DE69716638T2

DE69716638T2 - Oberflächenmuster von affinitätreagentien mittels photoablation

Info

Publication number: DE69716638T2
Application number: DE69716638T
Authority: DE
Inventors: Paul Bercier; Hugues Girault; Alain Laederach; A. Roberts; Brian Seddon
Original assignee: ECOLE POLYTECH; Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: ECOLE POLYTECH; Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-27
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2017-11-28
Also published as: EP0944834A1; DE69716638D1; EP0944834B1; WO1998023957A1; GB9624686D0

Description

Hintergrund der Erfindung

An vielen in jüngerer Zeit erzielten Fortschritten bei der chemischen Analyse ist der Einbau von Biomolekülen, die in der Lage sind, selektiv und mit hoher Affinität an gewünschte Analyten zu binden, beteiligt. Solche Vorrichtungen werden häufig als Biosensoren bezeichnet, bei denen eine Übertragung des Bindungsereignisses in ein elektronisches Signal in Echtzeit stattfindet, doch zählen dazu auch Analysetechniken wie etwa die Affinitätschromatographie, der Immungssay und die Enzymreaktion ebenso wie die Nukleinsäurehybridisierung, die in analytischen Polymerase- Kettenreaktions-(Polymerase Chain Reaction, PGR) Vorrichtungen durchgeführt werden kann. Bioanalysevorrichtungen, in denen diese Techniken genutzt werden, wurden bereits auf einen breiten Bereich von Anwendungen in der Medizin, der Landwirtschaft, der Industriehygiene sowie des Umweltschutzes angewendet. Ebenso besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung modifizierter Materialien in biomedizinischen Implantaten, Protheseapparaturen, Kathetern, usw. Weiterhin gibt es das noch junge Gebiet der bioelektronischen und biomimetischen Materialien, die sich bei der Verarbeitung von Informationen, die von der Übertragung gewisser molekularer Erkennungsereignisse¹ abhängen, verwenden lassen.
Ebenfalls gab es in jüngerer Zeit verstärkte Aktivitäten bei der Miniaturisierung von chemischen Geräten. Es wurden Anstrengungen unternommen, ganze Laborsysteme auf Mikrochipträger zu verkleinern, wobei oftmals die Kapillarelektrophorese (Capillary Electrophoresis, CE) als Hauptanalysetechnik² eingesetzt wurde. Diese Systeme wurden als "Micro-Total Analytical Systems" (u-TAS)³ bezeichnet. Es sind bereits einige vielversprechende bioanalytische Anwendungen, die auf innerhalb von mikrofabrizierten Fluid-Handling-Plattformen&sup4;&supmin;&sup7; mobilisierten Rezeptoren beruhen, demonstriert worden.
Für die weitere Entwicklung all dieser Technologien ist die Immobilisierungstechnik entscheidend. In vielen Fällen wurde die Kommerzialisierung neuer Ideen entweder durch unzureichende, instabile oder durch nicht reproduzierbare Immobilisierung der Biomolekülkomponenten&sup8; erschwert. In der Vergangenheit wurde die Immobilisierung durch Adsorption, Einfangen, nicht kovalentes Binden sowie durch kovalente Konjugation durchgeführt, gewöhnlich jedoch nur durch Anwendung von Ganzlösungstechniken und ohne die Fähigkeit zur sorgfältigen räumlichen Darstellung von Mustern&sup9;.
Es besteht daher ein großes Interesse an der Entwicklung von Techniken zur selektiven und ortsspezifischen Immobilisierung von Biomolekülreagenzien auf den Komponentenoberflächen von Analysevorrichtungen. Bei einem erst jüngst erzielten Fortschritt bei der gemusterten Immobilisierung werden Bakterienzellen verwendet, um eine Maske von chemischen Modifikationen auf Polymeroberflächen¹&sup0; aufzubringen. Nach Entfernung der Bakterien bindet das reaktive Polymer fluoreszenzmarkierte Antikörper innerhalb der auf den Polymeroberflächen befindlichen Bereiche von der Größe der Bakterien. Diese Behandlung ist noch von aus mehreren Schritten bestehenden naßchemischen Behandlungen abhängig und ist im wesentlichen eine Nachweistechnik für Bakterien. Mit Bezug auf eine gemusterte Immobilisierung von Nukleinsäuren wurde in einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel über vielversprechende neue DNA-Sequenztechniken vorgeschlagen, mikrofabrizierte Arrays immobilisierter Nukleinsäuresequenzen zu entwickeln, so daß eine Apparatur für paralleles und automatisches Sequenzieren produziert werden kann¹¹. Daher läßt sich der gegenwärtige Stand der Technik als eine aktive Suche nach neuen Techniken für die gemusterte Immobilisierung ansehen.
In Ligler, F. S. et al. US-Patent Nr. 5,391,463 wird eine mustererzeugende Technik, um Biomoleküle auf Siliciumdioxidoberflächen, die mit heterobifunktionalen quervernetzten Reagenzien kovalent modifiziert wurden, kovalent zu binden, beschrieben. Es konnte gezeigt werden, daß durch die UV-Bestrahlung solcher Oberflächen, die Thiol-, Expoxy- oder vicinale Diolfunktionen enthielten, Biomolekülmuster unter Verwendung einer Photomaske erzeugt werden konnten. Dieses Verfahren leidet jedoch an seiner Abhängigkeit von der kovalenten Modifikation des Trägermaterials vor der Bestrahlung und daran, daß kovalente, Chemie benötigt wird, um die Biomoleküle nach dem Bestrahlungsschritt zu binden. Weiterhin wurden zwar Musterbereiche, die der UV-Bestrahlung ausgesetzt waren, resistenter gegenüber nicht spezifischer Proteinadsorption, doch war dieser Effekt immer noch deutlich und meßbar (zwischen 13 und 54% der nicht bestrahlten Bereiche, je nach verwendetem quervernetztem Molekül). Ebenso ist es wichtig daraufhinzuweisen, daß es sich bei der von Ligler et al. offenbarten Technik eindeutig nicht um UV-Photoablation, sondern nur um UV-Bestrahlung handelt. Für die UV-Photoablation werden nämlich deutlich höhere Laserpulsenergien als die in jener Arbeit verwendeten benötigt, und außerdem handelt es sich bei der UV-Photoablation um ein vollkommen eigenständiges physikalisches Phänomen, das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung vorteilhaft bei der Erzeugung von Biomustern von Biomolekülen und chemischen Substanzen benutzt wird.
In WO 94/23295 wird ein Substrat mit einem photoablatierten Loch beschrieben. Antikörper lassen sich an die innere Oberfläche des Loches oder in der Nachbarschaft des Loches anbringen, jedoch nicht an einer Oberfläche, die durch Photoablation rauh gemacht wurde.
In den am 19. Dezember 1996 veröffentlichten WO 94/08236, WO 91/08474 und WO 96/39937 werden jeweils Substrate beschrieben, die photoablatiert wurden und an die ein Reagens gebunden wurde, jedoch nicht an den photoablatierten Substratbereich.
In der am 26. Juni 1997 veröffentlichten WO 97/22875 wird ein Substrat beschrieben, das laserhydrophylisiert wurde und an das ein Reagens gebunden ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, ein neues Verfahren zur Erzeugung von Mustern von Biomolekülen und chemischen Substanzen in Form von 2- und 3-dimensionalen Mustern auf UV-absorbierenden Substratmaterialien bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Materialoberflächen mit verbesserter Immobilisierungskapazität für Biomoleküle wie z. B. Proteine, Nukleinsäuren und Lipidfilmen mittels physikalischer Adsorption.
Eine weitere Aufgabe der Vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Materialoberflächen mit verbesserter Funktionalisierung chemischer Gruppen für nachfolgende kovalente Konjugationsverfahren.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Oberflächen mit Schutzschichten wie z. B. adsorbierten nicht spezifischen Proteinschichten, chemisch konjugierten Lipidfilmen, laminierten Polymeren, Adhäsionsmitteln oder Photoresist-Molekülen, die unter Verwendung der UV-Laserphotoablation in Mustern aufgetragen werden können.
Noch eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Nutzung der mit dem UV-Laser ablatierten geschützten Oberflächen als eine Kontaktmaske für das nachfolgende Auftragen von Mustern von Biomolekülen und chemischen Substanzen auf das darunterliegende Polymersubstrat.
Diese und weitere Aufgaben, die während der folgenden genauen Beschreibung der vorliegenden Erfindung ersichtlich werden, wurde von den Erfindern durch Verwendung der UV-Laserphotoablation (im Gegensatz zu einfacher Betrahlung) gelöst, wodurch eine verbesserte Funktionalisierung von Polymeroberflächen, eine verbesserte Biomolekülimmobilisierungskapazität sowie eine verbesserte Erzeugung von Biomolekülmustern mit einer Auflösung im um-(Mikron-)Bereich unter Verwendung gebundener Schutzschichten ermöglicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines Affinitätsreagensmusters, wie in Anspruch 1 dargelegt, sowie eines Musters eines biologischen oder chemischen Sensors, wie in Anspruch 14 dargelegt, bereit.
In der vorliegenden Erfindung wird ein von einem UV-Excimerlaser induziertes Photoablationsverfahren zur Herstellung von Kontaktmasken durch Schutzschichten hindurch, die direkt über UV-absorbierenden Substratmaterialien liegen, verwendet, und gleichzeitig werden in solchen Substraten physikalische und chemische Veränderungen, die zu einem großen Anstieg in der Immobilisierungskapazität von Biomolekülen führen, induziert. In der vorliegenden Erfindung werden UV-Laserflüsse von mehr als 0,5 J cm&supmin;² pro Puls verwendet, wobei es sich eindeutig um ein Photoablationsregime und nicht um einfache UV-Bestrahlung handelt. Die vorliegende Erfindung ist nicht ausschließlich auf die kovalente Bindung von Biomolekülen angewiesen, sondern kann auch physikalische Adsorption oder nichtkovalente Bindungen für einfache, Einschritt-Immobilisierungstechniken nutzen. Die vorliegende Erfindung bietet einfache Handhabung, während die Fähigkeit eines UV-Lasers, Materialien durch Photoablation in reaktive und nicht reaktive Bereiche mit einer Auflösung im um-(Mikron-) bzw. < 1 um-(Submikron-) Bereich zu definieren, beibehalten wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird nun beispielhaft nur mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1a und 1b schematische perspektivische Ansichten eines UV-Laser-Mikromaschinenprozesses gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2a bis 2c das Erzeugen von Biomustern auf proteinblockierten Polymeroberflächen mit einem UV-Laser;
Fig. 3a bis 3c das Erzeugen von Biomustern auf laminatblockierten Polymeroberflächen mit einem UV-Laser;
Fig. 4a eine lichtmikroskopische Aufnahme, die das Erzeugen eines Avidin-Biomusters unter Verwendung von UV-Laserphotoablation zeigt;
Fig. 4b eine Kontrolle, in der kein Avidin verwendet wurde;
Fig. 5 ein Strom-Spannungsdiagramm, das das Erzeugen eines β-Galactosidase-Biomusters unter Verwendung der UV-Laserphotoablation demonstriert;
Fig. 6a bis 6c schematische Diagramme eines UV-Laser definierten Mikrokanals zur Konzentration und Trennung von Analyten in Lösung;
Fig. 7 eine Rasterelektronenmikroskop (SEM)-Aufnahme eines UV-Laser-fabrizierten Mikrowell-Arrays für die Nukleinsäureanalyse; und
Fig. 8 einen Sandwich-Immungssay, ermöglicht durch das Erzeugen eines Musters mit einem UV-Laser.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Maschinelle Herstellung und Charakterisierung von UV-Laser-photoablatierten Mikromustern

Durch Photoablation nach Wechselwirkung mit UV-Laserstrahlung (λ < 330 nm; Fluß > 0,5 J cm&supmin;² pro Puls) lassen sich Strukturen in verschiedenen kommmerziell erhältlichen Polymeren formen. Zu diesen Polymeren gibt es einen Übersichtsartikel¹&sup4;, jedoch zählen dazu Celluloseacetat, Nitrocellulose, Polycarbonat, Polyimid, Poly(methylmethacrylat) (PMMA), Polystyrol, Polyethylenterephthalat) (PET) und Poly(tetrafluorethylen). Der Photoablationsvorgang beinhaltet eine Absorption im UV-Bereich mit gleichzeitigen Elektronenübergängen vom Singulett-Grundzustand zu den ersten angeregten Singulettzuständen, ein schnelles Aufbrechen der Bindungen innerhalb der langkettigen Polymermoleküle sowie das anschließende Herausschleudern von Substrat aus der Oberfläche in Form einer Miniexplosion, wobei eine photoablatierte Aushöhlung¹&sup4; 3 zurückbleibt, wie in Fig. 1b gezeigt.
Die Laserenergie läßt sich unter Verwendung einer Photomaske in ein spezifisches Muster bringen, wobei nachfolgend Mikrohöhlungen und Kanäle mit unterschiedlicher Geometrie erzeugt werden. Durch die Verwendung von faseroptischen Lichtleitern kann die Laserenergie sogar in ein noch kleiner dimensioniertes Muster gebracht werden. Solche Lichtleiter sind dazu in der Lage, eine UV-Laserenergie von mehreren hundert mJ pro Puls zu transportieren und können mit kleinen Spitzen ausgerüstet sein, wobei dem Fachmann bekannte Techniken verwendet werden, so daß die Lichtleiter eine Öffnung aufweisen, die deutlich innerhalb des Submikronbereichs (250-1000 nm) liegt. Durch die möglichst nahe Positionierung solcher Lichtleiterspitzen an der Oberfläche des UV-absorbierenden Substrats lassen sich Strukturen mit einer 2-dimensionalen Auflösung, die dem Durchmesser der Lichtleiteröffnung sehr nahe kommt, genau und reproduzierbar herstellen.
Die entstehenden Strukturen sind im allgemeinen dadurch gekennzeichnet, daß sie nur geringe temperaturbedingte Schäden aufweisen und gerade senkrechte Wände sowie eine gut definierte Tiefe besitzen. Muster lassen sich bis weit in den Submikronbereich hinein definieren, jedoch wird hier ein allgemeiner Arbeitsbereich für die Erzeugung von Mustern biologischer oder chemischer Substanzen mit 1-1000 um angegeben.
Es ist für die hier beschriebenen Experimente notwendig, nur eine einfache, aus Geraden und Löchern bestehende Maskengeometrie zu verwenden, doch ist sich der Fachmann darüber im klaren, daß sich kompliziertere Masken leicht mit anderen Mikrofabrikationstechniken wie z. B. der Kontaktlithographie herstellen lassen. In den Fig. 1a und 1b werden (nicht maßstabsgetreue) lineare Muster gezeigt, für die eine 10 · 0,4 mm große Maske¹ mechanisch in einer Kupferfolie hergestellt wurde. Für kreisförmige Muster wurden kreisförmige Masken mit einem Durchmesser von 1, 5 und 10 mm (nicht gezeigt) maschinell in 5 mm dicke Stahlplatten gebohrt. Zur Projektion der UV-Laserstrahlung (193 nm, Pulsgeschwindigkeit = 10-50 Hz), durch die Pfeile A angedeutet, durch diese Masken sowie ein 10 : 1 Teleobjektiv hindurch und danach auf verschiedene Polymersubstrate. 2 (Oberflächenenergie: 1,6 J cm&supmin;² pro Puls)" wird ein Excimerlaser (LPX 205 i, Lambda Physik GmbH, Göttingen) verwendet. Dadurch wird von jedem Laserpuls eine ablatierte Höhlung 3 mit einer Querschittsfläche von 1 · 0,04 mm bei Verwendung der in Fig. 1a gezeigten Linienmaske sowie ein Loch mit einem Durchmesser von 0,1, 0,5 oder 1 mm bei Verwendung der kreisförmigen Masken erzeugt.
Vor der maschinellen Bearbeitung mit dem Laser werden alle Substratproben durch Spülen mit destilliertem Wasser und anschließendes Trocknen mit Preßluft gereinigt. Danach wird vorzugsweise und vor der UV-Laserphotoablation eine Schutzschicht aufgetragen. Bei dieser Schutzschicht kann es sich um eine Schicht aus adsorbiertem Protein wie z. B. Rinderserumalbumin, Hühnereialbumin, menschliches Serumalbumin, sonstiges Albumin, entfettete Trockenmilch (Non-Fat Dry Milk, NFDM) oder um jede beliebige andere geeignete Proteinlösung, mit der das Substratmaterial effizient und homogen beschichtet werden kann, handeln. Ein Beispiel einer Schutzschicht aus adsorbiertem Protein 4 ist in Fig. 2a gezeigt. Diese Schutzschicht kann auch aus chemisch konjugierten Spezies wie z. B. Lipid-Einfachschichten, von selbst zusammengesetzten Schichten, Fettsäureketten, Kohlenhydratanteilen oder anderen geeigneten Substanzen bestehen. Eine alternative Schutzschicht besteht aus einem Polymerlaminat wie z. B. Poly(ethylenterephthalat)/Polyethylen (PET/PE) oder einem anderen geeigneten Polymer, das die Eigenschaft einer schnellen Anhaftung bei niedriger Temperatur an das Grundsubstrat besitzt. Ein Beispiel für eine an ein Polymersubstrat anhaftende laminierte Schutzschicht 5 ist in Fig. 3a gezeigt. Diese Schutzschicht kann auch aus anderen, mit verschiedenen Techniken aufgetragenen Materialarten bestehen, die Adhäsionsmittel, im Siebdruck aufgetragene Polymere sowie mit Spincoating aufgetragene Photoresistschichten einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Der Fachmann sollte sich darüber im klaren sein, daß es sich bei den hier erwähnten Substanzen nur um einen kleinen Teil der möglichen Schutzschichten, die auf UV-Laser-photoablative Substrate aufgetragen werden können, handelt und daß diese Schichte n nur zur Erzeugung einer allgemeinen Maske für das Muster der aufzutragenden Substanz dienen sollen. Man sollte sich ebenfalls darüber bewußt sein, daß eine solche Maske sowohl positiv als auch negativ sein kann, daß nämlich die chemischen Eigenschaften der Maske die gewünschte Spezies entweder in einer Art semi-permanenter Weise oder vollständig entweder abblocken oder anziehen können. Der nachfolgende UV-Ablationsschritt dient dazu, die geschützte Oberfläche in bestimmte Bereiche, die diese chemische Eigenschaft (nicht ablatiert) besitzen, und in Bereiche, die sie nicht besitzen (ablatiert), festzulegen.
Um eine wie in Fig. 2a gezeigte adsorbierte Schutzschicht zu erhalten, können die Substratproben einfach in eine hochkonzentrierte Lösung von RSA bzw. NFDM (10 mg/ml in 60 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7,0) bei Raumtemperatur 2-4 Stunden lang getaucht werden. Solche Lösungen "nicht spezifischer" Proteine sind bekannt dafür, daß sie in hochkonzentrierter Form an Polymermaterialien, die in ihrer unablatierten Form viele Jahre lang als Plattformen für das diagnostische Screening verwendet worden sind9, ¹², binden. In hohen Konzentrationen aufgetragen, adsorbieren sie in dicht gepackten Schichten und versuchen, die verfügbare Substratoberfläche soweit wie möglich zu besetzen. Aufgrund der Tatsache, daß die physikalische Adsorption solcher Substanzen semi-permanent ist, wird eine nachfolgende Auftragung von Biomolekülen an einer engen, Wechselwirkung mit dem Substratmaterial gehindert und nur locker an die Proteinschutzschicht gebunden. Diese Substanzen lassen sich dann von der Oberfläche abwaschen, wobei nur das proteingeschützte Substrat zurückbleibt.
Zur Herstellung der in Fig. 3a gezeigten laminierten Schutzschicht wird eine 35 um dicke Schicht 4 aus PET/PE für 3 Sekunden bei 125ºC auf das Substrat² aufgerollt. Die in den Fig. 2 und 3 dargestellten Techniken dienen beide dazu, eine gleichförmige "positive" Maske herzustellen, indem jede nachfolgende Wechselwirkung mit Rezeptoren, Enzymen oder chemischen Substanzen von allgemeinem Interesse blockiert wird.
Zur Herstellung von Mustern mit einer PET/PE-Polymerlaminatschutzschicht ist es zunächst notwendig, diese Schicht vor dem Aufbringen des Musters auf das darunterliegende Substrat vollständig zu ablatieren. Es wurde festgestellt, daß ungefähr 200 Pulse benötigt wurden, um das 35 um dicke Laminat vollständig zu ablatieren. Strukturen wie z. B. der u-Kanal 3 konnten dann in dem Substrat mittels zusätzlicher UV-Laserpulse entwickelt werden. Lineare Kanäle wurden normalerweise auf Polycarbonat durch Pulsen des Lasers für 3 Sekunden bei 50 Hz hergestellt. Dies entspricht 150 Pulsen, und es wurde festgestellt, daß dadurch die linearen Strukturen 3 ungefähr 17 um tief in das Grundsubstrat hinein hergestellt werden, nachdem das Muster des 35 um dicken Laminats ablatiert wurde. Für alle linearen Strukturen mit einer adsorbierten Proteinschutzschicht wird lediglich die Anzahl an Pulsen, die für die gewünschte Strukturtiefe erforderlich ist, benötigt, das heißt, daß die Entfernung des Proteins so gut wie keine Energie benötigt. Je nachdem, ob die Erzeugung des Musters in tiefen Strukturen oder nahe der Oberfläche gewünscht ist, kann dies bei allen Schutzmaskierungstechniken im Bereich von 0-200 um liegen.
Man ließ ein Affinitätsreagens an das photoablatierte Polymer durch laserdefinierte Öffnungen in einer Schutzschicht hindurch physikalisch adsorbieren. Im Fall eines PET/PE-Schutzlaminats wird die Laminierung nach gründlichem. Waschen einfach abgezogen, wobei nur die laserdefinierten Bereiche mit immobilisiertem Affinitätsreagens wie in Fig. 3d gezeigt zurückbleiben.
Es sollte vom Fachmann gleichfalls erkannt werden, daß sich alternativ komplexere Geometrien durch Verwendung komplizierterer Photomasken herstellen lassen. Unter Verwendung der Kontaktlithographie sowie anderer Techniken, die in der integrierte Schaltkreise herstellenden Industrie allgemein bekannt sind, können komplexere ablatierte Muster erzeugt werden. Die Photomasken werden einfach vor den Excimerlaser plaziert, und durch wiederholtes Pulsen werden Ablationsmuster durch unterschiedliche Masken hindurch auf das Substrat aufgetragen.

Charakterisierung photoablatierter Höhlungen

Das Verhältnis zwischen der Anzahl an Laserpulsen, der Laserfrequenz sowie der resultierenden u-Kanaltiefe wurde mittels SEM¹³ untersucht. Proben wurden unter Verwendung eines statischen Substrats sowie einer Photomaske mit den zuvor beschriebenen Abmessungen erzeugt. Hochenergie-UV-Laserpulse (2 J cm&supmin;² pro Puls) wurden auf eine Polycarbonatoberfläche fokussiert und 0-1000 Pulse bei 10, 20 und 50 Hz abgefeuert. Die Proben wurden danach mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) analysiert. In dieser Weise konnte die Kanaltiefe unter Verwendung eines hohen Kippwinkels (60º) und nachfolgenden Messungen eines exponierten Tiefenprofils bestimmt werden. Es wurde gefunden, daß die Kanaltiefe im wesentlichen linear verläuft (und sich nicht frequenzabhängig ändert), gemäß der Beziehung: Tiefe (um) = 0,17*N, wobei N = Anzahl der Laserpulse.
In vielen Fällen ist das gewünschte Ergebnis das Aufbringen eines Musters von chemischen Substanzen auf die Oberfläche, und daher wird nur eine geringe Anzahl an Pulsen benötigt, um das Muster auf die Schutzschicht aufzubringen, wodurch eine eigentliche Struktur im Substrat nur in geringem Ausmaß erzeugt wird. In komplizierteren Vorrichtungen, vor allem bei Fluid- Handling-Komponenten, kann eine hohe Anzahl von Pulsen verwendet werden, die über das gewünschte 2-dimensionale Muster hinweg unterschiedlich appliziert werden. Diese Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens gestattet das Aufbringen von Mustern von biologischen und chemischen Substanzen in unterschiedlicher Tiefe auf das Substrat, wodurch ein 3-dimensionales Muster erzeugt wird.
Es sollte festgehalten werden, daß die mit dieser Technik hergestellte Höhlungsgeometrie über ihr gesamtes Tiefenprofil nur wenig variiert, d. h. es werden sehr gerade Seitenwände mit einem hohen Aspektverhältnis produziert, wie mittels Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM) und SEM beobachtet wurde¹³. Die untere Oberfläche weist ebenfalls eine erhöhte Rauhigkeit und damit eine vergrößerte Oberfläche auf, wie in Tabelle 1 angedeutet. Tabelle 1
Es wurde beobachtet, daß die Rauhigkeit unablatierter Polymersubstrate nur eine Tiefenabweichung von 0,01 um über einen 70 · 70 um Querschnitt hinweg aufweist. Photoablatierte Polycarbonat und Polystyroloberflächen scheinen eine kleine wellenförmige Rauhigkeit zu besitzen und sind einander sehr ähnlich, mit Abweichungen von der durchschnittlichen Tiefe von 0,13 um. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, daß Celluloseacetat- und Poly(ethylenterephthalat)oberflächen sehr ausgeprägte rauhe Vorsprünge im Submikronmaßstab zeigen und sich in der Gesamtgröße dieses Effekts unterscheiden. Photoablatiertes Celluloseacetat zeigte einen Anstieg in der Rauhigkeit (0,27 um gesamt) gegenüber den obenerwähnten Substanzen, jedoch zeigte Poly(ethylenterephthalat) den größten Anstieg mit einer Gesamttiefenabweichung von 0,40 um. Vom Gesichtspunkt der Entwicklung mikrofabrizierter diagnostischer Assays aus gesehen könnte die vergrößerte Oberfläche, die insbesondere bei photoablatiertem Polyethylenterephthalat) auftrat, sehr nützlich bei der Ablagerung von Rezeptor- und Ligandenzonen sein. Die Größe der chemischen Adsorption steht im Zusammenhang mit der photoablativ induzierten Ladung und der Oberfläche der entstandenen Mikrostruktur. Die Vergrößerung der Oberfläche aufgrund der beobachteten Zunahme der Rauhigkeit führt zum Anstieg der Adsorption.
Die Adsorptionskapazität photoablatierter Polymere wurde ebenfalls untersucht, wobei RSA als Modellprotein verwendet wurde, das die relativen Unterschiede zwischen den verschiedenen untersuchten Oberflächen zeigen sollte, und die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 ersichtlich. Tabelle 2
Die unablatierten Polymersubstrate zeigten nur geringe Unterschiede bei der Proteinadsorption mit einem Durchschnitt von 1,32 ug RSA/cm², wie mit dem Bicinchonsäure (Bicinchoninic Acid, BCA)-Test (mißt die Reduktion von Kupfer durch Aminosäuren¹&sup4;) gemessen. Dieser Wert liegt höher als der in der Literatur&sup9; beschriebene Wert von 0,4 ug Protein/cm². Unsere Beobachtungen wurden nur für RSA, ein Protein, bei dem erwartet werden darf, daß es im Vergleich mit einer Allgemeinbeobachtung mehrerer unterschiedlicher Proteine Adsorptionsunterschiede zeigt, durchgeführt.
Obwohl der BCA-Test die Fähigkeit des Proteins zur Reduktion von Kupfer, die durch jede durch adsorptive Immobilisierung verursachte Denaturierung verstärkt werden kann, mißt, darf man erwarten, daß die relativen Unterschiede bei den hier untersuchten verschiedenen Oberflächen von dem Test korrekt bestimmt werden.
Die ablatierten Polymere zeigen dramatische Unterschiede in ihren Proteinadsorptionseigenschaften, die von 6,7-241,1 ug RSA/cm² reichen. Diese Menge ist nur für eine Querschnittsfläche auf der Ebene des ursprünglichen Polymersubstrats berechnet, doch wird mit den photoablativen Prozessen eine große Änderung in der Rauhigkeit herbeigeführt, und daher ist die wahre Oberfläche viel größer. Dies ist einer der Hauptgründe für den von uns beobachteten großen Anstieg in der Proteinadsorption. Die Adsorptionskapazität für RSA steigt in der folgenden Reihenfolge an: Celluloseacetat < PET < Polystyrol < Polycarbonat < Polyimid.
Ein nützlicher Faktor, der bei der Auswertung des Verfahrens UV-photoablativ induzierter Änderungen in der Immobilisierungskapazität berücksichtigt werden sollte, ist das Verhältnis der Adsorption an ablatiertem Polymer zur Adsorption an nicht ablatiertem Polymer, wie in Tabelle 2 gezeigt. Dies wurde hier nach der Formel: F = A/N, mit A = Masse pro Flächeneinheit an an ablatiertem Polymer adsorbiertem Protein und N = Masse pro Flächeneinheit an an nicht ablatiertem Polymer adsorbiertem Protein berechnet. Wird der Adsorptionsfaktor (F) einbezogen, so steigt die Adsorptionskapazität in der Reihenfolge Celluloseacetat < Polycarbonat < Polystyrol < Polyimid < PET an. Diese Polymere besitzen alle eine stark erhöhte Rauhigkeit nach Photoablation, ebenso wie eine erhöhte Proteinadsorptionskapazität. Der Anstieg korreliert in der Unterreihenfolge: Polycarbonat < Polystyrol < PET, doch handelt es sich bei dem Wert für Celluloseacetat um einen Ausreißer. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß photoablatierte Polymere eine chemisch modifizierte Oberflächenzusammensetzung aufweisen, die oft mit einer Oberflächenoxidation assoziiert ist, wenn die Ablation an der Luft durchgeführt wird, woraus die Aufnahme von Luftsauerstoff während des Photoablationsvorgangs folgt. Der Adsorptionsanstieg hat seine Ursache wahrscheinlich nicht nur in einer Erhöhung der Rauhigkeit, sondern auch in der spezifischen chemischen Beschaffenheit von funktionalen Gruppen, die während der UV-Laserphotoablation erzeugt werden.
Es sollte hier angemerkt werden, daß alle Proteinadsorptionsexperimente nicht nur einen Anstieg in der Adsorptionskapazität bei photoablatierten Polymeren zeigen, sondern auch, daß diese Bereiche durch Definieren der UV-Laserstrahlgeometrie mit einem 2-dimensionalen Muster versehen werden können. Alle BCA-Tests an photoablatierten Polymeren wurden über ablatierten Wells mit einem Durchmesser von 1 mm durchgeführt, und nach Entfernen des Laminats konnte kein Protein außerhalb der ablatierten Fläche gemessen werden. Daher wurde beobachtet, daß die 35 um dicke PET/PE-laminierte Schutzschicht die Bindung nicht spezifischer Proteine an Flächen außerhalb der Laserablatierten Bereiche vollständig blockiert. Dies ist ein signifikanter Vorteil gegenüber dem Stand der Technik für das Aufbringen von Biomustern.
Es wird hier ebenfalls demonstriert, daß ein Modellrezeptor, nämlich Avidin aus Eiweiß, in solchen mikrofabrizierten Mustern immobilisiert werden kann. Dieses Experiment demonstriert zwei zusätzliche Konzepte, die eine zentrale Rolle beim Aufbringen von Biomustern mit der UV-Laserphotoablationstechnik spielen; 1) Rezeptoren können auf photoablatierte Oberflächen unter Beibehaltung ihrer Bindungsaktivität für einen Liganden immobilisiert werden, und 2) daß in dieser Weise gebundene Rezeptoren in einem Muster mit hoher Auflösung aufgebracht werden können.
Avidin wurde physikalisch an photoablatiertes Polycarbonat durch laserdefinierte Öffnungen (Mikrowells mit 1 mm Durchmesser) in einem PET/PE-Schutzlaminat, wie zuvor beschrieben und in Fig. 3c gezeigt, adsorbieren gelassen. Nach dem Waschen wurde die Laminierung abgezogen, wobei nur laserdefinierte Flächen mit immobilisiertem Avidin wie in Fig. 3d gezeigt zurückblieben. Es konnte bereits gezeigt werden, daß biotinylierte Liposomen eine hohe Affinität zu Avidin in Lösung ebenso wie zu an Polymeroberflächen immobilisiertem Avidin aufweisen12, ¹&sup5;&supmin;¹&sup7;. Zehn ul Liposomlösungen mit 0,1 Mol-% Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin-Biotin-Konjugat (Molecular Probes, Engene Oregon) und 200 mM verkapseltes Sulfarhodamin-B wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur über den photoablatierten Mikrowells sowie den Kontrolloberflächen inkubiert. Die gesamte Oberfläche der Polycarbonatprobe wurde dann 60 Sekunden mit 67 mM PBS gründlich gewaschen. Die Liposomen blieben an der Oberfläche der UV-Laserdefinierten Mikrowells über eine nichtkovalente Avidin- Biotin-Verknüpfung gebunden, wie in Fig. 4a gezeigt. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß nur wenig oder gar keine Liposomenbindung an nicht mit Avidin inkubierten, laserbehandelten Flächen vorlag, wie aus Fig. 4b ersichtlich ist, womit gezeigt wird, daß der Avidinrezeptor tatsächlich in dem vom Laser definierten Bereich immobilisiert worden war und für das Einfangen biotinylierter Liposomen verantwortlich war. Aus Fig. 4a ist weiterhin ersichtlich, daß die Grenzen zwischen den ablatierten und den nicht ablatierten Bereichen scharf und gut definiert sind. Ein UV-Excimerlaser kann Strukturen mit gut aufgelösten Merkmalen im unteren Mikronbereich erzeugen. Daher ermöglicht die Anwendung dieser Technik die Erzeugung von Biomolekülmustern auf Polymeroberflächen mit der gleichen Mikronauflösung.
Das Enzym β-Galactosidase läßt sich ebenfalls unter Verwendung der vorliegenden Erfindung in einem Biomuster aufbringen und behält nach Immobilisierung auf UV-Laser-photoablatierten Oberflächen seine enzymatische Aktivität. β-Galactosidase wurde physikalisch and photoablatiertes Polycarbonat durch laserdefinierte Öffnungen (Mikrowells von 1 mm Durchmesser) in einem PET/PE-Schutzlaminat wie zuvor beschrieben adsorbieren gelassen. Nach dem Waschen wurde die Laminierung abgezogen, wobei nur laserdefinierte Flächen mit immobilisierter β-Galactosidase zurückblieben. Substratlösungen (10 ul große Tropfen aus Aminophenylgalaktosid (APG) in 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,4, mit 1 mg/ml MgCl&sub2;) wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur über photoablatierten Mikrowells sowie Kontrolloberflächen inkubiert. Eine im Eigenbau hergestellte Zwei-Elektroden-Mikrosonde (Arbeitselektrode = im Siebdruck aufgebrachter Kohlenstoff, Referenz = im Siebdruck aufgebrachte Ag/AgCl-Paste) wurde dann in die Substratlösungen eingeführt, und das Potential der Arbeitselektrode wurde bei 50 mV s&supmin;¹ gescannt. Das Strom/Spannungs-Kreisdiagramm sowohl für die Kontrolle (Substrat über Mikrowell mit keiner β- Galactosidase) als auch die Testlösung (Substrat über Mikrowell mit β-Galactosidase) ist in Fig. 5 gezeigt. Die Umsetzung von APG in Aminophenol und Galaktose ist aus dem Oxidationsstrom bei 200 mV, der die Anwesenheit von Aminophenol und damit β-Galactosidaseaktivität anzeigt, klar ersichtlich. Dieses Experiment zeigt, daß β-Galactosidase in einem, Muster innerhalb eines photoablatierten Mikrowells aufgebracht wurde, und daß die immobilisierte Spezies immer noch enzymatisch aktiv ist.
Es sollte ebenfalls angemerkt werden, daß die kovalente Bindung von Affinitätsmatrizen gleichfalls unter Verwendung der UV-Laserphotoablation zu Zwecken, die den oben beschriebenen ähnlich sind, definiert werden kann. Da beobachtet werden konnte, daß der Photoablationsvorgang chemisch modifizierte Oberflächen produziert, steht der dadurch definierte nicht blockierte Polymerabschnitt ebenfalls für die kovalente Modifikation zur Verfügung. Zwischen diesen funktionalen Oberflächengruppen und Aminosäureseitenketten, die auf Proteinstrukturen wie z. B. Enzymen und Rezeptoren vorliegen, können einfache Peptidverknüpfungen ausgebildet werden. Dies läßt sich durch Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid, erreichen. Auf diese Weise oder mittels anderer geeigneter Verfahren der chemischen Bindung können Proteine, Phospholipide, Aminosäuren und andere gewünschte Komponenten gebunden werden. Es sollte hervorgehoben werden, daß, wenn der erste Blockierungsschritt ausreicht, dann jede Art dieser Bindungen auf den Bereich, der durch den maschinellen UV- Laserherstellungsprozeß festgelegt ist, lokalisiert ist.
Beispiele für die Erzeugung von Biomolekülmustern durch UV-Laserphotoablation.

Beispiel 1

Das oben beschriebene UV-Laserphotoablationsverfahren läßt sich zur Erzeugung von Mustern von biologischen und anderen Affinitätsmatrizen in mikrofabrizierten Kanälen, aus diesen Kanälen bestehenden Netzwerken oder auf der, Oberfläche eines beliebigen geeigneten UV-absorbierenden Substrats, wie z. B. Polymeren, Keramiken, usw., verwenden. Das vorliegende Verfahren ist besonders vorteilhaft für mikrofabrizierte Kanäle, dadurch daß es deren präzise Aufteilung in reaktive und nicht reaktive Bereiche erlaubt.
Eine Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens beinhaltet die Herstellung der gewünschten Mikrostruktur mit einem UV-Laser, wie beispielsweise in EP-A-0708331 beschrieben. Diese gemusterte Oberfläche wird dann geschützt oder blockiert, wie in Fig. 2a dargestellt, wobei eine Anzahl von Standardreagenzien, die von der genauen Beschaffenheit der aufzutragenden Komponente abhängen, verwendet wird. Beispielsweise reicht eine 5 gew.-%ige NFDM-Lösung bekanntermaßen zur Blockierung einer Polystyroloberfläche aus, falls es sich bei dem aufzutragenden Reagens um einen Antikörper handelt und falls die Oberfläche in einem Immungssay verwendet werden soll. Die Dicke der adsorbierten Blockierungsschicht beträgt ungefähr 10 nm, so daß daher lediglich ein sehr schneller maschineller Laserprozeß benötigt wird, um die Oberfläche in dem definierten Bereich zu reinigen. Durch die Verwendung von Laserflüssen von ungefähr 1,6 J cm&supmin;² pro Puls wird nur ein einziger. Puls benötigt, um das geschützte Polymersubstrat effektiv zu reinigen und auszuwerfen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 3 Pulse eingesetzt, um die vollständige und einheitliche Reinigung des proteinbeschichteten Substrats sicherzustellen. Dies läßt eine sehr dünne (1 um), den gewünschten Bereich definierende Höhlung zurück, wie in Fig. 2b gezeigt. Nachfolgende, über adsorptive Ablagerung bzw. kovalente Modifikation durchgeführte Reaktionen treten lediglich in dem Bereich des mit dem UV-Laser erzeugten Musters auf. So ist beispielsweise in Fig. 2c die Adsorption von Antikörpern 6 in dem laserdefinierten Bereich dargestellt. Alle an den blockierten Polymerbereichen anhaftenden Antikörper können, einfach vor dem Versiegeln von der Oberfläche abgewaschen werden.
In einer alternativen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das ursprüngliche unablatierte Polymersubstrat vollständig blockiert, indem zunächst ein Laminat aufgetragen wird. In dieser Ausführungsform handelt es sich bei dem Laminat um eine 35-um-PET/PE-Schicht, die 2-3 Sekunden bei 125ºC fest an das Grundpolymer gebunden wird. Der Laser wird dazu verwendet, ein definiertes Muster in das Laminat einzubrennen, indem wiederholte Pulse, die ausreichen, um letztendlich das Laminat zu durchbohren und Strukturen der gewünschten Tiefe in dem Grundpolymer zu erzeugen, abgefeuert werden. Die entstehenden, gemusterten Laminat-Substratstrukturen lassen sich danach leicht in Affinitätsreagenslösungen eintauchen. So kann beispielsweise eine Proteinrezeptorlösung, die aus in 200 mM Boratpuffer (pH 9,0) gelösten IgG-Antikörpern besteht, über den obengenannten Strukturen ungefähr zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert werden. Die Struktur wird dann mit reinem Puffer, der keine Antikörper enthält, gewaschen und das Laminat danach abgezogen, wie in Fig. 3 gezeigt. Alle an das Laminat gebundenen Antikörper werden zusammen mit der Laminierung entfernt, und die einzigen verbleibenden Bereiche mit adsorbiertem Rezeptor sind diejenigen, die durch den maschinellen UV-Laserherstellungsprozeß definiert wurden. Eine geringe Anzahl an Laserpulsen läßt sich dann auf Substratoberflächen, auf denen keine Antikörper erwünscht sind, einsetzen, wodurch ein Reinigungsschritt gegeben ist. Dieses bevorzugte Verfahren kann in einigen Fällen vorteilhaft gegenüber dem Proteinblockierungsverfahren sein, das für viele analytische Anwendungen ausreicht, jedoch das Reagens nicht 100%ig blockieren kann. Im Gegensatz dazu läßt die Entfernung von an dem Laminat gebundenen Reagenzien durch Abziehen keine Möglichkeit zur Adsorption in nicht ablatierten Bereichen übrig.
Eine mögliche erfindungsgemäße Ausführungsform, in der ein mit einem UV-Laser definierter, reaktiver Bereich in einem mikrofabrizierten Fluid-Handling-System benutzt wird, ist in Fig. 6 gezeigt. Hier kann ein biologisches Affinitätsreagens 60, bei dem es sich um einen beliebigen Proteinrezeptor (d. h. Antikörper, Enzyme, usw.), Liganden oder eine beliebige Nukleinsäure (DNA, RNA, tRNA, usw.) handeln kann, in einer bis zu 5 · 5 um kleinen Fläche innerhalb einer photoablatierten Kapillare 61 definiert werden. In einem Beispielfall, der aber keinesfalls einschränkend sein soll, kann ein anti-polychlorinierter Biphenyl-Antikörper (anti-PCB-Antikörper) in einer solchen Zone aufgetragen werden. Eine Probe mit mehreren PCB- ähnlichen Substanzen könnte dann eingeführt und kontinuierlich über die Antikörperzone gepumpt werden, wie in Fig. 6b gezeigt. Das Pumpen der Flüssigkeit kann mit jedem beliebigen geeigneten Mittel durchgeführt werden, einschließlich elektroosmotischem Fluß, einem auf die Einlaßöffnung ausgeübten positiven Druck oder einem auf die Auslaßöffnung ausgeübten negativen Druck.
Dieses Verfahren dient zweierlei Zwecken. Erstens werden alle Moleküle, die den PCBs strukturell so ähnlich sind, daß dadurch die Bindung an den Antikörperrezeptor gestattet ist, mit der Zeit in diesem Bereich konzentriert, während sie aus der fließenden Gesamtlösung extrahiert werden. Zweitens werden die gewünschten Analyten, nämlich PCB-ähnliche Moleküle, von komplexen Hintergrundmatrizen, die oftmals ihren nachfolgenden Nachweis stören, getrennt. Nachdem genügend Zeit zur Konzentration des Analyten zur Verfügung gestellt wurde, kann ein Freisetzungsreagens, wie z. B. Octyl-Glukopyranosid oder eine beliebige Anzahl von chaotropischen Mitteln, die die Antikörper-Liganden-Bindungswechselwirkung beeinflussen können, in den Mikrokanal injiziert werden. Nach der Freisetzung wird eine Kapillarelektrophorese durchgeführt, indem an den Mikrokanal eine Hochspannung angelegt wird, wodurch nur die verwandten Substanzen 62, 63, 64 (Fig. 6c) mit einer Affinität zum Antikörper getrennt werden. Bei diesem Beispiel handelt es sich um eine mögliche Anwendung von laserdefinierten Affinitätsbereichen innerhalb von Mikrokanälen zur Extraktion, Konzentration, Trennung und nachfolgender Quantifizierung von gewünschten Spezies in einer Testlösung. Dieser Vorkonzentrierungsschritt wird in diesem Beispiel dazu verwendet, ein hochempfindliches und gut aufgelöstes Elektropherogramm zur Quantifizierung individueller PCB-verwandter Substanzen zu erhalten.

Beispiel 2

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Muster aus Nukleinsäuresonden, die entweder aus Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder aus Ribonukleinsäuren (RNA) bestehen, auf eine Oberfläche aufgetragen. Der gesamte Array der von dieser Erfindung im Muster aufzutragenden Sonden umfaßt zahlreiche Stränge mit genetischen Sequenzen, die gewünschte Genprodukte für die Diagnose von genetischen Krankheiten, der Umweltbelastung mit Toxinen, retroviralen Infektionen, usw. kodieren.
Ein bevorzugtes Substrat im vorliegenden Beispiel ist Polystyrol, das mit einem 35 um dicken PET/PE-Laminat (3 Sekunden unter Druck bei 125ºC aufgetragen) beschichtet wird. Es wurde bereits gezeigt, daß Polystyrol DNA physikalisch adsorbieren kann und zwar in einer Weise, die eine nachfolgende Hybridisierung gestattet¹¹. Es konnte nun gezeigt werden, daß photoablatiertes Polystyrol vorteilhaft für die Immobilisierung von Biomolekülen ist und daher eine Oberfläche mit größerer Immobilisierungskapazität für Nukleinsäuresonden bietet. Daher wird die Adsorption als ein zweckmäßiges Immobilisierungsverfahren für die in diesem Beispiel eingesetzten Nukleinsäuresonden verwendet. Nach der Laminierung werden kleine Löcher von ungefähr 10 um im Durchmesser mit 200 Pulsen von jeweils 1,6 J cm&supmin;² pro Puls durch die Schutzschicht ablatiert. Die UV-Laserphotoablation wird in das Polystyrolsubstrat hinein mit weiteren 60 Pulsen, die 10-um-Löcher mit einer Tiefe von ungefähr 10 um erzeugen, fortgesetzt.
Lösungen von als Sonden verwendbaren Nukleinsäuresequenzen werden nach dem Wissen des Fachmanns hergestellt und in Hochsalzpuffern (500 mM NaCl) gelöst und als kleine Tröpfchen (10 ul) 2-4 Stunden bei Raumtemperatur über UV-Laser-ablatierte Mikrowells plaziert. Nach dieser ersten Inkubationszeit wird (werden) das (die) mit dem Muster versehene(s) Mikrowell(s) mit Puffer gewaschen, um alles überschüssige Sondenmaterial zu entfernen, und danach an der Luft getrocknet. Unter Verwendung eines schrittweisen und sich wiederholenden Verfahrens werden unterschiedliche primäre Sondenlösungen zu dem wachsenden Array gegeben. Eine mögliche Ausführungsform ist in Fig. 7 gezeigt, in der ein vollständiges 2-dimensionales Array von Mikrolöchern mit einem Abstand von 100 um dargestellt ist. Schließlich wird das PET/PE-Schutzlaminat abgezogen, wobei alle nicht im Mikrowell immobilisierten Sonden entfernt werden.
Die Vorrichtung besteht nun aus einer Vielzahl von photoablatierten Wells, die 2-dimensional mit zahlreichen unterschiedlichen Nukleinsäuresonden, die mit Sequenzen von medizinischem und toxikologischem Interesse in einer Testprobe hybridisieren können, definiert sind. Nachfolgend wird eine unbekannte Lösung als Ganzes über den gesamten Array plaziert. Die immobilisierten Sonden hybridisieren dann jeweils spezifisch mit einer komplementären Sequenz, falls vorhanden, in der originalen Testlösung. Danach wird ein zweiter Satz von Sonden, die einen leicht sichtbar zu machenden Fluoreszenzmarker enthalten und spezifisch an einen anderen Teil der Testsequenz binden, in ähnlicher Weise hybridisiert. Nach dem Binden kann der gesamte Array mit Licht der korrekten Wellenlänge angeregt werden, um die Fluoreszenz anzuregen, und die Intensität eines jeden Wells kann gleichzeitig unter Verwendung einer CCD-Kamera erfaßt werden. Nach der Analyse liefert der Array daher Informationen darüber, ob wichtige genetische Sequenzen in der Testprobe vorhanden oder nicht vorhanden sind. Der Vorteil des vorliegenden Beispiels ist die Fähigkeit, eine Vielzahl von gewünschten Sonden dicht zu packen und zu definieren, was wiederum das parallele Testen der gleichen Probe auf viele Endpunkte gestattet.

Beispiel 3

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Oberflächenmuster in einem Zweischrittverfahren, und zwar zunächst mit Avidin und dann mit Antikörpern, die für ein Epitop von α-fötalem Protein (αFP) spezifisch sind, erzeugt.
Ein bevorzugtes Substrat für das vorliegende Beispiel ist Polyimid, das mit einem 35 um dicken PET/PE-Laminat (3 Sekunden unter Druck bei 125ºC aufgetragen) beschichtet wird. Es konnte bereits gezeigt werden, daß Polyimid Proteine physikalisch adsorbieren kann und, wie oben ausgeführt, nach einer UV-Laserphotoablation eine verstärkte Proteinbindung aufweist. Daher wird die Adsorption als ein zweckmäßiges Ablagerungsverfahren zur Immobilisierung einer Einzelschicht aus dem Rezeptor Avidin, der wie oben beschrieben seine Bindungsaktivität für seinen Liganden, Biotin, behält, selbst nach Adsorption an UV-Laser-ablatierte Polymersubstrate, verwendet.
Das Polyimidsubstrat wird zunächst mit Spülungen von Methanol und destilliertem Wasser gereinigt und anschließend, mit Preßluft getrocknet. Das Substrat wird dann mit einem 35 um dicken PET/PE-Laminat 3 s bei 125ºC laminiert. Nach der Laminierung werden kleine Löcher von ungefähr 100 um im Durchmesser mit 200 Pulsen von jeweils 2 J cm&supmin;² pro Puls durch die Schutzschicht ablatiert. Die UV-Laserphotoablation wird in das Polystyrolsubstrat hinein mit weiteren 200 Pulsen, die 100-um-Löcher mit einer Tiefe von ungefähr 50 um erzeugen, fortgesetzt. Eine mögliche Ausführungsform ist ähnlich wie die in Fig. 7 gezeigt ist, jedoch mit einem 10 · 10 Mikrolocharray, der Löcher im Abstand von 3 mm entweder in der vertikalen oder horizontalen Dimension aufweist. Die im vorliegenden Beispiel genannten größeren Abmessungen dienen der Trennung und der leichteren Adressierbarkeit der zahlreichen aufzutragenden Testlösungen. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß die gesamte Grundfläche einer solchen Testplatte nur 3 · 3 cm beträgt, wohingegen eine herkömmliche 96-Well-Mikrotiterplatte eine Größe von ungefähr 8,5 · 12,5 cm aufweist.
In einer bevorzugten Sandwich-Immungssay-Ausführungsform des vorliegenden Beispiels läßt man eine 500 ug/ml-Lösung von Avidin aus Hühnereiweiß in PBS über dem gesamten Array zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die Technik der Voradsorption von Avidin vor dem Auftragen einer spezifischen Antikörperlösung gestattet die Immobilisierung eines beliebigen biotinylierten Antikörpers, Rezeptors oder Markerreagens. Weiterhin wird durch diese Technik ein größerer Anteil der ursprünglichen Aktivität des Rezeptors bewahrt, indem eine enge Wechselwirkung mit dem Substrat, die zu einem gewissen Grad an Denaturierung führt, verhindert wird. Steht ein biotinyliertes Antikörperreagens nicht zur Verfügung oder läßt es sich nur unter Schwierigkeiten synthetisieren, so kann der Antikörper auch die direkt unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens an die Oberfläche immobilisiert werden. In diesem Fall wird nach. Adsorption der Avidintösung an die Oberfläche die Arrayplatte gründlich mit PBS gewaschen und mit Preßluft getrocknet, bevor die spezifische Antikörperlösung aufgetragen wird.
Im vorliegenden Beispiel besteht eine Antikörperlösung aus anti-αFP in Puffer (500 ug/ml in PBS), das für die nachfolgende Beobachtung des Gesundheitszustands von Neugeborenen verwendet wird. Man sollte sich darüber im klaren sein, daß es sich hier um einen nicht einschränkenden Fall handelt und daß anti-αFP durch einen beliebigen Antikörper substituiert werden kann, je nach der gewünschten analytischen Messung. Man läßt die Lösung von biotinyliertem Anti-Analyt-Antikörper über dem gesamten Array zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, wodurch dieser fest aber nicht kovalent an die adsorbierte Avidinschicht gebunden wird.
Die mit anti-αFP-Avidin beschichtete Mikroplatte wird dann durch gründliches Spülen mit PBS gereinigt und danach das mit dem Muster versehene Schutzlaminat von der Oberfläche abgezogen, wobei immobilisierte Rezeptoren nur in dem durch den Laser erzeugten Mikrolochmuster zurückbleiben. Die gesamte Oberfläche (unablatiertes Polyimid und beschichtete Mikrowells) wird dann mit einer Lösung von NFDM (10 mg/ml in. 60 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,0) 2-4 Stunden bei Raumtemperatur geblockt und dann wie oben beschrieben gewaschen. An dieser Stelle ist die mit dem Lasermuster versehene αFP-Nachweisplatte wie in Fig. 8a gezeigt konfiguriert.
Verschiedene αFP-Lösungen lassen sich nun innerhalb des 10 · 10-Mikrolocharrays analysieren. Verschiedene unbekannte, zu testende Serumlösungen werden in PBS verdünnt (zwischen 1 : 1 und 1 : 10, je nach der jeweils festzulegenden Nachweisgrenze), und 2 ul-Aliquots dieser Verdünnungen werden über ausgewählte Mikrowells in dem Array plaziert. Man läßt diese Lösungen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Aufgrund der kleinen Diffusionsumgebung, die in den Mikrolochstrukturen existiert, passiert die nichtkovalente Bindungsreaktion zwischen dem anti-αFP-Antikörper und dem αFP-Analyten im Vergleich zu einer in einem herkömmlichen Mikrotiterwell stattfindenden Reaktion relativ schnell. Die Platte wird wiederum, wie zuvor beschrieben, mit PBS gewaschen.
Der letzte Schritt in dem Assay des vorliegenden Beispiels ist die Zugabe eines zweiten anti-αFP-Antikörpers, der für ein anderes Epitop als der erste Antikörper spezifisch ist und der zuvor mit einem Enzymmarker, wie z. B. β-Gal, konjugiert wurde. Solche Enzym- Antikörpermarker sind heutzutage häufig mit Spezifitäten für verschiedene gewünschte Analyten kommerziell erhältlich und, falls dem nicht so ist, können leicht mit heterobifunktionalen Linke m, die Peptidbindungen zwischen den beiden Proteinen bilden können, hergestellt werden. Ein 2-ul-Aliquot eines solchen anti-αFP-Antikörper/β-Gal-Konjugats wird über verschiedene Mikrowells, die mit unbekannten αFP-Testlösungen vorinkubiert wurden, plaziert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur läßt man ein zweites 2-ul-Aliquot einer β-Gal-Substratlösung (1 mM APG in 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,4 mit 1 mg/ml MgCl&sub2;) mit dem Enzymkonjugat über eine Zeitdauer reagieren, die von der von dem Assay gewünschten Empfindlichkeit bestimmt wird. Wird die größtmögliche Empfindlichkeit gewünscht, kann diese Zeitdauer bis zu 4 Stunden betragen, ist jedoch der kritische Faktor die Assaygeschwindigkeit, so könnte diese Zeitspanne auf bis zu 30 Minuten verkürzt sein.
Eine Zwei-Elektroden-Mikrosonde (Arbeitselektrode = im Siebdruck aufgetragener Kohlenstoff, Referenz = im Siebdruck aufgetragene Ag/AgCl-Paste) oder ein beliebiges anderes geeignetes 2-Elektrodensystem, das zur Messung von 2-4-ul-Lösungen fähig ist, wird dann in die Substratlösungen über den Mikrowells eingeführt. Das Potential der Arbeitselektrode wird auf +200 mv eingestellt und die Stromstärke mit einem geeigneten, kommerziell erhältlichen Strommeßgerät gemessen. Die Strommenge sollte direkt proportional zu der Menge an anti-αFP-Antikörper/β-Gal-Konjugat, die an die Mikrowells gebunden wurde, sein. Die Menge an Konjugat ist wiederum direkt proportional zur Menge an αFP-Analyt, der an die durch den UV-Laser definierte anti-αFP-Antikörper-Primärbeschichtung gebunden wurde. Die endgültige molekulare Konfiguration zum Nachweis von αFP ist in Fig. 8b gezeigt.
Daher definiert dieses Beispiel einen möglichen Einsatz der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung von Biomustern bei der Herstellung von Mikrowell-Testplatten, mit denen gewünschte Proteine unter Verwendung der Sandwich-Immungssaytechnik nachgewiesen werden können. Das vorliegende Verfahren zur Erzeugung von Anti- Analyt-Antikörpermustern ist dahingehend vorteilhaft, daß die Diffusionsumgebung für alle Reaktionsschritte verkleinert ist, die Verwendung kleiner Volumina für Proben und teure Reagenzien erleichtert wird und die Gesamtgrundfläche der Testplatte beträchtlich verkleinert wird. Das vorliegende Verfahren zur Erzeugung von Mustern ist ebenfalls besonders vorteilhaft dahingehend, daß die an das Substrat gebundene Menge an Primärantikörper im Vergleich zu herkömmlichen Polymersubstraten stark erhöht ist. Dies führt weiter zu einer Erhöhung der Assayempfindlichkeit ebenso wie zu einem Anstieg der Reaktionskinetik aufgrund des großen Anstiegs in der Anzahl der Rezeptoren.

Literatur

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Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung eines Affinitätsreagens auf UV-absorbierendem Material, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren der UV-Excimerlaser-induzierten Photoablation in Kombination mit einer ein Lichtmuster erzeugenden Technik, wie z. B. Standard-Photomasken oder faseroptischen Lichtleitern, eingesetzt wird, um einen rauhen, photoablatierten Bereich aus einem UV-absorbierenden Material zu schaffen, wodurch die Bindung des Reagens in Form eines diesem Bereich entsprechenden Musters erleichtert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Affinitätsreagens ein Biomolekül umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Laserphotoablation innerhalb des Bereichs eine chemisch funktionalisierte Oberfläche auf dem UV- absorbierenden Material schafft, die eine verbesserte Immobilisierungskapazität zeigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das UV-absorbierende Material aus Polymeren, einschließlich Celluloseacetat, Polystyrol, Polycarbonat, Poly-(ethylenterephthalat) und Polyimid, ausgewählt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die für die Photoablation von Polymeren verwendete Laserstrahlung eine Wellenlänge unter 330 nm aufweist und Energieflüsse von mehr als 0,5 J cm&supmin;² pro Puls auf der Materialoberfläche auftreten.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche des UV-absorbierenden Materials von einem anderen Material, auf dem durch einen UV-Excimerlaser ein photoablatives Muster erzeugt werden kann, maskiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das andere Material aus nicht spezifischen Proteinmonolayern, chemisch konjugierten Substanzen oder Polymer- Schutzlaminaten ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei auf dem eine maskierende Schutzschicht bildenden anderen Material durch UV-Laserphotoablation ein Muster erzeugt wird, wodurch ein oder mehrere Öffnungen in einem 2-dimensionalen Muster mit einer Auflösung im um (Mikron)-Bereich geschaffen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine Lösung des Affinitätsreagens auf das darunterliegende UV-absorbierende Material über die durch den UV-Laser definierten Öffnungen durch die maskierende Schicht hindurch aufgebracht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem anderen Material um ein Polymer-Schutzlaminat handelt, das nach der Aufbringung des Affinitätsreagens auf das UV-absorbierende Material entfernt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Aufbringungsverfahren über physikalische Adsorption, nichtkovalente Bindung oder kovalente chemische Konjugation erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in Abhängigkeit von Anspruch 2, wobei es sich bei dem Biomolekül um einen Proteinrezeptor, ein mit einem Kohlenhydrat konjugiertes Protein, ein Enzym oder eine Nukleinsäure handelt.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Muster in drei Dimensionen unter Verwendung des UV-Laserphotoablationsverfahrens zur Schaffung von struktureller Tiefe gebildet wird, woraufhin Biomoleküle anschließend aufgebracht werden können.

14. Biologischer oder chemischer Sensor, der ein ein Affinitätsreagens in Form eines spezifischen Musters tragendes Substrat aus UV-absorbierendem Material umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens auf wenigstens einen rauhen, photoablatierten Bereich des das Muster bereitstellenden Substrats aufgebracht ist.

15. Sensor nach Anspruch 14, wobei das UV-absorbierende Material ein Polymer umfaßt.

16. Sensor nach Anspruch 15, wobei das Polymer aus Celluloseacetat, Polystyrol, Polycarbonat, Poly- (ethylenterephthalat) und Polyimid ausgewählt ist.

17. Sensor nach Ansprüchen 14, 15 und 16, wobei das Affinitätsreagens ein Biomolekül umfaßt.

18. Sensor nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem Biomolekül um einen Proteinrezeptor, ein mit einem Kohlenhydrat konjugiertes Protein, ein Enzym oder eine Nukleinsäure handelt.

19. Sensor nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der Bereich bzw. jeder der Bereiche einen Mikrokanal umfaßt.

20. Sensor nach einem der Ansprüche 14 bis 18, welcher ein Array aus mehreren der Bereiche umfaßt, wobei es sich bei jedem Bereich um ein Mikrowell handelt.