Lipid/Lösungsmittellösung zu
entfernen, und ein wässriger Elektrolyt
wird in den Kanal eingeführt.
Die äußere Kammer
wird versiegelt, ein Druck wird angelegt und die PLB bildet sich
spontan über
der Öffnung.
Das Mikrofluid PLB Bildungsverfahren erfordert eine große Anzahl
von Schritten und es konnte nicht gezeigt werden, dass es bei Öffnungen
unterhalb 100 μm Durchmesser
funktioniert.
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Die
vorstehend erläuterten
Doppelschichtbildungsverfahren erfordern entweder deutliche Übung (z.
B. das Lackieren und das Eintauchen der Spitzen), große Porengrößen, viele
Schritte oder erfordern freien Zugang zu beiden Seiten der Öffnung, über der
die Doppelschicht gebildet wird. Derzeit gibt es kein verfügbares Verfahren
zum zuverlässigen und
automatischen Bilden von Lipid-Doppelschichten über einer Öffnung, wenn nur eine Seite
der Öffnung zugänglich ist.
Entsprechend besteht die Notwendigkeit im Stand der Technik für ein Verfahren
und ein System, in dem Lipid-Doppelschichten einfach und reproduzierbar
direkt angelegt werden können,
auch wenn der Zugang nur auf eine Seite der Öffnung beschränkt ist.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren
zur einseitigen planaren Lipid-Doppelschicht; PLB (Planar Lipid
Bilayer) Bildung über
Nanoporen. Die Membran bildende Vorrichtung der vorliegende Erfindung
weist eine erste Fluidkammer und eine zweite Fluidkammer auf, die sich
durch die Seitenwandung der ersten Fluidkammer erstreckt und von
dieser durch eine Trennwand separiert ist, die eine darin gebildete
Nanopore aufweist. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die zweite
Fluidkammer eine Glaskapillare, die eine Glasnanoporenmembran (GNM)
definiert. Optional kann die Vorrichtung einen Deckel zum selektiven Abdichten
der ersten Fluidkammer und einen automatischen Fluid Pegelregulator
zum selektiven Ändern
der Fluidpegel innerhalb der ersten Fluidkammer aufweisen.
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Die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um
entweder Lösungsmittel enthaltende
PLBs oder lösungsfreie
PLBs zu enthalten. Bei Verwendung wird eine Elektrolytlösung in
die erste und die zweite Fluidkammer eingefüllt. Eine Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur
wird dann tropfenweise auf der Oberseite der Elektrolytlösung in der
ersten Fluidkammer abgesetzt und dieser ermöglicht, sich über die
Oberfläche
der Elektrolytlösung auszubreiten,
um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht
zu bilden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird eine Lösungsmittel
enthaltende PLB unter Verwendung einer Lipid-/organischen Lösungsmittel-Mixtur erzeugt, die
aus 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) in einem gering
flüchtigen
organischen Lösungsmittel,
wie etwa Dekan, Hexadekan, Squalen oder anderen Alkanen besteht.
Der Pegel der Elektrolytlösung
in der ersten Fluidkammer wird dann im Hinblick auf die Trennwand
derart eingestellt, dass die Elektrolytlösung und die Lipid-/organische
Lösungsmittelschicht über die
Trennwand hinaus getragen wird, wodurch eine Lösungsmittel enthaltende PLB über der
Nanopore auf der Oberfläche
der Trennwand gebildet wird. Wird eine lösungsmittelfreie PLB gewünscht, besteht die
Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur
aus einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel mit hohem Dampfdruck,
wie etwa Pentan. Dem organischen Lösungsmittel mit hohem Dampfdruck
wird ermöglicht
sich zu verflüchtigen,
um eine Lipid Monoschicht auf der Oberfläche der Elektrolytlösung vor dem
Anpassen des Pegels des Elektrolyts in der ersten Fluidkammer zu
bilden. Der Pegel der Elektrolytlösung wird dann derart eingestellt,
dass die Elektrolytlösung
und die Lipid Monoschicht nach oben über die Trennwand getragen
werden, wodurch über
die Nanopore auf der Oberfläche
der Trennwand eine lösungsmittelfreie
PLB gebildet wird. Eine hydrophobe Beschichtung kann vor der PLB
Bildung auf der Oberfläche
der Trennwand hinzugefügt
werden, um eine zusätzliche
Stütze
für die
PLB bereitzustellen.
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Die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden,
um entweder lösungsmittelenthaltende
PLB oder lösungsmittelfreie
PLB unter Verwendung von Lipidvesikeln zu erzeugen. Bei Verwendung
wird eine Elektrolytlösung
in die erste und in die zweite Fluidkammer gegeben. Lipidvesikel
können
entweder bereits in der Elektrolytlösung zur ersten Kammer hinzugefügt sein
oder Lipidvesikel können
zu der Elektrolytlösung
hinzugegeben werden, nachdem die Elektrolytlösung zur ersten Kammer hinzugefügt worden
ist. Die Lipidvesikel werden dann spontan auf der Oberfläche des
Elektrolyts eine Lipid Monoschicht bilden. Ein Lösungsmittel mit einem geringen
oder einem kombinierten hohen und geringen Dampfdruck wird dann
auf der Oberfläche
der Elektrolytlösung
hinzugegeben, um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht auf der Oberfläche des
Elektrolyts zu bilden. Der Pegel der Elektrolytlösung in der ersten Fluidkammer
wird dann im Hinblick auf die Trennwand derart eingestellt, dass die
Elektrolytlösung
und die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht
vorbei an der Trennwand nach oben getragen werden, wodurch eine
Lösungsmittel enthaltende
PLB über
der Nanopore in der Oberfläche
der Trennwand gebildet wird. Wird eine lösungsmittelfreie PLB gewünscht, die
durch Verwenden durch Lipidvesikeln gebildet ist, können Lipidvesikel entweder
bereits in der zu der ersten Kammer hinzugegebenen Elektrolytlösung sein
oder Lipidvesikel können
zu der Elektrolytlösung
hinzugegeben werden, nachdem die Lösung zur ersten Kammer hinzugegeben
worden ist. Die Lipidvesikel werden dann spontan eine Lipid Monoschicht
auf der Oberfläche des
Elektrolyts bilden vor dem Anpassen des Pegels des Elektrolyts in
der ersten Fluidkammer. Ein Lösungsmittel
mit geringem Dampfdruck kann auf die Oberfläche der Trennwand vor dem Anpassen
des Pegels der Elektrolytlösung
gebracht werden. Der Pegel der Elektrolytlösung wird dann derart eingestellt,
dass die Elektrolytlösung
und die Lipid Monoschicht an der Trennwand vorbei nach oben getragen werden,
wodurch eine lösungsfreie
PLB über
der Nanopore in der Oberfläche
der Trennwand gebildet wird.
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Elektrolytpegel
können
manuell oder unter Verwendung des automatischen Fluidpegelregulators
eingestellt werden. Der automatische Fluidpegelregulator kann in
Form einer Pumpe oder einer Steuerung sein, die den Pegel der Elektrolytlösung in der
ersten Fluidkammer selektiv variiert, um das Ablegen einer PLB über der
Nanopore zu beeinflussen oder kann in der Form einer Kippeinrichtung
sein, die die erste Fluidkammer kippt, um das Ablegen einer PLB über der
Nanopore zu beeinflussen.
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Die
membranbildende Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist insbesondere
an die Verwendung in einem Ionenkanalmesssystem angepasst. Speziell
können
Ionenkanäle
oder Proteinporen in PLBs eingesetzt werden und das System kann
verwendet werden, um die Ionenkanalsensitivität zu analysieren. Bei Verwendung
legt eine Steuerung eine Vorspannung über die ersten und die zweiten Elektroden
an, die jeweils in der ersten und der zweiten Fluidkammer angeordnet
sind und der Strom zwischen den Elektroden wird gemessen. Optional
kann die membranbildende Vorrichtung verwendet werden, um mehrere
PLBs über
einer Anordnung von Nanoporen zu bilden. In dieser Ausstattung ist
das Messsystem eingerichtet zum separaten Aufzeichnen der Leitfähigkeit
von Ionenkanälen,
die in mehrere PLBs eingesetzt sind.
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Vorteilhafterweise
vermeiden die vorliegende Vorrichtung und das Verfahren die signifikante Lernkurve,
die mit dem Anwenden von Spitzentauchen und Membranlackierverfahren
verbunden sind und bietet ein zuverlässiges Mittel zum Bilden von
Lipid-Doppelschichten über
eine Öffnung,
wenn nur eine Seite der Öffnung
zugänglich
ist.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A–1C stellen
verschiedene Stadien der Membranbildung in einer membranbildenden Vorrichtung
der vorliegenden Erfindung dar;
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2A–2B stellen
verschiedene Fluidpegelstände
in der membranbildenden Vorrichtung der 1A–1C unter
Verwendung eines Kippverfahrens einer Fluidpegelsteuerung dar;
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3A–3C zeigen
eine teilweise geschnittene Ansicht einer Glasnanoporenmembran während unterschiedlicher
Stadien der Bildung einer lösungsmittelenthaltenden
planaren Lipid-Doppelschicht
der vorliegenden Erfindung;
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4A–4D stellen
eine teilweise geschnittene Ansicht einer Glasnanoporenmembran während verschiedener
Stadien der Bildung einer lösungsmittelfreien
planaren Lipid-Doppelschicht nach der vorliegenden Erfindung dar;
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5 ist
eine schematische Abbildung eines ionenleitenden Messsystems der
vorliegenden Erfindung, die die membranbildende Vorrichtung aus
den 1A–1C beinhaltet;
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6 ist
ein Graph, der die Erfassung eines organischen Moleküls in einer
Lösung
darstellt, unter Verwenden eines rekombinanten alpha-Haemolysin-Ionenkanals,
der in eine PLB eingesetzt ist, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Anmeldung gebildet ist;
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7 stellt
ein Ionenleitmesssystem der vorliegenden Erfindung einschließlich einer
Anordnung von vier Glasnanoporenmembranen dar; und
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8 stellt
elektrische Ablesungsergebnisse des Ionenleitfähigkeitsmesssystems aus 7 dar.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN
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Allgemein
betrifft die vorliegende Erfindung ein System und ein Verfahren
zum Bilden von planaren Lipid-Doppelschichten; PLBs (Planar Lipid
Bilayers) über Öffnungen
in Nanometer- und Mikrometermaßstab,
d. h. Nanoporen. Anfänglich
mit Bezug auf die 1A–1C wird
eine membranbildende Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur
Verwendung in der Bildung von einseitigen Doppelschichten allgemein
mit 20 bezeichnet. Die membranbildende Vorrichtung 20 weist
eine erste Fluidzelle oder Kammer 24 auf, die eingerichtet
ist um Fluid zurückzuhalten und
eine zweite Fluidkammer 28, die eingerichtet ist um Fluid
zurückzuhalten.
Die erste Fluidkammer 24 weist eine Bodenwandung 30 und
wenigstens eine Seitenwandung 32 auf, die wenigstens eine Öffnung 34 darin
beinhaltet, durch die die zweite Fluidkammer 28 verbunden
ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Fluidkammer eine
1,25 cm × 3
cm × 2
cm Teflon® Zelle
mit einer Gesamtkapazität
von ungefähr 7,5
cm3. Die zweite Fluidkammer 28 weist
auch wenigstens eine Seitenwand 40 und eine Trennwand 42 zum
Trennen der ersten Fluidkammer 24 von der zweiten Fluidkammer 28 auf.
In dem gezeigten bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die zweite
Fluidkammer 28 aus einer 1,6 mm O. D. Natronkalkglaskapillare
gebildet mit einem inneren Durchmesser von 0,75 mm, die an einem
Polykarbonatpipettenhalter 44, der von der DAGAN Corp.
hergestellt ist, befestigt. Die Trennwand 42 ist mit einer
Nanopore 46 ausgestattet, wie in den 3 und 4 gezeigt. Bevorzugt ist die Nanopore 46 zu
ungefähr
0,5 cm von der Bodenwandung 30 der ersten Fluidkammer 24 angeordnet.
Optional kann die Vorrichtung auch einen automatischen Fluidpegelregulator,
bezeichnet mit 50, zum selektiven Ändern des Fluidpegels innerhalb
der ersten Fluidkammer 24 aufweisen. Wenn, wie gezeigt,
eine Glaskapillare verwendet wird, definieren die Trennwand 42 und
die Nanopore 46 eine Glasnanoporenmembran (GNM). Es sollte
beachtet werden, dass, wenn ein GNM System verwendet wird, der Zugriff
auf nur eine Seite der Nanopore 46 beschränkt ist.
Mit „beschränkt” ist gemeint,
dass der Zugriff auf eine Seite der Nanopore 46 durch die
zweite Fluidkammer 28 im Wesentlichen zu Zwecken der Membranbildung über der
Pore 46 unzugänglich
ist.
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Bei
Verwendung wird eine erste Elektrolytlösung 54 in die erste
Fluidkammer 24 bis auf einen ersten Fluidpegel, der bei 58 gezeigt
ist, gegeben und die zweite Fluidkammer 28 wird mit einer
zweiten Elektrolytlösung 55 gefüllt. Nach
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
besteht die Elektrolytlösung 54 und
die Elektrolytlösung 55 aus
einer Lösung
von 1 M KCl in Wasser, gepuffert mit 10 mM Trispuffer und Salzsäure (HCL),
um die Lösung
auf einen pH von 7,4 zu bringen. Eine Lipid-/organische Lösungsmittel-Mixtur
wird dann tropfenweise auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 platziert
und diese ermöglicht,
sich über
die Oberfläche
der Elektrolytlösung 54 auszubreiten,
um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60,
wie in 1B gezeigt, zu bilden. Der Pegel
der Elektrolytlösung 54 in
der ersten Fluidkammer 24 wird dann im Hinblick auf die
Trennwand 42 eingestellt. In dem in den 1A–1C gezeigten Beispiel
wird zusätzlich
Elektrolytlösung 54 zur
ersten Fluidkammer 24 gegeben, um den Fluidpegel der Elektrolytlösung 54 und
die Lipid/Lösungsmittelschicht 60 vom
ersten Fluidpegel 58 auf einen zweiten Fluidpegel 64,
wie in 1C dargestellt, zu heben. Das
Hinzufügen
von Elektrolytlösung 54 in
die erste Fluidkammer 24 kann manuell ausgeführt werden,
etwa mit einer Spritze, oder mechanisch unter Verwendung des Fluidpegelregulators 50.
Nach einem Ausführungsbeispiel
weist der Fluidpegelregulator 50 eine Leitung in fluidischer
Kommunikation mit der ersten Fluidkammer 24 auf und ist
an eine Fluidquelle über
eine Pumpe und eine Steuerung zum automatischen Hinzufügen und/oder
Entfernen einer gewünschten
Menge von Elektrolytlösung 54 zu/aus dem
System angeschlossen. Die Steuerung kann programmiert sein, um ein
oder zwei Flüssigkeitspegel
innerhalb der ersten Fluidkammer 24 zu halten, wobei ein
Pegel oberhalb der Nanopore 46 und ein Pegel unterhalb
der Nanopore 46 ist.
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In
einem in den 2A und 2B dargestellten
Ausführungsbeispiel
weist ein Fluidpegelregulator 50' bevorzugt eine mechanische Vorrichtung zum
Kippen der Fluidkammer 24 auf. In dieser Ausgestaltung
wird der Pegel der Elektrolytlösung 54 relativ
zur Trennwand 42 und Nanopore 46 durch Kippen
der ersten Fluidkammer 24 in einem Winkel relativ zur Vertikalen
vor dem Hinzufügen
der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 geändert, die
erste Fluidkammer 24 dann in eine horizontale Position
gekippt, so dass der Pegel der Elektrolytlösung 24 und die Lipid-/organische
Lösungsmittelschicht 60 von
einem ersten Fluidpegel 58' unterhalb
der Trennwand 42 auf einen zweiten Fluidpegel 64' oberhalb der Trennwand 42 gehoben
wird, wenn die erste Fluidkammer 24 repositioniert wird.
Optional kann die Vorrichtung 20 einen Deckel 66 zum
selektiven Versiegeln der ersten Fluidkammer 24 und zum
Verhindern von Spritzern aufweisen.
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Mit
dieser Anordnung werden PLBs über
der Trennwand 42 durch Ändern
des Pegels der Elektrolytlösung 54 und
der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 gebildet,
wie im Folgenden näher
erläutert
wird. Obwohl das Membranbildungsverfahren der vorliegenden Erfindung
mit Bezug auf ein GNM System erläutert
wird, versteht es sich, dass die Vorrichtung 20 mit jeder Öffnung im
Nano- oder Mikrometermaßstab
in einem hydrophoben film oder einer synthetischen Stützstruktur
(z. B., Trennwand 42) verwendet werden kann, die eine geeignete
Hydrophobie oder Hydrophilie zum Aufrechterhalten einer Lipid-Monoschicht
oder Doppelschicht besitzt, wie etwa Silizium, Glas, Quarz, Siliziumnitrid
und Öffnungen
im hydrophoben Kunststoff (z. B., Teflon®, Polyethylen,
DelrinTM, Styropor, Polysulfon, usw.). Ohne Rücksicht
auf das Substrat wird jede Nanopore 46, die in der Trennwand 42 gebildet
ist, einen Durchmesser zwischen 10 nm und 500 μm und besonders bevorzugt zwischen
100 nm und 2 μm
haben. Das vorliegende Verfahren stellt bereit entweder: 1) die Bildung
gestützter
PLBs, in denen Monolayer von Lipiden auf einer hydrophoben Stützoberfläche abgelegt
sind, die zusammenschwirren, um eine Doppelschicht zu bilden, die
nur die Öffnung überspannt; oder
2) gestützte
PLBs, in denen eine Doppelschicht auf der Oberseite einer hydrophoben
Stützstruktur und
der Öffnung
liegt. Die Bildung beider Doppelschichtstrukturen hängt allein von
den Oberflächeneigenschaften
der Stützstruktur
ab und ist nicht durch das Doppelschichtbildungsverfahren der vorliegenden
Erfindung eingeschränkt.
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Die
Bildung einer lösungsmittelenthaltenden planaren
Lipid-Doppelschicht 76 wird nun mit Berg auf die 3A–3C erläutert. Wiederum
wird Elektrolytlösung 54 in
die erste Fluidkammer 24 zum Etablieren eines ersten Fluidpegels 58,
wie in 3A abgebildet, eingeführt. Eine
Lipid-/organische Lösungsmittellösung, z.
B., ungefähr
0,1 bis 1 μL
wird dann auf der Oberfläche
der Elektrolytlösung 54 eingeführt und
dieser ermöglicht,
sich über
die Oberfläche
der Elektrolytlösung 54 auszubreiten,
um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 zu
bilden. Bevorzugt besteht die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 aus
2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Lipid in einem
Lösungsmittel
mit geringer Flüchtigkeit,
wie etwa Dekan, Hexan, Hexadekan, Squalen, andere Alkane und Mixturen
davon. Besonders bevorzugt besteht die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 aus
DPhPC Lipid in 100% Dekan oder DPhPC Lipid in einer Mischung aus
99% Dekan und 1% Hexadekan. Zusätzliche
Elektrolytlösung
wird dann zur ersten Fluidkammer 24 hinzugefügt, um den
Pegel der Elektrolytlösung 54 und
die Lipid-/organische
Lösungsmittelschicht 60 vom
ersten Fluidpegel 58 unterhalb der Nanopore 46 auf
den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der Nanopore 46 zu heben.
Während
die Lipid-/organische
Lösungsmittelschicht 60 sich
entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt eine kleine Menge
des Lipids (durch 70 angezeigt) die Nanopore 46 in
der Trennwand 42 und zusätzliche Lipide versammeln sich
spontan in einer Monolayer 72 auf einer äußeren Oberfläche 74 der Trennwand 42 und
hinterlassen eine kleine Menge des Lösungsmittels 75 zwischen
den Lipidschichten 75 und 72, um eine organische
Lösungsmittel
enthaltende PLB 76 zu bilden, die über der Nanopore 46 hängt. Bevorzugt
erstreckt sich die äußere Oberfläche 76 in
einer Ebene, die von ungefähr
vertikal bis 60° von
vertikal reicht. Nach einem alternativen Verfahren wird das Elektrolyt 54 über die
Trennwand 42 gehoben vor dem Bilden der Lipid-/organischen
Lösungsmittelschicht 60,
die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 wird
bis unterhalb der Trennwand 42 abgesenkt und der Elektrolytpegel
wird wieder angehoben, um die Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 über die
Trennwand 42 zum spontanen Bilden von PLB 76 getragen.
Die Vorrichtung 20 ermöglicht,
dass eine oder mehrere PLBs 76 einheitlich reproduziert
werden durch einfaches Absenken der Elektrolytlösung 54 unterhalb
der äußeren Oberfläche 74 der
Trennwand 42 und dann Anheben der Elektrolytlösung 54 über die äußere Oberfläche 74 der
Trennwand 42.
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Wie
oben erläutert,
kann die PLB Bildung auch durch Kippen der ersten Fluidkammer 24 erreicht
werden, so dass die Elektrolytlösung 54 und die
Lipid-/organische Lösungsmittelschicht 60 von
einem ersten Fluidpegel 58' unterhalb
der Nanopore 46 auf einen zweiten Fluidpegel 64' oberhalb der
Nanopore 46 bewegt werden. Die PLB 76 kann wiederholt
gebrochen und wiedergebildet werden durch Kippen der ersten Fluidkammer 24,
um den Pegel der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 unterhalb
der Ebene der Trennwand 42 zu bringen und Zurückkippen
der ersten Fluidkammer 24 in eine Position, in der der
Pegel der Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60 oberhalb
der Trennwand 42 ist. Unabhängig des zur Fluidpegelanpassung
verwendeten Verfahrens kann die Trennwand 42 mit einer
Beschichtung 78 vor der Fluidpegelanpassung ausgestattet
sein, wie in den 4A–4C dargestellt, um
die Membranbildung und Retention zu unterstützen. Die Beschichtung 78 kann
in der Form einer hydrophoben Beschichtung und/oder eines Lösungsmittels
mit geringem Dampfdruck wie etwa Squalen oder Hexadekan, sein.
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An
diesem Punkt sollte erwähnt
sein, dass die Bildung von lösungsmittelenthaltenden
Lipid-Doppelschichten 76 auch
durch Verwenden von Lipidvesikeln erreicht werden kann. Bei dieser
Anordnung wird wiederum Elektrolytlösung 54 in die erste Fluidkammer 24 eingefüllt, um
einen ersten Fluidpegel 58 auszubilden. Lipidvesikel (nicht
gezeigt) werden dann zur Elektrolytlösung 54 hinzugegeben
und diesen ermöglicht,
spontan ein Lipid Monolayer auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubilden. Alternativ
können
die Lipidvesikel bereits in der Elektrolytlösung 54 enthalten
sein, bevor die Lösung
zur ersten Fluidkammer 24 gegeben wird. Bevorzugt bestehen
die Lipidvesikeln aus 2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Lipidvesikeln.
Ein Lösungsmittel
mit geringer Flüchtigkeit
wird dann auf die Oberfläche
der Elektrolytlösung
gegeben, um eine Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht entsprechend
der Schicht 60 zu bilden. Besonders bevorzugt werden dann
ein geringflüchtiges
Lösungsmittel
und ein hochflüchtiges
Lösungsmittel
zur Oberfläche
der Elektrolytlösung
hinzugegeben, um die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht zu bilden.
Zusätzliche
Elektrolytlösung
wird dann zuerst in Fluidkammer hinzugegeben, um den Pegel der Elektrolytlösung 54 und
die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht
vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb der Nanopore 46 auf
den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der Nanopore 46 zu
heben. Während
die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht
sich entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt ein kleiner
Anteil des Lipids, wie etwa bei 70 angezeigt, die Nanopore 46 in
der Trennwand 46 und weitere Lipide sammeln sich spontan
zu einer Monolayer 72 an einer äußeren Oberfläche der
Trennwand 42 und hinterlassen eine kleine Menge des Lösungsmittels 75 zwischen
den Lipidschichten 70 und 72, um eine organische
lösungsmittelenthaltende
PLB 76 zu bilden, die über der
Nanopore 46 hängt.
Bevorzugt erstreckt sich die äußere Oberfläche 74 in
einer Ebene, die von ungefähr
vertikal bis 60° von
vertikal reicht. Nach einem alternativen Verfahren wird das Elektrolyt 54 auf
oberhalb der Trennwand 42 vor dem Bilden der Lipid-/organischen
Lösungsmittelschicht
gehoben, die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht wird unterhalb
der Trennwand 42 abgesenkt und der Elektrolytpegel wird
wieder angehoben, um die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht über die
Trennwand 42 zum spontanen Bilden von PLB 76 zu
tragen. Die Vorrichtung 20 erlaubt, das ein oder mehrere
PLBs 76 einheitlich durch einfaches Absenken der Elektrolytlösung 54 unterhalb
der äußeren Oberfläche 74 der
Trennwand 42 und dann Anheben der Elektrolytlösung 54 auf
oberhalb der äußeren Oberfläche 74 der
Trennwand 42 reproduziert werden.
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Die
Bildung einer lösungsmittelfreien
PLB 76' wird
nun mit Bezug auf die 4A–4D erläutert. Zunächst wird
die Elektrolytlösung 54 in
die erste Fluidkammer 24 eingeführt, um einen ersten Fluidpegel 58 auszubilden.
Eine Lösung
eines Lipids in einem organischen Lösungsmittel mit einem hohen Dampfdruck
wird dann auf die Oberfläche
der Elektrolytlösung 54 gegeben
und diesem ermöglicht,
sich über
die Oberfläche
der Elektrolytlösung 54 auszubreiten,
um eine Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60', wie in 4B dargestellt,
zu bilden. Bevorzugt besteht die Lipid-/organischen Lösungsmittelschicht 60' aus Lipid in
Pentan. Das Lipid bildet eine Monoschicht an der Schnittstelle zwischen
dem organischen Lösungsmittel
und dem Elektrolyt 54. Der Lösungsmittelschicht 60' wird es dann
ermöglicht,
sich für
eine Zeitspanne, die ausreicht, um das Verdunsten des organischen
Lösungsmittels
mit hohem Dampfdruck (z. B. Pentan) zu ermöglichen, abzusetzen, wodurch
eine Lipid-Monoschicht 80, wie in 4C dargestellt,
verbleibt. Die Elektrolytlösung 54 wird
dann zur ersten Fluidkammer 24 gegeben, um den Pegel der
Elektrolytlösung 54 und
der Lipid Monoschicht 58 vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb
der Nanopore 46 auf den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb der
Nanopore 46 anzuheben. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel
ist eine Beschichtung 78 auf die Trennwand 42 vor
dem Ändern
des Fluidpegels innerhalb der ersten Fluidkammer 24 aufgebracht. Während die
Lipid-Monolayer 80 sich entlang der Trennwand 42 bewegt,
kreuzt eine kleine Menge Lipid, die mit 70' bezeichnet ist, die Nanopore 46 in
der Trennwand 42 und zusätzliche Lipide sammeln sich spontan
in einer Monoschicht 72' auf
der Beschichtung 78 der Trennwand 42, um eine
lösungsmittelfreie
PLB 76' zu
bilden, die über
der Nanopore 46 hängt.
Alternativ kann der PLB Bildungsvorgang durch Verwenden der Kippmethode
der oben erläuterten
Fluidpegelsteuerung abgeschlossen werden.
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In ähnlicher
Weise zu der oben beschriebenen im Hinblick auf das Potential zum
Bilden einer planaren Lipidschicht 70 unter Verwendung
von Lipidvesikeln, kann die lösungsmittelfreie
PLB ebenso unter Verwenden von Lipidvesikeln gebildet werden. In
dieser Situation würde
die Elektrolytlösung 54 zunächst in
die erste Fluidkammer 24 zum Ausbilden eines ersten Fluidpegels 58 eingebracht
werden. Lipidvesikel (nicht gezeigt) werden dann zur Elektrolytlösung 54 gegeben
und diesen ermöglicht,
spontan eine Lipid-Monolayer auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54 auszubilden.
Alternativ können
die Lipidvesikel bereits in der Elektrolytlösung 54 enthalten sein,
bevor die Lösung
zur ersten Fluidkammer 24 gegeben wird. Bevorzugt bestehen
die Lipidvesikel aus 2-Diphytanoyl-sn-Gycero-3-Phosphocholin (DPhPC)
Lipidvesikeln. Die Elektrolytlösung 54 wird dann
zur ersten Fluidkammer 24 gegeben, um den Pegel der Elektrolytlösung 54 und
den Lipid Monolayer vom ersten Fluidpegel 58 unterhalb
der Nanopore 46 auf den zweiten Fluidpegel 64 oberhalb
der Nanopore 46 zu heben. Wie zuvor ist eine Beschichtung 78 an
der Trennwand 42 vor dem Ändern des Fluidpegels innerhalb
der Fluidkammer 24 aufgebracht. Während sich die Lipid Monoschicht
entlang der Trennwand 42 bewegt, kreuzt eine kleine Menge
des Lipids, wie bei 70' angezeigt,
durch die Nanopore 46 in der Trennwand 42 und
zusätzliche
Lipide sammeln sich spontan in einem Monolayer 72' auf der Beschichtung 78 der
Trennwand 42 zum Bilden einer lösungsfreien PLB 76', die über die
Nanopore 46 hängt.
Alternativ kann der PLB Bildungsvorgang auch durch Verwenden der
Kippmethode der oben erläuterten
Fluidpegelsteuerung abgeschlossen werden.
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Durch
einseitige Doppelschichtbildung hergestellte PLBs sind zur Ionenkanal/Proteinporenrekonstitution
und/oder Liposomenfusion geeignet. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung 20 in einem Ionenkanalmesssystem,
das mit 100 in 5 bezeichnet ist, verwendet.
Insbesondere können,
wenn die PLB 76, 76' erst
einmal an Ort und Stelle sind, Ionenkanäle oder Proteinproben (nicht
gezeigt) in die PLB 76, 76' in einer im Stand der Technik
bekannten Weise eingesetzt werden und das System 100 kann zum
Analysieren der Ionenkanalsensitivität verwendet werden. Typischerweise
wird ein positiver Druck von 20 bis 300 mm Hg an den zweiten Fluidkanal 28 mittels
einer Drucksteuerung 102, die mit einem Halter 44 nach
PLB Bildung verbunden ist, angelegt, um Insertionen von Ionenkanälen in die über der
Nanopore 46 abgehängten
PLB zu induzieren, während bevorzugt
ein negativer oder positiver Gegendruck angelegt wird, um die Ionenkanalaktivität zu stoppen. Eine
erste Elektrode 104 wird in die zweite Fluidkammer 28 derart
eingesetzt, dass diese in die Elektrolytlösung 55 getaucht ist
und eine zweite Elektrode 105 wird in die Elektrolytlösung 54 der
ersten Fluidkammer 24 eingetaucht. Die erste und die zweite
Elektrode 104 und 105 sind mittels elektrischer
Leitungen 106 und 107 jeweils mit einer Steuerung 110 verbunden,
die eingerichtet ist, um eine konstante oder eine sich über die
Zeit verändernde
Vorspannung über
die erste und die zweite Elektrode 104 und 105 anzulegen
und den elektrischen Strom zwischen der ersten und der zweiten Elektrode 104 und 105 zu
messen. Die erste und die zweite Elektrode 104 und 105 sind bevorzugt
Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl) Elektroden, die durch Freilegen von
Silberdrähten
zu einer Bleichlösung
erzeugt sind, obwohl auch andere Arten von Elektroden verwendet
werden können
einschließlich
derjenigen, die aus Silber, Silberchlorid, Platin, Kohlenstoff,
Gold oder jeder anderen Verbindung, die im Stand der Technik bekannt
ist, zusammengesetzt sein kann.
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Bei
einer alternativen Ausgestaltung kann der Fluidpegelregulator 52 mit
der Steuerung 110 mittels einer Rückkopplungssteuerung, wie durch
die gepunktete Linie, die den Fluidpegelregulator 52 mit der
Steuereinheit 10 verbindet, verbunden sein. Dieses ermöglicht der
Lösungshöhe innerhalb
der Zelle 24 automatisch eingestellt zu werden basierend
auf der zwischen den Elektroden 104 und 105 über die Nanopore 46 in
der Trennwand 42 gemessenen Leitfähigkeit.
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In
einer Rückkopplungsausgestaltung
liegt die Höhe 55 der
Lösung
anfänglich
unterhalb der Trennwand 42 und der Nanopore 46.
Lipid/organisches Lösungsmittel 60 wird
geeignet abgelegt. Die Leitfähigkeit
zwischen den beiden Elektroden ist unmessbar gering, weil keine
elektrische Verbindung zwischen den beiden Elektroden 104 und 105 besteht
(offener Schaltkreis). In diesem Fall wird der Fluidpegelregulator 52 beginnen,
die Lösungshöhe der Elektrolytlösung automatisch
anzuheben. Während
die Lösungshöhe die Trennwand 42 überstreicht, über die
Nanopore 46, eine PLB ablegend, wird die Leitfähigkeit
zwischen den zwei Elektroden 104 und 105 messbar
werden, zwischen 1,1 pS und 2 fS, dieser Wert ist abhängig von
der Stärke
der Elektrolytlösung,
der Größe der Nanopore,
des verwendeten Lipids und des verwendeten organischen Lösungsmittels.
Wird eine messbare Leitfähigkeit
gemessen, wird die Steuerung fortfahren, die Elektrolytlösungshöhe für eine vorbestimmte
Volumenmenge anzuheben, so dass die Elektrolytoberfläche oberhalb
der Trennwand und der Nanopore liegt.
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In
einer zweiten Rückkopplungsausgestaltung
liegt die Lösungshöhe 55 oberhalb
der Trennwand 42 und der Nanopore 46. Lipid/organisches
Lösungsmittel
wird geeignet abgelegt 60. Die Leitfähigkeit zwischen den zwei Elektroden 104 und 105 ist messbar
zwischen 20 pS und 0,1 mS, abhängig
von der Stärke
der Elektrolytlösung
und der Größe der Nanopore.
Basierend auf den gemessenen Leitfähigkeitswert, wird der Fluidpegelregulator 52 mittels
des Feedbacks, beginnen, die Höhe
der Elektrolytlösungshöhe zu verringern.
Ist die Elektrolytlösung
unterhalb der Trennwand und der Nanopore gefallen, wie durch einen
Abfall in der Leitfähigkeit
(< 2 fS) zwischen
den zwei Elektroden gemessen, wird die Lösung wieder an der Trennwand
vorbei angehoben, die PLB über
der Nanopore abgelegt, wie durch ein Leitfähigkeitswert zwischen 0,1 pS
und 2 fS gemessen. Die beiden Ausgestaltungen der Rückkopplung, die
vorstehend beschrieben worden sind, können also wiederholt zusammen
verwendet werden, um automatisch über der Nanopore Doppelschichten neu
zu bilden, sollten diese brechen.
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6 stellt
die Veränderung
im gemessenen Strom aufgrund des Einsetzens eines rekombinanten αHL Ionenkanals
in eine PLB dar, die durch einseitige Doppelschichtbildung in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung gebildet worden ist. Der rekombinante αHL Kanal
unterscheidet sich vom Wildtyp αHL
(WT-αHL)
Kanal dadurch, dass der Methioninrest an Position 113 jedes
Monomers durch Lysin ersetzt ist. Nach der spontanen Insertion des
rekombinanten Ionenkanals, behält
der Ionenkanal seine ihm innewohnende Aktivität, wie durch die Detektion des
organischen Moleküls
Diethylen-triamin-penta(Methylenphosphorsäure)-heptanatriumsalz
(DTPMPA) dargestellt.
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Die
PLB Bildungseinrichtung 20 kann auch verwendet werden,
um mehrere PLB über
eine Anordnung von Nanoporen zu bilden. Beispielsweise wird, wie
in 7 abgebildet, eine membranbildende Vorrichtung 20' zum Bilden
einer Anordnung von Membranen in einem Ionenkanalmesssystem 100' verwendet.
Die Vorrichtung 20' ist
gezeigt mit vier GNMs 120–123, die durch eine
Seitenwandung 32' in eine
ersten Fluidkammer 24' eingesetzt
sind. Jede GNM 120–123 ist
innerhalb eines separaten Halters 44' eingesetzt, der das Anlegen eines
Gegendrucks an das Innere jeder GNM 120–123 ermöglicht.
Jede GNM 120–123 wird
mit einer Elektrolytlösung
gefüllt und
separate Elektroden (nicht gezeigt) werden in jede GNM 120–123 derart
eingesetzt, dass jede Elektrode in die Elektrolytlösung innerhalb
der jeweiligen GNM 120–123 eingetaucht
ist. Elektrolytlösung 54 wird
zur ersten Fluidkammer 24' bis
zu einem ersten Fluidpegel unterhalb aller GNMs, wie bei 125 angezeigt,
hinzugefügt.
Eine einzelne Elektrode (nicht gezeigt) wird dann in die Elektrolytlösung 54 der
ersten Fluidkammer 24' eingesetzt.
Die Elektroden innerhalb der GNMs 120–123 und die Referenzelektrode in
der ersten Fluidkammer 24' sind
an eine Steuerung angeschlossen, wie der in 5 dargestellten
Steuerung 110, die zum Anlegen einer separaten und eindeutigen
Vorspannung zwischen jeder der Elektroden innerhalb der GNM 120–123 und
der Referenzelektrode in der ersten Fluidkammer 24' eingerichtet ist.
Die Steuerung ist ebenso zum Messen des Stroms zwischen jeder der
Elektroden innerhalb der GNM 120–123 und der Referenzelektrode
der ersten Fluidkammer 24' fähig. PLBs
werden dann über
die Oberfläche
der GNM 120–123 unter
Verwendung des Membranbildungsverfahrens, das oben beschrieben ist,
gebildet. Insbesondere wird eine Lipid-/organischen Lösungsmittelmixtur
auf der Oberfläche
der Elektrolytlösung 54 abgelegt
und der Pegel der Elektrolytlösung
wird entlang der Anordnung von GNMs 120–123 gehoben, wodurch
sich spontan PBL über jeder
einzelnen GNM 120–123 ausbilden.
Ionenkanäle
werden dann in die die Nanopore 46 jeder GNM überspannende
Doppelschicht eingesetzt mittels Vesikelfusion oder spontane Insertionauslösung in
einer aus dem Stand der Technik bekannten Weise. Mit dieser Einrichtung
ist das Messsystem 100' fähig, die Leitfähigkeit
von in die PLB mehrerer GNMs eingesetzter Ionenkanäle separat
aufzuzeichnen.
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Ein
Beispiel von Ionenkanalaufzeichnungen unter Verwendung des Messsystems 100' der vorliegenden
Erfindung sind in 8 abgebildet. In diesem Beispiel
wurde die erste Fluidkammer 24 aus Teflon hergestellt und
hat Reservoirabmessungen von 35 mm Tiefe, 35 mm Breite und 25 mm
Länge.
GNMs 120–123 wurden
an einer breiten Fläche 32' der ersten
Fluidkammer 24' angeordnet,
wie in 7 angezeigt. Mit der Elektrolytlösung 54 unterhalb
des Pegels der GNMs 102–123 wurde eine kleine
Menge (0,5 bis 1 μl)
von 5 mg/ml DPhPC Lipid in Dekan auf der Oberfläche der Elektrolytlösung 54,
die ein M KCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer (PPB) (pH 7,2) aufweist,
abgegeben. Die Elektrolytlösungsoberfläche wurde
dann vorbei an jeder GNM 120–123 angehoben, wodurch
simultan unterstützte
Lipid-Doppelschichten
auf jeder GNM 120–123 abgelegt
wurden. Enthielten alle vier GNM 120–123 Doppelschichten, wurde
WT-αHL Monomer
zur Testzelle auf eine Endkonzentration von etwa 400 nM hinzugegeben.
Dem Hinzugeben von WT-αHL
folgend, wurde der Gegendruck jeder GNM 120–123 nahe
des jeweiligen Brechdrucks (vor dem Hinzufügen von WT-αHL bestimmt) erhöht. War
WT-αHL in
die PLB 76 über
der Nanopore 46 einer bestimmten GNM 120–123 insertiert,
wurde der Gegendruck dieser GNM 120–123 auf nahe dem
Auszugsdruck verringert. Kam WT-αHL
aus der Doppelschicht heraus, wurde der Druck wieder nahe des jeweiligen
Brechdrucks erhöht.
Dieser Vorgang wurde fortgesetzt, bis alle vier Doppelschichten,
die die Nanoporen in den GNM 120–123 überspannten,
einen bis einige wenige αHL Kanäle enthielten.
Jede GNM 120–123 wurde
mit der Elektrolytlösung
(1 M KCl, 10 mM PPB, pH 7,2) oder der Elektrolytlösung und
einer oder mehrerer zusätzlicher
Untersuchungssubstanzen befüllt.
Insbesondere enthielt GNM 120–123 50 μM Beta-Cyclodextrin, sulfatiertes
Natriumsalz (s7γCD) (CAS#3791-69-8);
GNM 121 enthielt 50 μM
Gamma-Cyclodextrin (γCD)
(CAS#17465-86-0); GNM 122 enthielt 50 μM s7γCD
und 50 μM γCD; und GNM 123 enthielt
nur die Elektrolytlösung.
Eine Vorspannung von 40 mV wurde zwischen den internen Elektroden
jedes GNM 120–1123
und der Referenzelektrode in der ersten Fluidkammer 23' angelegt. Die
separaten Aufzeichnungen der elektrischen Ströme durch die Ionenkanäle, in denen
PLBs jeder der vier GNMs 1120–123 sind
diejenigen, die in 8 gezeigt sind.
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Es
versteht sich, dass die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden
Erfindung zuverlässige
Mittel zum Bilden von Lipid-Doppelschichten über einer Öffnung bereitstellt, wenn nur
eine Seite der Öffnung
zugänglich
ist. Vorteilhaft vermeiden die vorliegende Vorrichtung und das Verfahren
die signifikante Lernkurve, die mit dem Verwenden von Spitzentauchen
und Membranlackierungstechniken assoziiert sind. Obwohl mit Bezug
auf bevorzugte Ausführungsbeispiele
der Erfindung beschrieben, versteht es sich selbstverständlich,
dass verschiedene Änderungen
und/oder Modifikationen an der Erfindung vorgenommen werden können, ohne
sich von deren Wesen zu lösen.
Als besondere Anmerkung sollte es verständlich sein, dass die offenbarten
Beschichtungen, die zum Bilden der verschiedenen Schichten benutzt
sind, zur Doppelschichtbildung mit einem Lösungsmittel wie auch lösungsmittelfrei
verwendet werden können.
Beispielsweise kann die Beschichtung bereits auf dem Nanoporenmembran
bestehen und darauf ein Lösungsmittel
geringer Flüchtigkeit,
wie etwa Hexadekan hinzugefügt
werden. Daher muss es erkannt werden, dass die offenbarte Beschichtung
tatsächlich
wenigstens eine Beschichtung umfasst, die selbst aus mehreren Ebenen
oder Unterschichten gebildet sein kann. Allgemein ist beabsichtigt,
dass die Erfindung ausschließlich
durch den Umfang der folgenden Ansprüche beschränkt ist.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Vorrichtung
zur einseitigen Doppelschichtbildung einschließlich einer ersten Fluidkammer
mit einer Seitenwandung und einer zweiten Fluidkammer, die sich
durch die Seitenwandung erstreckt. Eine Sperrwand trennt die erste
und die zweite Fluidkammer und weist eine Nanopore auf, über die
eine planare Lipiddoppelschicht (Planar Lipid Bilayer; PLB) gebildet
wird. Bei Benutzung wird ein Elektrolyt zur ersten und zweiten Fluidkammer
hinzugegeben und eine Lipid-/organische Lösungsmittelmixtur zur ersten
Fluidkammer hinzugefügt,
um eine Lipid-/organische Lösungsmittelschicht
zu bilden. Der Elektrolytfüllstand
innerhalb der ersten Fluidkammer wird derart eingestellt, dass die
Lipidschicht über
die Sperrwand angehoben wird und ein PLB gebildet wird. Elektrolytfüllstände können manuell
oder durch Verwenden eines Fluidfüllstandregulators mit oder
ohne Rückkopplungssteuerung
eingestellt werden. Die Vorrichtung kann in einer Nanoporenanordnung
sein und kann in einem Ionenkanalmesssystem beinhaltet sein.