WO2003056334A2 - Charakterisierungsverfahren für funktionalisierte oberflächen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for characterizing an examination surface functionalized for examining a sample liquid.
  • the object of the present invention is to provide a method with which it is possible to determine in a simple manner and with little material expenditure the amount and / or type of molecules available for binding on a functionalized surface or the reaction kinetics of such Specify molecules with molecules in a solution.
  • a drop of a probe liquid is brought into contact with the functionalized area of a solid surface.
  • the drop size of the probe liquid is preferably selected such that the drop on the functionalized area of the surface is held together by its surface tension in such a way that its contact area approximately corresponds to the area of the functionalized area or is smaller.
  • the probe liquid is prepared in such a way that the probe liquid or the material contained therein can bind to the functionalized surface area.
  • at least one parameter is monitored, which changes with the binding of the probe liquid or the material contained therein with the functionalized partial area of the surface.
  • the probe liquid can comprise pure liquid, a mixture, a dispersion or a suspension, as well as a liquid in which there are solid particles.
  • the probe fluid can also be biological material, such as, for. B. cells, macromolecules, proteins, antibodies, antigens or DNA.
  • the binding of the probe liquid or the material contained therein with the functionalized surface area possible by the preparation of the probe liquid can result in a specific binding and / or an adhesion.
  • sion include.
  • the parameter to be monitored can in particular be a physical, a chemical or a biological parameter.
  • solid body denotes both solid bodies made of crystalline material, for example lithium niobate or quartz, and structures made of other materials, for example plastic.
  • the process according to the invention with a drop means that neither a liquid film on the surface nor immersion of the surface in a liquid is necessary.
  • the drop size is advantageously selected such that the contact area of the drop with the surface corresponds approximately to the surface of a functionalized partial area. In this way, a functionalization can be characterized very precisely. If the process is carried out appropriately, several functionalized partial surface areas can also be examined in parallel with one drop. If necessary, a serial examination of different functionalized partial areas can also be carried out by moving the drop from one functionalized partial area to the next functionalized partial area.
  • the change in the parameter can be used to infer the amount of the molecules available on the surface of the functionalized partial area for a reaction with the probe liquid or the material contained therein.
  • the corresponding functionalized surface can be examined very locally. Little material is required and the probe solution can be highly concentrated, even if there is little material available.
  • the volumes of the probe solution are e.g. B. in the range of one picoliter to several microliters.
  • a typical size of the functionalized sub-area is e.g. B. 100 microns x 100 microns.
  • the reaction times are very short due to the small volume of the drops, since the diffusion lengths are small.
  • the method is suitable due to the low amount of substance z. B. for quality assurance for DNA and protein chips or for so-called ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays).
  • the method according to the invention is repeated one or more times and the observed parameters are read out during this or between the individual method steps.
  • a small amount of probe liquid is applied to the functionalized portion, the parameter is measured, then another amount of the probe fluid is applied.
  • These steps may be repeated several times to determine the amount of probe fluid that will react or the extent to which.
  • the method according to the invention is preferably carried out on a solid-state chip, as described, for. B. is known from semiconductor technology. Such chips can be processed very easily with known techniques and allow the application of z. B. electrodes or functionalized layers using known lithographic techniques. Such chip units can be used in the context of lab-on-the-chip technology (cf. O. Müller, Laborwelt 1/2000, pages 36-38) for the miniaturization of chemical and biological processes. A plurality of analysis stations with which the method according to the invention can be carried out or other analysis steps can be carried out can be arranged on such a chip. In addition, integration with other units of a lab-on-the-chip is easy to implement. The observed parameter can e.g. B.
  • the method can be used particularly advantageously if the examination of the parameter comprises the reading out of a marker which is located on molecules in the probe solution and can form a bond with the functionalized partial area of the surface of the solid, in particular a fluorescent marker or radioactive marker.
  • Probe liquid is applied as a drop to the functionalized section and z. B. when using a fluorescence marker, the fluorescence is evaluated, which shows up after removal of the probe liquid. In this way, information about the material of the probe liquid bound to the sample molecules can be obtained.
  • a color change can be evaluated, which occurs when the probe liquid or the material contained therein reacts with the functionalized surface.
  • Such optical measurements can e.g. B. be carried out in transmission or reflection.
  • a washing step can be carried out after touching the drop of the probe liquid with the functionalized surface area in order to remove non-specifically bound or adhesive material of the probe liquid before the evaluation of the parameter is started.
  • the process is repeated several times until the signal at the functionalized subarea no longer increases after the drop of probe liquid has been removed. With a known concentration and volume of the drops with the probe liquid, a comparison can be made, for. B. the fluorescence signal on the functionalized portion can be concluded with and without drops on the number of bound molecules. If the process is repeated successively for several drops with different reaction parameters, the results can be used to determine, for example, the equilibrium constant, the reaction order, the reaction kinetics and the concentration of the reactive molecules located on the surface of the functionalized partial area.
  • the reaction parameters include, for example, the duration per reaction step, the concentration of the sample and the reaction temperature.
  • Information about the reaction kinetics of the probe liquid or of the material therein with the functionalized surface can be obtained, inter alia, by measuring the heat of reaction.
  • a surface acoustic wave is advantageously sent in the direction of the functionalized partial area during the reaction.
  • the impulse transmission of a surface sound wave sets the liquid on the surface in motion and leads to its mixing.
  • the impulse of the surface sound wave is brought about by the mechanical deformation of the surface or by the interaction of changes in the electrical field caused by the mechanical deformation of the surface with charged or polarizable particles which may be present in the liquid.
  • the probe liquid can be brought into contact with the functionalized sub-area drop by drop using a pipetting robot or piezo dispenser.
  • drops of the probe liquid are moved on the solid surface itself in the direction of the functionalized partial area.
  • the movement of the probe liquid drop in the direction of the functionalized partial area can also be triggered with the aid of a surface sound wave.
  • the movement on the surface through the impulse transmission of a surface sound wave enables a particularly directed one and defined movement.
  • the suitable frequency of the surface sound wave depends on the diameter of the drop to be moved and can e.g. B. can be determined in preliminary tests.
  • the surface sound waves advantageously used for mixing the liquid on the functionalized partial area and / or for moving the probe liquid drop can be generated with the help of one or more interdigital transducers on a piezoelectric solid surface, the radiation direction of which corresponds to the direction of the desired pulse transmission.
  • a piezoelectric surface can e.g. B. be formed from a lithium niobate or quartz crystal.
  • a piezoelectric coating, e.g. B. zinc oxide may be provided on another material.
  • the surface can also be provided with a sufficiently thin, preferably biocompatible, protective layer.
  • interdigital transducers to generate surface acoustic waves for moving small amounts of liquid is described in DE-A-100 55 318.
  • a reservoir drop of the probe liquid is applied to the solid surface, which is held together due to its surface tension.
  • a smaller drop of probe liquid is drawn off from this reservoir drop and fed to the functionalized partial area, the small amount of probe liquid moving on the surface.
  • the larger drop of probe liquid which serves as a reservoir and from which the small drop of probe liquid which is fed to the functionalized portion is drawn off, can be located on an anchor point on the surface of the solid which is better wetted by the probe liquid than its surrounding solid surface. This ensures that the larger reservoir drop remains at a certain point on the surface and does not leave it without external force.
  • the drop of probe liquid which is fed to the functionalized partial area can advantageously be moved on the solid surface along a path, at least part of its surface being wetted better by the probe liquid than its surrounding surface.
  • the probe fluid preferably moves along this path so that controlled movement is ensured.
  • Such a path can e.g. B. can be achieved by modulating the wetting properties, as described for the movement of amounts of liquid on surfaces in DE-A-100 55 318.
  • the reservoir drop at the anchor point can be passed through a path connected to the anchor point, the connection including an area so narrow that the reservoir drop at the anchor point due to its surface tension, it does not leave the anchor point without external force. If the reservoir drops are driven to this narrow point on this path by external force, it will tear off in a defined manner.
  • a reservoir drop e.g. B. also be moved by the impulse transmission of surface sound waves on the surface over one or more small surface areas that are wetted more by the probe liquid than their surroundings.
  • the area of such a partial surface area is chosen so small that it is smaller than the contact area of the drop with the surface. If the reservoir drop is passed one or more times over such a partial surface area, a small amount of the probe liquid remains on this stop and can be moved to the functionalized partial area to be characterized. In this way, a small amount of probe liquid can be divided in a very simple and reproducible manner.
  • the method according to the invention for controlling the thermodynamic conditions is advantageously carried out in a climatic chamber.
  • the probe liquid drop can from the functionalized portion z. B. can be easily removed by blowing with compressed air. It is particularly advantageous, however, to remove the drop of probe liquid by applying a surface acoustic wave which is directed in such a way that its momentum transfer to the quantity of probe liquid located on the functionalized subarea leads to its movement away.
  • a washing step to be carried out, if necessary, for removing unspecifically bound material can be achieved by applying a surface sound wave of suitable intensity.
  • FIG. 1 shows the implementation of a characterization method according to the invention
  • FIG. 2 shows another embodiment of the characterization method according to the invention
  • FIG 3 shows a method step in a preferred embodiment of the characterization method according to the invention.
  • Figure 1 shows a solid state chip, for. B. a piezoelectric lithium niobatch chip 5, on the surface of which the characterization method according to the invention is carried out.
  • a drop 1 of a probe liquid in the order of magnitude of 0.5 nl to 10 nl is located on a functionalized partial area 15 of the surface 7.
  • the specified amount of liquid is suitable for. B. for a functionalized partial area with an area of z. B. 100 microns x 100 microns.
  • the probe fluid includes e.g. B. Molecules with a marker (eg fluorescence or radioactivity marker) and their concentration in the drop is determined in advance.
  • a marker eg fluorescence or radioactivity marker
  • the volumes for the probe solution drop range from one picoliter to several microliters.
  • the functionalized area 15 comprises z. B. a surface on which the probe liquid can be adsorbed.
  • Another application includes macromolecules as sample molecules, which are bound to the functionalized portion and z. B. with other macromolecules are available (z. B. for DNA hybridization, antigen-antibody reaction, etc.).
  • the sample molecules to be examined can, for. B. have been applied by a pipetting robot or a piezo dispenser.
  • a reservoir drop 3 of the probe liquid is located on an anchor point 16.
  • the anchor point 16 is designed such that it wets the probe liquid more strongly than the surrounding solid surface. Includes the probe fluid z. B. an aqueous solution, the anchor point 16 is hydrophilic compared to the surrounding solid surface. This can e.g. B. can be achieved by making the surrounding surface hydrophobic by silanization.
  • the functionalized area 15 can also be equipped with a corresponding surface that localizes the probe liquid drop 1.
  • Functionalized area 15 and anchor point 16 are connected to one another via a path 18, which likewise has such wetting properties that it wets better with the probe liquid solution than the surrounding solid surface.
  • the path 18 is restricted at the narrow points 14, 12 such that the drops located on the anchor point 16 or the functionalized area 15 do not leave the anchor point 16 or the functionalized area 15 due to their surface tension without external force.
  • interdigital transducers which are suitable for exciting surface sound waves on the surface 7 of the lithium niobate crystal 5.
  • the interdigital transducers consist of two electrodes with finger-like interlocking extensions. Creating an alternating field z. B. in the order of 100 MHz to the electrodes of the interdigital transducer leads to the excitation of a surface sound wave with a wavelength which corresponds to the finger spacing of the interdigitated electrodes and whose direction of propagation is essentially perpendicular to the finger electrodes.
  • interdigital transducers 9 this is indicated schematically by arrow 10, for example.
  • Each transducer comprises a large number of interlocking fingers, only a few of which are shown schematically and not to scale. Other transducer geometries can also be used, as are known from the technology of surface acoustic wave filters.
  • the interdigital transducers 9 are aligned in such a way that a surface sound wave excited by them moves in the direction of the functionalized partial region 15.
  • the interdigital transducer 11 causes a surface sound wave in the direction 19.
  • the interdigital transducer 13 finally causes a surface sound wave in the direction 21.
  • the electrical connections to the electrodes of the interdigital transducers, which are provided in a conventional manner, are not shown.
  • An insulated surface area is designated by 20, which likewise wets the probe liquid more strongly than the surrounding solid surface.
  • a drop 1 can be transported in the direction of the area 20 and is located there due to the preferred wetting.
  • Such an embodiment is particularly advantageous when there is no path 18 for connecting the anchor point 16 to the functionalized partial area 15 and the small drops 17 of the probe liquid are moved on the surface 7 without path guidance.
  • FIG. 23 shows a schematic representation of the tip of a known piezo dispenser for applying the reservoir drop 3 of the probe liquid to the anchor point 16.
  • the outflow of the liquid from the dispenser tip 23 is indicated by the arrow 24.
  • the method according to the invention can be carried out as follows on the device shown in FIG. 1. First, the sub-area 15 is applied by applying sample molecules such. B. functionalized with the help of a pipetting robot or a piezo dispenser.
  • a drop 3 of the probe liquid is applied to the anchor point 16 with the dispenser tip 23. Due to the specially selected wetting properties (e.g. hydrophilic in the case of an aqueous probe solution) of the anchor point 16 compared to the wetting properties of the surrounding solid surface 7, the drop 3, which is held together by its surface tension, does not leave the anchor point 16.
  • wetting properties e.g. hydrophilic in the case of an aqueous probe solution
  • an alternating frequency, z. B. applied some 100 MHz, so that a surface sound wave is generated in the direction 21.
  • the impulse transmission of the surface sound wave moves the drop 3 in the direction of the constriction 14, which connects the anchor point 16 with the path 18.
  • a small amount of the drop 3 moves over the constriction 14 and tears off in a defined manner when dimensioned accordingly.
  • the necessary reduction in width at the constriction 14 can, for. B. have been determined by preliminary tests.
  • the separated amount of probe liquid 17 may e.g. B. be a few picoliters.
  • the withdrawn part 17 of the probe liquid also moves away from the anchor point 16 by means of pulse transmission of the surface sound wave, which is generated with the aid of the interdigital transducer 13.
  • both interdigital transducers 9 can also be used simultaneously in order to generate opposing surface sound waves in the direction of the functionalized surface area 15.
  • the drop 1 With a surface sound wave of sufficient intensity, which is emitted by the interdigital transducer 11, the drop 1 can be moved away from the functionalized partial area 15. He is then z. B. localized by the surface area 20, which also has such wetting properties that wet more with the probe liquid than the surrounding solid surface.
  • the interdigital transducers 9 can now be used to determine whether probe liquid or the material located therein with the sample molecules have remained or are bound on the functionalized surface area 15. For this purpose, one of the interdigital transducers 9 generates a surface sound wave in the direction of the functionalized area 15. With the second interdigital transducer, the surface sound wave can be detected after passing through the functionalized area 15.
  • the exact amount of material remaining on the functionalized area 15 can be determined from the damping or the change in speed of a surface sound wave by comparison with corresponding reference measurements.
  • the described method can be carried out several times in a defined manner by a correspondingly pulsed surface sound wave, which is generated with the interdigital transducer 13, by moving several small amounts of probe liquid 17 in the direction of the functionalized surface area 15.
  • the reaction can be determined as a function of the amount of probe liquid supplied, as a result of which an exact quantitative Determination of the sample molecules available for binding on the functionalized region 15 is made possible.
  • FIG. 2 An alternative method is shown in FIG.
  • FIG. 2 does not show the transducers that may be provided for mixing.
  • the same reference numerals designate the same elements as in FIG. 1.
  • an optical measurement is carried out to examine a possible reaction of the probe liquid or the material contained therein with the functionalized surface 15.
  • a light-emitting diode 31 or another suitable light source illuminates the solid-state chip 5 from below.
  • the optical signal is collected and forwarded to an evaluation device (not shown) and evaluated in a manner known per se.
  • an evaluation device not shown
  • the fluorescence can be evaluated, which originates from fluorescence-labeled material in the probe liquid, which has reacted with the functionalized surface area 15 and remains on the functionalized surface area 15 after removal of the probe liquid drop 1. If a non-transparent substrate is used, the light path can also be chosen parallel to the surface 7 of the chip 5.
  • FIG. 3 shows an alternative way of separating a small amount of liquid.
  • the same reference numerals designate the same elements as in FIGS. 1 and 2.
  • a reservoir drop 3 is located on one of the anchor points 16.
  • the surface drop is generated by pulse transmission of a surface sound wave that is generated with the interdigital transducer 13 that is closest to the corresponding anchor point 16 3 driven in the direction of the second anchor point 16.
  • the impulse transmission of another surface sound wave, which is generated with the interdigital transducer 13, which is the second is closest to the anchor point, the reservoir drop is driven back again. He moves back and forth along the indicated route 43.
  • a surface area 41 it crosses one or more times a surface area 41, the area of which is smaller than the contact area of the reservoir drop 3 with the solid surface 7.
  • This surface area 41 has such wetting properties that the liquid of the reservoir drop 3 wets it more than its surrounding solid surface. After the surface area 41 has been crossed one or more times, a small amount of probe liquid 17 has detached from the reservoir drop 3.
  • the surface area 41 z. B. chosen with hydrophilic properties.
  • the impulse transfer of a surface sound wave e.g. B. can be generated in the direction 45 with the interdigital transducer 11, the probe liquid quantity 17 can be moved away from the surface region 41, for. B. in the direction of a functionalized surface area 15, not shown in FIG. 3, in order to carry out the method steps for characterization, which are described with reference to FIGS. 1 and 2.
  • the reservoir drop 3 and the probe liquid drop 17 can be moved along paths which are preferably wetted, as have already been described with reference to FIGS. 1 and 2 and are designated there with the reference symbol 18. Such paths advantageously have a lateral extent which is smaller than the diameter of the surface area 41. However, the method according to the invention and the described separation of the small amount of probe liquid 17 can also be carried out without such paths, so that these are not shown in FIG. 3.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung einer zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit funktionalisierten Untersuchungsoberfläche, bei der ein Teilbereich der Oberfläche eines Festkörpers, vorzugsweise eines Festkörperchips, wobei der Teilbereich für eine Reaktion mit einer Probenflüssigkeit funktionalisiert ist, mit einem Tropfen einer Sondenflüssigkeit in Berührung gebracht wird, wobei die Tropfengrösse vorzugsweise so ausgewählt ist, dass der Tropfen auf dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche derart durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, dass seine Berührungsfläche etwa der Fläche des funktionalisierten Bereiches entspricht, und die Sondenflüssigkeit derart präpariert ist, dass eine Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Oberflächenteilbereich stattfinden kann, und ein Parameter, der sich mit der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche ändert, gemessen wird, während der Tropfen der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche in Berührung ist und/oder nachdem der Tropfen der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche in Berührung war.

Description

Charakterisierungsverfahren für funktionalisierte Oberflächen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung einer zur Untersuchung einer Probenflussigkeit funktionalisierten Untersuchungsoberfläche.
In der Chemie oder Biologie muß häufig die Reaktionskinetik zwischen zwei Molekülsorten untersucht werden, von denen eine an einer Oberfläche gebunden ist und die zweite sich in Lösung befindet. Ebenso besteht häufig der Wunsch, die Konzentration von Molekülen an einer Oberfläche zu bestimmen, die für eine Bindung mit anderen Molekülen zur Verfügung stehen, die sich in Lösung befinden. Insbesondere bei sogenannten DNA-Arrays oder Proteinarrays ist eine quantitative Auswertung der Ergebnisse nur eingeschränkt möglich, da im allgemeinen unbekannt ist, wie viele an der Oberfläche gebundene Moleküle für die Bindung mit in Lösung befindlichen Molekülen zur Verfügung stehen.
Bei bekannten Techniken wird zur Bestimmung der Konzentration von an einer Oberfläche z. B. in einem Array gebundenen Molekülen z. B. Eilipsometrie oder spektroskopische Methoden eingesetzt. Mit Hilfe der Eilipsometrie wird die Schichtdicke bzw. die Änderung der Schichtdicke gemessen. Kennt man andererseits die Schichtdicke der Moleküllage, so läßt sich aus der gemessenen Dicke der Bedeckungsgrad der Oberfläche bestimmen. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden kann man molekülspezifische Resonanzen quantitativ auswerten, um so den Bedeckungsgrad der Oberfläche zu bestimmen. Die bekannten Methoden haben jedoch den Nachteil, daß der Bedeckungsgrad nur eine obere Grenze für die Zahl der tatsächlich auch für eine weitere Bindung zur Verfügung stehenden Moleküle angibt. So können z. B. sterische Gründe dafür verantwortlich sein, daß nur ein Bruchteil der an der Oberfläche befindlichen Moleküle für eine Bindung mit weiteren z. B. in einer Lösung aufgebrachten Molekülen zur Verfügung steht.
Mit anderen Verfahren läßt sich nicht nur die Zahl der an der Oberfläche gebundenen Moleküle bestimmen, sondern auch noch deren Aktivität, d.h. wie viele der Moleküle für eine Bindung mit anderen Molekülen, die in einer Lösung auf die Oberfläche aufgebracht werden, zur Verfügung stehen. US 5,064,619 beschreibt ein Verfahren, das unter Ausnutzung der Oberflächenplasmonresonanz die Änderung des Winkels der Totalreflexion mißt, die durch die Bindung von sogenannten Sondenmolekülen an den an der Oberfläche bereits gebundenen Probenmolekülen hervorgerufen wird. In der Regel sind dabei die Probenmoleküle an einer Goldoberfläche gebunden. Bei diesem Verfahren des Standes der Technik wird nicht direkt die Anzahl der Moleküle bestimmt, da die Änderung der Oberflächenplasmonresonanz und damit die Änderung des Winkels der Totalreflexion von der Änderung der elektronischen Umgebung der Goldoberfläche abhängt. Diese wird jedoch nicht nur durch die Zahl der gebundenen Moleküle, sondern auch durch ihre elektronischen Eigenschaften bestimmt.
Andere Verfahren bedienen sich der Tatsache, daß sich durch eine Änderung des Bedeckungsgrades der Oberfläche mit Probenmolekülen die mechanischen Eigenschaften des Substrates ändern. US 5,130,257 beschreibt den Einsatz piezoelektrischer Substrate, die mit Oberflächenwellen angeregt werden, während sie sich in einer Lösung befinden. US 5,719,324 beschreibt die Verwendung von sogenannten Micro-Cantilevern, während US 5,552,274 dünn geschliffene Schwingquarze als Detektor einsetzt. Dabei wird die Änderung der Resonanzfrequenz der Oberflä- chenschallwelle, des Micro-Cantilevers bzw. des Schwingquarzes durch den zusätzlichen Massebelag der gebundenen Probenmoleküle gemessen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, mit dem es möglich ist, auf einfache Weise und mit geringem Materialaufwand die Menge und/oder Art von an einer funktionalisierten Oberfläche für eine Bindung zur Verfügung stehenden Molekülen bestimmen zu können bzw. die Reaktionskinetik solcher Moleküle mit in einer Lösung befindlichen Molekülen anzugeben.
Diese Aufgabe wird mit einem Charakterisierungsverfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Die Unteransprüche sind auf vorteilhafte Ausgestaltungen gerichtet.
Erfindungsgemäß wird ein Tropfen einer Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Bereich einer Festkörperoberfläche in Kontakt gebracht. Die Tropfengröße der Sondenflüssigkeit wird dabei vorzugsweise derart gewählt, daß der Tropfen auf dem funktionalisierten Bereich der Oberfläche derart durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, daß seine Berührungsfläche etwa der Fläche des funktionalisierten Bereiches entspricht oder kleiner ist. Die Sondenflüssigkeit ist derart präpariert, daß eine Bindung der Sondenflüssigkeit oder darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich stattfinden kann. Während der Berührung oder nach der Berührung wird zumindest ein Parameter überwacht, der sich mit der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche ändert.
Je nach Anwendung kann die Sondenflüssigkeit reine Flüssigkeit, eine Mischung, eine Dispersion oder eine Suspension, sowie eine Flüssigkeit umfassen, in der sich feste Teilchen befinden. Insbesondere kann die Sondenflüssigkeit auch biologisches Material, wie z. B. Zellen, Makromoleküle, Proteine, Antikörper, Antigene oder DNA enthalten. Die durch die Präparation der Sondenflüssigkeit mögliche Bindung der Sondenflüssigkeit oder des darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich kann eine spezifische Bindung und/oder eine Adhä- sion umfassen. Der zu überwachende Parameter kann insbesondere ein physikalischer, ein chemischer oder ein biologischer Parameter sein. Für die Zwecke der vorliegenden Schrift bezeichnet der Begriff „Festkörper" sowohl Festkörper aus kristallinem Material, z. B. Lithiumniobat oder Quarz, als auch Strukturen aus anderen Materialien, z. B. Kunststoff.
Durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung mit einem Tropfen ist weder ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche noch ein Eintauchen der Oberfläche in eine Flüssigkeit notwenig. Vorteilhafterweise wird die Tropfengröße so gewählt, daß die Berührungsfläche des Tropfens mit der Oberfläche etwa der Oberfläche eines funktionalisierten Teilbereiches entspricht. Auf diese Weise kann sehr präzise und exakt genau eine Funktionalisierung charakterisiert werden. Bei entsprechender Verfahrensführung können mit einem Tropfen aber auch mehrere funktionalisierte Oberflächenteilbereiche parallel untersucht werden. Gegebenenfalls kann durch Bewegung des Tropfens von einem funktionalisierten Teilbereich zum nächsten funktionalisierten Teilbereich auch eine serielle Untersuchung unterschiedlicher funktiona- lisierter Teilbereiche vorgenommen werden.
Ist der Tropfen der Sondenflüssigkeit ausreichend klein oder gering konzentriert, so kann aus der Änderung des Parameters auf die Menge der für eine Reaktion mit der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales zur Verfügung stehenden an der Oberfläche des funktionalisierten Teilbereiches befindlichen Moleküle geschlossen werden. Durch die Verwendung von einem Tropfen, der auf der freien Oberfläche ohne seitliche Wandberührung auf den funktionalisierten Teilbereich aufgebracht wird, läßt sich sehr lokal die entsprechende funktionalisierte Oberfläche untersuchen. Es ist nur wenig Material notwendig und die Sondenlösung kann hoch konzentriert sein, auch wenn nur wenig Material zur Verfügung steht. Die Volumina der Sondenlösung sind z. B. im Bereich von einem Pikoliter bis zu mehreren Mikrolitem. Eine typische Größe des funktionalisierten Teilbereiches ist z. B. 100 μm x 100 μm. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind aufgrund des kleinen Volumens der Tropfen die Reaktionszeiten sehr kurz, da die Diffusionslängen klein sind. Das Verfahren eignet sich aufgrund des geringen Stoffmengenverbrauches z. B. für die Qualitätssicherung für DNA- und Proteinchips oder für sogenannte ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays).
Um zu untersuchen, wie die Reaktion zwischen der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit den Probenmolekülen an dem funktionalisierten Teilbereich abläuft, wird das erfindungsgemäße Verfahren ein- oder mehrfach wiederholt und währenddessen bzw. zwischen den einzelnen Verfahrensschritten der beobachtete Parameter ausgelesen. Um Auskunft über die an dem funktionalisierten Teilbereich für eine Bindung zur Verfügung stehende Molekülanzahl, über die Gleichgewichtskonstante oder über die Anzahl der auf dem funktionalisierten Teilbereich befindlichen reaktiven Moleküle zu erhalten, wird eine kleine Menge Sondenflüssigkeit auf den funktionalisierten Teilbereich aufgebracht, der Parameter gemessen, dann eine weitere Menge der Sondenflüssigkeit aufgebracht. Diese Schritte werden ggf. mehrere Male wiederholt, um festzustellen, bei welcher Menge an Sondenflüssigkeit eine Reaktion stattfindet bzw. in welchem Maße.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Festkörperchip durchgeführt, wie er z. B. aus der Halbleitertechnik bekannt ist. Solche Chips lassen sich mit bekannten Techniken sehr einfach prozessieren und erlauben die Aufbringung von z. B. Elektroden oder funktionalisierten Schichten mit bekannten lithographischen Techniken. Solche Chipeinheiten können im Rahmen der lab-on- the-chip-Technologie (vgl. O. Müller, Laborwelt 1/2000, Seiten 36-38) bei der Miniaturisierung chemischer und biologischer Prozesse eingesetzt werden. Auf einem solchen Chip können mehrere Analysestationen angeordnet sein, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, bzw. andere Analyseschritte vorgenommen werden können. Außerdem ist eine Integration mit anderen Einheiten eines lab-on-the-chip leicht realisierbar. Der beobachtete Parameter kann z. B. die Leitfähigkeit, der pH-Wert, die Dämpfung einer Oberflächenschallwelle, die Ladung oder elektrische oder magnetische Eigenschaften sein. Besonders vorteilhaft läßt sich das Verfahren anwenden, wenn die Untersuchung des Parameters das Auslesen eines Markers umfaßt, der sich an Molekülen in der Sondenlösung befindet, und mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche des Festkörpers eine Bindung eingehen kann, insbesondere eines Fluoreszenzmarkers oder radioaktiven Markers. Sondenflüssigkeit wird als Tropfen auf den funktionalisierten Teilbereich aufgebracht und z. B. bei Verwendung eines Fluorzeszenzmarkers die Fluoreszenz ausgewertet, die sich nach Entfernung der Sondenflüssigkeit zeigt. Auf diese Weise läßt sich Information über das an den Probenmolekülen gebundene Material der Sondenflüssigkeit erhalten.
Alternativ kann z. B. ein Farbumschlag ausgewertet werden, der bei einer Reaktion der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche eintritt. Derartige optische Messungen können z. B. in Transmission oder Reflexion durchgeführt werden.
Soll eine spezifische Reaktion zwischen Material in der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche untersucht werden, so kann nach der Berührung des Tropfens der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich ein Waschschritt durchgeführt werden, um unspezifisch gebundenes oder durch Adhäsion haftendes Material der Sondenflüssigkeit zu entfernen, bevor die Auswertung des Parameters begonnen wird.
Bei einer anderen Verfahrensführung wird das Verfahren mehrfach wiederholt, bis man keine Zunahme des Signales an dem funktionalisierten Teilbereich mehr erhält, nachdem der Sondenflüssigkeitstropfen wieder entfernt worden ist. Bei bekannter Konzentration und Volumen der Tropfen mit der Sondenflüssigkeit kann aus einem Vergleich z. B. des Fluoreszenzsignales am funktionalisierten Teilbereich mit und ohne Tropfen auf die Zahl der gebundenen Moleküle geschlossen werden. Wiederholt man das Verfahren sukzessiv für mehrere Tropfen mit verschiedenen Reaktionsparametern, so lassen sich aus den Ergebnissen u.a. z. B. die Gleichgewichtskonstante, die Reaktionsordnung, die Reaktionskinetik und die Konzentration der an der Oberfläche des funktionalisierten Teilbereiches befindlichen reaktiven Moleküle bestimmen. Als Reaktionsparameter kommen beispielsweise die Dauer je Reaktionsschritt, die Konzentration der Probe und die Reaktionstemperatur in Betracht.
Über die Reaktionskinetik der Sondenflüssigkeit bzw. des darin befindlichen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche läßt sich unter anderem durch die Messung der Reaktionswärme Information gewinnen.
Um die Reaktion zwischen Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche zu befördern bzw. die auf dem funktionalisierten Teilbereich aufgebrachte Flüssigkeit zu durchmischen, wird während der Reaktion vorteilhafterweise eine Oberflächenschallwelle in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches geschickt. Der Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle versetzt die Flüssigkeit auf der Oberfläche in Bewegung und führt zu deren Durchmischung. Der Impuls der Oberflächenschallwelle wird dabei durch die mechanische Deformation der Oberfläche oder durch die Wechselwirkung von durch die mechanische Deformation der Oberfläche hervorgerufenen Änderungen des elektrischen Feldes mit ggf. in der Flüssigkeit vorhandenen geladenen oder polarisierbaren Teilchen bewirkt.
Die Sondenflüssigkeit kann tropfenweise mit Hilfe eines Pipettierroboters oder Piezodispensers mit dem funktionalisierten Teilbereich in Verbindung gebracht werden. Besonders einfach und vorteilhaft ist es jedoch, wenn Tropfen der Sondenflüssigkeit auf der Festkörperoberfläche selbst in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches bewegt werden. Die Bewegung des Sondenflüssigkeitstropfens in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches kann ebenfalls mit Hilfe einer Oberflächenschallwelle ausgelöst werden. Die Bewegung auf der Oberfläche durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle ermöglicht eine besonders gerichtete und definierte Bewegung. Die geeignete Frequenz der Oberflächenschallwelle hängt vom Durchmesser des zu bewegenden Tropfens ab und kann z. B. in Vorversuchen bestimmt werden.
Die zur Durchmischung der Flüssigkeit auf dem funktionalisierten Teilbereich und/oder zur Bewegung des Sondenflüssigkeitstropfens vorteilhafterweise eingesetzten Oberflächenschallwellen können mit Hilfe eines oder mehrerer Interdigi- taltransducer auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche erzeugt werden, deren Abstrahlrichtung der Richtung des gewünschten Impulsübertrages entspricht. Eine solche piezoelektrische Oberfläche kann z. B. aus einen Lithiumniobat- oder Quarzkristall gebildet sein. Ebenso kann auch eine piezoelektrische Beschichtung, z. B. Zinkoxid, auf einem anderen Material vorgesehen sein. Die Oberfläche kann auch mit einer ausreichend dünnen, vorzugsweise biokompatiblen Schutzschicht versehen sein. Allgemein ist die Verwendung von Interdigitaltransducem zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen zur Bewegung von kleinen Flüssigkeitsmengen in DE-A-100 55 318 beschrieben.
In einfacher Ausgestaltung dieser bevorzugten Verfahrensführung wird ein Reservoirtropfen der Sondenflussigkeit auf die Festkörperoberfläche aufgebracht, der aufgrund seiner Oberflächenspannung zusammengehalten wird. Aus diesem Reservoirtropfen wird ein kleinerer Sondenflüssigkeitstropfen abgezogen und dem funktionalisierten Teilbereich zugeführt, wobei sich die kleine Sondenflüssigkeitsmenge auf der Oberfläche bewegt.
Der als Reservoir dienende größere Sondenflüssigkeitstropfen, aus dem der kleine Sondenflüssigkeitstropfen abgezogen wird, der dem funktionalisierten Teilbereich zugeführt wird, kann sich auf einem Ankerpunkt auf der Oberfläche des Festkörpers befinden, der von der Sondenflüssigkeit besser benetzt wird als seine umgebende Festkörperoberfläche. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß der größere Reservoirtropfen an einer bestimmten Stelle der Oberfläche verbleibt und diese ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt. Der Sondenflüssigkeitstropfen, der dem funktionalisierten Teilbereich zugeführt wird, kann vorteilhafterweise auf der Festkörperoberfläche entlang eines Pfades bewegt werden, wobei zumindest ein Teil seiner Oberfläche von der Sondenflüssigkeit besser benetzt wird als seine umgebende Oberfläche. Die Sondenflüssigkeit bewegt sich vorzugsweise auf diesem Pfad, so daß eine kontrollierte Bewegung sichergestellt ist. Ein solcher Pfad kann z. B. durch eine Modulation der Benetzungseigenschaften erreicht werden, wie sie zur Bewegung von Flüssigkeitsmengen auf Oberflächen in DE-A-100 55 318 beschrieben ist.
Zur Abteilung einer kleinen Menge der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt kann der Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt über einen Pfad geführt werden, der mit dem Ankerpunkt verbunden ist, wobei die Verbindung einen Bereich umfaßt, der so schmal ist, daß der Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt aufgrund seiner Oberflächenspannung den Ankerpunkt ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt. Wird durch äußere Krafteinwirkung der Reservoirtropfen auf diesem Pfad an diese Engstelle getrieben, so reißt er definiert ab.
Alternativ kann ein Reservoirtropfen, z. B. ebenfalls durch den Impulsübertrag von Oberflächenschallwellen, auf der Oberfläche über einen oder mehrere kleine Oberflächenteilbereiche bewegt werden, die von der Sondenflüssigkeit stärker benetzt werden als ihre Umgebung. Die Fläche eines solchen Oberflächenteilbereiches ist dabei so klein gewählt, daß sie kleiner als die Berührungsfläche des Tropfens mit der Oberfläche ist. Wird der Reservoirtropfen ein- oder mehrmals über einen solchen Oberflachenteilbereich geführt, verbleibt eine kleine Menge der Sondenflüssigkeit auf diesem Haltepunkt zurück und kann zu dem zu charakterisierenden funktionalisierten Teilbereich bewegt werden. So kann auf sehr einfache und reproduzierbare Weise eine kleine Sondenflüssigkeitsmenge abgeteilt werden.
Um zu verhindern, daß die kleine Sondenflüssigkeitsmenge zu schnell verdampft, wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Kontrolle der thermodynamischen Bedingungen vorteilhafterweise in einer Klimakammer durchgeführt. Der Sondenflüssigkeitstropfen kann von dem funktionalisierten Teilbereich z. B. einfach durch Wegblasen mit Druckluft wieder entfernt werden. Besonders vorteilhaft läßt sich der Sondenflüssigkeitstropfen jedoch durch Applikation einer Oberflächenschallwelle entfernen, die derart gerichtet ist, daß ihr Impulsübertrag auf die auf dem funktionalisierten Teilbereich befindliche Sondenflüssigkeitsmenge zu deren Wegbewegung führt. Ebenso läßt sich ein ggf. durchzuführender Waschschritt zur Entfernung unspezifisch gebundenen Materiales durch Applikation einer Oberflächenschallwelle geeigneter Intensität erreichen.
Die Erfindung wird anhand besonderer Ausgestaltungen, die in den beiliegenden Figuren schematisch und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu dargestellt sind, näher erläutert. Dabei zeigt:
Figur 1 die Durchführung eines erfindungsgemäßen Charakterisierungsverfahrens,
Figur 2 eine andere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Charakterisierungsverfahrens, und
Figur 3 einen Verfahrensschritt bei eine bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Charakterisierungsverfahrens.
Figur 1 zeigt einen Festkörperchip, z. B. einen piezoelektrischen Lithiumniobatchip 5, auf dessen Oberfläche das erfindungsgemäße Charakterisierungsverfahren durchgeführt wird. Ein Tropfen 1 einer Sondenflussigkeit in der Größenordnung von 0,5 nl bis 10 nl befindet sich auf einem funktionalisierten Teilbereich 15 der Oberfläche 7. Die angegebene Flüssigkeitsmenge eignet sich z. B. für einen funktionalisierten Teilbereich mit einer Fläche von z. B. 100 μm x 100 μm. Die Sondenflussigkeit umfaßt z. B. Moleküle mit einem Marker (z. B. Fluoreszenz- oder Radioaktivi- tätsmarker) und ihre Konzentration in dem Tropfen wird im Vorhinein bestimmt. Die Volumina für den Sondenlösungstropfen liegen je nach Größe des funktionalisierten Bereiches im Bereich von einem Pikoliter bis zu mehreren Mikrolitern. Der funktionalisierte Bereich 15 umfaßt z. B. eine Oberfläche, an der die Sondenflüssigkeit adsorbiert werden kann. Eine andere Anwendung umfaßt Makromoleküle als Probenmoleküle, die an dem funktionalisierten Teilbereich gebunden sind und für eine spezifische Bindung z. B. mit anderen Makromolekülen zur Verfügung stehen (z. B. für die DNA-Hybridisierung, Antigen-Antikörper-Reaktion u.a.). Die zu untersuchenden Probenmoleküle können z. B. durch einen Pipettierroboter oder einen Piezodispenser aufgebracht worden sein.
Auf einem Ankerpunkt 16 befindet sich ein Reservoirtropfen 3 der Sondenflüssigkeit. Der Ankerpunkt 16 ist derart ausgestaltet, daß er mit der Sondenflüssigkeit stärker benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Umfaßt die Sondenflüssigkeit z. B. eine wäßrige Lösung, so ist der Ankerpunkt 16 hydrophil im Vergleich zur umgebenden Festkörperoberfläche. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, daß die umgebende Oberfläche durch Silanisierung hydrophob gemacht wird.
Auch der funktionalisierte Bereich 15 kann mit einer entsprechenden Oberfläche ausgestattet sein, die den Sondenflüssigkeitstropfen 1 lokalisiert.
Funktionalisierter Bereich 15 und Ankerpunkt 16 sind über einen Pfad 18 miteinander verbunden, der ebenfalls solche Benetzungseigenschaften aufweist, daß er mit der Sondenflüssigkeitslösung besser benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Der Pfad 18 ist an den Engstellen 14, 12 derart eingeschränkt, daß die auf dem Ankerpunkt 16 bzw. dem funktionalisierten Bereich 15 befindlichen Tropfen aufgrund ihrer Oberflächenspannung den Ankerpunkt 16 bzw. den funktionalisierten Bereich 15 ohne äußere Krafteinwirkung nicht verlassen.
9, 11 und 13 bezeichnen Interdigitaltransducer, die geeignet sind, Oberflächenschallwellen auf der Oberfläche 7 des Lithiumniobatkristalles 5 anzuregen. Die Interdigitaltransducer bestehen in ihrer einfachsten Form aus zwei Elektroden mit fingerartig ineinander greifenden Fortsätzen. Anlegen eines Wechselfeldes z. B. in der Größenordnung von 100 MHz an die Elektroden des Interdigitaltransducers führt zur Anregung einer Oberflächenschallwelle mit einer Wellenlänge, die dem Fingerabstand der fingerartig ineinander greifenden Elektroden entspricht und deren Ausbreitungsrichtung im wesentlichen senkrecht zu den Fingerelektroden ist. Im Fall der Interdigitaltransducer 9 wird dies beispielsweise durch den Pfeil 10 schematisch angedeutet. Jeder Transducer umfaßt eine große Anzahl von ineinander greifenden Fingern, von denen jeweils nur einige schematisch und nicht maßstabsgetreu dargestellt sind. Es sind auch andere Transducergeometrien einsetzbar, wie sie aus der Technologie der Oberflächenschallwellenfilter bekannt sind.
Die Interdigitaltransducer 9 sind derart ausgerichtet, daß sich eine durch sie angeregte Oberflächenschallwelle in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches 15 bewegt. Der Interdigitaltransducer 11 bewirkt eine Oberflächenschallwelle in Richtung 19. Der Interdigitaltransducer 13 bewirkt schließlich eine Oberflächenschallwelle in Richtung 21. Nicht gezeigt sind der Übersichtlichkeit halber die elektrischen Anschlüsse an die Elektroden der Interdigitaltransducer, die in konventioneller Weise vorgesehen sind.
Mit 20 ist ein isolierter Oberflächenbereich bezeichnet, der ebenfalls mit der Sondenflüssigkeit stärker benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Durch den Impulsübertrag einer ausreichend starken Oberflächenschallwelle, die z. B. mit dem Interdigitaltransducer 11 erzeugt wird, kann ein Tropfen 1 in Richtung des Bereiches 20 transportiert werden und wird dort aufgrund der bevorzugten Benetzung lokalisiert. Eine solche Ausführungsform ist im speziellen dann vorteilhaft, wenn kein Pfad 18 zur Verbindung des Ankerpunktes 16 mit dem funktionalisierten Teilbereich 15 vorgesehen ist und die kleinen Tropfen 17 der Sondenflüssigkeit ohne Pfadführung auf der Oberfläche 7 bewegt werden.
23 zeigt in schematischer Darstellung die Spitze eines an sich bekannten Piezo- dispensers zur Aufbringung des Reservoirtropfens 3 der Sondenflüssigkeit auf den Ankerpunkt 16. Das Abfließen der Flüssigkeit aus der Dispenserspitze 23 ist durch den Pfeil 24 angedeutet. Auf der in Figur 1 dargestellten Vorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt werden. Zunächst wird der Teilbereich 15 durch Aufbringen von Probenmolekülen z. B. mit Hilfe eines Pipettierroboters oder eines Piezo- dispensers funktionalisiert.
Mit der Dispenserspitze 23 wird ein Tropfen 3 der Sondenflüssigkeit auf den Ankerpunkt 16 aufgebracht. Aufgrund der speziell gewählten Benetzungseigenschaften (z. B. hydrophil bei einer wäßrigen Sondenlösung) des Ankerpunktes 16 verglichen mit den Benetzungseigenschaften der umgebenden Festkörperoberfläche 7 verläßt der Tropfen 3, der durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, den Ankerpunkt 16 nicht.
An den Interdigitaltransducer 13 wird jetzt eine Wechselfrequenz, z. B. einige 100 MHz angelegt, so daß eine Oberflächenschallwelle in Richtung 21 generiert wird. Der Impulsübertrag der Oberflächenschallwelle bewegt den Tropfen 3 in Richtung der Engstelle 14, die den Ankerpunkt 16 mit dem Pfad 18 verbindet. Eine kleine Menge des Tropfens 3 bewegt sich über die Engstelle 14 und reißt bei entsprechender Dimensionierung definiert ab. Die notwendige Verringerung der Breite an der Engstelle 14 kann z. B. durch Vorversuche festgestellt worden sein. Die abgetrennte Sondenflüssigkeitsmenge 17 kann z. B. einige Pikoliter betragen. Der abgezogene Teil 17 der Sondenflüssigkeit bewegt sich ebenfalls durch Impulsübertrag der Oberflächenschallwelle, die mit Hilfe des Interdigitaltransducers 13 erzeugt wird, von dem Ankerpunkt 16 weg. Mit Hilfe eines zweiten Transducers 11 wird die Bewegung der kleinen Sondenflüssigkeitsmenge in Richtung 19 des funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 fortgesetzt. Die kleine Sondenflüssigkeitsmenge 17 gelangt auf den funktionalisierten Oberflächenbereich 15. Durch die Engstelle 12 in der Bahn 18 vor dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 wird verhindert, daß sich die Sondenflüssigkeit bei Abwesenheit der vom Transducer 11 erzeugten Oberflächenschallwelle vom funktionalisierten Oberflächenbereich 15 zurückbewegt. Mit Hilfe einer Oberflächenschallwelle, die von einem der Interdigitaltransducer 9 erzeugt wird, kann die Reaktion zwischen Sondenflüssigkeit und darin befindlichem Material und den Probenmolekülen auf der funktionalisierten Oberfläche 15 beschleunigt werden. Zur effektiven Durchmischung können auch beide Interdigitaltransducer 9 gleichzeitig eingesetzt werden, um gegenläufige Oberflächenschallwellen in Richtung des funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 zu generieren.
Mit einer Oberflächenschallwelle ausreichender Intensität, die von dem Interdigitaltransducer 11 ausgesendet wird, kann der Tropfen 1 von dem funktionalisierten Teilbereich 15 wegbewegt werden. Er wird dann z. B. von dem Oberflächenbereich 20 lokalisiert, der ebenfalls solche Benetzungseigenschaften aufweist, die mit der Sondenflüssigkeit stärker benetzen als die umgebende Festkörperoberfläche. Die Interdigitaltransducer 9 können jetzt eingesetzt werden, um festzustellen, ob Sondenflüssigkeit bzw. darin befindliches Material mit den Probenmolekülen auf dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 verblieben bzw. gebunden sind. Einer der Interdigitaltransducer 9 generiert dazu eine Oberflächenschallwelle in Richtung des funktionalisierten Bereiches 15. Mit dem zweiten Interdigitaltransducer kann die Oberflächenschallwelle nach dem Durchlaufen des funktionalisierten Bereiches 15 detektiert werden. Durch die Reaktion der Sondenflüssigkeit bzw. des darin befindlichen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche kann sich z. B. die Dämpfung oder die Geschwindigkeit der Oberflächenschallwelle verändert haben, so daß Information über die Reaktion bzw. die verbliebene Menge erhalten werden kann. Außerdem kann durch Vergleich mit entsprechenden Referenzmessungen die genaue Menge des verbliebenen Materiales auf dem funktionalisierten Bereich 15 aus der Dämpfung oder der Geschwindigkeitsänderung einer Oberflächenschallwelle festgestellt werden.
Das beschriebene Verfahren kann durch eine entsprechend gepulste Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13 erzeugt wird, in definierter Weise mehrfach durchgeführt werden, indem mehrere kleine Mengen Sondenflüssigkeit 17 in Richtung des funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 bewegt werden. Mit einer solchen Verfahrensführung läßt sich die Reaktion in Abhängigkeit der zugeführten Sondenflüssigkeitsmenge feststellen, wodurch eine genaue quantitative Bestimmung der zur Bindung zur Verfügung stehenden Probenmoleküle auf dem funktionalisierten Bereich 15 ermöglicht wird.
Mehrere entsprechende Vorrichtungen können auf einem Chip parallel vorgesehen sein, so daß eine parallele Durchführung mehrerer Experimente möglich ist.
In Figur 2 ist ein alternatives Verfahren dargestellt. Der Übersichtlichkeit halber zeigt Figur 2 nicht die zur Durchmischung ggf. vorgesehenen Transducer. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente wie in Figur 1. Bei dem Verfahren, das in Figur 2 dargestellt ist, wird zur Untersuchung einer möglichen Reaktion der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche 15 eine optische Messung durchgeführt. Eine Leuchtdiode 31 oder eine andere geeignete Lichtquelle beleuchtet den Festkörperchip 5 von unten. Zum Beispiel mit Hilfe einer Glasfaser 29 wird das optische Signal aufgefangen und an eine nicht gezeigte Auswerteeinrichtung weitergeleitet und in an sich bekannter Weise ausgewertet. Mit dieser Ausführungsform kann z. B. die Fluoreszenz ausgewertet werden, die von fluoreszenzmarkiertem Material in der Sondenflüssigkeit herrührt, das mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 reagiert hat und nach dem Entfernen des Sondenflüssigkeitstropfens 1 auf dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 verblieben ist. Wird ein nicht transparentes Substrat eingesetzt, so kann der Lichtweg auch parallel zur Oberfläche 7 des Chips 5 gewählt werden.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen des Verfahrens nutzen die Engstelle 14, um eine definierte Menge 17 der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen 3 abzuziehen. In Figur 3 ist eine alternative Möglichkeit zur Abtrennung einer kleinen Flüssigkeitsmenge dargestellt. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente wie in den Figuren 1 und 2. Ein Reservoirtropfen 3 befindet sich auf einem der Ankerpunkte 16. Durch Impulsübertrag eine Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13, der dem entsprechenden Ankerpunkt 16 am nächsten ist, erzeugt wird, wird der Reservoirtropfen 3 in Richtung des zweiten Ankerpunktes 16 getrieben. Der Impulsübertrag einer anderen Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13 erzeugt wird, der dem zwei- ten Ankerpunkt am nächsten ist, wird der Reservoirtropfen wieder zurückgetrieben. Dabei bewegt er sich entlang der angedeuteten Strecke 43 hin und her. Er überquert dabei ein- oder mehrfach einen Oberflächenbereich 41 , dessen Fläche kleiner ist als die Berührungsfläche des Reservoirtropfens 3 mit der Festkörperoberfläche 7. Dieser Oberflächenbereich 41 hat derartige Benetzungseigenschaften, daß die Flüssigkeit des Reservoirtropfens 3 ihn stärker benetzt als seine umgebende Festkörperoberfläche. Nach ein- oder mehrfacher Überquerung des Oberflächenbereiches 41 hat sich aus dem Reservoirtropfen 3 eine kleine Sondenflüssigkeitsmenge 17 abgelöst. Für wäßrige Sondenflüssigkeit wird der Oberflächenbereich 41 z. B. mit hydrophilen Eigenschaften gewählt.
Nachdem die kleine Sondenflüssigkeitsmenge 17 auf diese Weise von dem Reservoirtropfen 3 abgetrennt worden ist, kann mit Hilfe des Impulsübertrages einer O- berflächenschallwelle, die z. B. in Richtung 45 mit dem Interdigitaltransducer 11 erzeugt werden kann, die Sondenflüssigkeitsmenge 17 von dem Oberflächenbereich 41 fortbewegt werden, z. B. in Richtung eines in der Figur 3 nicht gezeigten funktionalisierten Oberflächenbereiches 15, um die Verfahrensschritte zur Charakterisierung durchzuführen, die mit Bezug zu Figuren 1 und 2 beschrieben sind.
Der Reservoirtropfen 3 und der Sondenflüssigkeitstropfen 17 können dabei entlang von bevorzugt benetzten Pfaden bewegt werden, wie sie bereits mit Bezug zu den Figuren 1 und 2 beschrieben sind und dort mit dem Bezugszeichen 18 bezeichnet sind. Solche Pfade haben vorteilhafterweise eine laterale Ausdehnung, die kleiner ist als der Durchmesser des Oberflächenbereiches 41. Das erfindungsgemäße Verfahren und das beschriebene Abtrennen der kleinen Sondenflüssigkeitsmenge 17 lassen sich jedoch auch ohne derartige Pfade durchführen, so daß diese in Figur 3 nicht dargestellt sind.
Mit dem in Figur 3 dargestellten Verfahren lassen sich z. B. 20 Pikoliter kleine Sondenflüssigkeitstropfen 17 von einem Reservoirtropfen 3 mit 50 Nanolitern abtrennen. Es können auf dem Weg des Reservoirtropfens 3 mehrere Oberflächenbereiche 41 vorgesehen sein, wenn mehrere Sondenflüssigkeitsmengen 17 in einem Arbeitsschritt abgetrennt werden sollen. Je nach Eigenschaft der zu manipulierenden Flüssigkeit in dem Reservoirtropfen 3 können durch entsprechende Vorversuche geeignete Geometrien für den Oberflächenbereich 41 festgelegt werden, z. B. kreis- oder ringförmig.
Das in Figur 3 beschriebene Verfahren zur Abtrennung einer kleinen Sondenflüssigkeitsmenge 17 von einem Reservoirtropfen 3 kann selbstverständlich mit allen oben bereits beschriebenen Verfahrensausgestaltungen zur Charakterisierung eines funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 kombiniert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Charakterisierungsverfahren zur Charakterisierung einer zur Untersuchung einer Probenflussigkeit funktionalisierten Untersuchungsoberfläche, bei dem
- zumindest ein Teilbereich (15) der Oberfläche (7) eines Festkörpers, vorzugsweise eines Festkörperchips (5), wobei der Teilbereich (15) für eine Reaktion mit einer Probenflussigkeit funktionalisiert ist, mit einem Tropfen (1 ) einer Sondenflüssigkeit in Berührung gebracht wird, wobei die Tropfengröße vorzugsweise so gewählt ist, daß der Tropfen (1 ) auf dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) derart durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, daß seine Berührungsfläche etwa der Fläche des funktionalisierten Teilbereiches (15) bzw. der funktionalisierten Teilbereiche entspricht, und die Sondenflussigkeit derart präpariert ist, daß eine Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen stattfinden kann, und - ein Parameter, der sich mit der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) ändert, gemessen wird, während der Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) in Berührung ist und/oder nachdem der Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) in Berührung war.
Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 1 , wobei das Verfahren ein- oder mehrfach wiederholt wird, um aus der Untersuchung der Änderung des Parameters mit zunehmender Anzahl der Wiederholungen Information über den zeitlichen Ablauf der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) zu erhalten.
Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Untersuchung des Parameters das Auslesen eines Markers umfaßt, der sich in der Sondenlösung befindet und mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) der Oberfläche (7) des Festkörpers
(5) eine Bindung eingehen kann bzw. Teil von sich in der Lösung befindlichen Molekülen ist, die mit dem funktionalisierten Teilbereich eine Bindung eingehen können, vorzugsweise eines Fluoreszenzmarkers oder radioaktiven Markers.
Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Untersuchung des Parameters die Messung der Reaktionswärme umfaßt, die bei der Reaktion zwischen der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales und dem funktionalisierten Teilbereich (15) auftritt.
Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das zur Bestimmung der Anzahl von zur Bindung von zweiten Makromolekülen in einer Probenflussigkeit auf dem funktionalisierten Teilbereich (15) der Oberfläche (7) zur Verfügung stehenden ersten Makromolekülen eingesetzt wird.
6. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem eine Oberflächenschallwelle (10) in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches (15) geschickt wird, um die Reaktion zwischen der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales und dem funktionalisiertem Teilbereich (15) zu befördern und/oder den Tropfen (1 ) der Sondenflüssigkeit zu durchmischen.
7. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 6, bei dem zur Erzeugung der Oberflächenschallwelle bzw. der Oberflächenschallwellen ein oder mehrere Interdigitaltransducer (9, 11 , 13) mit einer Oberflächenschallwellenabstrahl- richtung in Richtung des funktionalisierten Teilbereichs (15) auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche (7) eingesetzt werden.
8. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der Tropfen (1 ) der Sondenflüssigkeit auf der Oberfläche (7) zu dem funktionalisierten Teilbereich (15) bewegt wird.
9. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 8, bei dem ein Reservoirtropfen (3) von Sondenflüssigkeit auf die Festkörperoberfläche (7) aufgebracht wird, der aufgrund seiner Oberflächenspannung zusammengehalten wird, aus diesem Reservoirtropfen (3) ein Tropfen (17) von Sondenflüssigkeit abgezogen wird und dem funktionalisierten Teilbereich (15) zugeführt wird.
10. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 9, bei dem die Bewegung des Tropfens (17) der Sondenflüssigkeit durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle ausgelöst wird.
11. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 10, bei dem zur Erzeugung der Oberflächenschallwelle bzw. der Oberflächenschallwellen ein oder mehrere Interdigitaltransducer (9, 11 , 13) mit einer Oberflächenschallwellenabstrahl- richtung in Richtung der gewünschten Bewegung des Tropfens (17) auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche (7) eingesetzt werden.
12. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , bei dem der Reservoirtropfen (3) auf einen Ankerpunkt (16) auf der Oberfläche (7) des Festkörpers (5) aufgebracht wird, der mit der Sondenflüssigkeit besser benetzt als seine umgebende Festkörperoberfläche.
13. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 12, bei dem die Sondenflüssigkeit von dem auf die Festkörperoberfläche (7) aufgebrachten Reservoirtropfen (3) der Sondenflüssigkeit auf einem Pfad (18) zum funktionalisierten Teilbereich (15) geführt wird, wobei der Pfad (18) derart ausgestaltet ist, daß zumindest ein Teil seiner Oberfläche von der Sondenflüssigkeit besser benetzt wird als seine umgebende Oberfläche.
14. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 13, bei dem der Tropfen (17) der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen (3) zum funktionalisierten Teilbereich (15) über einen Pfad (18) geführt wird, der mit dem Ankerpunkt (16) und/oder dem funktionalisierten Teilbereich (15) verbunden ist, wobei die Verbindung (14, 12) einen Bereich umfaßt, der so schmal ist, daß der Reservoirtropfen (3) auf dem Ankerpunkt (16) aufgrund seiner Oberflächenspannung den Ankerpunkt (16) ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt.
15. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 12, bei dem der Reservoirtropfen (3) zumindest einmal über zumindest einen Bereich (41 ) der Oberfläche (7) bewegt wird, der von der Flüssigkeit stärker benetzt wird als die umgebende Oberfläche, wobei die Fläche dieses Bereiches (41 ) kleiner ist als die Berührungsfläche des Reservoirtropfens (3) mit der Oberfläche (7), um einen Tropfen (17) der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen (3) abzutrennen.
16. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, das zur Kontrolle der thermodynamischen Bedingungen in einer Klimakammer durchgeführt wird.
17. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem eine Oberflächenschallwelle nach Entfernung des Tropfens (1 ) von dem funktionalisierten Teilbereich (15) in Richtung (10) des funktionalisierten Teilbereiches (15) geschickt wird und die Änderung eines oder mehrerer Parameter der Oberflächenschallwelle gemessen wird, die durch die Reaktion der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) ausgelöst worden ist.
18. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem der Tropfen (1 ) der Sondenflüssigkeit von dem funktionalisierten Teilbereich (15) mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle entfernt wird.
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