DE69735601T2

DE69735601T2 - Anordnungen von unabhängig voneinander ansteuerbaren, gestützten flüssigbilayer-membranen und ihre anwendungsverfahren

Info

Publication number: DE69735601T2
Application number: DE69735601T
Authority: DE
Inventors: G. Steven Stanford BOXER; T. Jay Princeton GROVES; Nick Mountain View ULMAN
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2017-11-27
Also published as: ATE322010T1; EP0941474B1; WO1998023948A1; AU5462498A; EP0941474A1; EP0941474A4; US6228326B1; DE69735601D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen gestützte Flüssigbilayer und Verfahren, um sie auf ausgewählte Bereiche zu beschränken. Genauer gesagt betrifft die Erfindung mikroerzeugte Anordnungen von unabhängig voneinander ansteuerbaren, gestützten Flüssigbilayer-Membranen und ihre Anwendungen.
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Stand der Technik
In den vergangenen paar Jahren sind etliche Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren entwickelt worden, um die Durchmusterung von Tausenden, wenn nicht Millionen von Verbindungen auf eine gewünschte Aktivität oder Aktivitäten hin zu ermöglichen. Solche Verfahren basieren üblicherweise auf dem Nachweis der Bindung einer möglicherweise wirksamen Verbindung an einen Rezeptor. Während diese Bindungstests dabei wirksam sind, die Gesamtheit der Verbindungen einzuschränken, welche die gewünschte Aktivität aufweisen könnten, sind sie üblicherweise nicht gut geeignet, die Aktivität mit jedem Grad an Genauigkeit zu bewerten.
Die biologische Aktivität von möglicherweise aktiven Verbindungen wird üblicherweise unter Verwendung von weniger effizienten, aber aufschlussreicheren „Sekundär-Durchmusterungen" oder Tests bewertet, die typischerweise einen erheblichen Zeitaufwand eines ausgebildeten Technikers oder Wissenschaftlers benötigen. Zur Bewertung von Verbindungs-Kandidaten, welche integrale Membranproteine wie zum Beispiel Rezeptoren und Ionenkanäle beeinflussen, könnte die für eine Komponente benötige Zeit mehrere Stunden oder Tage in Anspruch nehmen, wenn der Test die Effekte auf die elektrophysiologische Aktivität einschließt. Demgemäß gibt es einen Bedarf für effizienter „Sekundär-Durchmusterungen" von Verbindungen, welche die Aktivität solcher integraler Membranproteine beeinflussen, um jene wenigen Verbindungen zu identifizieren, die eine weitere genauere Analyse rechtfertigen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung eine Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung. Die Vorrichtung umfasst ein Substrat, welches eine Oberfläche aufweist, die eine Vielzahl an unterschiedlichen Bilayerkompatiblen Oberflächenregionen definiert, welche durch eine oder mehrere Bilayer-Barrierenregionen getrennt sind, eine Lipid-Bilayerfläche, welche auf jeder der Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen getragen wird, und einen wässrigen Film, der sich zwischen jeder Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion und der entsprechenden Lipid-Bilayerfläche befindet, und eine große wässrige Phase, welche die Substratoberfläche und die Lipid-Bilayerflächen bedeckt. In einer allgemein bevorzugten Ausführungsform werden die Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen und die Bilayer-Barrieren-Oberflächenregionen aus unterschiedlichen Materialen gebildet.
Die Bilayer-kompatible Oberflächenregion kann aus jedem einer Vielzahl von Materialen gebildet werden, die solche Bilayer-kompatiblen Oberflächeneigenschaften aufweisen, einschließlich SiO₂, MgF₂, CaF₂ und Mica sowie eines Polymerfilms, wie etwa eines Polyacrylamid- oder Dextranfilms. SiO₂ ist ein besonders wirksames Material zur Bildung einer Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion.
Die Bilayer-Barrierenoberflächenregion kann aus jedem einer Vielzahl von Materialen gebildet werden, die solche Bilayer-Barrierenoberflächeneigenschaften aufweisen, einschließlich Gold, positivem Photoresist und Aluminiumoxid.
In einer allgemeinen Ausführungsform enthält die Lipid-Bilayerfläche mindestens ein Lipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin und Sphingomyelin.
In einer Ausführungsform enthält die Vorrichtung zwischen etwa 10 und etwa 100 unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen. In einer anderen Ausführungsform enthält die Vorrichtung mindestens etwa 2500 unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen. In noch einer weiteren Ausführungsform enthält die Vorrichtung mindestens etwa 25.000 unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen. In noch einer anderen Ausführungsform enthält die Vorrichtung mindestens etwa 2,5 Millionen unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen.
Die Bilayer-kompatible Oberflächenregionen sind in einer allgemeinen Ausführungsform durch Bilayer-Barrierenregionen voneinander getrennt, die zwischen etwa 1 μm und etwa 10 μm weit sind.
Die Lipid-Bilayerflächen auf unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen können unterschiedliche Zusammensetzungen aufweisen und können ferner ein ausgewähltes Biomolekül mit unterschiedlichen Flächen umfassen, die ein unterschiedliches Biomolekül wie einen Transmembranrezeptor oder Ionenkanal aufweisen. Das Biomolekül kann kovalent oder nicht-kovalent mit einem Lipidmolekül verbunden sein. Beispiele von nicht-kovalenten Interaktionen umfassen elektrostatische und spezifische molekulare Interaktionen wie zum Beispiel Biotin/Streptavidin-Interaktionen. Beispiele an Biomolekülen umfassen Proteine wie zum Beispiel Liganden und Rezeptoren sowie auch Polynucleotide und andere organische Verbindungen.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines ausgewählten Liganden in einem Gemisch von Liganden. Das Verfahren umfasst die Schritte des (i) Inkontaktbringens des Gemischs mit einer Biosensor-Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung, wie vorstehend beschrieben, und (ii) Bindungsnachweises des ausgewählten Liganden an Rezeptoren, die ihn spezifisch binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jede Bilayerfläche eine Art von Rezeptor oder Biomolekül und unterschiedliche Bilayerflächen enthalten unterschiedliche Arten von Rezeptoren oder Biomolekülen.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden klarer werden, wenn die folgende ausführliche Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt einen Tei einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung (SDAD) der Erfindung.
2A und 2B sind schematische Darstellungen des Effekts von photobleichenden, fluoreszierenden Reporterlipiden in den Lipidbilayern von fünf unterschiedlichen Regionen einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung der Erfindung.
3 zeit die Fluoreszenzintensität von zwei Regionen auf einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung, wobei jede einen Feld-induzierten Konzentrationsgradienten von geladenen, fluoreszierenden Reporter-Lipiden enthält.
4 zeigt den strukturellen Teil der Vorrichtung der Erfindung, die für die Verwendung in einem Biosensor geeignet ist.
5 zeigt den strukturellen Teil der Vorrichtung der Erfindung, geeignet zur Verwendung in der Auftrennung von Membran-assoziierten Molekülen nach Größe.
Genaue Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Die nachstehenden Begriffe haben, sofern nicht anders angezeigt, die folgenden Bedeutungen.
Der Begriff „wässrig" bezieht sich auf wasserlösliches, flüssiges Medium, das für Lipide nicht schädlich ist.
Ein „Rezeptor" ist ein Makromolekül, das in der Lage ist, mit einem Ligandenmolekül spezifisch zu interagieren. In Zellen sind Rezeptoren üblicherweise mit Lipid-Bilayermembranen verbunden, wie zum Beispiel den extrazellulären-, Golgi- oder Kernmembranen. Rezeptoren zum Einbau in Lipidflächen in vitro (z.B. gestützte Bilayer) können entweder von Zellen gereinigt, rekombinant exprimiert oder, im Falle von kleinen Rezeptoren, chemisch synthetisiert werden.
Ein „Ligand" ist ein Molekül, das im Stande ist, spezifisch an einen Rezeptor zu binden. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor ist üblicherweise durch eine hohe Bindungsaffinität gekennzeichnet, d.h. K_m>10⁵, und kann entweder als eine Veränderung in der Rezeptorfunktion nachgewiesen werden (z.B. die Öffnung eines Ionenkanals, der in Verbindung mit einem Teil des Rezeptors steht) oder als eine Veränderung in der unmittelbaren Umgebung des Rezeptors (z.B. Nachweis der Bindung durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz). Liganden zum Einbau in Lipidflächen in vitro (z.B. gestützte Bilayer) können entweder von Zellen gereinigt, rekombinant exprimiert oder, im Falle von kleinen Liganden, chemisch synthetisiert werden.
Bindung ist „spezifisch", wenn sie eher aus einer molekularen Interaktion zwischen einer Bindungsstelle auf einem Rezeptor und einem Liganden resultiert, als von „nicht-spezifischen" Kleben eines Proteins an einem anderen. In Fällen, wo der Ligand den Rezeptor in einer reversiblen Art bindet, kann die Bindungsspezifität durch Hinweg kompetitieren von markiertem Liganden mit einem Überschuss an nicht markiertem Liganden in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren bestätigt werden. Nicht spezifische Interaktionen können durch Einbeziehung eines Überschusses an Protein (z.B. Rinderserumalbumin) minimiert werden, welches weder für den Liganden noch den Rezeptor Bindungsstellen aufweist.
II. Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung
1 ist eine perspektivische Ansicht einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung (SDAD) 20 in Übereinstimmung mit der Erfindung. Die Vorrichtung wird aus einem Substrat 22 fabriziert, wie zum Beispiel einem oxidierten Silizium oder einem fusionierten Silicawafer. Die Substratdimensionen liegen üblicherweise zwischen etwa 0,5 cm bis etwa 5 cm pro Seite und etwa 0,1 mm bis etwa 1 cm Dicke.
Die Substratoberfläche enthält eine Vielzahl an unterschiedlichen Bilayerkompatiblen Oberflächeregionen 24, getrennt durch eine oder mehrere Bilayer-Barrierenregionen 26. Die Bilayer-Barrierenregion(en) 26 werden vorzugsweise aus einem Material 28 gebildet, das sich vom Material 22, welches die Bilayerkompatiblen Oberflächenregionen 24 bildet, unterscheidet.
Eine Lipid-Bilayerfläche 30 wird von jeder der Lipid-Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen 24 getragen. Zwischen jeder Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion 24 und der entsprechenden Bilayerfläche 30 liegt ein wässriger Film 32, welcher zwischen etwa 5 Å und 15 Å (üblicherweise etwa 10 Å) Dicke aufweist. Die Substratoberfläche und Lipidflächen werden von einer großen wässrigen Phase bedeckt.
Die Bilayer-Barrierenregionen können im Bezug auf die Bilayer-kompatible Oberfläche 24 erniedrigt, auf gleicher Ebene oder erhöht sein (wie bei 26 in 1 gezeigt). In Ausführungsformen, die erhöhte Barrieren aufweisen, kann die Höhe der Barrieren von mehreren zehn Angströms bis zu mehreren Mikrometern oder mehr betragen. Die Breite der Barrieren liegt üblicherweise zwischen etwa 100 nm und etwa 250 μm. Vorzugsweise liegt die Breite zwischen etwa 1 und 100 μm.
Gemäß den Ergebnissen der zur Unterstützung der Erfindung durchgeführten Experimente arbeiten die Lipid-Barrierenregionen nicht einfach durch mechanische oder physikalische Trennung der benachbarten Lipid-Bilayerregionen. Die Experimente deuten eher darauf hin, dass die Eigenschaften, welche einer Oberfläche ermöglichen, als eine Bilayer-Barrierenregion zu fungieren, chemische/elektrostatische Eigenschaften, die dem Material eigen sind, aus dem die Oberfläche besteht. Beispiele solcher chemischen/elektrostatischen Eigenschaften schließen Hydrophobie, dielektrische Durchlässigkeit, Leitfähigkeit und Oberflächen-Ladungsdichte ein.
Auf ähnliche Weise ist der Grad an „Bilayer-Kompatibilität" einer ausgewählten Oberfläche eher eine Funktion seiner intrinsischen Materialeigenschaften als seiner Form. Die Interaktionen zwischen Membranen und Oberflächen beinhalten elektrostatische und Hydrationskräfte; weit reichende van der Waals-Kräfte leisten einen Anziehungsbeitrag. In einer geeigneten Bilayer-kompatiblen Oberfläche hält ein energetisches Minimum die Bilayer-Membran zwischen etwa 5 Å und 15 Å (üblicherweise etwa 10 Å) von der stützenden Oberfläche weg, die von der stützenden Oberfläche durch einen wässrigen Film von entsprechender Dicke getrennt ist. Bilayer-kompatible Oberflächen sind üblicherweise hydrophil.
Funktionell kann die Eignung eines Materials zur Verwendung als eine Bilayer-Barrierenoberflächenregion oder eine Bilayer-kompatible Oberflächenregion durch die Materialleistung in einem einfachen „Fluoreszenzwiederkehr nach dem Photobleichen" („fluorescence recovery after photobleaching") (FRAP)-Test wie folgt bewertet werden:
Eine kleine Materialprobe (z.B. ein Teil, der eine ~ 1 cm² flache Oberfläche aufweist) wird, wie hierin beschrieben, gereinigt oder behandelt (z.B. Verwendung des Inkontaktbringens mit Argonplasma oder bei Materialien, die es tolerieren können, ein Waschen mit Säuren). Die Oberfläche wird dann gespült und eine ausgewählte Menge (z.B. 50 μl) einer Suspension aus Lipidvesikeln, die einen fluoreszierenden Marker beinhalten (hergestellt, wie in Material und Methoden beschrieben), wird auf die Oberfläche aufgetragen. Der Suspension wird dann ermöglicht, mit der Oberfläche für mehrere Minuten (z.B. 5 Minuten) in Kontakt zu bleiben. Die Oberfläche wird dann in ein wässriges Medium getaucht, um die Suspension abzuwaschen oder wesentlich zu verdünnen (z.B. durch Hinzufügen von 100 ml an destilliertem Wasser oder PBS) und die Oberfläche wird auf den Objekttisch eines Standard-Fluoreszenzmikroskops transferiert. Ein Teil der Oberfläche wird dann einem hellen Licht ausgesetzt (z.B. von einer 100 W-Quecksilberdampflampe), das ausreichend ist, um die fluoreszierenden Reste des dem Licht ausgesetzten Reporters zu bleichen (z.B. etwa 1 Minute, abhängig vom Fluorophor) und die Oberfläche wird unter dem Mikroskop für ~ 10 Minuten überwacht (abhängig von der Größe der gebleichten Stelle), um die Wiederkehr der Fluoreszenz zu bewerten.
Wenn der vorstehende Test unter Verwendung eines Materials durchgeführt wird, das im Stande ist, eine Bilayer-kompatible Oberfläche zu bilden, werden die Vesikel in der Suspension mit der Oberfläche fusioniert haben, um eine gestützte Bilayer zu bilden, die den fluoreszierenden Reporter enthält, und die örtlich begrenzte Aussetzung gegenüber photobleichendem Licht wird den Bereich der Bilayer gebleicht haben, welcher der Oberflächenregion entspricht, auf welche das photobleichende Licht gerichtet war. Während der Überwachungsperiode wird die Fluoreszenz im gebleichten Bereich der Bilayer aufgrund der Fluidität der gestützten Bilayer wiederkehren.
Wenn der vorstehende Test unter Verwendung eines Materials durchgeführt wird, welches eine Bilayer-Barrierenoberfläche bildet, werden die Vesikeln in der Suspension im Gegensatz dazu nicht mit der Oberfläche fusioniert haben, um eine flüssige Bilayer zu bilden. Unter solchen Bedingungen werden die Vesikel entweder während des Waschschrittes heruntergespült oder an die Oberfläche gebunden und immobilisiert bleiben. Wenn die Vesikel heruntergespült werden, wird wenig oder keine Fluoreszenz beobachtet werden. Wenn die Vesikel an der Oberfläche anheften, aber keine Flüssigbilayer bilden, wird die Fluoreszenz nach dem Photobleichen in der gebleichten Fläche nicht wiederkehren. In jedem Fall ist das Material ein effektives Bilayermaterial. Man wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass die Verwendung von Materialien, an welche sich die Vesikel nicht anheften, jenen vorzuziehen ist, welche nach dem vorstehenden FRAP-Test das immobiliserte Lipid- oder Membranmaterial enthalten.
Der vorstehende Test kann gleichzeitig mit etlichen unterschiedlichen Materialien durchgeführt werden, die der Fachmann der Erfindung greifbar hat. Auf diese Weise kann der Fachmann innerhalb weniger Stunden leicht bestimmen, ob ein bestimmtes Material bei der Bildung einer Oberfläche effektiv sein wird, die entweder Bilayer-kompatibel ist oder als eine Bilayer-Barriere dient.
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass im Wesentlichen alle zur Verwendung in der Mikrofabrikation einer Vorrichtung gemäß der Erfindung geeigneten Materialien, wenn sie gereinigt sind, entweder eine Bilayer-kompatible Oberflächenregion darstellen oder eine Bilayer-Barrierenoberflächenregion. Demgemäß ergibt die Anwendung des vorstehend beschriebenen, einfachen FRAP-Tests üblicherweise mit jedem getesteten Material ein Material, das in der Anwendung der Erfindung nützlich ist.
Beispielhafte Materialien, die Eigenschaften aufweisen, die sie als Lipid-Bilayerbarrieren geeignet machen, umfassen bestimmte Polymere (z.B. Photoresist) und verschiedene Metalle (z.B. Gold) und Mineralien (z.B. Aluminiumoxid). Ein Vorteil von Photoresist ist, dass es mit einer Photomaske relativ leicht gemustert werden kann und nicht leitend ist. Aluminiumoxid hat den Vorteil, dass es sowohl nicht leitend als auch wieder verwendbar ist und den meisten Reinigungsverfahren widersteht.
Beispielhafte Materialien, die Eigenschaften aufweisen, die sie als Bilayer-kompatible Oberflächenregionen geeignet machen, umfassen verschiedene Gläser, Siliziumoxide, einschließlich oxidiertes Silizium (SiO₂), MgF₂, CaF₂, Mica und verschiedene Polymerfilme wie zum Beispiel dünne Polyacrylamid- oder Dextranfilme (siehe z.B. Elender, et al., 1996; Khüner, et al., 1994). Beide Polymerfilmarten bilden eine geeignete Bilayer-kompatible Oberfläche, die hydriert ist, um einen wässrigen Film zwischen dem Polymerfilm und der gestützten Bilayermembran bereitzustellen.
Um eine Substratoberfläche zu bilden, die „Bilayer-kompatibel" ist, wird die Oberfläche üblicherweise gereinigt und/oder behandelt, um Oberflächenunreinheiten (Schmutz, Öle usw.) zu entfernen. Geeignete Behandlungen werden nachstehend mit Bezug auf die Herstellung oder Konstruktion einer Vorrichtung der Erfindung besprochen.
Die gestützte Bilayer selbst ist ein selbst-organisierendes, zwei-dimensionales Flüssigkeitssystem, welches üblicherweise aus zwei entgegengesetzten Blättern aus Vesikel-bildenden Lipidmolekülen besteht. Sie kann jedoch, wie nachstehend beschrieben, aus jedem geeigneten Membran-bildenden amphiphilen Material aufgebaut sein, einschließlich Proteinen und Nicht-Lipiden.
Die meisten Vesikel-bildenden Lipide sind langkettige Carbonsäuren wie zum Beispiel Glyceride, welche die Hydroxylgruppen des Glycerins verestert haben mit (i) (einer) Fettsäurekette(n) und (ii) einem geladenen oder polaren Rest wie zum Beispiel einer Phosphatestergruppe. Die Vesikel-bildenden Lipide sind vorzugsweise solche, die zwei Kohlenwasserstoffketten aufweisen, üblicherweise Acrylketten, und eine polare Kopfgruppe. Langkettige Carbonsäuren mit einer Phosphatgruppe oder Phospholipide sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders gut geeignet.
Es gibt eine Vielzahl an synthetischen, Vesikel-bildenden Lipiden und natürlich vorkommenden, Vesikel-bildenden Lipiden, einschließlich der Phospholipide wie zum Beispiel Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidsäure, Phosphatidylinosit (PI), Phosphatidylglycerin (PG) und Sphingomyelin, wobei die beiden Kohlenwasserstoffketten üblicherweise zwischen etwa 14-22 Kohlenstoffatome lang sind und unterschiedliche Ausmaße an Nichtsättigung aufweisen. Die vorstehend beschriebenen Lipide und Phospholipide, deren Acylketten unterschiedliche Ausmaße an Sättigung aufweisen, können im Handel erhalten werden oder können gemäß veröffentlichter Verfahren erzeugt werden. Andere geeignete Lipide schließen Glycolipide und Sterole wie Cholesterin ein.
Bevorzugte Diacyl-Kettenlipide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Diacylglycerin, Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerin (PG). Diese Lipide werden zur Verwendung als das vesikelbildende Lipid, die Haupt-Liposomenkomponente, und zur Verwendung in dem derivatisierten Lipid bevorzugt, wie nachstehend beschrieben. Alle diese Phospholipide und andere sind von spezialisierten Lieferanten von Phospholipiden (z.B. Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Alabama) sowie von allgemeinen Chemikalien-Lieferanten wie zum Beispiel Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhältlich.
Der wässrige Film und die große wässrige Phase können jede geeignete wässrige Lösung sein, wie zum Beispiel eine gepufferte Salzlösung (z.B. PBS). Die große Lösung kann z.B. durch Durchflussspülung mit einer Lösung, die eine unterschiedliche Zusammensetzung hat, leicht ausgetauscht werden (natürlich indem darauf geachtet wird, dass die gestützte Bilayer immer eingetaucht bleibt).
Wie vorstehend beschrieben, zeigt 1 ein Stützgitter, das aus einem Wafer eines Materials mikrofabriziert wurde, das die Bilayer-kompatiblen Oberflächen der Vorrichtung bildet. Eine Vorrichtung kann jedoch auch aus einem Wafer eines Materials mikrofabriziert werden, das die Bilayer-Barrierenoberflächenregionen der Vorrichtung bildet. Eine Ausführungsform einer solchen Vorrichtung wird in 4 gezeigt. Hier wird der strukturelle Teil 50 einer Vorrichtung der Erfindung durch Mikrofabrikation eines Wafers aus einem Bilayer-Barrierenmaterial 52 (z.B. Aluminiumoxid) erzeugt, um Regionen wie zum Beispiel Region 54 zu enthalten, die aus einem Bilayer-kompatiblen Material bestehen, wobei jede Region einer von einer Vielzahl von unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen entspricht, wie zum Beispiel Region 56. In einer Ausführungsform sind die Regionen 54 elektrisch leitfähig und sind mit Leitungen 58 verbunden, die dazu verwendet werden können, Änderungen im Membranpotential an der Oberfläche zu erfassen. Ein Beispiel eines elektrisch leitfähigen Bilayer-kompatiblen Materials ist ein Metall wie zum Beispiel Gold, überzogen mit einem dünnen Film an Siliziumoxid oder mit einem Polymermaterial, um die Oberfläche Bilayer-kompatibel zu machen. Der dünne Film von Siliziumoxid kann kapazitativen Strom wirksam leiten, obwohl er kein elektrischer Leiter ist.
Alternativ oder zusätzlich können Elektroden, die eine Bilayer-kompatible Oberfläche aufweisen, von Standard-dotierten (z.B. Bor-dotierten) Siliziumwafern erzeugt werden. Eine Lage an Siliziumoxid kann auf solchen Wafersubstraten gebildet werden, um eine Bilayer-kompatible Oberfläche zu bilden, unter der eine Halbleiter (dotiertes Silizium)-Elektrode liegt. Die Halbleiter-Elektrode kann natürlich wie gewünscht mit jedem einer Vielzahl von anderen Elementen gekoppelt sein, z.B. Halbleiter-Elementen im Substrat selbst oder in einem getrennten Chip, um die Prozessierung der Information von dem Abschnitt der Bilayermembran, das dieser Elektrode zugeordnet ist, zu erleichtern oder zu verstärken.
Etliche verschiedene Vorrichtungen sind in Übereinstimmung mit der Erfindung erzeugt worden. Sie schließen die folgenden ein (i) eine Vorrichtung, die eine 1 cm²-Anordnung von 2500 identischen, quadratischen 200 μm-Korralen oder Regionen enthält, (ii) eine Vorrichtung, die eine 1 cm²-Anordnung von 10.000 identischen quadratischen 100 μm-Regionen enthält, (iii) eine Vorrichtung, die eine 1 cm²-Anordnung von etwa 37.000 identischen quadratischen 50 μm-Regionen enthält, getrennt durch 2 μm-Barrieren aus Photoresist, und (iv) einer Vorrichtung, die eine 1 cm²-Anordnung von etwa 2,8 Millionen quadratischen 5 μm-Korralen oder Regionen, getrennt durch 1 μm breite Barrieren aus Photoresist, enthält.
Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung schließen Vorrichtungen ein, in welchen die Bilayer-Lipidflächen unterschiedliche Biomoleküle enthalten, wie zum Beispiel Rezeptor-Proteinmoleküle, Liganden-Proteinmoleküle oder andere Proteinmoleküle. Solche Vorrichtungen sind in Biosensoren besonders nützlich, sie werden im Anwendungsabschnitt der Beschreibung genauer beschreiben und werden, wie nachstehend beschrieben, durch Fusionierung von Proteoliposomen an die Bilayer-kompatible Oberfläche erzeugt.
Es wird anerkannt, dass Proteoliposomenvesikel an eine Glasoberfläche fusioniert werden können, um eine ebene gestützte Membran zu bilden (Brian und McConnell, 1984). Diese Technik ist in etlichen Situationen erfolgreich angewandt worden. In einem Beispiel wurde das H-2K^k-Protein in Ei-Phosphatidylcholin-Cholesterin-Vesikeln durch Detergens-Dialyse wiederhergestellt und die Vesikel wurden verwendet, um eine ebene Membran auf Glas zu bilden (Brian und McConnell. 1984). Die H-2K^k-enthaltende Membran war im Stande, eine spezifische cytotoxische Antwort hervorzurufen, wenn sie mit einer Zelle in Kontakt gebracht wurde.
Chan, et al., (1991) stellten fest, dass ein Glycosylphosphatidylinosit (GPI)-verankerter Membranrezeptor in ebenen Membranen, die aus Proteoliposomenfusion gebildet wurden, lateral beweglich ist und dass diese Beweglichkeit die Zelladhäsion and die Membran verstärkt. Andere Anwendungen setzten eine Kombination aus Vesikelfusion, Langmuir-Blodgett-Methodologie und derivatisierten Oberflächen ein, um gestützte Membranen zu erzeugen (Sui, et al., 1988; Plant, et al., 1995) Zusätzlich zum Einbau der Rezeptoren oder Ionenkanäle in die Bilayermembran kann die Bilayer mit jeder von etlichen Gruppen oder Verbindungen derivatisiert werden, um eine Oberfläche zu bilden, welche die gewünschten Eigenschaften aufweist. Zum Beispiel können die Liposomen einen Liganden enthalten, der durch Verbindung mit den Oberflächen-Lipidkomponenten an die Oberfläche des Lipids gebunden ist. Im Allgemeinen ist ein solcher Ligand an die polare Hauptgruppe eines Vesikel-bildenden Lipids gekoppelt. Beispielhafte Verfahren zum Erreichen solcher Kopplungen werden nachstehend beschrieben.
III. Konstruktion einer Oberflächendetektorvorrichtung mit unabhängig ansteuerbaren Lipid-Bilayerregionen
Die Oberflächendefektorvorrichtung der Erfindung kann unter Verwendung einer Kombination aus Mikrofabrikations- und Lipidvesikel-Technologien, z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben, bequem erzeugt werden.
A. Mikrofabrikation des gemusterten Stützgitters
Die Musterung des Substrats zur Erzeugung einer Substratoberfläche, die eine Vielfalt an unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen aufweist, getrennt durch eine oder mehrere Bilayer-Barrierenregionen, kann auf etliche verschiedene Arten gemacht werden, was Fachleuten der Mikrofabrikationstechnik klar sein wird, die den Vorteil der vorliegenden Beschreibung haben. Zum Beispiel schließen im Fachgebiet bekannte Mikromaterialbearbeitungs-Verfahren Filmauftragungsverfahren ein, wie zum Beispiel Spritzen, Rotationsbeschichtung und Auftragung von chemischem Dampf, Laserfabrikation oder photolithographische Techniken oder Ätzverfahren, die entweder durch nasse Chemikalien oder Plasmaprozesse durchgeführt werden können. Diese und andere Micromaterialbearbeitungs-Verfahren werden zum Beispiel in Petersen (1982) zusammengefasst. Allgemeine im Fachgebiet bekannte Siliziumverarbeitungs-Techniken werden zum Beispiel in Wolf und Tauber beschrieben (1986).
Eine Vorrichtung wird üblicherweise produziert, indem zuerst ein Substratmaterial ausgewählt wird und ein gemustertes Stützgitter hergestellt wird (der strukturelle Teil einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung der Erfindung). Das Stützgitter trägt gemäß der Erfindung die gemusterte Seite der Substratoberfläche. Das Substrat besteht üblicherweise aus einem Material, das ausgewählt wurde, um die Eigenschaften von einem von dem Bilayer-kompatiblen oder Bilayer-Barrierenmaterial aufzuweisen, mit Streifen eines Materials, welches die Eigenschaften des anderen von dem Bilayer-kompatiblen oder Bilayer-Barrierenmaterials aufweist. In einer allgemeinen Ausführungsform ist ein Bilayer-kompatibles Substratmaterial mit Streifen eines Bilayer-Barrierenmaterials gemustert. In einer anderen allgemeinen Ausführungsform ist das Substratmaterial ein Bilayer-Barrierenmaterial und seine Oberfläche ist mit Regionen eines Bilayer-kompatiblen Materials gemustert. Man wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass das Substratmaterial sowohl mit Regionen des Bilayer-kompatiblen Materials als auch Regionen des Bilayer-Barrierenmaterials gemustert sein kann, sodass das ursprüngliche Substratmaterial nicht auf der gemusterten Substratoberfläche vertreten ist. Die Materialen, welche die Substratoberfläche bilden, werden so ausgewählt, dass eines nach Oberflächenreinugung und/oder -Behandlung eine Bilayer-kompatibleoberflächenregion ergibt und das andere die Bilayerbarrierenoberflächenregion.
Photoresist hat mindestens zwei mögliche Verwendungen mit Hinblick auf die vorliegende Erfindung. Wie vorstehend besprochen, ist positives Photoresist ein wirkungsvolles Bilayer-Barrierenmatierial. Natürlich kann Photoresist auch im herkömmlichen Sinne der Musterung eines Substrates für die anschließende Lithographie verwendet werden, um mikrofabrizierte Vorrichtungen der Erfindung zu erzeugen. Geeignete Negativ- oder Positiv-Resistmaterialien sind gut bekannt. Gebräuchliche Negativ-Resistmaterialien umfassen Zwei-Komponenten-Bisarylazid/Gummiresist-Materialien und Positiv-Resistmaterialien umfassen Zwei-Komponenten-Diazoquinon/Phenolharz-Materialien. Ein Beispiel von Elektronenstrahlresist, das auch geeignet sein kann, umfasst Polymethylmethacrylat (PMMA); siehe z.B. Thompson, et al. (1983).
Wie vorstehend erwähnt, ist Silizium ein bevorzugtes Substratmaterial, da die gut entwickelte Technologie seine präzise und wirkungsvolle Erzeugung erlaubt, aber andere Materialen, einschließlich Polymere wie zum Beispiel Polytetrafluorethylene, können verwendet werden. Der Substratwafer (z.B. Siliziumwafer) wird üblicherweise unter Verwendung einer Standard-RCA-Reinigung gereinigt (Kern und Puotinen, 1970; Wolf und Tauber, 1986). Der Wafer wird dann bei einer Temperatur von zwischen etwa 800 und 1000°C im Dampf unter Verwendung bekannter Verfahren (Wolf und Tauber, 1986) oxidiert, bis eine Oxidschicht (vorzugsweise etwa 0,5 μm dick) gebildet ist. Die Oxidschicht wird dann mit einer Photoresistschicht von vorzugsweise etwa 1 μm Dicke beschichtet. Wie hierin beschrieben, kann dieses Verfahren verwendet werden, um den strukturellen Teil einer beispielhaften Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung der Erfindung zu erzeugen, welche jetzt nur noch, wie nachstehend beschrieben, gereinigt werden muss, bevor sie einer Vesikelsuspension ausgesetzt wird, um die Bilayerflächen zu bilden.
Alternativ kann das mit Photoresist gemusterte Substrat einer Standard-Lithographie unterzogen werden, um eine Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung mit einem anderen Material als Photoresist, welches die Bilayer-Barrierenregionen bildet, zu erzeugen. In diesem Fall wird das beschichtete Laminat durch eine Photomaske bestrahlt, welche mit einem Muster bedruckt ist, das in Größe und Layout dem gewünschten Muster entspricht. Verfahren zur Bildung von Photomasken, welche die gewünschten Photomaskenmuster aufweisen, sind gut bekannt. Zum Beispiel können unter Verwendung von Standardverfahren Quarzplatten mit einem Elektronenstrahlgerät und einem Elektronenstrahlresist wie zum Beispiel PBS mit Chrom gemustert werden. Alternativ kann eine Maske im Handel von jedem von etlichen Lieferanten erworben werden, z. B. Align-Rite (Burbank, CA). Der Kontakt wird auf einem Standard-Kontakt-Maskenaligner-Gerät wie zum Beispiel einem Karl Suss Kontakt-Lithographiegerät durchgeführt. Herkömmliche Positiv- oder Negativ-Photoresist-Materialien können mit Klarfeld- oder Dunkelfeld-Photomasken verwendet werden. Die Muster können durch anschließende Ätz- oder Liftoffprozesse auf das Substrat übertragen werden.
Elektroden können unter Verwendung von jedem von etlichen unterschiedlichen Techniken in die Vorrichtung eingebaut werden, die zur Aufbringung von dünnen Metallbeschichtungen auf ein Substrat in einem gewünschten Muster verfügbar sind. Diese werden zum Beispiel in Krutenat, 1986; und in Wolf und Tauber zusammengefasst. Geeignete und gebräuchliche, zur Fabrikation von Mikroelektroden verwendete Techniken umfassen Vakuumaufdampfen, Verdampfung, Aufspritzen und Plattierung. Verschiedene leitfähige Materialien, einschließlich dotiertes Silizium und Metalle wie zum Beispiel Platin, Gold oder Silber können für die Elektroden verwendet werden.
Auftrangetechniken, die eine genaue Kontrolle des Bereichs der Auftragung ermöglichen, werden zur Aufbringung von Elektroden auf die ausgewählten Regionen der Vorrichtung bevorzugt. Solche Techniken werden zum Beispiel in Krutenat, vorstehend, und in Wolf und Tauber, 1986, beschrieben. Sie schließen physikalische Dampfaufbringung unter Verwendung eines Elektronenstrahls ein, wobei Atome von einer virtuellen, punktförmigen Quelle mit Sichtverbindung auf das Substrat aufgetragen werden. In der Laserbeschichtung wird ein Laser auf einen Zielpunkt auf der Oberfläche fokussiert und ein Trägergas projiziert pulverisiertes Beschichtungsmaterial in den Strahl, sodass die geschmolzenen Partikel in Richtung Substrat beschleunigt werden.
Eine andere Technik, welche die genaue Ausrichtung auf ein Ziel ermöglicht, verwendet einen Elektronenstrahl, um die selektive Zersetzung von einer vorher aufgetragenen Substanz zu induzieren, wie zum Beispiel einem herkömmlichen Elektronenstrahlresist (z.B. PMMA), einer dünnen Schicht eines anderen Materials (z.B. einem Metallsalz), einer Monolayer oder ähnlichem (siehe z.B. Tiberio, et al., 1993). Diese Technik ist verwendet worden, um Submikron-Leiterbahnen zu erzeugen (z.B. Ballantyne, et al., 1973). Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die Dimensionen der einzelnen Regionen außerordentlich klein erzeugt werden können, da Elektronenstrahl-Lithographie gemeinsam mit Nahfeld-Rastermikroskopie verwendet werden kann, um Membranmuster im Nanometermaßstab herzustellen und abzubilden. Weiter können bestimmte unübliche Mikrofabrikationsmaterialien, die Bilayer-Barriereneigenschaften aufweisen, unter Verwendung von Standardtechnologien mit Mustern versehen werden. Zum Beispiel können SiO₂-Substratwafer durch Verdampfung und Liftoff mit Aluminiumoxid gemustert werden (Wolf und Tauber, 1986, siehe S. 535). Eine solche Musterung sowie auch die allgemeine, vorstehend beschriebene Mikrofabrikation, können bequem durch Vergabe der Arbeit an eine Firma durchgeführt werden, die Mikrofabrikationsservice anbieten, wie zum Beispiel MCNC (Research Triangel Park, NC), IC Sensors (Milpitas, CA) und Silica-Source Technology (Tempe, AZ).
B. Reinigung des gemusterten Stützgitters
Nachdem das gemusterte Stützgitter hergestellt ist, wird es gereinigt und/oder behandelt, um alle auf der Substratoberfläche vorhandenen Unreinheiten oder Kontaminationen abzulösen oder wegzuätzen, welche die Bildung einer Lipid-Bilayers neben der Oberfläche ansonsten verhindern könnten. Der Reinigungsvorgang wird so ausgewählt, dass er die Funktionsfähigkeit der Bilayer-Barrierenregionen nicht wesentlich beeinträchtigt. Zum Beispiel sollten Ausführungsformen, bei welchen die Barrierenregionen aus Photoresist bestehen, nicht unter Verwendung der herkömmlichen Pirhanalösung-Säurespülung (3:1 H₂SO₄:H₂O₂) gereinigt werden, da die Säure die Bilayer-Barrierenregionen ablösen kann. Ein beispielhafter Reinigungs-/Behandlungsprozess, der Photoresist nicht schädigt, setzt das Inkontaktbringen des gemusterten Gitters für mehrere Minuten mit Argon- oder Sauerstoffplasma an. Obwohl das Plasma Photoresist etwas wegätzt, löst es, bevor es die Photoresistschicht erheblich schädigt, Kontaminationen von der Oberflächenschicht des Substrates (z.B. SiO₂-Substrat) ab.
Etliche geeignete Ätz- und/oder Reinigungsverfahren sind im Fachgebiet bekannt. Vier solche Verfahren werden nachstehend zusammengefasst. Sie schließen jene vorstehend beschriebenen ein und können getrennt oder in Kombination eingesetzt werden. Im ersten Verfahren wird der strukturelle Teil der Vorrichtung (Stützgitter) für mehrere Stunden bei 500°C gebacken. Dieses Verfahren verträgt sich nicht mit Gold oder Photoresist. Im zweiten Verfahren wird das Stützgitter in Pirhanalösung-Säurespülung (3:1 H₂SO₄:H₂O₂) gewaschen. Dieses Verfahren verträgt sich nicht mit Photoresist und vielen Metallen, obwohl es mit Gold und Platin erfolgreich angewendet werden kann. Im dritten Verfahren wird das Stützgitter in Detergens gekocht (z.B. 7 X Detergens von ICN Biomedicals, Inc. (Aurora, Ohio), verdünnt 1:4). Dieses Verfahren verträgt sich nicht mit Photoresist und ist, wenn es alleine verwendet wird, nicht sehr effektiv. Im vierten Verfahren wird das Stützgitter in einem Gasplasma geätzt (z.B. Argon oder Sauerstoff). Dieses Verfahren ist am wirkungsvollsten, wenn es mit dem dritten Verfahren kombiniert wird, kann aber alleine verwendet werden; es ist das einzige hierin beschriebene Verfahren, das zur Verwendung mit Photoresist geeignet ist.
C. Herstellung von gestützten Bilayerflächen
Nach einem solchen Wasch/Ätz/Behandlungsschritt wird das Gitter in eine Kammer platziert und eine Suspension aus Vesikeln oder Liposomen, die aus einem ausgewählten Lipid gebildet ist und (wahlweise) ausgewählte Proteine oder andere Biomoleküle enthält, wird mit jeder Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion in Kontakt gebracht. Vesikel in der Suspension fusionieren im Allgemeinen innerhalb einer Minute oder weniger mit der Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion, um eine gestützte Bilayermembran zu bilden (Xia, et al., 1996; Grovers, et al., 1996). Eine befeuchtete Kammer wird vorzugsweise in Anwendungen verwendet, bei denen das Volumen der Tropfen der Lipidsuspension klein genug ist (z.B. ~ < 5 μl), um eine erhebliche Verdampfung zu ermöglichen, bevor sich die Bilayer bilden und das Gitter von der großen wässrigen Phase überflutet wird.
Liposomen können durch eine Vielzahl an Techniken erzeugt werden, wie zum Beispiel durch jene, die in Szoka, Jr., et al., (1980) genau beschrieben werden. Die zur Bildung von Liposomen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, verwendeten Lipidkomponenten enthalten vorzugsweise mindestens 70 Prozent vesikelbildende Lipide. In einer allgemeinen Ausführungsform werden die Bilayer, wie in Beispiel 1 beschrieben, gebildet.
Wie vorstehend erörtert, können die gestützten Bilayer Rezeptoren von anderen Biomolekülen wie Peptiden, Nucleinsäuren, Faktoren usw. enthalten, verbunden mit oder eingebaut in die gestützte Bilayermembran. Verfahren zur Herstellung von solchen „modifizierten" Bilayer unter Verwendung von „derivatisierten" Liposomen oder Liposomen, die einen zusätzlichen Rest wie zum Beispiel ein Protein enthalten, sind gut bekannt (siehe z.B. Zalipsky, 1995; Allen et al., 1995, sowie auch US Patente Nr. 6,605,630, 4,731,324, 4,429,008, 4,622,294 und 4,483,929). Einige Beispiele werden nachstehend besprochen.
Ein für die Herstellung von solchen derivatisierten Liposomen geeignetes Verfahren umfasst Diffusion von Polymer-Lipid-Konjugaten in vorgeformte Liposomen. In diesem Verfahren werden Liposomen, wie beschrieben, von Vesikel-bildenden Lipiden erzeugt und die vorgeformten Liposomen werden zu einer Lösung hinzugefügt, die eine konzentrierte Disperson an Micellen von Polymer-Lipid-Konjugaten aufweist. Das Gemisch wird dann bei Bedingungen inkubiert, die in der Erzielung der Insertion der micellaren Lipide in die vorgeformten Liposomen effektiv sind.
In einem anderen Verfahren ist das Biomolekül durch eine nachfolgend beschriebene Koppelungsreaktion an ein Lipid gekoppelt, um ein Biomolekül-Lipidkonjugat zu bilden. Dieses Konjugat wird, wie beschrieben werden wird, zur Bildung von Liposomen zu einer Lösung von Lipiden hinzugefügt. In einem anderen Verfahren wird ein vesikelbildendes Lipid, das für die kovalente Bindung eines Biomoleküls aktiviert ist, in Liposomen eingebaut. Die gebildeten Liposomen werden mit dem Biomolekül in Kontakt gebracht, um Bindung des Biomoleküls an die aktivierten Lipide zu erreichen. In noch einem weiteren Verfahren, das besonders zur Herstellung von Liposomen geeignet ist, die integrale Membranrezeptoren oder Proteine enthalten, werden die Liposomen einfach in Gegenwart solcher Proteine gebildet, um, wie nachstehend beschrieben, „Proteoliposomen" zu bilden.
Eine Vielzahl an Verfahren ist für die Herstellung eines Konjugats vorhanden, zusammengesetzt aus einem Biomolekül und einem Vesikel-bildenden Lipid. Zum Beispiel können wasserlösliche, Amin-enthaltende Biomoleküle durch Umsetzung des Amin-enthaltenden Biomoleküls mit einem Lipid, das derivatisiert wurde, um einen aktivierten Ester von N-Hydroxysuccinimid zu enthalten, kovalent mit Lipiden wie zum Beispiel Phosphatidylethanolamin verbunden werden.
Als anderes Beispiel können Biomoleküle und im Besonderen große Biomoleküle wie zum Beispiel Proteine gemäß berichteter Verfahren an Lipide gekoppelt werden. Ein Verfahren umfasst die Bildung einer Schiffschen Base zwischen einer Aldehydgruppe auf einem Lipid, üblicherweise einem Phospholipid, und einer primären Aminosäure auf dem Biomolekül. Die Aldehydgruppe wird vorzugsweise durch Perjodatoxidation des Lipids gebildet. Die Kopplungsreaktion wird nach Entfernung des Oxidationsmittels in der Anwesenheit eines reduzierenden Agens, wie zum Beispiel Dithiotreit, wie beschrieben von Heath (1981), durchgeführt. Typische für das Verfahren geeignete Aldehyd-Lipidvorläufer umfassen Lactosylceramid, Trihexosylceramin, Galactocerebrosid, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Ganglioside.
Ein zweites allgemeines Kopplungsverfahren ist auf Biomoleküle anwendbar, die Thiol enthalten, und umfasst die Bildung einer Disulfid- oder Thioetherbindung zwischen einem Lipid und dem Biomolekül. In der Disulfidreaktion wird ein Lipidamin wie zum Beispiel Phosphatidylethanolamin modifiziert, um ein Pyridylditho-Derivat zu enthalten, das mit einer exponierten Thiolgruppe in dem Biomolekül umgesetzt werden kann. Reaktionsbedingungen für ein solches Verfahren können in Martin (1981) gefunden werden. Das Thioether-Koppelungsverfahren, beschrieben von Martin (1982), wird durch Bildung eines Sulfodryl-reaktiven Phospholipids wie N-(4)P-Maleimido-phenyl(butyryl)phosphatidylethanolamin und durch Umsetzung des Lipids mit dem Thiol-enthaltenden Biomolekül durchgeführt.
Ein anderes Verfahren zur Umsetzung eines Biomolekül mit einem Lipid umfasst die Umsetzung des Biomoleküls mit einem Lipid, welches derivatisiert wurde, um einen aktivierten Ester von N-Hydroxysuccinimid zu enthalten. Die Umsetzung wird üblicherweise in der Anwesenheit eines milden Detergens wie zum Beispiel Desoxycholat durchgeführt. Wie auch die vorstehend beschriebenen Reaktionen wird diese Koppelungsreaktion vorzugsweise vor dem Einbau des Lipids in das Liposom durchgeführt.
Verfahren zur Anheftung eines Biomoleküls an das Liposom durch einen kurzen Spacerarm sind zum Beispiel im US Patent Nr. 4,762,915 beschrieben worden. Im Allgemeinen kann die Anheftung eines Rests an einen Spacerarm durch Derivatisierung des Vesikel-bildenden Lipids, üblicherweise Distearolphosphatidylethanolamin (DSPE) mit einem hydrophilien Polymer wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG) erzielt werden, das eine reaktive terminale Gruppe zur Anheftung eines Affinitätsrests aufweist. Verfahren zur Anheftung von Liganden an aktivierte PEG-Ketten, werden im Fachgebiet beschrieben (Allen, et al., 1995; Zalipsky, 1992a; Zalipsky, 1992b; Zalipsky, 1993, Zalipsky, 1994). In diesen Verfahren wird die inerte terminale Methoxygruppe von mPEG durch eine reaktive Funktionalität ersetzt, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist, wie zum Beispiel eine Amino- oder Hydrazidgruppe. Das endfunktionalisierte PEG wird mit einem Lipid verbunden, üblicherweise DSPE. Die funktionalisierten PEG-DSPE-Derivate werden bei der Liposomenbildung eingesetzt und der gewünschte Ligand (z.B. Biomolekül) wird vor oder nach der Liposomenbildung mit dem reaktiven Ende der PEG-Kette verbunden.
Ein weiteres Verfahren der Bindung von Biomolekülen wie zum Beispiel Proteinen an eine gestützte Lipidbilayer findet über spezifische Interaktionen zwischen der Seitenkette der Aminosäure Histidin und divalenten Transitions-Metalllionen statt (Malik, et al., 1994; Arnold, 1991), die auf der Membranoberfläche immobilisiert sind. Dieses Verfahren ist zum Beispiel verwendet worden, um verschiedene Proteine und Peptide an Lipidmonolayer zu binden (Shnek, et al., 1994; Frey, et al., 1996; Sigal, et al., 1996). Kurz gesagt wird eine cDNA konstruiert, die den Liganden oder Rezeptor codiert, der auf der Bilayer-Oberfläche immobilisiert werden soll, so dass der Ligand oder Rezeptor eine Poly-Histidin (z.B. Hexahistidin)-Markierung an einem seiner beiden Enden (z.B. dem C-Terminus) enthält. Die Bilayer wird aus Metall-chelatbildenden Resten gebildet oder damit derivatisiert (z.B. Kupfer-chelatbildende Einheiten oder Lipide (Shnek, et al., 1994; Frey, et al., 1996)) und das exprimierte His-markierte Protein wird mit den Vesikeln, die verwendet werden, um die gestützte Bilayer zu bilden, oder mit der gestützten Bilayer selbst inkubiert.
Spezifische molekulare Interaktionen mit hoher Affinität können auch eingesetzt werden, um ausgewählte Biomoleküle mit einer gestützten Bilayer zu verbinden. Zum Beispiel kann eine Bilayerfläche gebildet werden, um biotinylierte Lipide (erhältlich von z.B. Molecular Probes, Eugene, OR) zu umfassen, und ein Biomolekül, verbunden oder gekoppelt an Avidin oder Streptavidin, kann mit der Bilayer über die Biotinreste verbunden werden.
Biotinmoleküle können auch mit einer gestützten Lipidbilayer über Glycan-Phosphatidyl-Inosit (GPI) verbunden werden. Die zu verbindenden Proteine können gentechnisch erzeugt werden, um eine GPI-Verbindung zu enthalten (Caras, et al., 1987; Whitehorn, et al., 1995). Einbau eines GPI-Anhaftungssignals in ein Gen wird verursachen, dass das Protein post-translationell von der Zelle modifiziert wird, was in einer GPI-Bindung an der Signalposition resultiert. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass diese Art von Änderung im Allgemeinen die molekularen Erkennungseigenschaften von Proteinen wie von jenen, die hierin beschriebenen werden, nicht beeinflusst (Lin, et al., 1990; McHugh, et al., 1995; Wettstein, et al., 1991).
Ein zweckmäßiger Ansatz ist es, die das Protein von Interesse codierende cDNA-Sequenz unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren und Methoden in einen Vektor zu clonieren, der das GPI-Anhaftungssignal aufweist (siehe z.B. Ausubel, et al., 1988; Sambrook, et al., 1989). Ein beispielhafter Vektor ist das pBJ1Neo-Derivat, beschrieben in Whitehorn, et al., (1995), das einen modifizierten Polylinker und das menschliche alkalische Plazenta-Phosphatase-GPI-Verbindungssignal aufweist. Ein anderer geeigneter Vektor ist pBJ1Neo (Lin, et al., 1990). Das Konstrukt wird dann unter Verwendung eines Standard-Transfektionsverfahren wie Elektroporation (z.B. unter Verwendung der Einstellungen von ~ 0,23 kV/960 μF) in geeignete Wirtszellen transfiziert (z.B. Chinesische Hamster-Eierstock (CHO)-Zellen). Die transfizierten Zellen werden z.B. unter Verwendung von Fluorezenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) mit einem gegen die Proteine von Interesse gerichteten Antikörper ausgewählt.
Transfizierte CHO-Zellen mit hoher Oberflächenexpression werden in Kultur vermehrt. GPI-verbundene Proteine werden z.B. durch Detergens-Extraktion (Schild, et al., 1994) von der Zellmembranfraktion gereinigt. Kurz gesagt werden die fast konfluenten CHO-Zellen durch Waschen mit PBS vom Medium befreit, das einen Cocktail an Proteinase und Phosphatase-Inhibitoren enthält. Die Zellen werden auf Eis im gleichen Puffer lysiert, der 0,5% NP40 enthält. Kerne und Zelltrümmer werden abzentrifungiert und der Überstand auf eine Antikörper-Affinitätssäule geladen.
Das Detergens wird dann auf der Säule gegen 1 % Octoglucosid (OG) ausgetauscht und die Proteine werden durch eine Base (pH-Wert 11,5) eluiert, die 1 % OG enthält. Nach der Elution werden die Proteine entweder in einem neutralisierten Elutionspuffer gelagert oder der Puffer wird gegen 1 % OG in PBS ausgetauscht. Die gereinigten, mit GPI verbundenen Proteine oder andere gewünschten Proteine und Rezeptoren können dann, wie nachstehend beschrieben, in Proteoliposomen eingebaut werden.
Proteoliposomen, die ein ausgewähltes Membranprotein enthalten, können unter Verwendung von Standardverfahren, z.B. unter Verwendung des von Sadler et al., (1984) beschriebenen Protokolls, erzeugt werden. In diesem Verfahren werden rekombinante Rezeptorproteine in einem geeigneten Puffer (z.B. 10 mM Tris pH-Wert 8,0, 0,1% LDAO-Puffer) konzentriert, zum Beispiel unter Verwendung einer DEAE-Ionenaustauschsäule oder eines Centricon-Konzentrators (Amicon Co., Beverly, MA). Falls erwünscht, kann die Salzkonzentration durch Dialyse auf einen gewünschten Wert (z.B. 100 mM NaCl) eingestellt werden.
Die konzentrierten Rezeptorproteine werden dann zu einer Suspension von kleinen unilamellaren Vesikeln hinzugefügt (SUVs; erzeugt, wie nachstehend beschrieben, wahlweise mit einem solchen Lipidmarker wie Texas Rot), z.B. unter Rühren in kleinen Röhrchen mit konischem Boden, bis zu einem ausgewählten endgültigen molaren RC:Lipid-Verhältnis. Das Verhältnis liegt im Allgemeinen zwischen etwa 1:100 und 1:1000, vorzugsweise etwa zwischen 1:300 und 1:500. In einer Ausführungsform ist das Verhältnis 1:350.
Im Falle der mit GPI verbundenen, vorstehend beschriebenen Proteine, werden die Proteine bei Konzentrationen von etwa 100 nM mit SUVs bei einer Lipidkonzentration von 1 mM in TN25/50 gemischt, wobei die Gesamt-OG-Konzentration vorzugsweise 0,15% nicht übersteigt. Das Detergens kann durch Dialyse gegen 3 Chargen von je 1 Liter TN25/50 bei 4°C entfernt werden. Nach der Dialyse kann die Lipidkonzentration unter Verwendung der NBD-PE-Absorption bei 465 nm bestimmt und auf 0,2 mg/ml eingestellt werden.
Alternativ können die Proben eine Sepharosesäule (z.B. einer Sepharose CL-4B (Sigma)-Säule) durchlaufen, die vorher mit SUVs äquilibriert wurde, um die Lipidadsorption zu minimieren, und die Fraktionen werden gesammelt. Die Absoptionsspektren der Proteoliposomenfraktionen werden gemessen und das wahre molare Protein:Lipid-Verhältnis wird unter Verwendung des Absoptionspeaks der Lipidmarkierung berechnet.
Typischerweise folgt das molare Verhältnis von Protein:Lipid in den Fraktionen einer monotonischen Abnahme, beginnend bei etwa 1:300 und endend bei etwa 1:1000-1200. Nur die Fraktionen mit einem molaren Verhältnis von etwa 1:500 oder niedriger werden im Allgemeinen verwendet, um ebene gestützten Bilayer herzustellen; die Fraktionen mit höheren molaren Verhältnissen bilden nicht immer gleichförmige ebene Bilayer.
IV. Anwendungen
A. Biosensoren
In einem Aspekt umfasst die Erfindung einen Biosensor, der eine Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung aufweist. Die Anordnungsdetektorvorrichtung umfasst (i) ein Substrat, welches eine Oberfläche aufweist, die eine Vielzahl an unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen definiert, welche durch eine oder mehrere Bilayer-Barrierenregionen getrennt sind, (ii) eine große wässrige Phase, welche diese Substratoberfläche bedeckt, (iii) eine Lipid-Bilayerfläche, welche von jeder dieser Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen getragen wird, (iv) einen wässrigen Film, der sich zwischen jeder Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion und der entsprechenden Lipidbilayerfläche befindet, wobei jede Bilayerfläche eine Rezeptorart oder ein Biomolekül enthält und verschiedene Bilayerflächen verschiedene Rezeptorarten oder Biomoleküle enthalten. Der Rezeptor oder das Biomolekül ist an jede oder in jeder der Lipid-Bilayerflächen verankert. Die spezifische Bindung eines besonders Liganden an einen Rezeptor in einer Lipidfläche wird durch jeden einer Vielzahl von bekannten Biosensor-Detektionsmechanismen nachgewiesen, wie zum Beispiel optische oder elektrische Detektion.
In Biosensoren, die elektrische Detektion anwenden, enthält das Stützgitter vorzugsweise eine leitende Elektrode und elektronische Leitung für jedes Anordnungselement der Vorrichtung. Die Leitungen enden üblicherweise als Erweiterungen oder „Spitze" von der Vorrichtung, die an ein Verbindungskabel oder Band gekoppelt sein kann, das zu einem Rechner führt. Die Elektroden bilden vorzugsweise mindestens einen Teil der Bilayer-kompatiblen Oberfläche und sind voneinander durch Streifen an Isolationsmaterial getrennt. Sie können verwendet werden, um kapazitative oder leitende transiente Ströme nachzuweisen. In einer Ausführungsform bilden die Elektroden einen Teil der Bilayer-kompatiblen Oberfläche. In einer weiteren Ausführungsform, deren Konstruktion in Beispiel 5 genau beschrieben wird, werden die Elektroden gleich unterhalb der Bilayerkompatiblen Oberfläche positioniert, d.h. die Elektrodenoberfläche ist mit einer dünnen Schicht an Material beschichtet, wie zum Beispiel einem bei niedrigen Temperaturen gewachsenen Oxid (z.B. SiO₂), das die Bilayeroberfläche bildet. In Ausführungsformen, in denen diese Schicht ein Isolationsmaterial ist, ist sie vorzugsweise weniger als etwa 1 μm dick, um den Nachweis der durch Bindung der Liganden an Ionophor-Rezeptoren verursachten kapazitativen transienten Strömen zu ermöglichen. Eine Ausführungsform des strukturellen Teils einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung, die zur Verwendung mit einem Biosensor geeignet ist, wird, wie vorstehend beschrieben, in 4 gezeigt.
Die Vorrichtung ist verbunden mit oder gekoppelt an einen Rechner, welcher das Signal von jedem Anordnungselement speichert und/oder analysiert. Der Rechner leitet die Daten dann an einen Computerspeicher (entweder Festplatte oder RAM) weiter, von wo sie durch ein Softwareprogramm verwendet werden können, um sie weiter zu analysieren, drucken und/oder das Ergebnis anzuzeigen.
Biosensoren, die Anordnungen von unabhängig ansteuerbaren Rezeptor-enthaltenden Lipid-Bilayerregionen einsetzen, haben etliche Vorteile gegenüber den Biosensoren, die früher zur Verfügung standen. Zum Beispiel stattet das Fließvermögen der Bilayermembran die Vorrichtung der Erfindung mit Oberflächeneigenschaften aus, die ähnlich jenen einer lebenden Zelle sind (z.B. Chan, et al., 1991; Tözeren, et al., 1992). In einer besonders zwingenden Untersuchungsreihe ist gezeigt worden, dass gereinigtes Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Protein, das in eine gestützte Membran eingebaut war, die Antigen-präsentierende Zelle in der Präsentation eines erneut prozessierten Antigens an eine Helfer-T-Zelle effektiv ersetzen kann (McConnell, et al., 1986; Watts and McConnell, 1987).
1. Nachweisverfahren. Auf Rezeptoren basierende Biosensoren arbeiten durch Nachweis der spezifischen Bindung von ausgewählten Analyten an „Rezeptor"-Biomoleküle auf dem Biosensor. Da die vorliegende Erfindung Flüssigbilayer einsetzt, die Zellmembranen ähnlich sind, kann nahezu jedes Transmembran-, Membran-verankerte oder Membran-assoziierte Protein als der Rezeptor verwendet werden. Der Rezeptor wird in die Lipidvesikel eingebaut, die verwendet werden, um die Bilayerflächen der Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung zu bilden. Bindung von Liganden an einen Rezeptor wird üblicherweise entweder optisch oder elektrisch/elektrochemisch nachgewiesen.
Optische Nachweisverfahren umfassen Ellipsometrie (Corsel, et al., 1986; Jönsson, et al., 1985; Vroman und Adams, 1969), Lichtwellenleitung (Nellen und Lukosz, 1990) und Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR, Cullen et al., 1988; Liedberg, et al., 1983). SPR ist besonders vorteilhaft für die Überwachung von molekularen Interaktionen in Echt-Zeit, indem es eine sensitive und umfassende Analyse des Grads der Bindungsinteraktionen zwischen zwei Proteinen ermöglicht.
In diesem Ansatz wird das Stützgitter durch Herstellung eines Stützgitters einer Anordnung von leitfähigen Regionen (z.B. Gold) erzeugt, die durch Bilayer-Barrierenregionen getrennt sind. Ein sehr dünner Polymerfilm (z.B. Polyacrylamid oder Dextran; Elender, et al., 1996; Khüner, et al., 1994) wird dann auf die leitfähigen Regionen aufgetragen, um Bilayer-kompatible Oberflächenregionen zu bilden. Khüner et al., (1994) beschreiben die Koppelung von Polyacrylamid an eine Oberfläche durch 3-Methacryl-oxypropyl-trimethoxy-silan (MPTS; Serva, Heidelberg, Germany).
Bilayer, die ausgewählte Moleküle enthalten, werden, wie beschrieben, aufgebracht und das Bilayer-enthaltende Stützgitter wird in eine Zelle platziert, die es ermöglicht, dass eine Lösung über die Oberfläche geleitet wird, welche die Anordnung von Rezeptor-bestückten Lipidflächen enthält. Das Gitter wird in einem Winkel mit einer Leuchtdiode (LED) beleuchtet und das reflektierte Licht wird mit einem Photodetektor analysiert. Durch ein abklingendes elektrisches Feld, das durch die Interaktion von einfallendem Licht mit der Goldschicht erzeugt wird, ist das reflektierte Licht für die Umgebung einer Schicht sensitiv, die sich etwa 1 μm (λ = 760 nm) von den Rezeptoren in das Medium erstreckt. Veränderungen in der Umgebung des Rezeptors, wie sie zum Beispiel durch die Bindung eines Liganden an den Rezeptor verursacht werden, werden als Veränderungen der Reflexionsintensität bei einem bestimmten Reflexionswinkel (Resonanzwinkel) nachgewiesen.
Kapazitativer Nachweis oder Impedanzanalyse kann auch verwendet werden. Hier wird eine Elektrode in jede der Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen eingebaut und ein „Erdungs"-Elektrode wird in die große wässrige Phase eingebracht. Eine Spannung von einem Funktionsgenerator mit variabler Frequenz wird verwendet, um eine ausgewählte Spannungs-Wellenform zu erzeugen, die über ausgewählte Anordnungselemente zugeleitet wird. Die Peak-zu-Peak-Amplitude der Spannung ist üblicherweise von einer Größenordnung von etwa 10 V, kann aber auch erheblich geringer sein. Die Spannung wird über einen Bereich von Frequenzen angelegt und die Kapazitanz wird vom gemessenen Strom als eine Funktion der Signalfrequenz unter Verwendung von Standard-Signalprozessierungstechniken bestimmt. Beispiele der Anwendung von Kapazitanzmessungen und Widerstandsanalysen von gestützten Bilayern werden zum Beispiel in Stelzle et al., (1993) und Stelzle und Sackmann (1989) besprochen.
Andere Nachweisverfahren werden in den US-Patenten besprochen, die sich auf Biosensoren beziehen, einschließlich Gitler, et al., 1993; Osman, et al., 1993; Taylor, et al., 1993; Case, et al., 1994; und Tomich et al., 1994:
2. Herstellung von Biosensoren. Eine Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung wird im Wesentlichen, wie vorstehend beschrieben erzeugt, außer, dass (i) die zur Herstellung der Bilayerfläche verwendeten Vesikel üblicherweise den gewünschten Rezeptor oder das gewünschte Biomolekül enthalten (obwohl der Rezeptor oder das Biomolekül auch eingeführt werden können, nachdem der Bilayer gebildet wurde), und (ii) verschiedene Anordnungselemente üblicherweise mit unterschiedlichen Vesikelsuspensionen erzeugt werden.
Analytselektivität wird durch unterschiedliche, im gestützten Bilayer jedes Anordnungselements anwesende Rezeptortypen an unterschiedliche Anordnungselemente verliehen. Solche unterschiedlichen Bilayer können unter Verwendung von Liposomen oder Proteoliposomen gebildet werden, welche die unterschiedlichen Biomoleküle oder Rezeptoren enthalten. Ein zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung einer solchen Vorrichtung ist durch Auftragen von Mikrotröpfchen der gewünschten Liposomensuspension auf die unterschiedlichen Abteilungen eines Vorrichtungssubstrates, welches sich in einer befeuchteten Kammer befindet, um Flüssigkeitsverlust durch Verdampfung zu vermeiden.
Jede von mehreren, im Fachgebiet bekannten Vorgehensweisen kann verwendet werden, um Bilayer von unterschiedlicher Zusammensetzung auf einem einzelnen mikrofabrizierten Stützgitter zu bilden. Ein geeignetes Verfahren setzt eine modifizierte Tintenstrahldruckervorrichtung ein (Blanchard, et al., 1996), um Mikrotropfen aufzutragen, welche auf den einzelnen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen der Vorrichtung in einer befeuchteten Kammer ausgewählte Vesikelsuspensionen enthalten. Der Tintenstrahldruckerkopf der Vorrichtung ist modifiziert, um kleine Tropfen (z.B. ~ 100 μm in Durchmesser) an Vesikel-enthaltender Suspension in einem Anordnungsformat von hoher Dichte aufzutragen. Benachbarte Tropfen können so nahe wie 30 μm voneinander aufgetragen werden. Die Barrieren in solchen Anwendungen weisen eine Breite auf, die üblicherweise in der Größenordnung des minimalen Zwischenraumes zwischen den benachbarten Tropfen liegt (d.h. ~ 30 μm), kann aber in besonderen Anwendungen größer oder keiner sein.
Natürlich kann die Vesikelsuspension auch unter Verwendung von Standard-Mikropipettierungstechnologie (d.h. eine Mikropipette in einer Halterung, verbunden mit einem Mikromanipulator) aufgetragen werden. Der Mikromanipulator kann für größere Präzision und Effizienz durch einen motorisierten Antrieb kontrolliert werden. Solche Antriebe sowie auch Mikromanipulatoren sind kommerziell erhältlich, z.B. von Newport Corp. (Irvine, CA) und Narashige USA, Inc. (Greenvale, NY). Der Antrieb kann wiederum für einen vollautomatisierten Arbeitsablauf durch einen Mikrocomputer kontrolliert werden. Der gesamte Prozess kann falls gewünscht unter Verwendung eines herkömmlichen Mikroskops wie zum Beispiel eines Seziermikroskops überwacht werden.
Geeignete Mikropipetten können unter Verwendung eines Standard-Mikropipetten-Pulleys wie zum Beispiel einem Puller, wie er von Narashige erhältlich ist, gemacht werden. Die Spitzen der Pipetten können so hergestellt werden, dass sie einen Öffnungsdurchmesser aufweisen, der von weniger als einem Micron bis zu mehreren zehn Microns oder mehr reicht. Die Hinterseite der Pipette kann mit einer Standard-Mikroinjektionspumpe verbunden sein, die eingestellt ist, um ein gewünschtes Volumen an Vesikelsuspension zu verabreichen.
Die Tropfen, welche die Vesikelsuspension enthalten, wird erlaubt, für ein paar Minuten auf dem Substratgitter zu inkubieren, um im Wesentlichen allen Membranen, die im Stande sind, sich zu bilden, die Bildung zu ermöglichen. Das Gitter wird dann behutsam mit wässriger Lösung geflutet, bis eine geeignete große wässrige Phase über den Bilayermembranen etabliert ist. Ein geeignetes Verfahren zur Überflutung des Gitters, ohne wesentliche Störung der Bilayer, ist es, das Wasserniveau in der Kammer zu erhöhen, bis die Oberfläche mit dem Oberteil des Gitters auf einer Ebene ist, aber die Abteile noch immer nur die ursprünglich aufgetragenen Tropfen enthalten. Der Oberteil des Gitters wird dann einem feinen Nebel aus einer wässrigen Lösung ausgesetzt, bis sich die Tröpfchen zu einem einheitlichen Film aus wässriger Lösung zusammenfügen. Das Niveau der Lösung wird dann angehoben, um das gewünschte Volumen der großen wässrigen Phase oberhalb des Gitters zu erreichen.
3. Verwendung von Biosensoren. Ein Biosensor, der eine Biosensor-Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung einsetzt, wie sie vorstehend beschrieben ist, kann verwendet werden, um niedrige Konzentrationen an biologisch-aktiven Analyten oder Liganden in einer Lösung nachzuweisen, die ein komplexes Gemisch an Liganden enthält. In einem solchen Verfahren wird die Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung mit unterschiedlichen Rezeptoren in den Bilayerflächen bei unterschiedlichen Anordnungspositionen konstruiert. Um auf Signalfluktuationen zu prüfen, können mehrere unterschiedliche Anordnungselemente den gleichen Rezeptortyp enthalten. Auf ähnliche Weise können gezeichnete Anordnungselemente für positive und/oder negative Kontrollzwecke verwendet werden.
Die Biosensor-Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung wird dann mit einer wässrigen Lösung in Kontakt gebracht, die ein Gemisch an Liganden enthält, welche auf die Anwesenheit von ausgewählten Liganden überprüft werden soll, wie zum Beispiel Rezeptorantagonisten, wobei das Inkontaktbringen über den großen wässrigen Lösungsanteil der Vorrichtung stattfindet. Mit anderen Worten wird das Gemisch, das untersucht werden soll, über der Vorrichtung gewaschen und dadurch die große wässrige Phase ausgetauscht. Wenn ein ausgewählter Ligand spezifisch an einen Rezeptor bindet, wird die Bindung durch ein geeignetes Nachweisverfahren nachgewiesen. Zum Beispiel wird in einem Test auf die Anwesenheit von Acetylcholin (Ach) unter Verwendung der Anordnungsvorrichtung, welche die Ach-Rezeptoren (AchRs) enthält, die in die Lipidfläche von mindestes einem Anordnungselement eingebaut sind, die Bindung von Ach an die AchRs als eine Veränderung in der Transmembranspannung oder dem Strom in dem Element nachgewiesen, das die AchRs enthält.
B. Substrat für Bioaktivitätsdurchmusterungen
In einer Ausführungsform, die sich auf die vorstehend beschriebene Biosensoranwendung bezieht, können Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung als Substrate verwendet werden, die eine Rezeptoranordnung halten, welche in den Bioaktivtätsdurchmusterungen von Verbindungen eingesetzt werden. Im Besonderen werden üblicherweise Hochdurchsatz-Durchmusterungen von großen Verbindungsbanken in Bezug auf Schnelligkeit und Effizienz optimiert, um Verbindungskandidaten für die anschließende Bioaktivitätsuntersuchung rasch zu identifizieren. Wenn eine solche Bioaktivitätsuntersuchung zum Beispiel Tests für Ionenkanal-Agonisten- oder Antagonistenaktivität umfasst, wird die Untersuchung von einem Forscher oft an einer Verbindung nach der anderen unter Verwendung von elektrophysiologischen Messungen (z.B. Patch-Clamp-Technik; siehe z.B. Hamill, et al., 1981) von einzelnen Zellen durchgeführt, die den Ziel-Ionenkanal oder Rezeptor exprimieren. Obwohl diese Analyseart genaue, hoch qualitative Daten für jede Verbindung bereitstellt, ist sie langsam und ineffizient, wenn eine große Anzahl an Verbindungen auf Bioaktivität getestet werden sollen.
Vorrichtungen der Erfindung können in sekundären Durchmusterungen verwendet werden, um die Bioaktivität von Verbindungen zu bewerten, die in einer Hochdurchsatz-Durchmusterung identifiziert wurden, dadurch wird es den Forschern ermöglicht, sich auf die wenigen, wirklich interessanten Verbindungen zu konzentrieren. Die Vorrichtungen werden im Wesentlichen, so wie vorstehend für Biosensoren beschrieben, erzeugt. Die gleichen Arten an Bindungs-Nachweisschemata können angewandt werden, obwohl ein elektrischer Nachweis üblicherweise dem optischen Nachweis vorgezogen wird, wenn Verbindungen auf ihre Bioaktivität auf ionotrophen Rezeptoren oder Ionenkanälen hin bewertet werden.
In Vorrichtungen, die elektrischen Nachweis unter Verwendung von Elektroden in jedem der Anordnungselemente einsetzen, wird man sich darüber im Klaren sein, dass ein elektrisches Feld über die Bilayermembran angelegt werden kann, z.B. um spannungsabhängige Ionenkanäle zu aktivieren, da der Wasserfilm die Elektrode von der Bilayer trennt. Das ermöglicht die Durchmusterung auf Verbindungen, die nur an den Kanal binden, wenn der Kanal in einem anderen Zustand als im Ruhezustand vorliegt (z.B. in einem aktivierten oder nicht-aktivierten Zustand).
In einer verwandten Ausführungsform können die Vorrichtungen der Erfindung als Substrate zum Halten von Verbindungsbanken (z.B. kombinatorischen Banken) verwendet werden. Die Bilayerflächen werden, wie in Beispiel 1 genau beschrieben, auf ein Stützgitter von einer herkömmlichen Hauptvesikelsuspension aufgetragen und jede Bilayerflächenregion wird dann mit einem ausgewählten Biomolekül derivatisiert, z.B. unter Verwendung eines der vorstehend genau beschriebenen Verfahren. Eine Anwendung dieses Ansatzes ist die Verwendung von lichtgerichteter Synthese (Fodor, et al., 1991), um räumlich ansteuerbare molekulare Banken (z.B. Peptidbanken) in einer Form zu erzeugen, in der die Peptide auf der Oberfläche von begrenzten Stellen der Flüssigmembran gezeigt werden. Das ist ein wenig analog zum Phagendisplay, außer dass hier die Peptidsequenz durch ihre Position auf der Anordnung definiert ist. Solche Banken können aufgrund der Naturähnlichen, durch die Membran bereitgestellten Oberfläche für die Zelldurchmusterung besonders nützlich sein.
C. Bildung von Regionen mit einer hohen Dichte an Membranproteinen
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Bildung von gestützten Bilayern mit Regionen von sehr hoher Membranproteindichte ein. Wie vorstehend angegeben, können Protein-enthaltende Vesikel oder Proteoliposomen üblicherweise nur mit einem molaren Protein:Lipid-Verhältnis von etwa 1:500 oder niedriger gebildet werden – Vesikel mit höheren molaren Verhältnissen bilden nicht durchwegs einheitliche ebene Bilayer. Demgemäß können Proteinanordnungen von hoher Dichte in Lipidbilayern nicht einfach durch Fusionieren von Protein-enthaltenden Vesikeln mit einer Oberfläche gebildet werden, um eine gestützte Bilayer zu bilden.
Wie in Beispiel 3 und 3 gezeigt, können die Membranproteine jedoch in Regionen von sehr hoher Dichte konzentriert werden, wenn die gestützte Bilayer in einem von Bilayer-Barrierenregionen umgebenen Korral gebildet wird und einem elektrischen Feld ausgesetzt wird. Diese Wirkung kann zum Beispiel amplifiziert werden, indem der Migrations-Brennpunkt zur Spitze eines dreieckigen Korrals gemacht wird.
Nachdem die Proteine konzentriert worden sind, können sie für nachfolgende Anwendungen wie Diffraktionsstudien zur Strukturbestimmung verwendet werden. Falls erwünscht, kann die Proteinregion von hoher Dichter des Feld-induzierten Konzentrationsgradienten „eingefroren" werden, indem die Proteine unter Verwendung von Standard-Quervernetzungsverfahren (z.B. Behandlung mit Glutaraldehyd) quervernetzt werden.
D. Vorrichtung zum Messen der Rezeptorgröße und/oder Aggregation
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Sortierungsvorrichtungen für Biomoleküle, die in die gestützte Bilayer integriert oder damit verbunden sind. Die Sortierungsvorrichtungen setzten die Bilayerbarrierenoberflächenregionen nicht ein, um die Oberfläche in einzelne Stücke aufzuteilen, sondern eher, um als ein zweidimensionales Sieb zu wirken, das fortschreitend kleinere „Öffnungen" von einem Ende der Vorrichtung zum anderen aufweist. Eine Ausführungsform des strukturellen Teils dieses Aspekts der Erfindung wird in einer Aufsicht in 5 gezeigt. Hier wird der strukturelle Teil der Vorrichtung 70 aus einem Wafer 72 gebildet, der eine Substratoberfläche 74 aufweist, die eine Bilayer-kompatible Region definiert, die auf allen Seiten durch eine Bilayer-Barrierenregion 76 begrenzt ist. Die Bilayer-kompatible Region wird auch durch eine Vielzahl an im Wesentlichen parallel gestrichelten Linien 78 unterbrochen, welche die Bilayerbarrierenoberflächenregionen definieren. Die Abstände in den Linien sind molekulare Dimensionen und werden ausgehend von einer Kante 80 der Vorrichtung zur gegenüberliegenden Kante 82 fortschreitend kleiner. Elektroden 84, 86 sind nahe der Kanten der Vorrichtung positioniert und sind mit einer Spannungsquelle 88 über Drähte 90 verbunden.
Die Vorrichtung wird eingesetzt, um Membran-assoziierte Moleküle nach Größe zu sortieren. Ein Gemisch von ähnlich geladenen Molekülen, die unterschiedliche Größen aufweisen, wird in die Vertiefung geladen, die durch die eingrenzende Bilayer-Barrierenregion und die gestrichelte Linie gebildet wird, welche die größten Abstände aufweist. Die Spannungsquelle wird mit einer Polarität angeschalten, um zu bewirken, dass die geladenen Biomoleküle durch die fortschreitend kleineren Abstände der aufeinanderfolgenden Barrieren wandern, bis sie entsprechend der Größe in der auf der „stromabwärts" gelegenen Seite der Barriere definierten Vertiefung gefangen werden, die für das Durchströmen der Moleküle zu kleine Abstände aufweist.
In einer verwandten Anwendung sind die Bilayer-Barrierenregionen so angeordnet, dass sie eine einheitliche oder abgestufte Anordnung oder ein einheitliches oder abgestuftes Netzwerk von Barrieren bilden, und einer elektrophorese unterworfene Membranmoleküle werden basierend auf der Migrationszeit durch die Anordnung sortiert. Hier ist das Separationsverfahren ähnlich zu jenem, das mit einem Gel wie zum Beispiel einem Agarose- oder Polyacrylamidgel erhalten wird, wobei kleinere Moleküle schneller als größere Moleküle wandern.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die vorliegende Erfindung, sind aber in keiner Weise dafür gedacht, sie zu limitieren.
MATERIALIEN UND METHODEN
Soweit nicht anders angegeben, wurden die Chemikalien von Sigma (St. Louis, MO) oder United States Biochemical (Cleveland, OH) bezogen.
A. Puffer
Standardpuffer

10 mM Tris
100 mM NaCl (pH-Wert 8,0)

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)

10 × Stammlösung, 1 Liter:
80 g NaCl
2 g KCl
11,5 g Na₂HPO₄-7H₂O
2 g KH₂PO₄

Arbeitslösung von PBS, pH-Wert 7,3:

137 mM NaCl
2,7 mM KCl
4,3 mM Na₂HPO₄-7H₂O
1,4 mM KH₂PO₄

B. Lipide und Markierungen
L-α-Phosphatidylcholin vom Ei (Ei-PC) wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) erhalten. Die fluoreszierende Sonde N-(Texas-Rotsulfonyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammonium Salz (Texas-Rot DHPE) wurde von Molecular Probes (Eugene, OR) erhalten.
C. Erzeugung von Phospholipidvesikeln
Kleine unilamelläre Vesikel (SUVs) wurden durch das folgende Protokoll, umrissen in Barenholz, et al., (1977), unter Verwendung von Ei-L-α-Phosphatidylcholin (Avanti) erzeugt. Das Phosphatidylcholin wurde mit 1 Mol-% Texas-Rot-DHPE in Chloroform mit HPLC-Reinheitsgrad (Sigma-Aldrich) gemischt und in einem Vakuum-Exsikkator über Nacht getrocknet. Die getrockneten Lipide wurden auf etwa 6 mg/ml in einem Standardpuffer resuspendiert, der unter Verwendung einer Sibata-Filtereinheit durch 0,45 μm-Rainin-Nylon-66 Filter gefiltert worden ist. Die Suspension wurde zur Klärung mit einem Branson Ultrasonicator unter fließendem Argon (Ar) auf Eis für Perioden von 3 Minuten, getrennt durch 1-minütige Kühlperioden, mit Ultraschall behandelt (Martin, 1990). Die Probe wurde dann für 30 Minuten bei 100.000 × g zentrifugiert, um Ti-Partikel von der Ultraschallspitze zu entfernen, und dann wurde der Überstand für 4 Stunden bei 166.000 × g zentrifugiert, um die SUVs zu erhalten. Die SUVs wurden bei 4°C unter N₂ oder Ar im Dunkeln gelagert und wurden innerhalb von 3 Wochen verwendet. Die Lipidkonzentration in diesen Proben wurde aus der Texas-Rot-Sondenabsorption bei 590 nm (E = 100.000 M^-1cm^-1; Haugland, 1992) unter der Annahme bestimmt, dass die Sondenkonzentration in den Vesikeln, wie hergestellt, 1 Mol-% beträgt. Erträge (mg SUV-Lipid/mg ursprüngliches Lipid) werden von dieser Konzentration berechnet und entsprechen jenen, die von Barenholz et al., (1977) beschrieben wurden.
D. Membran-Elektrophorese
Für die elektrophoretischen Studien wurde die gestützte Membran in PBS auf 1 mM Gesamtionenstärke verdünnt. Diese wurde dann mit einem anderen Deckglas unter Puffer in einen Sandwich zusammengesetzt. Die Elektrophoresezelle bestand aus zwei Platindraht-Elektroden mit 0,01" Durchmesser in mit Lösung gefüllten Vertiefungen einer Teflonwanne. Das Deckglas-Sandwich wurde angeordnet, um eine Brücke zwischen den beiden Elektrodenvertiefungen zu bilden. Eine elektrische Verbindung wurde durch die Lösung im Deckglas-Sandwich erzielt. Felder bis zu 60 V/cm wurden mit einem Standard-Stromversorgungsgerät angelegt. Die Ströme wurden mit einem Keithley-Picoammeter (Cleveland, OH) überwacht und waren bei 15 V/cm üblicherweise um die 3 μA für einen einzelnen, 18 mm quadratischen Deckglas-Sandwich. Das entspricht einer Verlustleistung von 9 × 10^-5 W, der eine vernachlässigbare Menge an Joule-Erwärmung erzeugen sollte.
BEISPIEL 1
Konstruktion einer Oberflächendetektorvorrichtung
Ein gemustertes Stützgitter wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Wolf und Tauber, 1986) mikrofabriziert. Silizium-1-0-0-Wafer mit 100 mm Durchmesser wurden von Silrec Corporation (San Jose, CA) erhalten. Die Wafer wurden in einem Oxidationsofen in Dampf von 1000°C gehalten (Tylan Inc., San Diego, CA), um eine ~ 1 μm dicke Schicht an thermischem Oxid zu bilden. Standard-Positiv-Photoresist (S-1800; Shipley Inc., Marlborough, MA) wurde mit einer Dicke von einem Mikron mit einer Spurenauftragsmaschine („track coater") (Silicon Valley Group, San Jose, CA) aufgeschleudert.
Die Wafer wurden für ~ 8 Sekunden mit ~ 10 mW/cm² UV-Licht durch eine photolithographische Maske mit einem Kontakt-Maskaligner (Karl Suss America (Waterbury Center, VT), MA-4) belichtet. Die Entwicklung wurde auf einem Spurenentwickler (SVG) unter Verwendung eines Entwicklers, der auf Standard-Tetramethylammonium-Hydroxyd (TMAH) basiert (Shipley), durchgeführt. Die Wafer wurden dann einer 3-minütigen Ätzung in Argonplasma unterzogen.
Die Membranen wurden durch Inkontaktbringen der gemusterten Oberfläche der Wafer-Stützgitter mit einer Suspension gebildet, erzeugt, wie vorstehend beschrieben, welche unilamelläre Vesikel von ~ 25 nm Durchmesser enthielten, die hauptsächlich aus L-α-Phosphatidylcholin (PC)-Molekülen bestanden, die mit 1 Mol-% des mit Fluoreszenz markierten Lipids Texas-Rot-DHPE dotiert waren. Vesikel in der Suspension setzten sich in innerhalb von Sekunden spontan zusammen, um einen durchgehenden einzelnen Bilayer auf den Bilayer-kompatiblen Regionen des Stützgitters zu bilden, wie durch nachstehend beschriebene Photobleichung und Elektrophoreseexperimente nachgewiesen wurde.
Überschüssige Vesikel werden weggespült, während die Membran unter der großen wässrigen Phase zu allen Zeiten gehalten wurde. Ergebnisse von erweiterten Experimenten, welche den Zustand der gestützten Bilayer überwachten, zeigten, dass die Bilayer unter Wasser stabil sind und ihre Uniformität und ihr Fließvermögen über eine Dauer von Wochen beibehielten.
BEISPIEL 2
Fließvermögen von gestützten Bilayern, getestet durch Photobleichung
Weitreichendes Fließvermögen innerhalb der Bilayer-kompatiblen Regionen oder Korrale wurde durch Fluoreszenz-Wiederkehr nach dem Photobleichen (FRAP) beobachtet. Das Experiment wird mit Hinblick auf 2A und 2B beschrieben, die schematische Darstellungen einer Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung zeigen, welche 25 Bilayer-kompatible Oberflächenregionen oder Korrale mit entsprechenden Lipid-Bilayerflächen enthielt, die auf jeder dieser Oberflächenregionen getragen wurden. Die Vorrichtung wurde aus einem oxidierten Siliziumwafer erzeugt, der mit Photoresist gemustert war, um pro Seite 100 μm bemessene Korrale zu bilden. Der 10 μm dicke Photoresist (Bilayer-Barriereregionen) erscheint in 2A und 2B als schwarze Grenzen, welche die 25 Korrale trennen. Texas-Rot-DHPE-Lipidsonde (Molecular Probes, Eugene, OR) wurde in die Bilayermembran eingebaut, um als eine Markierung zu dienen.
Ein kreisförmiger Lichtstrahl, der einen Durchmesser von weniger als 100 μm aufweist, wurde verwendet, um die fluoreszierenden Sondenmoleküle in fünf einzelnen Korralen 40 (2A) mit Licht zu bleichen, das ergab die in 2B schematisch dargestellten Ergebnisse. Diffusive Mischung von Molekülen innerhalb jedes Korrals verursachte die Ausbreitung der kreisförmig gebleichten Stellen und Füllung des quadratischen Korrals. Die Linien an Photoresist agierten als Barrieren gegen seitliche Diffusion und Verhinderung der Durchmischung zwischen getrennten Korralen. Das Fließvermögen der Membran wurde durch die Ausbreitung der gebleichten Region, um jedes quadratische Korral zu füllen, bestätigt. Wenn die Membran nicht flüssig gewesen wäre, wäre der kreisförmige, gebleichte (dunkle) Bereich gleich geblieben.
Bleichmuster, wie jene, die in 2B gezeigt werden, waren für viele Tage stabil, wohingegen Punkte, die mit Licht in diese einzelne, durchgehende Membran ohne solche Barrieren gebleicht wurden, in etwa 30 Minuten vollständig weg diffundierten.
BEISPIEL 3
Fließvermögen von gestützten Bilayern, getestet durch Elektrophorese
Das Fließvermögen der gestützten Bilayer auf den Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen wurde auch über die elektrophoretische Neuverteilung von geladenen Membrankomponenten überprüft. Dieses Verfahren veranschaulicht sowohl das Fließvermögen der Lipidbilayer als auch die Beschränkung von Bilayerbereichen von unterschiedlicher Zusammensetzung auf unterschiedliche, unabhängig ansteuerbare Bilayer-kompatible Oberflächenregionen.
Eine Vorrichtung mit quadratischen 200 μm-Korralen wurde, wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von mit 1 Mol-% an Fluoreszenz-markiertem Lipid, Texas-Rot-DHPE (Molecular Probes), dotieren PC-Molekülen erzeugt.
Ein elektrisches Feld von 15 V/cm wurde parallel zu der Lipid-Bilayermembran angelegt. Nach Anlegen des Feldes drifteten die geladenen Moleküle (markiertes DHPE) in der Bilayerebene, wohingegen die neutralen PC-Moleküle, die den Hauptteil der Membran ausmachten, von dem Feld nicht beeinflusst wurden. Anlegen des Feldes für ~ 25 Minuten resultierte in einem vom elektrischen Feld induzierten Konzentrationsprofil in einem stabilen Zustand (Groves und Boxer, 1995) der negativ geladenen fluoreszierenden Sonde.
Eine quantitative Beschreibung des durch das Feld induzierten Konzentrationsgradienten wird in 3 dargestellt, die quantitative Spuren an Fluoreszenzintensität zeigt, berechnet von videomikroskopischen Aufnahmen von Konzentrationsgradienten des fluoreszierenden Sonden-Lipids in stabilem Zustand (Texas-Rot-DHPE), in zwei mikrofabrizierten 200 μm-Korralen. Die Konzentrationsgradienten in diesem Experiment nahmen ein exponentielles Profil an. Die Abbildung, von welcher die Fluoreszenz-Intensitätsspuren berechnet wurden, wurde mit einer Restlicht-Videokamera bei geringer Lichtmenge aufgenommen, die auf die lineare Darstellung von Fluoreszenzintensität angepasst wurde.
Die feldinduzierten Konzentrationsgradienten waren völlig reversibel und nahmen in etwa die gleiche Zeitspanne für die Auflösung in Anspruch, die sie zur Bildung bei 15 V/cm benötigten. Die Profile konnten, ohne jeden offensichtlichen Effekt auf die Membran oder die Bilayer-Barrierenregionen oder Barrieren, durch Umkehr der Feldpolarität wiederholt geändert werden. Die vorstehend beschriebenen feldinduzierten Konzentrationsprofile konnten verwendet werden, um die molekulare Größe, Anhäufung und nicht-ideale Durchmischung zu überprüfen.
BEISPIEL 4
Bilayer-Barrierenregionen funktionieren nicht durch mechanisches Trennen von benachbarten Bilayerflächen
Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Bilayer-Barrierenregionen benachbarte Bilayerflächen durch mechanische Trennung oder durch intrinsische Eigenschaften des Materials isolieren, welches die Bilayerbarrierenoberflächenregionen darstellte. Bilayermembranen wurden, wie vorstehend beschrieben, auf nicht gemusterte SiO₂-Substrate aufgetragen (d.h. ein Substrat, das eine einzelne Bilayer-kompatible Oberfläche aufweist). Die Topographie der Bilayer-kompatiblen Oberfläche war jedoch die gleiche wie die, des vorstehend beschriebenen, mit Photoresist gemusterten SiO₂-Substrats.
Die Kontinuität der Bilayer wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen FRAP und elektrophoretischen Verfahren getestet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Lipidfläche eine einzelne gestützte Membran war, die der Kontur der gewellten Oberfläche ohne Unterbrechung folgte.
BEISPIEL 5
Herstellung einer Anordnungsvorrichtung mit Elektroden unter den gestützten Bilayern
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung vom mit einer dünnen Schicht an Siliziumdioxid überzogenen Siliziumelektroden. Bond-Pads können verwendet werden, um die Drähte mit den Siliziumelektroden zu verbinden.
A. Wafer
Silizium-auf-Oxid-Wafer wurden von Ibis Technology Corporation, Danvers, MA erworben. Die Wafer hatten einen Durchmesser von 100 mm und waren ungefähr 100 μm dick. Wie vom Hersteller bereitgestellt, wiesen die Wafer eine ~ 0,4 μm dicke Siliziumdioxidschicht auf, die unter einer ~ 0,2 μm dicken Schicht von reinem Silizium lag, welche die oberste Oberfläche des Wafers bildete.
B. Prä-Resist-Reinigung und Resist-Beschichtung
Die Wafer wurden mit einem herkömmlichen RCA-Reinigungsverfahren (Kern und Puotinen, 1970; Wolf und Tauber, 1986, S. 516) gereinigt, bei 150°C für 30 Minuten gebacken und mit 1 μm Photoresist (Shipley S-1813) unter herkömmlicher Spinbeschichtung mit einem Track-Beschichtungssystem der Silicon Valley Group (SVG) beschichtet.
C. Aussetzung und Entwicklung
Die Maskenmuster wurden unter Verwendung einer 8-sekündigen Belichtung auf einem Karl Suss MA-4-Kontaktmaskenaligner mit einer Elektronenstrahl-Vorlagenmaske ausgesetzt, welche aus Chrommustern auf einem Quarzsubstrat bestand. Die Wafer wurden dann vor der Entwicklung mit auf Standard-TMAH (Tetramethylammoniumhydroxid)basierendem Entwickler (Shipley) unter Verwendung eines Silicon Valley Group-Track-Entwicklersystems für 15 Minuten in Chlorobenzol getränkt.
D. Ätzen und dünnes Oxidwachstum
Die Elektrodenmuster wurden unter Verwendung von herkömmlichem, auf Fluor basierendem Plasma-Ätzen (Wolf und Tauber, 1986), welches Silizium, aber nicht Siliziumdioxid, selektiv ätzt, in die oberste Siliziumschicht geätzt. Die in der Plasmaätzung verwendeten Gase waren SF₆, O₂ und CHF₃. Nach einer zweiten RCA-Reinigung wurde bei 1000°C in einem Dampfofen bis zu einer Dicke von 0,1 μm eine dünnes Oxid aufgebaut.
E. Muster für Bond-Pads
Eine weitere RCA-Reinigung wurde durchgeführt und eine neue Schicht von Resist wurde, wie vorstehend beschrieben, aufgetragen. Ein neues Muster mit definierten Öffnungen in der im vorigen Schritt aufgebauten Oxidschicht wurde durch Photolithographie, wie vorstehend beschrieben, auf das Resist übertragen und das ausgesetzte Resist wurde dann, wie vorstehend beschrieben, belichtet.
F. Ätzöffnungen für die Bond-Pads
Die Wafer wurden in einem reaktiven Ionenätzgerät von Applied Materials (Santa Clara, CA) geätzt, um in der obersten Oxidschicht Löcher zu öffnen, sodass für die „Bond-Pads" Verbindungen zu der darunter liegenden Siliziumschicht erzeugt werden konnten.
G. Aufgedampftes Gold
Eine 0,3 μm-Goldschicht wurde auf den Wafer aufgedampft, bevor das Resist vom vorhergehenden Schritt entfernt wurde. Dieses Gold wurde dann mit Aceton abgehoben, was in goldenen Bond-Pads resultierte, die in den Löcher lagen, welche im vorhergehenden Schritt geätzt wurden.

Claims

Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung (20), umfassend ein Substrat (22), welches eine Oberfläche besitzt, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen (24) definiert, welche durch eine oder mehrere Bilayer-Barrierenregionen (26) getrennt sind, eine Lipid-Bilayerfläche (30), welche jede der Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen trägt, ein wässriger Film (32), der sich zwischen jeder Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion und der entsprechenden Lipid-Bilayerfläche befindet, und eine große, wässrige Phase (34), welche das Substrat und die Lipid-Bilayerfläche bedeckt, wobei die Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen und die Bilayer-Barrierenoberflächenregionen aus unterschiedlichen Materialen bestehen (22 bzw. 28).
Detektor nach Anspruch 1, wobei die Bilayer-kompatible Oberflächenregion aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SiO, MgF₂, CaF₂ und Mica, geformt ist.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Bilayer-kompatible Oberflächenregion aus SiO₂ geformt ist.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bilayer-Barrierenoberflächenregion aus Gold geformt ist.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bilayer-Barrierenoberflächenregion aus positivem Fotoresist geformt ist.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bilayer-Barrierenoberflächenregion aus Aluminiumoxid geformt ist.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Lipid-Bilayerfläche mindestens ein Lipid umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin und Sphingomyelin.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Lipid-Bilayerfläche Phosphatidylcholin umfaßt.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung zwischen etwa 10 und etwa 100 unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen enthält.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung mindestens etwa 2500 unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen enthält.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung mindestens etwa 25.000 unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen enthält.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung mindestens etwa 2,5 Mio. unterschiedliche Bilayer-kompatible Oberflächenregionen enthält.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen durch Bilayer-Barrierenregionen von einander getrennt sind, welche zwischen etwa 1 μm und etwa 10 μm breit sind.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Lipid-Bilayerflächen auf unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen unterschiedliche Zusammensetzungen haben.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Lipid-Bilayerflächen zusätzlich ein ausgewähltes Biomolekül enthalten und unterschiedliche Flächen unterschiedliche Biomoleküle besitzen.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 15, wobei das Biomolekül ein Transmembranrezeptor oder Ionenkanal ist.
Detektorvorrichtung nach Anspruch 15, wobei das Biomolekül kovalent an ein Lipidmolekül gebunden ist.
Verfahren zum Nachweis eines ausgewählten Liganden in einer Mischung von Liganden, umfassend: (i) das Inkontaktbringen der Mischung mit einer Biosensor-Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung (20), umfassend: ein Substrat (22), welches eine Oberfläche besitzt, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen (24) definiert, welche durch eine oder mehrere Bilayer-Barrierenregionen (26) getrennt sind, eine Lipid-Bilayerfläche (30), welche jede der Bilayer-kompatiblen Oberflächenregionen trägt, wobei jede Fläche eine Vielzahl von Rezeptoren enthält, ein wässriger Film (32), der sich zwischen jeder Bilayer-kompatiblen Oberflächenregion und der entsprechenden Lipid-Bilayerfläche befindet, eine große, wässrige Phase (34), welche die Substratoberfläche und die Lipid-Bilayerflächen bedeckt, wobei mindestens eine Fläche Rezeptoren enthält, die den ausgewählten Liganden spezifisch binden können; und (ii) den Nachweis der Bindung des ausgewählten Liganden an die Rezeptoren, welche ihn spezifisch binden.
Oberflächenanordnungsdetektorvorrichtung nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Biosensor, wobei jede Bilayerfläche eine Art von Rezeptor oder Biomolekül enthält, und unterschiedliche Bilayerflächen unterschiedliche Arten von Rezeptoren oder Biomolekülen enthalten.